Nature.com தளத்திற்கு வருகை தந்ததற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவியில் CSS-க்கான ஆதரவு குறைவாக உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்தைப் பெற, மேம்படுத்தப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு (அல்லது இன்டர்நெட் எக்ஸ்ப்ளோரரில் இணக்கப் பயன்முறையை அணைக்குமாறு) பரிந்துரைக்கிறோம். இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்யும் வகையில், நாங்கள் இந்தத் தளத்தை ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் காண்பிப்போம்.
மனிதக் குடல் உருவமாதல், முப்பரிமாண எபிதீலியல் நுண்கட்டமைப்பு மற்றும் இடஞ்சார்ந்த ஒழுங்கமைப்பின் கிரிப்ட்-வில்லஸ் அம்சங்களை நிறுவுகிறது. இந்தத் தனித்துவமான கட்டமைப்பு, அடி கிரிப்டில் உள்ள ஸ்டெம் செல் நிக்கை வெளிப்புற நுண்ணுயிர் ஆன்டிஜென்கள் மற்றும் அவற்றின் வளர்சிதை மாற்றப் பொருட்களிலிருந்து பாதுகாப்பதன் மூலம் குடல் சமநிலையைப் பராமரிக்கத் தேவைப்படுகிறது. கூடுதலாக, குடல் வில்லிகளும் சுரக்கும் சளியும், செயல்பாட்டு ரீதியாக வேறுபடுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் செல்களுக்கு குடல் சளி சவ்வுப் பரப்பில் ஒரு பாதுகாப்புத் தடையை வழங்குகின்றன. எனவே, இன் விட்ரோ குடல் மாதிரிகளைக் கட்டமைப்பதற்கு முப்பரிமாண எபிதீலியல் கட்டமைப்புகளை மீண்டும் உருவாக்குவது மிகவும் முக்கியமானது. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், கரிமப் போலியான 'குடல்-ஆன்-எ-சிப்' ஆனது, மேம்படுத்தப்பட்ட உடலியல் செயல்பாடுகள் மற்றும் உயிர்விசையியலுடன் குடல் எபிதீலியத்தின் தன்னிச்சையான முப்பரிமாண உருவமாதலைத் தூண்ட முடியும். இங்கே, ஒரு மைக்ரோஃப்ளூயிடிக் சிப்பிலும், டிரான்ஸ்வெல் உட்பொதிக்கப்பட்ட கலப்பின சிப்பிலும் குடலில் குடல் உருவமாதலை வலுவாகத் தூண்டுவதற்கான மீண்டும் மீண்டும் செய்யக்கூடிய ஒரு நெறிமுறையை நாங்கள் வழங்குகிறோம். கருவி உருவாக்கம், வழக்கமான அமைப்புகளிலும் மைக்ரோஃப்ளூயிடிக் தளத்திலும் Caco-2 அல்லது குடல் ஆர்கனாய்டு எபிதீலியல் செல்களை வளர்த்தல், முப்பரிமாண உருவமாதலைத் தூண்டுதல் மற்றும் பண்புக்கூறுதல் ஆகியவற்றுக்கான விரிவான முறைகளை நாங்கள் விவரிக்கிறோம். பல்வேறு பிம்பமாக்கல் முறைகளைப் பயன்படுத்தி, ஏற்கனவே உருவாக்கப்பட்ட முப்பரிமாண எபிதீலியங்களின் மீளுருவாக்கத்தை இந்த நெறிமுறை சாத்தியமாக்குகிறது. இந்த நெறிமுறை, 5 நாட்களுக்கு அடிப்பக்க திரவ ஓட்டத்தைக் கட்டுப்படுத்துவதன் மூலம், குடலின் செயல்பாட்டு நுண்ணமைப்பை மீளுருவாக்கம் செய்கிறது. எங்களின் இன் விட்ரோ உருவமாக்கல் முறையானது, உடலியல் ரீதியாகப் பொருத்தமான வெட்டுவிசை மற்றும் இயந்திர இயக்கத்தைப் பயன்படுத்துகிறது. மேலும், இதற்குச் சிக்கலான செல் பொறியியல் அல்லது கையாளுதல் தேவையில்லை. இது தற்போதுள்ள மற்ற நுட்பங்களை விடச் சிறப்பாகச் செயல்படக்கூடும். நாங்கள் முன்மொழிந்த இந்த நெறிமுறையானது, உயிர்மருத்துவ, மருத்துவ மற்றும் மருந்துப் பயன்பாடுகளுக்காக, இன் விட்ரோ முறையில் முப்பரிமாண குடல் எபிதீலியல் அடுக்குகளை மீளுருவாக்கம் செய்யும் ஒரு முறையை வழங்குவதன் மூலம், உயிர்மருத்துவ ஆராய்ச்சி சமூகத்திற்குப் பரந்த தாக்கங்களை ஏற்படுத்தக்கூடும் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம்.
அடிப்படை இயங்குமுறை குறித்த தெளிவான புரிதல் இல்லாமலேயே, 'கட்-ஆன்-எ-சிப்'¹,²,³,⁴,⁵ அல்லது இரு அடுக்கு நுண் பாய்ம சாதனங்களில்⁶,⁷ வளர்க்கப்பட்ட குடல் எபிதீலியல் Caco-2 செல்கள், ஆய்வகச் சூழலில் தன்னிச்சையான முப்பரிமாண உருவமாற்றத்திற்கு உள்ளாக முடியும் என்பதைப் பரிசோதனைகள் நிரூபிக்கின்றன. எங்களின் சமீபத்திய ஆய்வில், ஆய்வகச் சூழலில் முப்பரிமாண எபிதீலியல் உருவமாற்றத்தைத் தூண்டுவதற்கு, வளர்ப்புச் சாதனங்களிலிருந்து அடிப்பக்கவாட்டில் சுரக்கப்படும் உருவமாற்றத் தூண்டிகளை அகற்றுவது அவசியமானது மற்றும் போதுமானது என்பதைக் கண்டறிந்தோம்; இது Caco-2 மற்றும் நோயாளியிடமிருந்து பெறப்பட்ட குடல் உறுப்புருவாக்கிகள் மூலம் நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது. எபிதீலியல் செல்கள் சரிபார்க்கப்பட்டன. இந்த ஆய்வில், "ஹைப்ரிட் சிப்" எனப்படும், 'கட்-ஆன்-எ-சிப்' மற்றும் டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளைக் கொண்ட மாற்றியமைக்கப்பட்ட மைக்ரோஃப்ளூயிடிக் சாதனங்களில், ஒரு சக்திவாய்ந்த Wnt எதிரியான டிக்கோஃப்-1 (DKK-1)-இன் செல் உற்பத்தி மற்றும் செறிவுப் பரவல் மீது நாங்கள் குறிப்பாகக் கவனம் செலுத்தினோம். சிப்பில் உள்ள குடலில் புற Wnt எதிரிகளை (DKK-1, Wnt ரெப்ரஸர் 1, சுரக்கப்பட்ட ஃபிரிஸில்டு-தொடர்புடைய புரதம் 1, அல்லது சாகி-1 போன்றவை) சேர்ப்பது உருவ உருவாக்கத்தைத் தடுக்கிறது அல்லது முன் கட்டமைக்கப்பட்ட 3D எபிதீலியல் அடுக்கைச் சீர்குலைக்கிறது என்பதை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம். இது, வளர்ப்பின் போது ஏற்படும் எதிரி அழுத்தமே இன் விட்ரோவில் குடல் உருவ உருவாக்கத்திற்குக் காரணம் என்பதைக் காட்டுகிறது. எனவே, எபிதீலியல் இடைமுகத்தில் வலுவான உருவ உருவாக்கத்தை அடைவதற்கான ஒரு நடைமுறை அணுகுமுறை, அடிப்பக்கப் பகுதியில் உள்ள Wnt எதிரிகளின் அளவுகளைச் செயல்திறன் மிக்க வெளியேற்றம் (எ.கா., 'கட்-ஆன்-எ-சிப்' அல்லது 'ஹைப்ரிட்-ஆன்-எ-சிப்' தளங்களில்) அல்லது பரவல் மூலம் அகற்றுவது அல்லது குறைந்தபட்சம் பராமரிப்பது ஆகும். அடிப்பக்க ஊடகம் (எ.கா., டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளிலிருந்து பெரிய ஊடகங்களுக்குள்) கிணறுகளில் உள்ள அடிப்பக்க நீர்த்தேக்கங்கள்).
இந்த நெறிமுறையில், குடல் எபிதீலியல் செல்களை பாலிடைமெத்தில்சிலாக்சேன் (PDMS) அடிப்படையிலான நுண்துளை சவ்வுகள் (படிகள் 6A, 7A, 8, 9) அல்லது டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளின் பாலியஸ்டர் சவ்வுகளில் (படிகள் 6B, 7B, 8, 9) வளர்ப்பதற்கும், இன் விட்ரோவில் 3D உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்கும் (படி 10), குடல்-சிப் நுண்கருவிகள் மற்றும் டிரான்ஸ்வெல்-செருகக்கூடிய கலப்பின சிப்களை (படிகள் 1-5) உருவாக்குவதற்கான ஒரு விரிவான முறையை நாங்கள் வழங்குகிறோம். மேலும், பல படமாக்கல் முறைகளைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் (படிகள் 11-24), திசு-குறிப்பிட்ட ஹிஸ்டோஜெனெசிஸ் மற்றும் வம்சாவளி-சார்ந்த செல் வேறுபாட்டைக் குறிக்கும் செல்லுலார் மற்றும் மூலக்கூறு அம்சங்களையும் நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம். நுண்துளை சவ்வுகளின் மேற்பரப்பு மாற்றம், 2D ஒற்றை அடுக்குகளை உருவாக்குதல், மற்றும் குடல் உயிர்வேதியியல் மற்றும் உயிர் இயந்திரவியல் நுண்சூழலை இன் விட்ரோவில் மீண்டும் உருவாக்குதல் உள்ளிட்ட தொழில்நுட்ப விவரங்களுடன், Caco-2 அல்லது குடல் ஆர்கனாய்டுகள் போன்ற மனித குடல் எபிதீலியல் செல்களைப் பயன்படுத்தி இரண்டு வளர்ப்பு வடிவங்களில் உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுகிறோம். 2D எபிதீலியலில் இருந்து 3D உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்கு. ஒற்றை அடுக்குகளில், வளர்ப்பின் அடிப்பக்கப் பகுதிக்குள் ஊடகத்தைப் பாய்ச்சுவதன் மூலம், வளர்க்கப்பட்ட இரு வடிவங்களிலிருந்தும் உருவமைப்பு எதிர்ப்பிகளை நாங்கள் அகற்றினோம். இறுதியாக, உருவமைப்பு சார்ந்த எபிதீலியல் வளர்ச்சி, நீள்வட்ட ஓம்புயிர்-நுண்ணுயிரிக் கூட்டிணைப்புகள், நோய்க்கிருமித் தொற்று, அழற்சிக் காயம், எபிதீலியல் தடுப்புச் செயலிழப்பு மற்றும் புரோபயாடிக் அடிப்படையிலான சிகிச்சைகள் ஆகியவற்றின் தாக்கங்களை மாதிரியாகக் காட்டப் பயன்படும், மீளுருவாக்கம் செய்யக்கூடிய ஒரு முப்பரிமாண எபிதீலியல் அடுக்கின் பயன்பாட்டை உதாரணமாக வழங்குகிறோம்.
எங்கள் நெறிமுறையானது, அடிப்படை (எ.கா., குடல் சளிச்சவ்வு உயிரியல், தண்டு உயிரணு உயிரியல் மற்றும் வளர்ச்சி உயிரியல்) மற்றும் பயன்பாட்டு ஆராய்ச்சி (எ.கா., மருத்துவத்திற்கு முந்தைய மருந்துச் சோதனை, நோய் மாதிரியாக்கம், திசுப் பொறியியல் மற்றும் இரைப்பைக் குடலியல்) ஆகிய துறைகளில் உள்ள பலதரப்பட்ட விஞ்ஞானிகளுக்குப் பரந்த தாக்கத்தை ஏற்படுத்தும் வகையில் பயனுள்ளதாக இருக்கலாம். ஆய்வகச் சூழலில் குடல் புறத்தோலின் முப்பரிமாண உருவமைப்பைத் தூண்டுவதில் எங்கள் நெறிமுறையின் மீண்டும் மீண்டும் செய்யக்கூடிய தன்மை மற்றும் உறுதியான தன்மை காரணமாக, குடல் வளர்ச்சி, மீளுருவாக்கம் அல்லது சமநிலை பேணலின் போது உயிரணு சமிக்ஞைகளின் இயக்கவியலைப் படிக்கும் பார்வையாளர்களுக்கு எங்கள் தொழில்நுட்ப உத்தியைப் பரப்ப முடியும் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம். மேலும், நோரோவைரஸ் 8, கடுமையான சுவாச நோய்க்குறி கொரோனா வைரஸ் 2 (SARS-CoV-2), கிளாஸ்ட்ரிடியம் டிஃபிசில், சால்மோனெல்லா டைஃபிமூரியம் 9 அல்லது விப்ரியோ காலரா போன்ற பல்வேறு தொற்று முகவர்களின் கீழ் ஏற்படும் தொற்றை ஆராய்வதற்கும் எங்கள் நெறிமுறை பயனுள்ளதாக உள்ளது. நோய் நோயியல் மற்றும் நோய்க்காரணவியல் பற்றிய பார்வையாளர்களும் பயனுள்ளவர்கள். ஒரு ஆன்-சிப் குடல் நுண் உடலியல் அமைப்பின் பயன்பாடு, இரைப்பை குடல் (GI) பாதையில் நீள்வட்ட இணை-வளர்ப்பு 10 மற்றும் அதைத் தொடர்ந்து புரவலர் பாதுகாப்பு, நோயெதிர்ப்பு பதில்கள் மற்றும் நோய்க்கிருமி தொடர்பான காயம் சரிசெய்தல் 11 ஆகியவற்றை அனுமதிக்கலாம். கசிவு குடல் நோய்க்குறி, செலியாக் நோய், க்ரோன் நோய், அல்சரேட்டிவ் பெருங்குடல் அழற்சி, பவுச்சிடிஸ் அல்லது எரிச்சல் குடல் நோய்க்குறி ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடைய பிற GI கோளாறுகளை, நோயாளியின் 3D குடல் எபிதீலியல் அடுக்குகளைப் பயன்படுத்தி 3D குடல் எபிதீலியல் அடுக்குகள் தயாரிக்கப்படும்போது உருவகப்படுத்தலாம்; இந்த நோய்களில் வில்லஸ் அட்ராபி, கிரிப்ட் சுருக்கம், சளி சவ்வு சேதம் அல்லது பலவீனமான எபிதீலியல் தடுப்பு ஆகியவை அடங்கும். பயாப்ஸி அல்லது ஸ்டெம் செல்-வழித்தோன்றல் குடல் ஆர்கனாய்டுகள்12,13. நோய்ச் சூழலின் அதிக சிக்கலான தன்மையை சிறப்பாக மாதிரியாக்க, வாசகர்கள் 3D குடல் வில்லஸ்-கிரிப்ட் நுண் கட்டமைப்புகளைக் கொண்ட மாதிரிகளில், நோயாளியின் புற இரத்த மோனோநியூக்ளியர் செல்கள் (PBMCs) போன்ற நோய் தொடர்பான செல் வகைகளைச் சேர்ப்பதைக் கருத்தில் கொள்ளலாம். திசு-குறிப்பிட்ட நோயெதிர்ப்பு செல்கள், 5.
3D எபிதீலியல் நுண் கட்டமைப்பை, துண்டாக்கும் செயல்முறை இல்லாமலேயே நிலைநிறுத்திக் காட்சிப்படுத்த முடியும் என்பதால், இடஞ்சார்ந்த டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் உயர்-தெளிவுத்திறன் அல்லது சூப்பர்-தெளிவுத்திறன் இமேஜிங்கில் பணிபுரியும் பார்வையாளர்கள், எபிதீலியல் இடங்களில் மரபணுக்கள் மற்றும் புரதங்களின் இட-கால இயக்கவியல் குறித்த எங்கள் வரைபடத்தில் ஆர்வம் காட்டக்கூடும். தொழில்நுட்பத்தில் ஆர்வம். நுண்ணுயிர் அல்லது நோயெதிர்ப்புத் தூண்டுதல்களுக்கான பதில். மேலும், குடல் சமநிலையை ஒருங்கிணைக்கும் நீள்வட்ட ஹோஸ்ட்-மைக்ரோபயோம் குறுக்குத் தொடர்பு 10, 14, குறிப்பாக 'கட்-ஆன்-எ-சிப்'-இல், பல்வேறு நுண்ணுயிர் இனங்கள், நுண்ணுயிர் சமூகங்கள் அல்லது மல நுண்ணுயிரிகளை இணை-வளர்ப்பதன் மூலம் 3D குடல் சளி சவ்வு அடுக்கில் நிறுவப்படலாம். இந்த அணுகுமுறை, ஆய்வகத்தில் இதுவரை வளர்க்கப்படாத குடல் நுண்ணுயிரிகளை வளர்க்க விரும்பும் சளிச்சவ்வு நோயெதிர்ப்புவியல், இரைப்பைக்குடலியல், மனித நுண்ணுயிரித்தொகுதி, வளர்ப்புமுறையியல் மற்றும் மருத்துவ நுண்ணுயிரியல் ஆகியவற்றை ஆய்வு செய்யும் பார்வையாளர்களுக்கு குறிப்பாக கவர்ச்சிகரமானது. நமது இன் விட்ரோ உருவமாற்ற நெறிமுறையை, அடிப்பக்கப் பகுதிகளைத் தொடர்ந்து நிரப்பும் 24, 96 அல்லது 384 கிணறு தட்டுகளில் உள்ள பலகிணறு செருகிகள் போன்ற அளவிடக்கூடிய வளர்ப்பு வடிவங்களுக்கு ஏற்ப மாற்றியமைக்க முடிந்தால், இந்த நெறிமுறையை மருந்து, உயிர்மருத்துவ அல்லது உணவுத் தொழிலுக்கான அதிவேக பரிசோதனை அல்லது சரிபார்ப்பு தளங்களை உருவாக்குபவர்களுக்கும் பரப்பலாம். ஒரு கொள்கை நிரூபணமாக, 24-கிணறு தட்டு வடிவத்திற்கு அளவிடக்கூடிய ஒரு மல்டிபிளக்ஸ் அதிவேக உருவமாற்ற அமைப்பின் சாத்தியக்கூறை நாங்கள் சமீபத்தில் நிரூபித்தோம். கூடுதலாக, பல 'ஆர்கன்-ஆன்-எ-சிப்' தயாரிப்புகள் வணிகமயமாக்கப்பட்டுள்ளன¹⁶,¹⁷,¹⁸. எனவே, நமது இன் விட்ரோ உருவமாற்ற முறையின் சரிபார்ப்பை விரைவுபடுத்தி, இன் விட்ரோ குடலின் செல்லுலார் மறுநிரலாக்கத்தைப் புரிந்துகொள்வதற்காக பல ஆராய்ச்சி ஆய்வகங்கள், தொழில்துறை அல்லது அரசாங்கம் மற்றும் ஒழுங்குமுறை முகமைகளால் ஏற்றுக்கொள்ள முடியும். மருந்துகள் அல்லது உயிரியல் சிகிச்சை மருந்துகளைச் சோதிப்பதற்காக டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மட்டத்தில் நடைபெறும் உருவ உருவாக்கவியல். குடல் உருவ உருவாக்கச் செயல்முறையின் மறுஉருவாக்கத்தன்மையை மதிப்பிடுவதற்காக, மருந்து வேட்பாளர்களின் உறிஞ்சுதலும் கடத்தலும் 3D குடல் பதிலீடுகளைப் பயன்படுத்தியோ அல்லது தனிப்பயனாக்கப்பட்ட அல்லது வணிகரீதியான 'ஆர்கன்-ஆன்-எ-சிப்' மாதிரிகளைப் பயன்படுத்தியோ மதிப்பிடப்பட்டது.
குடல் எபிதீலியல் உருவ உருவாக்கத்தைப் பற்றி ஆய்வு செய்ய, மனிதர்களுக்குப் பொருத்தமான வரையறுக்கப்பட்ட எண்ணிக்கையிலான சோதனை மாதிரிகளே பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளன. இதற்குக் காரணம், ஆய்வகத்தில் முப்பரிமாண உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்கான நடைமுறைப்படுத்தக்கூடிய நெறிமுறைகள் இல்லாததே ஆகும். உண்மையில், குடல் உருவ உருவாக்கம் பற்றிய தற்போதைய அறிவின் பெரும்பகுதி விலங்கு ஆய்வுகளையே (எ.கா., வரிமீன்20, எலிகள்21 அல்லது கோழிகள்22) அடிப்படையாகக் கொண்டது. இருப்பினும், அவை அதிக உழைப்பையும் செலவையும் கோருபவை, நெறிமுறை ரீதியாக கேள்விக்குரியவையாக இருக்கலாம், மேலும் மிக முக்கியமாக, மனித வளர்ச்சி செயல்முறைகளைத் துல்லியமாகத் தீர்மானிப்பதில்லை. இந்த மாதிரிகள், பல வழிகளில் அளவிடக்கூடிய வகையில் சோதிக்கப்படும் திறனிலும் மிகவும் குறைவாகவே உள்ளன. எனவே, ஆய்வகத்தில் முப்பரிமாண திசு அமைப்புகளை மீளுருவாக்கம் செய்வதற்கான எங்கள் நெறிமுறையானது, உயிருள்ள விலங்கு மாதிரிகளையும் மற்ற பாரம்பரிய நிலையான இருபரிமாண செல் வளர்ப்பு மாதிரிகளையும் விட சிறப்பாகச் செயல்படுகிறது. முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி, முப்பரிமாண எபிதீலியல் அமைப்புகளைப் பயன்படுத்துவது, பல்வேறு சளிச்சவ்வு அல்லது நோயெதிர்ப்புத் தூண்டுதல்களுக்கு ஏற்ப, கிரிப்ட்-வில்லஸ் அச்சில் வேறுபடுத்தப்பட்ட செல்களின் இடஞ்சார்ந்த இருப்பிடத்தை ஆராய எங்களுக்கு உதவியது. முப்பரிமாண எபிதீலியல் அடுக்குகள், நுண்ணுயிரிக் செல்கள் எவ்வாறு இடஞ்சார்ந்த இடங்களை உருவாக்கப் போட்டியிடுகின்றன என்பதையும், புரவலன் காரணிகளுக்கு (எ.கா.,) ஏற்ப சூழலியல் பரிணாம வளர்ச்சியையும் ஆய்வு செய்ய ஒரு இடத்தை வழங்க முடியும். உள் மற்றும் வெளி சளிப்படலங்கள், IgA மற்றும் நுண்ணுயிரெதிர்ப்பு பெப்டைடுகளின் சுரப்பு). மேலும், குடல் நுண்ணுயிரிகள் எவ்வாறு தங்கள் சமூகங்களை கட்டமைக்கின்றன என்பதையும், அடிக்குழிகளில் உள்ள செல் அமைப்பு மற்றும் தண்டுசெல் இடங்களை வடிவமைக்கும் நுண்ணுயிரி வளர்சிதைப்பொருட்களை (எ.கா., குறுகிய சங்கிலி கொழுப்பு அமிலங்கள்) எவ்வாறு ஒருங்கிணைந்து உற்பத்தி செய்கின்றன என்பதையும் முப்பரிமாண எபிதீலியல் உருவவியல் மூலம் நாம் புரிந்துகொள்ள முடியும். முப்பரிமாண எபிதீலியல் அடுக்குகள் ஆய்வகச் சூழலில் நிறுவப்படும்போது மட்டுமே இந்த அம்சங்களை நிரூபிக்க முடியும்.
3D குடல் எபிதீலியல் கட்டமைப்புகளை உருவாக்கும் எங்கள் முறையுடன் கூடுதலாக, பல இன் விட்ரோ முறைகளும் உள்ளன. குடல் ஆர்கனாய்டு வளர்ப்பு என்பது, குறிப்பிட்ட மார்போஜென் நிலைமைகளின் கீழ் குடல் ஸ்டெம் செல்களை வளர்ப்பதை அடிப்படையாகக் கொண்ட ஒரு அதிநவீன திசு பொறியியல் நுட்பமாகும்²³,²⁴,²⁵. இருப்பினும், போக்குவரத்து பகுப்பாய்வு அல்லது ஹோஸ்ட்-மைக்ரோபயோம் இணை-வளர்ப்புகளுக்கு 3D ஆர்கனாய்டு மாதிரிகளைப் பயன்படுத்துவது பெரும்பாலும் சவாலானது, ஏனெனில் குடல் குழி ஆர்கனாய்டுக்குள் மூடப்பட்டிருக்கும், எனவே, நுண்ணுயிர் செல்கள் அல்லது புற ஆன்டிஜென்கள் போன்ற குழி கூறுகளை அறிமுகப்படுத்துவது குறைவாகவே உள்ளது. ஒரு மைக்ரோஇன்ஜெக்டரைப் பயன்படுத்தி ஆர்கனாய்டு குழிகளுக்கான அணுகலை மேம்படுத்தலாம்²⁶,²⁷, ஆனால் இந்த முறை ஊடுருவும் தன்மை கொண்டது, அதிக உழைப்பு தேவைப்படுகிறது, மேலும் இதைச் செய்வதற்கு சிறப்பு அறிவு தேவைப்படுகிறது. மேலும், நிலையான நிலைமைகளின் கீழ் ஹைட்ரோஜெல் சாரக்கட்டுகளில் பராமரிக்கப்படும் பாரம்பரிய ஆர்கனாய்டு வளர்ப்புகள், இன் விவோவில் செயல்படும் உயிர் இயக்கவியலைத் துல்லியமாகப் பிரதிபலிப்பதில்லை.
பல ஆராய்ச்சிக் குழுக்களால் பயன்படுத்தப்படும் பிற அணுகுமுறைகள், முன் கட்டமைக்கப்பட்ட 3D ஹைட்ரோஜெல் சாரக்கட்டுகளைப் பயன்படுத்தி, ஜெல் மேற்பரப்பில் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மனித குடல் செல்களை வளர்ப்பதன் மூலம் குடல் எபிதீலியல் கட்டமைப்பைப் பிரதிபலிக்கின்றன. 3D-அச்சிடப்பட்ட, மைக்ரோ-மில் செய்யப்பட்ட, அல்லது லித்தோகிராஃபிக் முறையில் உருவாக்கப்பட்ட அச்சுகளைப் பயன்படுத்தி ஹைட்ரோஜெல் சாரக்கட்டுகளை உருவாக்கவும். இந்த முறை, தனிமைப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் செல்களின் சுய-ஒழுங்கமைக்கப்பட்ட அமைப்பை, உடலியல் ரீதியாக தொடர்புடைய மார்போஜென் சாய்வுகளுடன் இன் விட்ரோவில் காட்டுகிறது. இது சாரக்கட்டில் ஸ்ட்ரோமா செல்களைச் சேர்ப்பதன் மூலம் ஒரு உயர் விகித எபிதீலியல் கட்டமைப்பையும் ஸ்ட்ரோமா-எபிதீலியல் குறுக்குத் தொடர்பையும் நிறுவுகிறது. இருப்பினும், முன் கட்டமைக்கப்பட்ட சாரக்கட்டுகளின் தன்மை, தன்னிச்சையான மார்போஜெனடிக் செயல்முறையையே காண்பிப்பதைத் தடுக்கக்கூடும். இந்த மாதிரிகள், குடல் செல்கள் உருவமாதலுக்கு உட்பட்டு உடலியல் செயல்பாட்டைப் பெறுவதற்குத் தேவையான திரவ வெட்டு அழுத்தத்தைக் கொண்டிருக்காததால், மாறும் லுமினல் அல்லது இன்டர்ஸ்டிஷியல் ஓட்டத்தையும் வழங்குவதில்லை. மற்றொரு சமீபத்திய ஆய்வு, ஒரு மைக்ரோஃப்ளூயிடிக் தளத்தில் ஹைட்ரோஜெல் சாரக்கட்டுகளைப் பயன்படுத்தி, லேசர்-எச்சிங் நுட்பங்களைப் பயன்படுத்தி குடல் எபிதீலியல் கட்டமைப்புகளை வடிவமைத்தது. எலி குடல் ஆர்கனாய்டுகள், பொறிக்கப்பட்ட வடிவங்களைப் பின்பற்றி குடல் குழாய் கட்டமைப்புகளை உருவாக்குகின்றன, மேலும் இன்ட்ராலுமினல் திரவ ஓட்டத்தைக் காண முடியும். ஒரு நுண் பாய்மவியல் தொகுதியைப் பயன்படுத்தி இது மீண்டும் தொகுக்கப்பட்டது. இருப்பினும், இந்த மாதிரியானது தன்னிச்சையான உருவவியல் செயல்முறைகளையோ அல்லது குடல் இயந்திர உயிரியல் இயக்கங்களையோ வெளிப்படுத்தவில்லை. அதே குழுவின் 3D அச்சிடும் நுட்பங்கள், தன்னிச்சையான உருவவியல் செயல்முறைகளைக் கொண்ட சிறிய குடல் குழாய்களை உருவாக்க முடிந்தது. குழாயினுள் வெவ்வேறு குடல் பகுதிகளைச் சிக்கலான முறையில் உருவாக்கிய போதிலும், இந்த மாதிரியில் உள்ளகப் பாய்ம ஓட்டம் மற்றும் இயந்திர உருக்குலைவு ஆகியவையும் இல்லை. கூடுதலாக, மாதிரியின் இயக்கத்திறன் குறைவாக இருக்கலாம், குறிப்பாக உயிரி அச்சிடும் செயல்முறை முடிந்த பிறகு, அது சோதனை நிலைமைகளையோ அல்லது செல்களுக்கு இடையேயான தொடர்புகளையோ சீர்குலைக்கக்கூடும். மாறாக, நாங்கள் முன்மொழிந்த நெறிமுறையானது தன்னிச்சையான குடல் உருவவியல், உடலியல் ரீதியாகப் பொருத்தமான வெட்டு விசை, குடல் இயக்கத்தைப் பிரதிபலிக்கும் உயிரியக்கவியல், தனித்த நுனி மற்றும் அடிப்பக்கப் பிரிவுகளுக்கான அணுகல் மற்றும் தொகுதியமைப்பின் சிக்கலான உயிரியல் நுண்சூழல்களை மீண்டும் உருவாக்குதல் ஆகியவற்றை வழங்குகிறது. எனவே, எங்களின் இன் விட்ரோ 3D உருவவியல் நெறிமுறையானது, தற்போதுள்ள முறைகளின் சவால்களைச் சமாளிக்க ஒரு நிரப்பு அணுகுமுறையை வழங்கக்கூடும்.
எங்கள் நெறிமுறை முழுவதுமாக 3D எபிதீலியல் உருவ உருவாக்கத்தில் கவனம் செலுத்துகிறது, இதில் வளர்ப்பில் எபிதீலியல் செல்கள் மட்டுமே உள்ளன, மேலும் மீசென்கைமல் செல்கள், எண்டோதெலியல் செல்கள் மற்றும் நோயெதிர்ப்பு செல்கள் போன்ற பிற வகை சுற்றியுள்ள செல்கள் இல்லை. முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி, அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட ஊடகத்தின் அடிப்பக்கத்தில் சுரக்கப்படும் உருவ உருவாக்கத் தடுப்பான்களை அகற்றுவதன் மூலம் எபிதீலியல் உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதே எங்கள் நெறிமுறையின் மையமாகும். எங்கள் 'கட்-ஆன்-எ-சிப்' மற்றும் 'ஹைப்ரிட்-ஆன்-எ-சிப்' ஆகியவற்றின் வலுவான மட்டுத்தன்மை, அலைபோன்ற 3D எபிதீலியல் அடுக்கை மீண்டும் உருவாக்க எங்களை அனுமதித்தாலும், எபிதீலியல்-மீசென்கைமல் இடைவினைகள்33,34, புற-செல்லுலார் மேட்ரிக்ஸ் (ECM) படிதல்35 மற்றும், எங்கள் மாதிரியில், அடித்தள கிரிப்டுகளில் ஸ்டெம் செல் இடங்களை வழங்கும் கிரிப்ட்-வில்லஸ் அம்சங்கள் போன்ற கூடுதல் உயிரியல் சிக்கல்கள் மேலும் கருத்தில் கொள்ளப்பட வேண்டும். மீசென்கைமில் உள்ள ஸ்ட்ரோமல் செல்கள் (எ.கா., ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள்) ECM புரதங்களின் உற்பத்தியிலும், உயிருள்ளவற்றில் குடல் உருவ உருவாக்கத்தை ஒழுங்குபடுத்துவதிலும் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன35,37,38. எங்கள் மாதிரியில் மீசென்கைமல் செல்களைச் சேர்ப்பது மேம்படுத்தியது. உருவவியல் செயல்முறை மற்றும் செல் இணைப்புத் திறன். குடல் நுண்ணுயிர்சூழலில் மூலக்கூறுப் போக்குவரத்தை ஒழுங்குபடுத்துவதிலும்39 மற்றும் நோயெதிர்ப்பு செல் திரட்டலிலும்40 எண்டோதெலியல் அடுக்கு (அதாவது, நுண்குழாய்கள் அல்லது நிணநீர் நாளங்கள்) ஒரு முக்கியப் பங்கு வகிக்கிறது. மேலும், பல உறுப்பு இடைவினைகளை வெளிப்படுத்த திசு மாதிரிகள் வடிவமைக்கப்படும்போது, ​​திசு மாதிரிகளுக்கு இடையில் இணைக்கப்படக்கூடிய இரத்த நாளக் கூறுகள் ஒரு முன்நிபந்தனையாகும். எனவே, உறுப்பு-நிலைத் தெளிவுத்திறனுடன் மிகவும் துல்லியமான உடலியல் அம்சங்களை மாதிரியாக்க, எண்டோதெலியல் செல்களைச் சேர்க்க வேண்டியிருக்கலாம். குடல் நோயைப் போலச் செய்யும் சூழலில், உள்ளார்ந்த நோயெதிர்ப்புத் துலங்கல்கள், ஆன்டிஜென் வழங்கல், உள்ளார்ந்த தகவமைப்பு நோயெதிர்ப்புப் பரிமாற்றத் தொடர்பு மற்றும் திசு-குறிப்பிட்ட நோயெதிர்ப்பு ஆகியவற்றைக் காண்பிப்பதற்கு, நோயாளியிடமிருந்து பெறப்பட்ட நோயெதிர்ப்பு செல்களும் அவசியமானவை.
'கட்-ஆன்-எ-சிப்' முறையை விட கலப்பின சில்லுகளின் பயன்பாடு மிகவும் நேரடியானது, ஏனெனில் அதன் சாதன அமைப்பு எளிமையானது மற்றும் டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளின் பயன்பாடு குடல் எபிதீலியத்தை அளவிடக்கூடிய அளவில் வளர்க்க அனுமதிக்கிறது. இருப்பினும், பாலியஸ்டர் சவ்வுகளைக் கொண்ட வணிக ரீதியாகக் கிடைக்கும் டிரான்ஸ்வெல் செருகிகள் மீள்தன்மை அற்றவை மற்றும் குடல் அசைவு போன்ற இயக்கங்களை உருவகப்படுத்த முடியாது. மேலும், கலப்பின சில்லுவில் வைக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்வெல் செருகியின் நுனிப் பகுதி, நுனிப் பக்கத்தில் எந்தவிதமான வெட்டு அழுத்தமும் இல்லாமல் நிலையாக இருந்தது. தெளிவாக, நுனிப் பகுதியில் உள்ள இந்த நிலையான பண்புகள், கலப்பின சில்லுகளில் நீண்ட கால பாக்டீரியா இணை-வளர்ப்பை அரிதாகவே சாத்தியமாக்குகின்றன. கலப்பின சில்லுகளைப் பயன்படுத்தும்போது டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளில் முப்பரிமாண உருவ உருவாக்கத்தை நம்மால் வலுவாகத் தூண்ட முடிந்தாலும், உடலியல் ரீதியாகப் பொருத்தமான உயிர்விசை இயல் மற்றும் நுனிப் பகுதி திரவ ஓட்டத்தின் பற்றாக்குறை, சாத்தியமான பயன்பாடுகளுக்கு கலப்பின சில்லு தளங்களின் சாத்தியக்கூறுகளைக் கட்டுப்படுத்தக்கூடும்.
கட்-ஆன்-எ-சிப் மற்றும் ஹைப்ரிட்-ஆன்-எ-சிப் வளர்ப்புகளில் மனித கிரிப்ட்-வில்லஸ் அச்சின் முழு அளவிலான புனரமைப்புகள் இன்னும் முழுமையாக நிறுவப்படவில்லை. உருவ உருவாக்கம் ஒரு எபிதீலியல் ஒற்றை அடுக்கிலிருந்து தொடங்குவதால், 3D நுண் கட்டமைப்புகள் உயிருள்ள கிரிப்டுகளுடன் உருவவியல் ஒற்றுமையை அவசியமாக வழங்குவதில்லை. நுண் பொறியியல் செய்யப்பட்ட 3D எபிதீலியத்தில் அடித்தள கிரிப்ட் பகுதிக்கு அருகிலுள்ள பெருகும் செல் தொகுதியை நாங்கள் வகைப்படுத்தியிருந்தாலும், கிரிப்ட் மற்றும் வில்லஸ் பகுதிகள் தெளிவாக வரையறுக்கப்படவில்லை. சிப்பில் உள்ள உயர்ந்த மேல் சேனல்கள் நுண் பொறியியல் செய்யப்பட்ட எபிதீலியத்தின் உயரத்தை அதிகரிக்க வழிவகுத்தாலும், அதிகபட்ச உயரம் இன்னும் ~300–400 µm ஆகவே வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது. சிறுகுடல் மற்றும் பெருங்குடலில் உள்ள மனித குடல் கிரிப்டுகளின் உண்மையான ஆழம் முறையே ~135 µm மற்றும் ~400 µm ஆகும், மேலும் சிறுகுடல் வில்லியின் உயரம் ~600 µm41 ஆகும்.
பிம்பமாக்கல் கண்ணோட்டத்தில், முப்பரிமாண நுண்கட்டமைப்புகளின் இடத்திலேயே செய்யப்படும் மீத்தீர்மானப் பிம்பமாக்கல், சில்லு மீதான குடலுக்கு மட்டுமே வரையறுக்கப்பட்டிருக்கலாம். ஏனெனில், பொருளெறி வில்லைக்கும் புறத்தோல் அடுக்குக்கும் இடையே தேவைப்படும் செயல்படும் தூரம் சில மில்லிமீட்டர்கள் அளவில் உள்ளது. இந்தப் பிரச்சனையைச் சமாளிக்க, ஒரு தொலைதூரப் பொருளெறி வில்லை தேவைப்படலாம். மேலும், PDMS-இன் அதிக மீள் தன்மை காரணமாக, பிம்பமாக்கல் மாதிரித் தயாரிப்பிற்காக மெல்லிய பகுதிகளை உருவாக்குவது சவாலானது. மேலும், சில்லு மீதான குடலின் அடுக்குக்கு அடுக்கு நுண்உருவாக்கத்தில் ஒவ்வொரு அடுக்குக்கும் இடையில் நிரந்தர ஒட்டுதல் இருப்பதால், புறத்தோல் அடுக்கின் மேற்பரப்பு அமைப்பை ஆய்வு செய்ய மேல் அடுக்கைத் திறப்பது அல்லது அகற்றுவது மிகவும் சவாலானது. உதாரணமாக, ஒரு வருடல் மின்னணு நுண்ணோக்கியை (SEM) பயன்படுத்துவதன் மூலம்.
PDMS-இன் நீர் விலக்கும் தன்மையானது, நீர் விலக்கும் சிறு மூலக்கூறுகளைக் கையாளும் நுண் பாய்மவியல் அடிப்படையிலான ஆய்வுகளில் ஒரு வரம்புக்குட்பட்ட காரணியாக இருந்து வருகிறது, ஏனெனில் PDMS அத்தகைய நீர் விலக்கும் மூலக்கூறுகளைத் தனித்தன்மையின்றி உறிஞ்சிக்கொள்ளும். PDMS-க்கு மாற்றாக மற்ற பாலிமர் பொருட்களைக் கருத்தில் கொள்ளலாம். மாற்றாக, நீர் விலக்கும் மூலக்கூறுகளின் உறிஞ்சுதலைக் குறைக்க, PDMS-இன் மேற்பரப்பு மாற்றியமைத்தலைக் (எ.கா., கொழுப்பு விரும்பும் பொருட்கள் 42 அல்லது பாலி(எத்திலீன் கிளைக்கால்) 43 கொண்டு பூசுதல்) கருத்தில் கொள்ளலாம்.
இறுதியாக, அதிக-செயல்திறன் கொண்ட திரையிடலை வழங்குவது அல்லது "அனைவருக்கும் பொருந்தும்" பயனர்-நட்பு சோதனைத் தளத்தை வழங்குவது ஆகியவற்றின் அடிப்படையில் எங்கள் முறை நன்கு வரையறுக்கப்படவில்லை. தற்போதைய நெறிமுறைக்கு ஒவ்வொரு நுண்கருவிக்கும் ஒரு சிரிஞ்ச் பம்ப் தேவைப்படுகிறது, இது CO2 அடைகாப்பானில் இடத்தை எடுத்துக்கொள்வதோடு, பெரிய அளவிலான சோதனைகளையும் தடுக்கிறது. அடிப்புற ஊடகத்தைத் தொடர்ச்சியாக நிரப்பவும் அகற்றவும் அனுமதிக்கும் புதுமையான வளர்ப்பு வடிவங்களின் (எ.கா., 24-குழி, 96-குழி, அல்லது 384-குழி நுண்துளை செருகிகள்) விரிவாக்கத்தன்மையால் இந்தக் குறைபாட்டை கணிசமாக மேம்படுத்த முடியும்.
சோதனைக் குழாயில் மனித குடல் எபிதீலியத்தின் முப்பரிமாண உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்காக, இரண்டு இணையான நுண்குழாய்களையும் அவற்றுக்கு இடையில் ஒரு மீள் தன்மை கொண்ட நுண்துளை சவ்வையும் கொண்டு, ஒரு உள்ளீட்டு-நுண்குழாய் இடைமுகத்தை உருவாக்கும் நுண்பாய்ம சில்லு குடல் சாதனத்தை நாங்கள் பயன்படுத்தினோம். டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளில் வளர்க்கப்பட்ட முனைவாக்கப்பட்ட எபிதீலியல் அடுக்குகளுக்குக் கீழே தொடர்ச்சியான அடிப்பக்கப் பாய்வை வழங்கும் ஒரு ஒற்றைக் குழாய் நுண்பாய்ம சாதனத்தின் (ஒரு கலப்பின சில்லு) பயன்பாட்டையும் நாங்கள் செய்து காட்டுகிறோம். இந்த இரண்டு தளங்களிலும், அடிப்பக்கப் பகுதியிலிருந்து உருவ உருவாக்க எதிர்ப்பிகளை அகற்றுவதற்காகப் பாய்வின் திசைசார் கையாளுதலைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், பல்வேறு மனித குடல் எபிதீலியல் செல்களின் உருவ உருவாக்கத்தை செய்து காட்ட முடியும். முழுமையான சோதனை செயல்முறை (படம் 1) ஐந்து பகுதிகளைக் கொண்டுள்ளது: (i) குடல் சில்லு அல்லது டிரான்ஸ்வெல் செருகக்கூடிய கலப்பின சில்லுவின் நுண் உருவாக்கம் (படிகள் 1-5; பெட்டி 1), (ii) குடல் எபிதீலியல் செல்கள் (Caco-2 செல்கள்) அல்லது மனித குடல் உறுப்புருவாக்கங்களைத் தயாரித்தல்; (i) குடல் சில்லுகள் அல்லது கலப்பின சில்லுகளில் குடல் எபிதீலியல் செல்களை வளர்த்தல் (படிகள் 6-9), (iv) இன் விட்ரோவில் 3D உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுதல் (படி 10) மற்றும் (v) 3D எபிதீலியல் நுண் கட்டமைப்பைப் பண்புப்படுத்துதல் (படிகள் 11-24). இறுதியாக, இடஞ்சார்ந்த, காலஞ்சார்ந்த, நிபந்தனைக்குட்பட்ட அல்லது செயல்முறை சார்ந்த கட்டுப்பாடுகளுடன் எபிதீலியல் உருவ உருவாக்கத்தை ஒப்பிடுவதன் மூலம் இன் விட்ரோ உருவ உருவாக்கத்தின் செயல்திறனைச் சரிபார்க்க ஒரு பொருத்தமான கட்டுப்பாட்டுக் குழு (கீழே மேலும் விவாதிக்கப்பட்டுள்ளது) வடிவமைக்கப்பட்டது.
நாங்கள் இரண்டு வெவ்வேறு வளர்ப்புத் தளங்களைப் பயன்படுத்தினோம்: நேரான அல்லது நேர்கோட்டில் அமையாத சுருண்ட கால்வாய்களைக் கொண்ட 'கட்-ஆன்-எ-சிப்', அல்லது பெட்டி 1 மற்றும் படி 1 - 5 இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி தயாரிக்கப்பட்ட ஒரு நுண் பாய்ம சாதனத்தில் டிரான்ஸ்வெல் (TW) செருகிகளைக் கொண்ட கலப்பின சில்லுகள். "சாதனத் தயாரிப்பு" என்பது ஒரு தனி சில்லு அல்லது ஒரு கலப்பின சில்லுவை உருவாக்குவதற்கான முக்கிய படிகளைக் காட்டுகிறது. "மனித குடல் எபிதீலியல் செல்களின் வளர்ப்பு" என்பது இந்த நெறிமுறையில் பயன்படுத்தப்படும் செல் மூலம் (Caco-2 அல்லது மனித குடல் ஆர்கனாய்டுகள்) மற்றும் வளர்ப்பு செயல்முறையை விளக்குகிறது. "சோதனைக் குழாய் உருவ உருவாக்கம்" என்பது Caco-2 அல்லது ஆர்கனாய்டிலிருந்து பெறப்பட்ட எபிதீலியல் செல்கள் ஒரு குடல் சில்லுவில் அல்லது ஒரு கலப்பின சில்லுவின் டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளில் வளர்க்கப்பட்டு, அதைத் தொடர்ந்து முப்பரிமாண உருவ உருவாக்கம் தூண்டப்பட்டு, ஒரு பண்புப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் அமைப்பு உருவாக்கப்படும் ஒட்டுமொத்த படிகளைக் காட்டுகிறது. ஒவ்வொரு அம்புக்குறியின் கீழும் நிரல் படி எண் அல்லது பெட்டி எண் காட்டப்பட்டுள்ளது. நிறுவப்பட்ட குடல் எபிதீலியல் அடுக்குகளை, எடுத்துக்காட்டாக, செல் வேறுபாட்டுப் பண்புப்படுத்தல், குடல் உடலியல் ஆய்வுகள், புரவலன்-நுண்ணுயிரி சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளை நிறுவுதல் மற்றும் நோய் மாதிரியாக்கம் ஆகியவற்றில் எவ்வாறு பயன்படுத்தலாம் என்பதற்கான எடுத்துக்காட்டுகளை இந்தச் செயலி வழங்குகிறது. இம்யூனோஃப்ளூரசன்ஸ் படங்கள் குடல் சில்லுவில் உருவாக்கப்பட்ட 3D Caco-2 எபிதீலியல் அடுக்கில் வெளிப்படுத்தப்படும் உட்கருக்கள், F-ஆக்டின் மற்றும் MUC2 ஆகியவற்றைக் காட்டும் "செல் வேறுபாடு". MUC2 சமிக்ஞையானது கோப்லெட் செல்களிலும், சளிச்சவ்வுப் பரப்புகளில் இருந்து சுரக்கப்படும் சளியிலும் காணப்படுகிறது. குடல் உடலியலில் உள்ள ஒளிரும் படங்கள், ஒளிரும் கோதுமை முளை அக்ளுடினினைப் பயன்படுத்தி சியாலிக் அமிலம் மற்றும் N-அசிடைல்குளுக்கோசமைன் எச்சங்களுக்காகச் சாயமேற்றுவதன் மூலம் உற்பத்தி செய்யப்படும் சளியைக் காட்டுகின்றன. "ஓம்புயிர்-நுண்ணுயிர் இணை-வளர்ப்புகள்" பகுதியில் உள்ள, ஒன்றுடன் ஒன்று மேற்பொருந்தும் இரண்டு படங்கள், ஒரு சில்லுவின் மீது குடலில் உள்ள பிரதிநிதித்துவ ஓம்புயிர்-நுண்ணுயிர்த்தொகுதி இணை-வளர்ப்புகளைக் காட்டுகின்றன. இடதுபுறப் பலகம், பச்சை ஒளிரும் புரதத்தை (GFP) வெளிப்படுத்தும் E. coli-யின், நுண்-பொறியியல் செய்யப்பட்ட 3D Caco-2 எபிதீலியல் செல்களுடனான இணை-வளர்ப்பைக் காட்டுகிறது. வலதுபுறப் பலகம், 3D Caco-2 எபிதீலியல் செல்களுடன் இணை-வளர்க்கப்பட்ட GFP E. coli-யின் இருப்பிடத்தைக் காட்டுகிறது, அதைத் தொடர்ந்து F-ஆக்டின் (சிவப்பு) மற்றும் உட்கருக்கள் (நீலம்) கொண்டு இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் சாயமேற்றம் செய்யப்பட்டுள்ளது. நோய் மாதிரியாக்கம், பாக்டீரியல் ஆன்டிஜென்களுடனான உடலியல் சவாலின் கீழ், குடல் அழற்சி சில்லுகளில் ஆரோக்கியமான குடலுக்கும் கசிவுள்ள குடலுக்கும் உள்ள வேறுபாட்டை விளக்குகிறது. (எ.கா., லிப்போபாலிசாக்கரைடு, LPS) மற்றும் நோயெதிர்ப்பு செல்கள் (எ.கா., PBMC; பச்சை). ஒரு முப்பரிமாண எபிதீலியல் அடுக்கை நிறுவுவதற்காக Caco-2 செல்கள் வளர்க்கப்பட்டன. அளவுகோல், 50 µm. கீழ் வரிசையில் உள்ள படங்கள்: “செல்களின் வேறுபாடு” என்பது மேற்கோள் 2. ஆக்ஸ்போர்டு பல்கலைக்கழக அச்சகத்திலிருந்து அனுமதியுடன் தழுவி எடுக்கப்பட்டது; மேற்கோள் 5. NAS-இலிருந்து அனுமதியுடன் மீண்டும் வெளியிடப்பட்டது; “ஓம்புயிர்-நுண்ணுயிர் இணை-வளர்ப்பு” என்பது மேற்கோள் 3. NAS-இலிருந்து அனுமதியுடன் தழுவி எடுக்கப்பட்டது; “நோய் மாதிரியாக்கம்” என்பது மேற்கோள் 5. NAS-இலிருந்து அனுமதியுடன் தழுவி எடுக்கப்பட்டது.
சிலிக்கான் அச்சுகளிலிருந்து மென் அச்சுக்கலை¹,⁴⁴ மூலம் பிரித்தெடுக்கப்பட்டு, SU-8 கொண்டு வடிவமைக்கப்பட்ட PDMS பிரதிகளைப் பயன்படுத்தி, கட்-ஆன்-சிப் மற்றும் கலப்பின சிப்கள் இரண்டும் உருவாக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு சிப்பிலும் உள்ள நுண்குழாய்களின் வடிவமைப்பு, வெட்டு விசை மற்றும் நீரியக்க அழுத்தம்¹,⁴,¹² போன்ற நீரியக்கவியலைக் கருத்தில் கொண்டு தீர்மானிக்கப்படுகிறது. அருகருகே அமைந்த இரண்டு இணையான நேரான நுண்குழாய்களைக் கொண்டிருந்த அசல் கட்-ஆன்-எ-சிப் வடிவமைப்பு (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 1a), வளர்க்கப்பட்ட செல்களில் அதிகரித்த திரவத் தங்கு நேரம், நேரியலற்ற ஓட்ட வடிவங்கள் மற்றும் பன்முக அச்சு உருக்குலைவைத் தூண்டுவதற்காக ஒரு ஜோடி வளைந்த நுண்குழாய்களை உள்ளடக்கிய ஒரு சிக்கலான கட்-ஆன்-எ-சிப்பாக (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 1b) உருமாறியுள்ளது (படம் 2a–f)¹². மேலும் சிக்கலான குடல் உயிரியல் இயக்கவியலை மீண்டும் உருவாக்க வேண்டியிருக்கும் போது, ​​சிக்கலான கட்-ஆன்-எ-சிப்களைத் தேர்ந்தெடுக்கலாம். சிக்கலான கட்-சிப், அதே காலக்கட்டத்தில், அதே அளவிலான எபிதீலியல் வளர்ச்சியுடன், முப்பரிமாண உருவமைப்பை வலுவாகத் தூண்டுகிறது என்பதை நாங்கள் நிரூபித்துள்ளோம். வளர்க்கப்பட்ட செல் வகையைப் பொருட்படுத்தாமல், அசல் குடல்-சிப் பயன்படுத்தப்பட்டது. எனவே, 3D உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்கு, சிப்பில் உள்ள நேரியல் மற்றும் சிக்கலான குடல் வடிவமைப்புகள் ஒன்றுக்கொன்று மாற்றிக்கொள்ளக்கூடியவை. SU-8 வடிவங்களைக் கொண்ட சிலிக்கான் அச்சுகளில் பதப்படுத்தப்பட்ட PDMS பிரதிகள், அச்சிலிருந்து பிரித்தெடுத்த பிறகு எதிர்மறை அம்சங்களை வழங்கின (படம் 2a). ஒரு சிப்பில் குடலை உருவாக்க, தயாரிக்கப்பட்ட மேல் PDMS அடுக்கு, ஒரு நுண்துளை PDMS படலத்துடன் தொடர்ச்சியாகப் பிணைக்கப்பட்டு, பின்னர் ஒரு கொரோனா ட்ரீட்டரைப் பயன்படுத்தி மீளமுடியாத பிணைப்பு மூலம் கீழ் PDMS அடுக்குடன் சீரமைக்கப்பட்டது (படம் 2b–f). கலப்பின சிப்களை உருவாக்க, பதப்படுத்தப்பட்ட PDMS பிரதிகள் கண்ணாடி ஸ்லைடுகளுடன் பிணைக்கப்பட்டு, டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளைப் பொருத்தக்கூடிய ஒற்றை-சேனல் மைக்ரோஃப்ளூயிடிக் சாதனங்கள் உருவாக்கப்பட்டன (படம் 2h மற்றும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 2). PDMS பிரதி மற்றும் கண்ணாடியின் மேற்பரப்புகளை ஆக்ஸிஜன் பிளாஸ்மா அல்லது கொரோனா சிகிச்சை மூலம் பதப்படுத்துவதன் மூலம் பிணைப்பு செயல்முறை செய்யப்படுகிறது. சிலிக்கான் குழாயுடன் இணைக்கப்பட்ட நுண்-உருவாக்கப்பட்ட சாதனத்தை கிருமி நீக்கம் செய்த பிறகு, குடலின் 3D உருவ உருவாக்கத்தைச் செய்ய சாதன அமைப்பு தயாராக இருந்தது. எபிதீலியம் (படம் 2g).
அ, SU-8 வடிவமைப்புள்ள சிலிக்கான் அச்சுகளிலிருந்து PDMS பாகங்களைத் தயாரிப்பதற்கான திட்ட வரைபடம். பதப்படுத்தப்படாத PDMS கரைசல் ஒரு சிலிக்கான் அச்சின் மீது ஊற்றப்பட்டு (இடதுபுறம்), 60 °C வெப்பநிலையில் பதப்படுத்தப்பட்டு (நடுவில்) பின்னர் அச்சிலிருந்து பிரிக்கப்பட்டது (வலதுபுறம்). அச்சிலிருந்து பிரிக்கப்பட்ட PDMS துண்டுகளாக வெட்டப்பட்டு, மேலதிக பயன்பாட்டிற்காக சுத்தம் செய்யப்பட்டது. ஆ, PDMS மேல் அடுக்கைத் தயாரிக்கப் பயன்படுத்தப்பட்ட சிலிக்கான் அச்சின் புகைப்படம். இ, PDMS நுண்துளை சவ்வை உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்பட்ட சிலிக்கான் அச்சின் புகைப்படம். ஈ, மேல் மற்றும் கீழ் PDMS பாகங்கள் மற்றும் ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட ஆன்-சிப் குடல் சாதனத்தின் தொடர் புகைப்படங்கள். உ, மேல், சவ்வு மற்றும் கீழ் PDMS பாகங்களின் சீரமைப்பின் திட்ட வரைபடம். ஒவ்வொரு அடுக்கையும் பிளாஸ்மா அல்லது கொரோனா சிகிச்சை மூலம் மீளமுடியாதபடி பிணைக்கப்பட்டுள்ளது. ஊ, மேல் பதிக்கப்பட்ட சுருண்ட நுண்குழாய்கள் மற்றும் வெற்றிட அறைகளுடன் உருவாக்கப்பட்ட குடல்-ஆன்-சிப் சாதனத்தின் திட்ட வரைபடம். எ, நுண் பாய்ம செல் வளர்ப்பிற்கான குடல்-ஆன்-சிப் அமைப்பு. சிலிக்கான் குழாய் மற்றும் ஊசியுடன் ஒருங்கிணைக்கப்பட்ட, உருவாக்கப்பட்ட குடல்-ஆன்-சிப் வைக்கப்பட்டது. ஒரு மூடிச்சறுக்கின் மீது. சிப் சாதனம் செயலாக்கத்திற்காக 150 மிமீ பெட்ரி தட்டின் மூடியில் வைக்கப்பட்டது. சிலிக்கான் குழாயை மூட பிணைப்பான் பயன்படுத்தப்படுகிறது.h, கலப்பின சிப் உருவாக்கம் மற்றும் கலப்பின சிப்களைப் பயன்படுத்தி 3D உருவமாக்கத்தின் காட்சிப் படங்கள். குடல் எபிதீலியல் செல்களின் 2D ஒற்றை அடுக்குகளை வளர்ப்பதற்காகத் தனித்தனியாகத் தயாரிக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்வெல் செருகிகள், குடல் 3D உருவமாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்காகக் கலப்பின சிப்பில் செருகப்பட்டன. டிரான்ஸ்வெல் செருகியில் நிறுவப்பட்ட செல் அடுக்கின் கீழ் உள்ள நுண்குழாய்கள் வழியாக ஊடகம் பாய்ச்சப்படுகிறது. அளவுகோல், 1 செ.மீ.h மேற்கோள் 4-இலிருந்து அனுமதியுடன் மறுபதிப்பு செய்யப்பட்டது. எல்செவியர்.
இந்த நெறிமுறையில், Caco-2 செல் வரிசை மற்றும் குடல் ஆர்கனாய்டுகள் எபிதீலியல் மூலங்களாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன (படம் 3a). இரு வகை செல்களும் தனித்தனியாக வளர்க்கப்பட்டு (பெட்டி 2 மற்றும் பெட்டி 5), ஆன்-சிப் குடல் அல்லது டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளின் ECM-பூசப்பட்ட நுண்குழாய்களில் விதைக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டன. செல்கள் அடர்த்தியாக வளர்ந்தவுடன் (குடுவைகளில் >95% பரவல்), T-குடுவைகளில் வழக்கமாக வளர்க்கப்படும் Caco-2 செல்கள் (10 முதல் 50 வரையிலான பத்தியங்களுக்கு இடையில்) டிரிப்சினைசேஷன் திரவத்தைப் பயன்படுத்தி பிரிக்கப்பட்ட செல் சஸ்பென்ஷன்களைத் தயாரிக்க அறுவடை செய்யப்படுகின்றன (பெட்டி 2). குடல் பயாப்ஸிகள் அல்லது அறுவை சிகிச்சை நீக்கங்களிலிருந்து பெறப்பட்ட மனித குடல் ஆர்கனாய்டுகள், கட்டமைப்பு நுண்சூழலை ஆதரிப்பதற்காக 24-குழித் தட்டுகளில் உள்ள மேட்ரிஜெல் சாரக்கட்டு குவிமாடங்களில் வளர்க்கப்பட்டன. ஆர்கனாய்டுகள் ~500 µm விட்டம் வரை வளரும் வரை, பெட்டி 3-இல் விவரிக்கப்பட்டபடி தயாரிக்கப்பட்ட அத்தியாவசிய மார்போஜென்கள் (Wnt, R-ஸ்பான்டின் மற்றும் நாக்ஜின் போன்றவை) மற்றும் வளர்ச்சி காரணிகளைக் கொண்ட ஊடகம் ஒரு நாள் விட்டு ஒரு நாள் சேர்க்கப்பட்டது. முழுமையாக வளர்ந்த ஆர்கனாய்டுகள் ஒரு சிப்பில் உள்ள குடல் அல்லது டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளில் விதைப்பதற்காக, இவை அறுவடை செய்யப்பட்டு ஒற்றை செல்களாகப் பிரிக்கப்படுகின்றன (பெட்டி 5). நாங்கள் முன்பு தெரிவித்தபடி, இதை நோய் வகை¹²,¹³ (எ.கா. அல்சரேட்டிவ் கோலைடிஸ், க்ரோன் நோய், பெருங்குடல் புற்றுநோய், அல்லது சாதாரண கொடையாளர்), புண் உள்ள இடம் (எ.கா., புண் உள்ள பகுதி மற்றும் புண் இல்லாத பகுதி) மற்றும் குடல் பாதையில் உள்ள இரைப்பை-குடல் பகுதி (எ.கா., முன்சிறுகுடல், நடுச்சிறுகுடல், பின்சிறுகுடல், குடல்வால், பெருங்குடல், அல்லது மலக்குடல்) ஆகியவற்றின் அடிப்படையில் வேறுபடுத்தி அறியலாம். சிறுகுடல் ஆர்கனாய்டுகளை விட பொதுவாக அதிக செறிவுள்ள மார்போஜென்கள் தேவைப்படும் பெருங்குடல் ஆர்கனாய்டுகளை (கொலாய்டுகள்) வளர்ப்பதற்கான ஒரு மேம்படுத்தப்பட்ட நெறிமுறையை பெட்டி 5-இல் நாங்கள் வழங்குகிறோம்.
அ, குடல் சில்லுவில் குடல் உருவமைப்பைத் தூண்டுவதற்கான பணிப்பாய்வு. முப்பரிமாண உருவமைப்பை நிரூபிக்க, இந்த நெறிமுறையில் Caco-2 மனித குடல் புறத்தோல் மற்றும் குடல் ஆர்கனாய்டுகள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. தனிமைப்படுத்தப்பட்ட புறத்தோல் செல்கள், தயாரிக்கப்பட்ட 'குடல்-மீது-ஒரு-சில்லு' சாதனத்தில் (சில்லு தயாரிப்பு) விதைக்கப்பட்டன. செல்கள் விதைக்கப்பட்டு (விதைக்கப்பட்டது) மற்றும் நாள் 0 (D0) அன்று PDMS நுண்துளை சவ்வில் இணைக்கப்பட்டவுடன் (இணைக்கப்பட்டது), நுனி (AP) ஓட்டம் தொடங்கப்பட்டு முதல் 2 நாட்களுக்குப் பராமரிக்கப்படுகிறது (ஓட்டம், AP, D0-D2). ஒரு முழுமையான 2D ஒற்றை அடுக்கு உருவாகும்போது, ​​சுழற்சி நீட்சி இயக்கங்களுடன் (நீட்சி, ஓட்டம், AP மற்றும் BL) சேர்ந்து அடிப்பக்க (BL) ஓட்டமும் தொடங்கப்படுகிறது. நுண் பாய்ம வளர்ப்பின் 5 நாட்களுக்குப் பிறகு குடல் முப்பரிமாண உருவமைப்பு தன்னிச்சையாக நிகழ்ந்தது (உருவமைப்பு, D5). கட்ட வேறுபாட்டுப் படங்கள் ஒவ்வொரு சோதனைப் படியிலும் அல்லது நேரப் புள்ளியிலும் Caco-2 செல்களின் பிரதிநிதித்துவ உருவமைப்பைக் காட்டுகின்றன (பட்டை வரைபடம், 100 µm). தொடர்புடையவற்றை விளக்கும் நான்கு திட்ட வரைபடங்கள். குடல் உருவ உருவாக்கத்தின் தொடர் நிகழ்வுகள் (மேல் வலது). திட்ட வரைபடத்தில் உள்ள புள்ளியிட்ட அம்புகள் திரவ ஓட்டத்தின் திசையைக் குறிக்கின்றன.b, உருவாக்கப்பட்ட 3D Caco-2 எபிதீலியத்தின் மேற்பரப்பு அமைப்பைக் காட்டும் SEM படம் (இடது). பெரிதாக்கப்பட்ட பகுதியை (வெள்ளை புள்ளியிட்ட பெட்டி) எடுத்துக்காட்டும் உட்செருகல், 3D Caco-2 அடுக்கில் மீளுருவாக்கம் செய்யப்பட்ட மைக்ரோவில்லிகளைக் காட்டுகிறது (வலது).c, உருவாக்கப்பட்ட Caco-2 3D-யின் கிடைமட்ட முன்பக்கத் தோற்றம், கிளாடின் (ZO-1, சிவப்பு) மற்றும் F-ஆக்டின் (பச்சை) மற்றும் உட்கருக்கள் (நீலம்) எனக் குறியிடப்பட்ட தொடர்ச்சியான பிரஷ் பார்டர் சவ்வுகள். குடல் சில்லுகளில் உள்ள எபிதீலியல் செல்களின் இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் கான்ஃபோகல் காட்சிப்படுத்தல். நடு திட்ட வரைபடத்தைச் சுட்டிக்காட்டும் அம்புகள் ஒவ்வொரு கான்ஃபோகல் காட்சிக்கும் குவியத் தளத்தின் இருப்பிடத்தைக் குறிக்கின்றன.d, ஒரு சில்லுவில் வளர்க்கப்பட்ட ஆர்கனாய்டுகளில் ஏற்படும் உருவ மாற்றங்களின் காலப்போக்கு, 3, 7, 9, 11, மற்றும் 13 ஆம் நாட்களில் ஃபேஸ் கான்ட்ராஸ்ட் மைக்ரோஸ்கோபி மூலம் பெறப்பட்டது. உட்செருகல் (மேல் வலது) வழங்கப்பட்ட படத்தின் அதிக உருப்பெருக்கத்தைக் காட்டுகிறது.e, 7-ஆம் நாளில் எடுக்கப்பட்ட துண்டில் குடலில் நிறுவப்பட்ட ஆர்கனாய்டு 3D எபிதீலியத்தின் DIC ஒளிநுண்படம்.f, முறையே 3 நாட்களுக்கு குடல் சில்லுகளில் வளர்க்கப்பட்ட தண்டு செல்கள் (LGR5; மெஜந்தா), கோப்லெட் செல்கள் (MUC2; பச்சை), F-ஆக்டின் (சாம்பல்) மற்றும் உட்கருக்கள் (சயான்) ஆகியவற்றிற்கான குறிப்பான்களைக் காட்டும் மேலிடப்பட்ட இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் படங்கள் (இடது) மற்றும் எபிதீலியல் அடுக்கில் 13-நாள் (நடுவில்) ஆர்கனாய்டுகள். MUC2 சமிக்ஞை இல்லாமல் LGR5 சமிக்ஞையை எடுத்துக்காட்டும் விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 3-ஐயும் பார்க்கவும். வளர்ப்பின் 13-ஆம் நாளில், செல்மாஸ்க் சாயத்தைக் கொண்டு பிளாஸ்மா சவ்விற்கு சாயமேற்றுவதன் மூலம் (வலது) ஒரு சில்லில் குடலில் நிறுவப்பட்ட 3D ஆர்கனாய்டு எபிதீலியத்தின் எபிதீலியல் நுண்கட்டமைப்பைக் (வலது) காட்டும் ஃப்ளோரசன்ஸ் படங்கள். வேறுவிதமாகக் குறிப்பிடப்படாவிட்டால், அளவுகோல் பட்டை 50 μm ஆகும்.b மேற்கோள்.2. ஆக்ஸ்போர்டு பல்கலைக்கழக அச்சகத்திலிருந்து அனுமதியுடன் மறுபதிப்பு செய்யப்பட்டது; c மேற்கோள்.2. ஆக்ஸ்போர்டு பல்கலைக்கழக அச்சகத்திலிருந்து அனுமதியுடன் தழுவி எடுக்கப்பட்டது; e மற்றும் f ஆகியவை மேற்கோள் மூலம் அனுமதியுடன் தழுவி எடுக்கப்பட்டுள்ளன.¹² கிரியேட்டிவ் காமன்ஸ் உரிமம் CC BY 4.0 இன் கீழ்.
'கட் ஆன் எ சிப்' (gut on a chip) அமைப்பில், வெற்றிகரமான ECM பூச்சுக்காக PDMS நுண்துளை சவ்வின் நீர் விலக்கும் மேற்பரப்பை மாற்றுவது அவசியமாகிறது. இந்த நெறிமுறையில், PDMS சவ்வுகளின் நீர் விலக்கும் தன்மையை மாற்றுவதற்கு நாங்கள் இரண்டு வெவ்வேறு முறைகளைப் பயன்படுத்துகிறோம். Caco-2 செல்களை வளர்ப்பதற்கு, புற ஊதா/ஓசோன் சிகிச்சை மூலம் மேற்பரப்பைச் செயல்படுத்துவது மட்டுமே PDMS மேற்பரப்பின் நீர் விலக்கும் தன்மையைக் குறைக்கவும், ECM-ஐப் பூசவும், மற்றும் Caco-2 செல்களை PDMS சவ்வில் இணைக்கவும் போதுமானதாக இருந்தது. இருப்பினும், ஆர்கனாய்டு எபிதீலியத்தின் நுண்பாய்ம வளர்ப்பிற்கு, பாலிஎதிலீன்இமைன் (PEI) மற்றும் குளுடரால்டிஹைடு ஆகியவற்றை PDMS நுண்குழாய்களில் தொடர்ச்சியாகப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் ECM புரதங்களின் திறமையான படிதலை அடைய, வேதியியல் அடிப்படையிலான மேற்பரப்பு செயல்பாட்டுமயமாக்கல் தேவைப்படுகிறது. மேற்பரப்பு மாற்றத்திற்குப் பிறகு, செயல்பாட்டுமயமாக்கப்பட்ட PDMS மேற்பரப்பை மூடுவதற்கு ECM புரதங்கள் படியவைக்கப்பட்டு, பின்னர் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட ஆர்கனாய்டு எபிதீலியத்திற்குள் செலுத்தப்பட்டன. செல்கள் இணைக்கப்பட்ட பிறகு, செல்கள் ஒரு முழுமையான ஒற்றை அடுக்கை உருவாக்கும் வரை மேல் நுண்குழாயில் ஊடகத்தை மட்டும் செலுத்துவதன் மூலம் நுண்பாய்ம செல் வளர்ப்பு தொடங்குகிறது, அதே நேரத்தில் கீழ் நுண்குழாய் நிலையான நிலைமைகளைப் பராமரிக்கிறது. மேற்பரப்பு செயல்பாட்டுமயமாக்கல் மற்றும் ECM பூச்சுக்கான இந்த மேம்படுத்தப்பட்ட முறை, ஆர்கனாய்டு இணைப்பைச் சாத்தியமாக்குகிறது. PDMS மேற்பரப்பில் முப்பரிமாண உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்கு எபிதீலியம்.
டிரான்ஸ்வெல் வளர்ப்புகளுக்கும் செல் விதைப்புக்கு முன்னர் ECM பூச்சு தேவைப்படுகிறது; இருப்பினும், நுண்துளை செருகிகளின் மேற்பரப்பைச் செயல்படுத்த, டிரான்ஸ்வெல் வளர்ப்புகளுக்கு சிக்கலான முன்சிகிச்சை படிகள் தேவையில்லை. டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளில் Caco-2 செல்களை வளர்ப்பதற்கு, நுண்துளை செருகிகளில் உள்ள ECM பூச்சு, பிரிக்கப்பட்ட Caco-2 செல்களின் இணைப்பையும் (<1 மணிநேரம்) மற்றும் இறுக்கமான சந்தித் தடை உருவாக்கத்தையும் (<1-2 நாட்கள்) துரிதப்படுத்துகிறது. டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளில் ஆர்கனாய்டுகளை வளர்க்க, தனிமைப்படுத்தப்பட்ட ஆர்கனாய்டுகள் ECM பூசப்பட்ட செருகிகளில் விதைக்கப்பட்டு, சவ்வு மேற்பரப்பில் இணைக்கப்பட்டு (<3 மணிநேரம்), தடை ஒருமைப்பாட்டுடன் ஆர்கனாய்டுகள் ஒரு முழுமையான ஒற்றை அடுக்கை உருவாக்கும் வரை பராமரிக்கப்படுகின்றன. டிரான்ஸ்வெல் வளர்ப்புகள், ஹைப்ரிட் சில்லுகளின் பயன்பாடு இல்லாமல் 24-குழித் தட்டுகளில் செய்யப்படுகின்றன.
ஏற்கனவே உருவாக்கப்பட்ட எபிதீலியல் அடுக்கின் அடிப்பக்கத்திற்கு திரவ ஓட்டத்தைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், செயற்கை முறையில் முப்பரிமாண உருவ உருவாக்கத்தைத் தொடங்கலாம். 'கட் ஆன் எ சிப்'-இல், மேல் மற்றும் கீழ் நுண்குழாய்களுக்குள் ஊடகம் செலுத்தப்பட்டபோது எபிதீலியல் உருவ உருவாக்கம் தொடங்கியது (படம் 3a). முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி, திசைசார்ந்து சுரக்கப்படும் உருவ உருவாக்கத் தடுப்பான்களைத் தொடர்ச்சியாக அகற்றுவதற்கு, கீழ் (அடிப்பக்க) பகுதியில் திரவ ஓட்டத்தை அறிமுகப்படுத்துவது மிகவும் முக்கியமானது. நுண்துளை சவ்வுகளில் பிணைக்கப்பட்ட செல்களுக்குப் போதுமான ஊட்டச்சத்துக்களையும் சீரத்தையும் வழங்கவும், குடல் உட்புறத்தில் வெட்டு அழுத்தத்தை உருவாக்கவும், நாங்கள் பொதுவாக 'கட் ஆன் எ சிப்'-இல் இரட்டை ஓட்டத்தைப் பயன்படுத்துகிறோம். கலப்பின சிப்களில், எபிதீலியல் ஒற்றை அடுக்குகளைக் கொண்ட டிரான்ஸ்வெல் செருகிகள் கலப்பின சிப்களில் செருகப்பட்டன. பின்னர், நுண்துளை டிரான்ஸ்வெல் செருகியின் அடிப்பக்கத்திற்குக் கீழே உள்ள நுண்குழாய் வழியாக ஊடகம் செலுத்தப்பட்டது. இரண்டு வளர்ப்புத் தளங்களிலும் அடிப்பக்க ஓட்டம் தொடங்கப்பட்ட 3-5 நாட்களுக்குப் பிறகு குடல் உருவ உருவாக்கம் நிகழ்ந்தது.
கட்ட வேறுபாட்டு நுண்ணோக்கி, வேறுபாட்டு குறுக்கீட்டு வேறுபாட்டு (DIC) நுண்ணோக்கி, SEM, அல்லது நோயெதிர்ப்பு ஒளிர்தல் குவிய நுண்ணோக்கி (படம் 3 மற்றும் 4) உள்ளிட்ட பல்வேறு படமாக்கல் முறைகளைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம், நுண்பொறியியல் செய்யப்பட்ட 3D எபிதீலியல் அடுக்குகளின் உருவவியல் அம்சங்களைப் பகுப்பாய்வு செய்யலாம். 3D எபிதீலியல் அடுக்குகளின் வடிவம் மற்றும் நீட்சியைக் கண்காணிக்க, வளர்ப்பின் போது எந்த நேரத்திலும் கட்ட வேறுபாட்டு அல்லது DIC படமாக்கலை எளிதாகச் செய்ய முடியும். PDMS மற்றும் பாலியஸ்டர் படங்களின் ஒளி ஊடுருவும் தன்மையால், 'கட்-ஆன்-எ-சிப்' மற்றும் 'ஹைப்ரிட் சிப்' ஆகிய இரண்டு தளங்களும், சாதனத்தைப் பிரிக்கவோ அல்லது பிரித்தெடுக்கவோ தேவையின்றி, நிகழ்நேர இடத்திலேயே படமாக்கலை வழங்க முடியும். நோயெதிர்ப்பு ஒளிர்தல் படமாக்கலைச் செய்யும்போது (படம் 1, 3c, f மற்றும் 4b, c), செல்கள் பொதுவாக 4% (எடை/கன அளவு) பாராஃபார்மால்டிஹைடு (PFA) கொண்டு நிலைநிறுத்தப்படுகின்றன, அதைத் தொடர்ந்து டிரைட்டான் X-100 மற்றும் 2% (எடை/கன அளவு) போவின் சீரம் அல்புமின் (BSA) கொண்டு வரிசையாக நிலைநிறுத்தப்படுகின்றன. செல் வகையைப் பொறுத்து, வெவ்வேறு நிலைநிறுத்திகள், ஊடுருவச் செய்பவைகள் மற்றும் தடுப்பிகள் பயன்படுத்தப்படலாம். பயன்படுத்தப்பட்டது. சிப்பில் உள்ள இடத்திலேயே அசையாமல் நிலைநிறுத்தப்பட்ட செல்களை முன்னிலைப்படுத்த, வம்சாவளியைச் சார்ந்த செல் அல்லது பகுதி குறிப்பான்களை இலக்காகக் கொண்ட முதன்மை ஆன்டிபாடிகள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. அதனைத் தொடர்ந்து, உட்கருவை (எ.கா., 4′,6-டயமிடினோ-2-ஃபினைலீன்) இண்டோல், DAPI) அல்லது F-ஆக்டினை (எ.கா., ஒளிரும் தன்மையுடன் குறியிடப்பட்ட ஃபாலாய்டின்) இலக்காகக் கொண்ட ஒரு எதிர்சாயச் சாயத்துடன் இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகளும் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. சளி உற்பத்தியைக் (படம் 1, “செல் வேறுபாடு” மற்றும் “குடல் உடலியல்”), நுண்ணுயிர் செல்களின் சீரற்ற குடியேற்றத்தைக் (படம் 1, “ஓம்புயிர்-நுண்ணுயிர் இணை வளர்ப்பு”), நோயெதிர்ப்பு செல்களின் சேர்க்கையைக் (படம் 1, 'நோய் மாதிரியாக்கம்') அல்லது 3D எபிதீலியல் உருவவியலின் விளிம்புகளைக் (படம் 3c,f மற்றும் 4b,c) கண்டறிய, ஒளிர்தல் அடிப்படையிலான நேரடிப் படமெடுத்தலையும் அந்த இடத்திலேயே செய்ய முடியும். மேற்கோளில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, மேல் அடுக்கை கீழ் நுண்குழாய் அடுக்கிலிருந்து பிரிப்பதற்காக சிப்பில் உள்ள குடலை மாற்றியமைக்கும்போது, ​​படம் 2-இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, 3D எபிதீலியல் உருவவியல் மற்றும் நுண்குழிகள்... நுனி தூரிகை விளிம்பை SEM மூலம் காட்சிப்படுத்தலாம் (படம் 3b). வேறுபடுத்தும் குறிப்பான்களின் வெளிப்பாட்டை அளவுசார் PCR5 அல்லது ஒற்றை-செல் RNA வரிசைப்படுத்தலைச் செய்வதன் மூலம் மதிப்பிடலாம். இந்த நிலையில், குடல் சில்லுகள் அல்லது கலப்பின சில்லுகளில் வளர்க்கப்பட்ட எபிதீலியல் செல்களின் 3D அடுக்குகள் டிரிப்சினைசேஷன் மூலம் அறுவடை செய்யப்பட்டு, பின்னர் மூலக்கூறு அல்லது மரபணு பகுப்பாய்விற்காகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.
அ, ஒரு கலப்பின சில்லுவில் குடல் உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்கான பணிப்பாய்வு. ஒரு கலப்பின சில்லு தளத்தில் முப்பரிமாண உருவ உருவாக்கத்தை நிரூபிக்க, இந்த நெறிமுறையில் Caco-2 மற்றும் குடல் ஆர்கனாய்டுகள் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. பிரித்தெடுக்கப்பட்ட எபிதீலியல் செல்கள், தயாரிக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளில் (TW prep; கீழே உள்ள படத்தைப் பார்க்கவும்) விதைக்கப்பட்டன. செல்கள் விதைக்கப்பட்டு (seeded) டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளில் உள்ள பாலியஸ்டர் சவ்வுகளில் இணைக்கப்பட்டவுடன், அனைத்து செல்களும் நிலையான நிலைமைகளின் கீழ் (TW culture) வளர்க்கப்பட்டன. 7 நாட்களுக்குப் பிறகு, எபிதீலியல் செல்களின் 2D ஒற்றை அடுக்கைக் கொண்ட ஒரு டிரான்ஸ்வெல் செருகி, ஒரு அடித்தளப் பக்க ஓட்டத்தை (Flow, BL) அறிமுகப்படுத்த ஒரு கலப்பின சில்லுவில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டது, இது இறுதியில் ஒரு 3D எபிதீலியல் அடுக்கின் (உருவ உருவாக்கம்) உருவாக்கத்திற்கு வழிவகுத்தது. ஒவ்வொரு சோதனைப் படியிலும் அல்லது நேரப் புள்ளியிலும், சாதாரண கொடையாளரிடமிருந்து (C103 வரிசை) பெறப்பட்ட ஏறும் பெருங்குடலின் மனித உறுப்பு எபிதீலியல் செல்களின் உருவவியல் அம்சங்களைக் காட்டும் கட்ட வேறுபாட்டு நுண்ணோக்கிப் படங்கள். மேல் அடுக்குகளில் உள்ள திட்ட வரைபடங்கள் ஒவ்வொரு படிக்குமான சோதனை உள்ளமைப்பை விளக்குகின்றன. ஆ, கலப்பின சில்லுகள் (இடது திட்ட வரைபடம்) மேல்-கீழ் கான்ஃபோகல் மூலம் ஆர்கனாய்டு எபிதீலியல் செல்களின் முப்பரிமாண உருவ உருவாக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும். வெவ்வேறு Z நிலைகளில் (மேல், நடு, மற்றும் கீழ்; வலதுபுற வரைபடம் மற்றும் அதனுடன் தொடர்புடைய புள்ளியிடப்பட்ட கோடுகளைப் பார்க்கவும்) எடுக்கப்பட்ட நுண்ணோக்கிக் காட்சிகள் தெளிவான உருவவியல் பண்புகளைக் காட்டின. F-ஆக்டின் (சியான்), உட்கரு (சாம்பல்). c, நிலையான டிரான்ஸ்வெல்லில் (TW; வெள்ளைக் கோடு போட்ட பெட்டிக்குள் செருகப்பட்டுள்ளது) வளர்க்கப்பட்ட ஆர்கனாய்டு-வழித்தோன்றல் எபிதீலியல் செல்களின் 2D மற்றும் 3D உருவவியலை ஒப்பிடும் ஃப்ளோரசன்ஸ் கான்ஃபோகல் மைக்ரோகிராஃப்கள் (3D கோணக் காட்சி) மற்றும் ஹைப்ரிட் சிப்பின் (மிகப்பெரிய முழுப் படம்). ஒரு ஜோடி 2D செங்குத்து குறுக்குவெட்டுக் காட்சிகளும் (மேல் வலது மூலையில் செருகப்பட்டுள்ளது; “XZ”) 2D மற்றும் 3D அம்சங்களைக் காட்டுகின்றன. அளவுகோல், 100 µm. c மேற்கோள் 4-இலிருந்து அனுமதியுடன் மறுபதிப்பு செய்யப்பட்டது. எல்செவியர்.
வழக்கமான நிலையான வளர்ப்புச் சூழல்களில், அதே செல்களை (Caco-2 அல்லது குடல் ஆர்கனாய்டு எபிதீலியல் செல்கள்) இரு பரிமாண ஒற்றை அடுக்குகளாக வளர்ப்பதன் மூலம் கட்டுப்பாட்டு மாதிரிகளைத் தயாரிக்கலாம். குறிப்பாக, நுண்குழாய்களின் வரையறுக்கப்பட்ட கொள்ளளவுத் திறனின் காரணமாக (அதாவது, அசல் குடல்-சிப் வடிவமைப்பில் உள்ள மேல் குழாயில் ~4 µL) ஊட்டச்சத்துக் குறைபாடு ஏற்படலாம். எனவே, அடிப்பக்க ஓட்டத்தைப் பயன்படுத்துவதற்கு முன்னும் பின்னும் உள்ள எபிதீலியல் உருவமைப்பையும் ஒப்பிடலாம்.
மென் அச்சுக்கலை செயல்முறை ஒரு தூய்மையான அறையில் செய்யப்பட வேண்டும். சிப்பில் உள்ள ஒவ்வொரு அடுக்குக்கும் (மேல் மற்றும் கீழ் அடுக்குகள் மற்றும் சவ்வுகள்) மற்றும் கலப்பின சிப்புகளுக்கும், நுண்குழாய்களின் உயரங்கள் வேறுபட்டிருந்ததால், வெவ்வேறு ஒளிமுகமூடிகள் தனித்தனி சிலிக்கான் தகடுகளில் பயன்படுத்தப்பட்டு உருவாக்கப்பட்டன. சிப்பில் உள்ள மேல் மற்றும் கீழ் நுண்குழாய்களின் இலக்கு உயரங்கள் முறையே 500 µm மற்றும் 200 µm ஆகும். கலப்பின சிப்பின் குழாய் இலக்கு உயரம் 200 µm ஆகும்.
3 அங்குல சிலிக்கான் தகட்டை அசிட்டோன் உள்ள ஒரு பாத்திரத்தில் வைக்கவும். தட்டை 30 விநாடிகளுக்கு மெதுவாகச் சுழற்றி, பின்னர் தகட்டை காற்றில் உலர விடவும். தகட்டை IPA உள்ள ஒரு தட்டிற்கு மாற்றி, பின்னர் சுத்தம் செய்வதற்காக தட்டை 30 விநாடிகளுக்குச் சுழற்றவும்.
சிலிக்கான் வேஃபர் மேற்பரப்பில் இருந்து கரிம எச்சங்களை அதிகபட்சமாக அகற்றுவதற்கு, பிரன்ஹா கரைசலை (ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு மற்றும் அடர் கந்தக அமிலம், 1:3 (கன அளவு/கன அளவு) விகிதத்தில் கலந்த கலவை) விருப்பப்படி பயன்படுத்தலாம்.
பிரன்ஹா கரைசல் அதிக அரிக்கும் தன்மை கொண்டது மற்றும் வெப்பத்தை உருவாக்குகிறது. கூடுதல் பாதுகாப்பு முன்னெச்சரிக்கைகள் அவசியம். கழிவை அப்புறப்படுத்த, கரைசலைக் குளிர வைத்து, சுத்தமான, உலர்ந்த கழிவுக் கொள்கலனுக்கு மாற்றவும். இரண்டாம் நிலை கொள்கலன்களைப் பயன்படுத்தவும் மற்றும் கழிவுக் கொள்கலன்களில் முறையாக அடையாளமிடவும். மேலும் விரிவான நடைமுறைகளுக்கு, இந்த இடத்தின் பாதுகாப்பு வழிகாட்டுதல்களைப் பின்பற்றவும்.
வேஃபர்களை 200 °C வெப்பத் தட்டில் 10 நிமிடங்களுக்கு வைத்து நீர் நீக்கம் செய்யவும். நீர் நீக்கத்திற்குப் பிறகு, வேஃபரைக் குளிர்விப்பதற்காகக் காற்றில் ஐந்து முறை குலுக்கப்பட்டது.
சுத்தம் செய்யப்பட்ட சிலிக்கான் வேஃபரின் மையத்தில் சுமார் 10 கிராம் SU-8 2100 போட்டோரெசிஸ்ட்டை ஊற்றவும். சாமணத்தைப் பயன்படுத்தி போட்டோரெசிஸ்ட்டை வேஃபரில் சீராகப் பரப்பவும். போட்டோரெசிஸ்ட்டின் பிசுபிசுப்பைக் குறைத்து, பரப்புவதை எளிதாக்குவதற்காக, அவ்வப்போது வேஃபரை 65°C வெப்பத் தட்டின் மீது வைக்கவும். வேஃபரை நேரடியாக வெப்பத் தட்டின் மீது வைக்க வேண்டாம்.
ஸ்பின் கோட்டிங் செய்வதன் மூலம் SU-8 வேஃபரில் சீராகப் பரப்பப்பட்டது. உள்வரும் SU-8 சுழற்சியை 5–10 வினாடிகளுக்கு, 100 rpm/s முடுக்கத்தில் 500 rpm வேகத்தில் பரவுமாறு நிரல்படுத்தவும். 200 µm தடிமன் பேட்டர்னிங்கிற்காக பிரதான சுழற்சியை 1,500 rpm வேகத்தில் அமைக்கவும், அல்லது 250 µm தடிமனை அடைய (சிப்பின் உட்பகுதியின் மேல் அடுக்குக்கு 500 µm உயரத்தை உருவாக்குதல்; கீழே உள்ள “முக்கிய படிகள்” பகுதியைப் பார்க்கவும்) 300 rpm/s முடுக்கத்தில் 1,200 rpm வேகத்தில் 30 வினாடிகளுக்கு அமைக்கவும்.
சிலிக்கான் தகட்டின் மீதான SU-8 வடிவத்தின் இலக்குத் தடிமனுக்கு ஏற்ப, பிரதான சுழற்சி வேகத்தைச் சரிசெய்ய முடியும்.
சிப்பின் உட்பகுதியின் மேல் அடுக்கிற்காக 500 µm உயரமுள்ள SU-8 வடிவங்களை உருவாக்குவதற்கு, இந்தப் பெட்டியின் சுழல் பூச்சு மற்றும் மென் பேக்கிங் படிகள் (படிகள் 7 மற்றும் 8) தொடர்ச்சியாக மீண்டும் செய்யப்பட்டன (படி 9-ஐப் பார்க்கவும்). இதன் மூலம் 250 µm தடிமன் கொண்ட இரண்டு SU-8 அடுக்குகள் உருவாக்கப்பட்டன. இந்தப் பெட்டியின் படி 12-இல், இந்த அடுக்குகளை UV கதிர்வீச்சுக்கு உட்படுத்தி அடுக்கி இணைப்பதன் மூலம் 500 µm உயரமுள்ள ஒரு அடுக்கு உருவாக்கப்படுகிறது.
SU-8 பூசப்பட்ட வேஃபர்களை, 65 °C வெப்பநிலையில் உள்ள சூடேற்றும் தட்டில் கவனமாக வைத்து 5 நிமிடங்களுக்கு மென்மையாக வேகவைக்கவும். பின்னர், வெப்பநிலையை 95 °C-க்கு மாற்றி, மேலும் 40 நிமிடங்களுக்கு அடைகாக்கவும்.
மேல் நுண்குழாயில் SU-8 வடிவத்தின் உயரத்தை 500 μm ஆக அடைவதற்கு, 250 μm தடிமன் கொண்ட இரண்டு SU-8 அடுக்குகளை உருவாக்க, படிகள் 7 மற்றும் 8-ஐ மீண்டும் செய்யவும்.
UV மாஸ்க் அலைனரைப் பயன்படுத்தி, வேஃபரின் வெளிப்பாட்டு நேரத்தைக் கணக்கிட, உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி ஒரு விளக்குச் சோதனையைச் செய்யவும். (வெளிப்பாட்டு நேரம், ms) = (வெளிப்பாட்டு அளவு, mJ/cm²)/(விளக்குத் திறன், mW/cm²).
வெளிப்பாட்டு நேரத்தை நிர்ணயித்த பிறகு, UV மாஸ்க் அலைனரின் மாஸ்க் ஹோல்டரில் போட்டோமாஸ்க்கை வைத்து, SU-8 பூசப்பட்ட வேஃபரின் மீது போட்டோமாஸ்க்கை வைக்கவும்.
புற ஊதாக் கதிர் சிதறலைக் குறைப்பதற்காக, ஃபோட்டோமாஸ்க்கின் அச்சிடப்பட்ட மேற்பரப்பை, சிலிக்கான் தகட்டின் SU-8 பூசப்பட்ட பக்கத்தின் மீது நேரடியாக வைக்கவும்.
SU-8 பூசப்பட்ட வேஃபர் மற்றும் ஃபோட்டோமாஸ்க்கை, முன்னரே தீர்மானிக்கப்பட்ட வெளிப்பாட்டு நேரத்திற்கு (இந்தப் பெட்டியின் படி 10-ஐப் பார்க்கவும்) 260 mJ/cm2 புற ஊதா ஒளிக்குச் செங்குத்தாக வெளிப்படுத்தவும்.
புற ஊதாக் கதிர்களுக்கு உட்படுத்தப்பட்ட பிறகு, 200 μm உயரமுள்ள வடிவங்களை உருவாக்குவதற்காக, SU-8 பூசப்பட்ட சிலிக்கான் தகடுகள் ஒவ்வொரு சூடேற்றும் தட்டிலும் 65°C வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கும், 95°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கும் சுடப்பட்டன. 500 μm உயரமுள்ள வடிவங்களை உருவாக்குவதற்கு, 95°C வெப்பநிலையில் சுடும் நேரத்தை 30 நிமிடங்களாக நீட்டிக்கவும்.
டெவலப்பர் ஒரு கண்ணாடிக் கிண்ணத்தில் ஊற்றப்பட்டு, சுடப்பட்ட வேஃபர் அந்தக் கிண்ணத்தில் வைக்கப்படுகிறது. கண்ணாடிக் தட்டின் அளவைப் பொறுத்து SU-8 டெவலப்பரின் அளவு மாறுபடலாம். வெளிப்படாத SU-8-ஐ முழுமையாக அகற்ற, போதுமான அளவு SU-8 டெவலப்பரைப் பயன்படுத்துவதை உறுதிசெய்யவும். உதாரணமாக, 1 லிட்டர் கொள்ளளவு கொண்ட 150 மிமீ விட்டம் உள்ள கண்ணாடிக் கிண்ணத்தைப் பயன்படுத்தும்போது, ​​சுமார் 300 மிலி SU-8 டெவலப்பரைப் பயன்படுத்தவும். அவ்வப்போது மெதுவாகச் சுழற்றியவாறு, அச்சை 25 நிமிடங்களுக்கு டெவலப் செய்யவும்.
உருவாக்கப்பட்ட அச்சின் மீது சுமார் 10 மிலி புதிய டெவலப்பரைக் கொண்டு அலசுங்கள், அதனைத் தொடர்ந்து ஒரு பிப்பெட்டைப் பயன்படுத்தி IPA கரைசலைத் தெளிக்கவும்.
வேஃபரை ஒரு பிளாஸ்மா கிளீனரில் வைத்து, 1.5 நிமிடங்களுக்கு ஆக்சிஜன் பிளாஸ்மாவிற்கு (வளிமண்டல வாயு, இலக்கு அழுத்தம் 1 × 10−5 Torr, திறன் 125 W) வெளிப்படுத்தவும்.
ஒரு கண்ணாடி ஸ்லைடு உள்ளே இருக்கும் நிலையில், வேஃபரை வெற்றிட உலர்த்தியில் வைக்கவும். வேஃபர்களையும் ஸ்லைடுகளையும் அருகருகே வைக்கலாம். வெற்றிட உலர்த்தி ஒரு தட்டினால் பல அடுக்குகளாகப் பிரிக்கப்பட்டிருந்தால், ஸ்லைடுகளைக் கீழ் அறையிலும், வேஃபர்களை மேல் அறையிலும் வைக்கவும். ஒரு கண்ணாடி ஸ்லைடில் 100 μL டிரைகுளோரோ(1H, 1H, 2H, 2H-பெர்ஃப்ளூரோஆக்டைல்)சிலேன் கரைசலை இட்டு, சிலேனேற்றத்திற்காக வெற்றிடத்தைப் பயன்படுத்தவும்.
உறைந்த Caco-2 செல்கள் உள்ள ஒரு குப்பியை 37°C நீர்த் தொட்டியில் வைத்து உருகச் செய்யவும், பின்னர் உருகிய அந்த செல்களை, 37°C வெப்பநிலையில் முன்கூட்டியே சூடுபடுத்தப்பட்ட 15 மிலி Caco-2 ஊடகம் உள்ள ஒரு T75 குடுவைக்கு மாற்றவும்.
Caco-2 செல்களை சுமார் 90% அடர்த்தியில் வளர்க்க, முதலில் Caco-2 ஊடகம், PBS மற்றும் 0.25% டிரிப்சின்/1 mM EDTA ஆகியவற்றை 37°C நீர்த் தொட்டியில் சூடுபடுத்தவும்.
வெற்றிட உறிஞ்சுதல் மூலம் ஊடகத்தை உறிஞ்சவும். வெற்றிட உறிஞ்சுதல் முறையை மீண்டும் செய்து, புதிய PBS-ஐச் சேர்ப்பதன் மூலம், 5 மிலி வெதுவெதுப்பான PBS கொண்டு செல்களை இருமுறை கழுவவும்.