Nature.com ஐப் பார்வையிட்டதற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவி பதிப்பில் CSS-க்கு குறைந்த ஆதரவு உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்திற்கு, புதுப்பிக்கப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு பரிந்துரைக்கிறோம் (அல்லது Internet Explorer இல் இணக்கத்தன்மை பயன்முறையை முடக்கவும்). இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்ய, ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் தளத்தைக் காண்பிப்போம்.
மனித குடல் உருவவியல், 3D எபிதீலியல் நுண்கட்டமைப்பு மற்றும் இடஞ்சார்ந்த அமைப்பின் கிரிப்ட்-வில்லஸ் அம்சங்களை நிறுவுகிறது. வெளிப்புற நுண்ணுயிர் ஆன்டிஜென்கள் மற்றும் அவற்றின் வளர்சிதை மாற்றங்களிலிருந்து அடித்தள கிரிப்டில் உள்ள ஸ்டெம் செல் இடத்தைப் பாதுகாப்பதன் மூலம் குடல் ஹோமியோஸ்டாசிஸை பராமரிக்க இந்த தனித்துவமான அமைப்பு தேவைப்படுகிறது. கூடுதலாக, குடல் வில்லி மற்றும் சுரக்கும் சளி குடல் சளி மேற்பரப்பில் ஒரு பாதுகாப்புத் தடையுடன் செயல்பாட்டு ரீதியாக வேறுபட்ட எபிதீலியல் செல்களை வழங்குகின்றன. எனவே, 3D எபிதீலியல் கட்டமைப்புகளை மீண்டும் உருவாக்குவது இன் விட்ரோ குடல் மாதிரிகளை உருவாக்குவதற்கு மிக முக்கியமானது. குறிப்பிடத்தக்க வகையில், கரிம மிமெடிக் குடல்-ஆன்-எ-சிப், மேம்பட்ட உடலியல் செயல்பாடுகள் மற்றும் பயோமெக்கானிக்ஸ் மூலம் குடல் எபிதீலியத்தின் தன்னிச்சையான 3D உருவவியல் உருவாக்கத்தைத் தூண்டலாம். இங்கே, ஒரு மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சிப் மற்றும் டிரான்ஸ்வெல் உட்பொதிக்கப்பட்ட கலப்பின சிப்பில் குடலில் குடல் உருவவியல் உருவாக்கத்தை வலுவாகத் தூண்டுவதற்கான ஒரு மறுஉருவாக்க நெறிமுறையை நாங்கள் வழங்குகிறோம். சாதன உற்பத்தி, Caco-2 அல்லது குடல் ஆர்கனாய்டு எபிதீலியல் செல்களை வழக்கமான அமைப்புகளிலும் மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் தளத்திலும் வளர்ப்பது, 3D உருவவியல் தூண்டுதல் மற்றும் நிறுவப்பட்டவற்றின் தன்மை ஆகியவற்றிற்கான விரிவான முறைகளை நாங்கள் விவரிக்கிறோம். பல இமேஜிங் முறைகளைப் பயன்படுத்தி 3D எபிதீலியா. இந்த நெறிமுறை 5 நாட்களுக்கு பாசோலேட்டரல் திரவ ஓட்டத்தைக் கட்டுப்படுத்துவதன் மூலம் செயல்பாட்டு குடல் நுண்கட்டமைப்பின் மீளுருவாக்கத்தை அடைகிறது. எங்கள் இன் விட்ரோ மார்போஜெனெசிஸ் முறை உடலியல் ரீதியாக பொருத்தமான வெட்டு அழுத்தம் மற்றும் இயந்திர இயக்கத்தைப் பயன்படுத்துகிறது மற்றும் சிக்கலான செல் பொறியியல் அல்லது கையாளுதல் தேவையில்லை, இது ஏற்கனவே உள்ள பிற நுட்பங்களை விஞ்சக்கூடும். எங்கள் முன்மொழியப்பட்ட நெறிமுறை உயிரிமருத்துவ ஆராய்ச்சி சமூகத்திற்கு பரந்த தாக்கங்களை ஏற்படுத்தக்கூடும் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம், இது உயிரிமருத்துவ, மருத்துவ மற்றும் மருந்து பயன்பாடுகளுக்கான விட்ரோவில் 3D குடல் எபிதீலியல் அடுக்குகளை மீண்டும் உருவாக்குவதற்கான முறையை வழங்குகிறது.
குடல்-ஆன்-எ-சிப்1,2,3,4,5 அல்லது இரு அடுக்கு மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சாதனங்களில் வளர்க்கப்படும் குடல் எபிதீலியல் Caco-2 செல்கள், அடிப்படை வழிமுறையைப் பற்றிய தெளிவான புரிதல் இல்லாமல், தன்னிச்சையான 3D உருவவியல் உருவாக்கத்திற்கு உட்படுத்தப்படலாம் என்பதை சோதனைகள் நிரூபிக்கின்றன. எங்கள் சமீபத்திய ஆய்வில், வளர்ப்பு சாதனங்களிலிருந்து அடிப்படை பக்கவாட்டு சுரக்கும் மார்போஜென் எதிரிகளை அகற்றுவது, 3D எபிதீலியல் உருவவியல் உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்கு அவசியமானது மற்றும் போதுமானது என்பதைக் கண்டறிந்தோம், இது Caco-2 மற்றும் நோயாளி-பெறப்பட்ட குடல் ஆர்கனாய்டுகளால் நிரூபிக்கப்பட்டுள்ளது. எபிதீலியல் செல்கள் சரிபார்க்கப்பட்டன. இந்த ஆய்வில், "ஹைபிரிட் சிப்" என்று அழைக்கப்படும் டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களைக் கொண்ட குட்-ஆன்-எ-சிப் மற்றும் மாற்றியமைக்கப்பட்ட மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சாதனங்களில், சக்திவாய்ந்த Wnt எதிரியான Dickopf-1 (DKK-1) இன் செல் உற்பத்தி மற்றும் செறிவு விநியோகத்தில் நாங்கள் குறிப்பாக கவனம் செலுத்தினோம். வெளிப்புற Wnt எதிரிகளை (DKK-1, Wnt ரெப்ரசர் 1, சுரக்கும் ஃப்ரிஸ்ல்டு-தொடர்புடைய புரதம் 1, அல்லது சோகி-1 போன்றவை) ஆன்-சிப் குடலில் சேர்ப்பது உருவவியல் உருவாக்கத்தைத் தடுக்கிறது அல்லது முன் கட்டமைக்கப்பட்ட 3D எபிதீலியல் அடுக்கை சீர்குலைக்கிறது என்பதை நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம், இது வளர்ப்பின் போது விரோதமான அழுத்தம் குடல் உருவவியல் உருவாக்கத்திற்கு விட்ரோவில் காரணமாகிறது என்பதைக் குறிக்கிறது. எனவே, எபிதீலியல் இடைமுகத்தில் வலுவான உருவவியல் உருவாக்கத்தை அடைவதற்கான ஒரு நடைமுறை அணுகுமுறை, செயலில் ஃப்ளஷிங் (எ.கா., குடல்-ஆன்-எ-சிப் அல்லது கலப்பின-ஆன்-எ-சிப் தளங்களில்) அல்லது பரவல் மூலம் பாசோலேட்டரல் பெட்டியில் Wnt எதிரிகளின் அளவை அகற்றுவது அல்லது குறைந்தபட்சமாக பராமரிப்பதாகும். பாசோலேட்டரல் மீடியா (எ.கா., டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களிலிருந்து பெரிய பாசோலேட்டரல் நீர்த்தேக்கங்களில் கிணறுகளில்).
இந்த நெறிமுறையில், பாலிடைமெதில்சிலோக்சேன் (PDMS) அடிப்படையிலான நுண்துளை சவ்வுகள் (படிகள் 6A, 7A, 8, 9) அல்லது டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களின் பாலியஸ்டர் சவ்வுகள் (படிகள் 6B, 7B, 8, 9) மற்றும் விட்ரோவில் தூண்டப்பட்ட 3D மார்போஜெனீசிஸ் (படி 10) ஆகியவற்றில் குடல் எபிதீலியல் செல்களை வளர்ப்பதற்கு குடல்-ஆன்-எ-சிப் மைக்ரோடிவைஸ்கள் மற்றும் டிரான்ஸ்வெல்-இன்சர்ட்டபிள் ஹைப்ரிட் சில்லுகளை (படிகள் 1-5) உருவாக்குவதற்கான விரிவான முறையை நாங்கள் வழங்குகிறோம். பல இமேஜிங் முறைகளைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் திசு-குறிப்பிட்ட ஹிஸ்டோஜெனீசிஸ் மற்றும் பரம்பரை சார்ந்த செல்லுலார் வேறுபாட்டைக் குறிக்கும் செல்லுலார் மற்றும் மூலக்கூறு அம்சங்களையும் நாங்கள் அடையாளம் கண்டோம் (படிகள் 11-24). நுண்துளை சவ்வுகளின் மேற்பரப்பு மாற்றம், 2D மோனோலேயர்களை உருவாக்குதல் மற்றும் குடல் உயிர்வேதியியல் மற்றும் பயோமெக்கானிக்கல் நுண்ணிய சூழலின் இனப்பெருக்கம் உள்ளிட்ட தொழில்நுட்ப விவரங்களுடன் இரண்டு கலாச்சார வடிவங்களில் Caco-2 அல்லது குடல் ஆர்கனாய்டுகள் போன்ற மனித குடல் எபிதீலியல் செல்களைப் பயன்படுத்தி மார்போஜெனீசிஸைத் தூண்டுகிறோம்.in vitro.2D எபிதீலியல் மோனோலேயர்களில் இருந்து 3D மார்போஜெனீசிஸைத் தூண்ட, மார்போஜென் எதிரிகளை அகற்றினோம். கலாச்சாரத்தின் அடிப்படைப் பகுதிக்குள் ஊடகத்தைப் பாய்ச்சுவதன் மூலம் இரண்டு வளர்ப்பு வடிவங்களிலும். இறுதியாக, மார்போஜென் சார்ந்த எபிதீலியல் வளர்ச்சி, நீளமான ஹோஸ்ட்-நுண்ணுயிர் இணை-பண்பாடுகள், நோய்க்கிருமி தொற்று, அழற்சி காயம், எபிதீலியல் தடை செயலிழப்பு மற்றும் புரோபயாடிக் அடிப்படையிலான சிகிச்சைகள் ஆகியவற்றை மாதிரியாகப் பயன்படுத்தக்கூடிய மீளுருவாக்கம் செய்யக்கூடிய 3D எபிதீலியல் அடுக்கின் பயன்பாட்டின் பிரதிநிதித்துவத்தை நாங்கள் வழங்குகிறோம்.
எங்கள் நெறிமுறை அடிப்படை (எ.கா., குடல் சளிச்சவ்வு உயிரியல், ஸ்டெம் செல் உயிரியல் மற்றும் வளர்ச்சி உயிரியல்) மற்றும் பயன்பாட்டு ஆராய்ச்சி (எ.கா., முன் மருத்துவ மருந்து சோதனை, நோய் மாதிரியாக்கம், திசு பொறியியல் மற்றும் இரைப்பை குடல்) ஆகியவற்றில் பரந்த அளவிலான விஞ்ஞானிகளுக்கு பயனுள்ளதாக இருக்கலாம். குடல் எபிட்டிலியத்தின் 3D உருவவியல் உருவாக்கத்தை இன் விட்ரோவில் தூண்டுவதற்கான எங்கள் நெறிமுறையின் மறுஉருவாக்கம் மற்றும் வலிமை காரணமாக, குடல் வளர்ச்சி, மீளுருவாக்கம் அல்லது ஹோமியோஸ்டாசிஸின் போது செல் சிக்னலின் இயக்கவியலைப் படிக்கும் பார்வையாளர்களுக்கு எங்கள் தொழில்நுட்ப உத்தியைப் பரப்ப முடியும் என்று நாங்கள் கருதுகிறோம். கூடுதலாக, நோரோவைரஸ் 8, கடுமையான கடுமையான சுவாச நோய்க்குறி கொரோனா வைரஸ் 2 (SARS-CoV-2), க்ளோஸ்ட்ரிடியம் டிஃபிசில், சால்மோனெல்லா டைபிமுரியம் 9 அல்லது விப்ரியோ காலரா போன்ற பல்வேறு தொற்று முகவர்களின் கீழ் தொற்றுநோயை விசாரிக்க எங்கள் நெறிமுறை பயனுள்ளதாக இருக்கும். நோய் நோயியல் மற்றும் நோய்க்கிருமி உருவாக்கம் பற்றிய பார்வையாளர்களும் பயனுள்ளதாக உள்ளனர். ஆன்-சிப் குடல் நுண்உடலியல் அமைப்பின் பயன்பாடு, இரைப்பை குடல் (GI) பாதையில் உள்ள ஹோஸ்ட் பாதுகாப்பு, நோயெதிர்ப்பு மறுமொழிகள் மற்றும் நோய்க்கிருமி தொடர்பான காயம் சரிசெய்தல் ஆகியவற்றின் நீளமான இணை-வளர்ப்பு 10 மற்றும் அதன் பின்னர் மதிப்பீட்டை அனுமதிக்கலாம் 11. நோயாளியின் 3D குடல் எபிதீலியல் அடுக்குகளைப் பயன்படுத்தி 3D குடல் எபிதீலியல் அடுக்குகள் தயாரிக்கப்படும்போது, ​​கசிவு குடல் நோய்க்குறி, செலியாக் நோய், கிரோன் நோய், அல்சரேட்டிவ் பெருங்குடல் அழற்சி, பவுச்சிடிஸ் அல்லது எரிச்சல் கொண்ட குடல் நோய்க்குறி ஆகியவற்றுடன் தொடர்புடைய பிற GI கோளாறுகளை உருவகப்படுத்தலாம். இந்த நோய்களில் மோசமான அட்ராபி, கிரிப்ட் சுருக்கம், மியூகோசல் சேதம் அல்லது பலவீனமான எபிதீலியல் தடை ஆகியவை அடங்கும். பயாப்ஸி அல்லது ஸ்டெம் செல்-பெறப்பட்ட குடல் ஆர்கனாய்டுகள் 12,13. நோய் சூழலின் உயர் சிக்கலான தன்மையை சிறப்பாக மாதிரியாக்க, 3D குடல் வில்லஸ்-கிரிப்ட் மைக்ரோஆர்கிடெக்சர்களைக் கொண்ட மாதிரிகளில், நோயாளியின் புற இரத்த மோனோநியூக்ளியர் செல்கள் (PBMCs) போன்ற நோய் தொடர்பான செல் வகைகளைச் சேர்ப்பதை வாசகர்கள் பரிசீலிக்கலாம். திசு-குறிப்பிட்ட நோயெதிர்ப்பு செல்கள், 5.
3D எபிதீலியல் நுண் கட்டமைப்பை பிரித்தல் செயல்முறை இல்லாமலேயே சரி செய்து காட்சிப்படுத்த முடியும் என்பதால், இடஞ்சார்ந்த டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக்ஸ் மற்றும் உயர்-தெளிவுத்திறன் அல்லது சூப்பர்-தெளிவுத்திறன் இமேஜிங்கில் பணிபுரியும் பார்வையாளர்கள், எபிதீலியல் இடங்களில் மரபணுக்கள் மற்றும் புரதங்களின் இடஞ்சார்ந்த தற்காலிக இயக்கவியலின் எங்கள் வரைபடத்தில் ஆர்வமாக இருக்கலாம். தொழில்நுட்பத்தில் ஆர்வம். நுண்ணுயிர் அல்லது நோயெதிர்ப்பு தூண்டுதல்களுக்கு பதில். மேலும், குடல் ஹோமியோஸ்டாசிஸை ஒருங்கிணைக்கும் நீளமான ஹோஸ்ட்-நுண்ணுயிரி குறுக்கு 10, 14, குறிப்பாக குடல்-ஆன்-எ-சிப்பில், பல்வேறு நுண்ணுயிர் இனங்கள், நுண்ணுயிர் சமூகங்கள் அல்லது மல நுண்ணுயிரிகளை இணைந்து வளர்ப்பதன் மூலம் 3D குடல் சளி அடுக்கில் நிறுவப்படலாம். மேடையில். இந்த அணுகுமுறை சளிச்சவ்வு நோயெதிர்ப்பு, இரைப்பை குடல், மனித நுண்ணுயிரியல், கலாச்சாரவியல் மற்றும் மருத்துவ நுண்ணுயிரியல் ஆகியவற்றைப் படிக்கும் பார்வையாளர்களை குறிப்பாக கவர்ச்சிகரமானதாக ஆக்குகிறது, ஆய்வகத்தில் முன்னர் வளர்க்கப்படாத குடல் நுண்ணுயிரிகளை வளர்க்க முயல்கிறது. எங்கள் இன் விட்ரோ மார்போஜெனிசிஸ் நெறிமுறையை அளவிடக்கூடிய கலாச்சார வடிவங்களுக்கு மாற்றியமைக்க முடிந்தால், 24, 96 அல்லது 384 கிணறு தகடுகளில் உள்ள மல்டிவெல் செருகல்கள் போன்ற பாசோலேட்டரல் பெட்டிகளைத் தொடர்ந்து நிரப்புகின்றன, இந்த நெறிமுறையை மருந்து, உயிரி மருத்துவ அல்லது உயர்-செயல்திறன் திரையிடல் அல்லது உணவுத் துறைக்கான சரிபார்ப்பு தளங்களை உருவாக்குபவர்களுக்கும் பரப்ப முடியும். கொள்கையின் சான்றாக, 24-கிணறு தட்டு வடிவத்திற்கு அளவிடக்கூடிய மல்டிபிளக்ஸ் உயர்-செயல்திறன் மார்போஜெனிசிஸ் அமைப்பின் சாத்தியக்கூறுகளை நாங்கள் சமீபத்தில் நிரூபித்தோம். கூடுதலாக, பல உறுப்பு-ஆன்-எ-சிப் தயாரிப்புகள் வணிகமயமாக்கப்பட்டுள்ளன16,17,18. எனவே, எங்கள் இன் விட்ரோ மார்போஜெனிசிஸ் முறையின் சரிபார்ப்பை துரிதப்படுத்தலாம் மற்றும் பல ஆராய்ச்சி ஆய்வகங்கள், தொழில் அல்லது அரசு மற்றும் ஒழுங்குமுறை நிறுவனங்களால் மருந்துகளைச் சோதிக்க டிரான்ஸ்கிரிப்டோமிக் மட்டத்தில் இன் விட்ரோ குடல் மார்போஜெனிசிஸின் செல்லுலார் மறுநிரலாக்கத்தைப் புரிந்துகொள்ள சாத்தியமான முறையில் ஏற்றுக்கொள்ளலாம். அல்லது உயிரி சிகிச்சைகள் மருந்து வேட்பாளர்களின் உறிஞ்சுதல் மற்றும் போக்குவரத்து 3D குடல் மாற்று மருந்துகளைப் பயன்படுத்தி அல்லது குடல் உருவவியல் செயல்முறையின் மறுஉருவாக்கத்தை மதிப்பிடுவதற்கு தனிப்பயன் அல்லது வணிக உறுப்பு-ஆன்-எ-சிப் மாதிரிகளைப் பயன்படுத்தி மதிப்பிடப்பட்டது.
குடல் எபிதீலியல் மார்போஜெனீசிஸை ஆய்வு செய்ய, மனிதனுடன் தொடர்புடைய குறிப்பிட்ட எண்ணிக்கையிலான சோதனை மாதிரிகள் பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளன, முக்கியமாக இன் விட்ரோவில் 3D மார்போஜெனீசிஸைத் தூண்டுவதற்கு செயல்படுத்தக்கூடிய நெறிமுறைகள் இல்லாததால். உண்மையில், குடல் மார்போஜெனீசிஸ் பற்றிய தற்போதைய அறிவின் பெரும்பகுதி விலங்கு ஆய்வுகளை அடிப்படையாகக் கொண்டது (எ.கா., ஜீப்ராஃபிஷ்20, எலிகள்21 அல்லது கோழிகள்22). இருப்பினும், அவை உழைப்பு மற்றும் செலவு மிகுந்தவை, நெறிமுறை ரீதியாக கேள்விக்குரியவை, மேலும் மிக முக்கியமாக, மனித வளர்ச்சி செயல்முறைகளை துல்லியமாக தீர்மானிக்கவில்லை. இந்த மாதிரிகள் பல வழிகளில் அளவிடக்கூடிய முறையில் சோதிக்கப்படும் திறனிலும் மிகவும் குறைவாகவே உள்ளன. எனவே, இன் விட்ரோவில் 3D திசு கட்டமைப்புகளை மீண்டும் உருவாக்குவதற்கான எங்கள் நெறிமுறை விவோ விலங்கு மாதிரிகள் மற்றும் பிற பாரம்பரிய நிலையான 2D செல் கலாச்சார மாதிரிகளில் சிறப்பாக செயல்படுகிறது. முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி, 3D எபிதீலியல் கட்டமைப்புகளைப் பயன்படுத்துவது பல்வேறு சளி அல்லது நோயெதிர்ப்பு தூண்டுதல்களுக்கு பதிலளிக்கும் விதமாக கிரிப்ட்-வில்லஸ் அச்சில் உள்ள வேறுபட்ட செல்களின் இடஞ்சார்ந்த உள்ளூர்மயமாக்கலை ஆராய அனுமதித்தது. 3D எபிதீலியல் அடுக்குகள் நுண்ணுயிர் செல்கள் எவ்வாறு இடஞ்சார்ந்த இடங்களை உருவாக்க போட்டியிடுகின்றன மற்றும் ஹோஸ்ட் காரணிகளுக்கு (எ.கா., உள் மற்றும் வெளிப்புற சளி அடுக்குகள், IgA மற்றும் நுண்ணுயிர் எதிர்ப்பு பெப்டைடுகளின் சுரப்பு).மேலும், 3D எபிதீலியல் உருவவியல், குடல் நுண்ணுயிரி அதன் சமூகங்களை எவ்வாறு கட்டமைக்கிறது மற்றும் அடித்தள கிரிப்ட்களில் செல்லுலார் அமைப்பு மற்றும் ஸ்டெம் செல் இடங்களை வடிவமைக்கும் நுண்ணுயிர் வளர்சிதை மாற்றங்களை (எ.கா., குறுகிய-சங்கிலி கொழுப்பு அமிலங்கள்) எவ்வாறு ஒருங்கிணைக்கிறது என்பதைப் புரிந்துகொள்ள நமக்கு உதவும். 3D எபிதீலியல் அடுக்குகள் செயற்கை முறையில் நிறுவப்பட்டால் மட்டுமே இந்த அம்சங்களை நிரூபிக்க முடியும்.
3D குடல் எபிதீலியல் கட்டமைப்புகளை உருவாக்கும் எங்கள் முறைக்கு கூடுதலாக, பல இன் விட்ரோ முறைகள் உள்ளன. குடல் ஆர்கனாய்டு கலாச்சாரம் என்பது குறிப்பிட்ட மார்போஜென் நிலைமைகளின் கீழ் குடல் ஸ்டெம் செல்களை வளர்ப்பதை அடிப்படையாகக் கொண்ட ஒரு அதிநவீன திசு பொறியியல் நுட்பமாகும்23,24,25. இருப்பினும், போக்குவரத்து பகுப்பாய்வு அல்லது ஹோஸ்ட்-மைக்ரோபயோம் இணை-பண்பாடுகளுக்கு 3D ஆர்கனாய்டு மாதிரிகளைப் பயன்படுத்துவது பெரும்பாலும் சவாலானது, ஏனெனில் குடல் லுமேன் ஆர்கனாய்டுக்குள் இணைக்கப்பட்டுள்ளது, எனவே, நுண்ணுயிர் செல்கள் அல்லது வெளிப்புற ஆன்டிஜென்கள் போன்ற லுமினல் கூறுகளின் அறிமுகம் குறைவாக உள்ளது. மைக்ரோஇன்ஜெக்டரைப் பயன்படுத்தி ஆர்கனாய்டு லுமன்களுக்கான அணுகலை மேம்படுத்தலாம்,26,27 ஆனால் இந்த முறை ஆக்கிரமிப்பு மற்றும் உழைப்பு மிகுந்தது மற்றும் அதைச் செய்வதற்கு சிறப்பு அறிவு தேவைப்படுகிறது. மேலும், நிலையான நிலைமைகளின் கீழ் ஹைட்ரஜல் சாரக்கட்டுகளில் பராமரிக்கப்படும் பாரம்பரிய ஆர்கனாய்டு கலாச்சாரங்கள் விவோ பயோமெக்கானிக்ஸில் செயலில் இருப்பதை துல்லியமாக பிரதிபலிக்காது.
பல ஆராய்ச்சி குழுக்களால் பயன்படுத்தப்படும் பிற அணுகுமுறைகள், ஜெல் மேற்பரப்பில் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மனித குடல் செல்களை வளர்ப்பதன் மூலம் குடல் எபிதீலியல் கட்டமைப்பைப் பிரதிபலிக்க முன் கட்டமைக்கப்பட்ட 3D ஹைட்ரோஜெல் சாரக்கட்டுகளைப் பயன்படுத்துகின்றன. 3D-அச்சிடப்பட்ட, மைக்ரோ-மில் செய்யப்பட்ட அல்லது லித்தோகிராஃபிகலாக தயாரிக்கப்பட்ட அச்சுகளைப் பயன்படுத்தி ஹைட்ரோஜெல் சாரக்கட்டுகளை உருவாக்குங்கள். இந்த முறை உடலியல் ரீதியாக பொருத்தமான மார்போஜென் சாய்வுகளுடன் இன் விட்ரோவில் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் செல்களின் சுய-ஒழுங்கமைக்கப்பட்ட ஏற்பாட்டைக் காட்டுகிறது, ஸ்காஃபோல்டில் ஸ்ட்ரோமல் செல்களைச் சேர்ப்பதன் மூலம் உயர் விகித எபிதீலியல் அமைப்பு மற்றும் ஸ்ட்ரோமா-எபிதீலியல் க்ராஸ்டாக்கை நிறுவுகிறது. இருப்பினும், முன் கட்டமைக்கப்பட்ட சாரக்கட்டுகளின் தன்மை தன்னிச்சையான மார்போஜெனடிக் செயல்முறையைக் காண்பிப்பதைத் தடுக்கலாம். இந்த மாதிரிகள் டைனமிக் லுமினல் அல்லது இன்டர்ஸ்டீடியல் ஓட்டத்தையும் வழங்காது, குடல் செல்கள் மார்போஜெனீசிஸுக்கு உட்படவும் உடலியல் செயல்பாட்டைப் பெறவும் தேவையான திரவ வெட்டு அழுத்தத்தைக் கொண்டிருக்கவில்லை. மற்றொரு சமீபத்திய ஆய்வு, மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் தளத்தில் ஹைட்ரோஜெல் சாரக்கட்டுகளையும் லேசர்-எச்சிங் நுட்பங்களைப் பயன்படுத்தி வடிவமைக்கப்பட்ட குடல் எபிதீலியல் கட்டமைப்புகளையும் பயன்படுத்தியது. எலி குடல் ஆர்கனாய்டுகள் குடல் குழாய் கட்டமைப்புகளை உருவாக்க பொறிக்கப்பட்ட வடிவங்களைப் பின்பற்றுகின்றன, மேலும் இன்ட்ராலுமினல் திரவ ஓட்டத்தை மைக்ரோஃப்ளூயிடிக்ஸ் மூலம் மீண்டும் உருவாக்கலாம். தொகுதி.இருப்பினும், இந்த மாதிரி தன்னிச்சையான உருவவியல் செயல்முறைகளை வெளிப்படுத்துவதில்லை அல்லது குடல் இயந்திர உயிரியல் இயக்கங்களை உள்ளடக்குவதில்லை. ஒரே குழுவிலிருந்து 3D அச்சிடும் நுட்பங்கள் தன்னிச்சையான உருவவியல் செயல்முறைகளுடன் மினியேச்சர் குடல் குழாய்களை உருவாக்க முடிந்தது. குழாயினுள் வெவ்வேறு குடல் பிரிவுகளின் சிக்கலான உருவாக்கம் இருந்தபோதிலும், இந்த மாதிரியில் லுமினல் திரவ ஓட்டம் மற்றும் இயந்திர சிதைவு இல்லை. கூடுதலாக, மாதிரி செயல்பாடு குறைவாக இருக்கலாம், குறிப்பாக பயோபிரிண்டிங் செயல்முறை முடிந்த பிறகு, சோதனை நிலைமைகள் அல்லது செல்-க்கு-செல் தொடர்புகளை குழப்புகிறது. அதற்கு பதிலாக, எங்கள் முன்மொழியப்பட்ட நெறிமுறை தன்னிச்சையான குடல் உருவவியல், உடலியல் ரீதியாக பொருத்தமான வெட்டு அழுத்தம், குடல் இயக்கத்தைப் பிரதிபலிக்கும் பயோமெக்கானிக்ஸ், சுயாதீனமான நுனி மற்றும் பாசோலேட்டரல் பெட்டிகளின் அணுகல் மற்றும் மட்டுப்படுத்தலின் சிக்கலான உயிரியல் நுண்ணிய சூழல்களை மீண்டும் உருவாக்குதல் ஆகியவற்றை வழங்குகிறது. எனவே, எங்கள் இன் விட்ரோ 3D உருவவியல் நெறிமுறை தற்போதுள்ள முறைகளின் சவால்களை சமாளிக்க ஒரு நிரப்பு அணுகுமுறையை வழங்கக்கூடும்.
எங்கள் நெறிமுறை 3D எபிதீலியல் மார்போஜெனீசிஸில் முழுமையாக கவனம் செலுத்துகிறது, கலாச்சாரத்தில் எபிதீலியல் செல்கள் மட்டுமே உள்ளன மற்றும் மீசன்கிமல் செல்கள், எண்டோடெலியல் செல்கள் மற்றும் நோயெதிர்ப்பு செல்கள் போன்ற சுற்றியுள்ள செல்கள் எதுவும் இல்லை. முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி, அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட ஊடகத்தின் பாசோலேட்டரல் பக்கத்தில் சுரக்கும் மார்போஜென் தடுப்பான்களை அகற்றுவதன் மூலம் எபிதீலியல் மார்போஜெனீசிஸின் தூண்டுதலே எங்கள் நெறிமுறையின் மையமாகும். எங்கள் குடல்-ஆன்-எ-சிப் மற்றும் ஹைப்ரிட்-ஆன்-எ-சிப்பின் வலுவான மட்டுப்படுத்தல் அலை அலையான 3D எபிதீலியல் அடுக்கை மீண்டும் உருவாக்க அனுமதிக்கிறது, எபிதீலியல்-மெசன்கிமல் தொடர்புகள் போன்ற கூடுதல் உயிரியல் சிக்கல்கள்33,34, எக்ஸ்ட்ராசெல்லுலர் மேட்ரிக்ஸ் (ECM) படிவு35 மற்றும், எங்கள் மாதிரியில், அடித்தள கிரிப்ட்களில் ஸ்டெம் செல் இடங்களை வெளிப்படுத்தும் கிரிப்ட்-வில்லஸ் அம்சங்கள் மேலும் பரிசீலிக்கப்பட உள்ளன. மீசன்கிமில் உள்ள ஸ்ட்ரோமல் செல்கள் (எ.கா., ஃபைப்ரோபிளாஸ்ட்கள்) ECM புரதங்களின் உற்பத்தியிலும், விவோவில் குடல் மார்போஜெனீசிஸை ஒழுங்குபடுத்துவதிலும் முக்கிய பங்கு வகிக்கின்றன35,37,38. எங்கள் மாதிரியில் மீசன்கிமல் செல்களைச் சேர்ப்பது மார்போஜெனடிக் செயல்முறையை மேம்படுத்தியது. மற்றும் செல் இணைப்பு திறன். குடல் நுண்ணிய சூழலில் மூலக்கூறு போக்குவரத்து39 மற்றும் நோயெதிர்ப்பு செல் ஆட்சேர்ப்பை40 ஒழுங்குபடுத்துவதில் எண்டோடெலியல் அடுக்கு (அதாவது, தந்துகிகள் அல்லது நிணநீர் நாளங்கள்) முக்கிய பங்கு வகிக்கிறது. மேலும், திசு மாதிரிகள் பல-உறுப்பு தொடர்புகளை நிரூபிக்க வடிவமைக்கப்படும்போது திசு மாதிரிகளுக்கு இடையில் இணைக்கக்கூடிய வாஸ்குலேச்சர் கூறுகள் ஒரு முன்நிபந்தனையாகும். எனவே, உறுப்பு-நிலை தெளிவுத்திறனுடன் மிகவும் துல்லியமான உடலியல் அம்சங்களை மாதிரியாக்க எண்டோடெலியல் செல்கள் சேர்க்கப்பட வேண்டியிருக்கலாம். குடல் நோயைப் பிரதிபலிக்கும் சூழலில் உள்ளார்ந்த நோயெதிர்ப்பு மறுமொழிகள், ஆன்டிஜென் விளக்கக்காட்சி, உள்ளார்ந்த தகவமைப்பு நோயெதிர்ப்பு குறுக்குவழி மற்றும் திசு-குறிப்பிட்ட நோய் எதிர்ப்பு சக்தியைக் காண்பிப்பதற்கும் நோயாளி-பெறப்பட்ட நோயெதிர்ப்பு செல்கள் அவசியம்.
கலப்பின சில்லுகளின் பயன்பாடு குட்-ஆன்-எ-சிப்பை விட நேரடியானது, ஏனெனில் சாதன அமைப்பு எளிமையானது மற்றும் டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களின் பயன்பாடு குடல் எபிட்டிலியத்தின் அளவிடக்கூடிய கலாச்சாரத்தை அனுமதிக்கிறது. இருப்பினும், பாலியஸ்டர் சவ்வுகளுடன் வணிக ரீதியாகக் கிடைக்கும் டிரான்ஸ்வெல் செருகல்கள் மீள் தன்மை கொண்டவை அல்ல, மேலும் பெரிஸ்டால்டிக் போன்ற இயக்கங்களை உருவகப்படுத்த முடியாது. மேலும், கலப்பின சிப்பில் வைக்கப்பட்டுள்ள டிரான்ஸ்வெல் செருகலின் நுனிப் பகுதி, நுனிப் பக்கத்தில் எந்த வெட்டு அழுத்தமும் இல்லாமல் நிலையானதாக இருந்தது என்பது தெளிவாகிறது. நுனிப் பகுதியில் உள்ள நிலையான பண்புகள், ஹைப்ரிட் சில்லுகளில் நீண்டகால பாக்டீரியா கூட்டு-கலாச்சாரத்தை அரிதாகவே செயல்படுத்துகின்றன. ஹைப்ரிட் சில்லுகளைப் பயன்படுத்தும் போது டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களில் 3D உருவவியல் மற்றும் நுனிப் திரவ ஓட்டத்தின் பற்றாக்குறை சாத்தியமான பயன்பாடுகளுக்கு கலப்பின சிப் தளங்களின் சாத்தியக்கூறுகளைக் கட்டுப்படுத்தலாம்.
குட்-ஆன்-எ-சிப் மற்றும் ஹைப்ரிட்-ஆன்-எ-சிப் கலாச்சாரங்களில் மனித கிரிப்ட்-வில்லஸ் அச்சின் முழு அளவிலான மறுகட்டமைப்புகள் முழுமையாக நிறுவப்படவில்லை. ஒரு எபிதீலியல் மோனோலேயரில் இருந்து உருவவியல் உருவாக்கம் தொடங்குவதால், 3D மைக்ரோஆர்கிடெக்சர்கள் விவோவில் கிரிப்ட்களுடன் உருவவியல் ஒற்றுமையை வழங்க வேண்டிய அவசியமில்லை. மைக்ரோஎன்ஜினீயரிங் செய்யப்பட்ட 3D எபிதீலியத்தில் அடித்தள கிரிப்ட் டொமைனுக்கு அருகில் பெருகும் செல் மக்கள்தொகையை நாங்கள் வகைப்படுத்தினாலும், கிரிப்ட் மற்றும் வில்லஸ் பகுதிகள் தெளிவாக வரையறுக்கப்படவில்லை. சிப்பில் உள்ள உயர்ந்த மேல் சேனல்கள் மைக்ரோஎன்ஜினீயரிங் செய்யப்பட்ட எபிதீலியத்தின் உயரத்தை அதிகரிக்க வழிவகுத்தாலும், அதிகபட்ச உயரம் இன்னும் ~300–400 µm ஆக வரையறுக்கப்பட்டுள்ளது. சிறு மற்றும் பெரிய குடல்களில் மனித குடல் கிரிப்ட்களின் உண்மையான ஆழம் முறையே ~135 µm மற்றும் ~400 µm ஆகும், மேலும் சிறுகுடல் வில்லியின் உயரம் ~600 µm41 ஆகும்.
இமேஜிங் பார்வையில், 3D மைக்ரோஆர்கிடெக்சர்களின் இன் சிட்டு சூப்பர்-ரெசல்யூஷன் இமேஜிங் ஒரு சிப்பில் உள்ள குடலுக்கு மட்டுப்படுத்தப்படலாம், ஏனெனில் புறநிலை லென்ஸிலிருந்து எபிதீலியல் அடுக்குக்கு தேவையான வேலை தூரம் சில மில்லிமீட்டர்கள் வரிசையில் உள்ளது. இந்த சிக்கலை சமாளிக்க, ஒரு தொலைதூர குறிக்கோள் தேவைப்படலாம். மேலும், PDMS இன் அதிக நெகிழ்ச்சித்தன்மை காரணமாக இமேஜிங் மாதிரி தயாரிப்பிற்கான மெல்லிய பிரிவுகளை உருவாக்குவது சவாலானது. மேலும், ஒரு சிப்பில் உள்ள குடலின் அடுக்கு-மூலம்-அடுக்கு மைக்ரோஃபேப்ரிகேஷன் ஒவ்வொரு அடுக்குக்கும் இடையில் நிரந்தர ஒட்டுதலை உள்ளடக்கியிருப்பதால், எபிதீலியல் அடுக்கின் மேற்பரப்பு அமைப்பை ஆய்வு செய்ய மேல் அடுக்கைத் திறப்பது அல்லது அகற்றுவது மிகவும் சவாலானது. எடுத்துக்காட்டாக, ஸ்கேனிங் எலக்ட்ரான் நுண்ணோக்கி (SEM) ஐப் பயன்படுத்துவதன் மூலம்.
PDMS இன் ஹைட்ரோபோபிசிட்டி, ஹைட்ரோபோபிக் சிறிய மூலக்கூறுகளைக் கையாளும் மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் அடிப்படையிலான ஆய்வுகளில் ஒரு வரையறுக்கும் காரணியாக இருந்து வருகிறது, ஏனெனில் PDMS அத்தகைய ஹைட்ரோபோபிக் மூலக்கூறுகளை குறிப்பிட்ட முறையில் உறிஞ்சாது. PDMS க்கு மாற்றுகளை மற்ற பாலிமெரிக் பொருட்களுடன் பரிசீலிக்கலாம். மாற்றாக, ஹைட்ரோபோபிக் மூலக்கூறுகளின் உறிஞ்சுதலைக் குறைக்க PDMS இன் மேற்பரப்பு மாற்றத்தை (எ.கா., லிப்போபிலிக் பொருட்கள் 42 அல்லது பாலி(எத்திலீன் கிளைக்கால்) 43 உடன் பூச்சு) கருத்தில் கொள்ளலாம்.
இறுதியாக, உயர்-செயல்திறன் திரையிடல் அல்லது "அனைவருக்கும் ஒரே அளவு பொருந்தக்கூடிய" பயனர் நட்பு சோதனை தளத்தை வழங்குவதில் எங்கள் முறை நன்கு வகைப்படுத்தப்படவில்லை. தற்போதைய நெறிமுறைக்கு ஒரு மைக்ரோ சாதனத்திற்கு ஒரு சிரிஞ்ச் பம்ப் தேவைப்படுகிறது, இது CO2 இன்குபேட்டரில் இடத்தை எடுத்துக்கொள்கிறது மற்றும் பெரிய அளவிலான சோதனைகளைத் தடுக்கிறது. புதுமையான கலாச்சார வடிவங்களின் அளவிடுதல் மூலம் இந்த வரம்பை கணிசமாக மேம்படுத்தலாம் (எ.கா., 24-கிணறு, 96-கிணறு, அல்லது 384-கிணறு நுண்துளை செருகல்கள் தொடர்ச்சியான நிரப்புதல் மற்றும் பாசோலேட்டரல் மீடியாவை அகற்ற அனுமதிக்கின்றன).
மனித குடல் எபிட்டிலியத்தின் 3D உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்ட, இரண்டு இணையான மைக்ரோ சேனல்கள் மற்றும் இடையில் ஒரு மீள் நுண்துளை சவ்வு கொண்ட ஒரு மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சிப் குடல் சாதனத்தைப் பயன்படுத்தி ஒரு லுமேன்-கேபிலரி இடைமுகத்தை உருவாக்கினோம். டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களில் வளர்க்கப்படும் துருவப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் அடுக்குகளுக்கு அடியில் தொடர்ச்சியான பாசோலேட்டரல் ஓட்டத்தை வழங்கும் ஒற்றை-சேனல் மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சாதனத்தின் (ஒரு கலப்பின சிப்) பயன்பாட்டையும் நாங்கள் நிரூபிக்கிறோம். இரண்டு தளங்களிலும், பாசோலேட்டரல் பெட்டியிலிருந்து மார்போஜென் எதிரிகளை அகற்ற ஓட்டத்தின் திசை கையாளுதலைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் பல்வேறு மனித குடல் எபிதீலியல் செல்களின் உருவ உருவாக்கத்தை நிரூபிக்க முடியும். முழு சோதனை செயல்முறையும் (படம் 1) ஐந்து பகுதிகளைக் கொண்டுள்ளது: (i) குடல் சிப் அல்லது டிரான்ஸ்வெல் செருகக்கூடிய கலப்பின சிப்பின் நுண் உருவாக்கம் (படிகள் 1-5; பெட்டி 1), (ii) குடல் எபிதீலியல் செல்கள் (Caco-2 செல்கள்) அல்லது மனித குடல் ஆர்கனாய்டுகளை தயாரித்தல்; பெட்டிகள் 2-5), (iii) குடல் சில்லுகள் அல்லது கலப்பின சில்லுகளில் குடல் எபிதீலியல் செல்களை வளர்ப்பது (படிகள் 6-9), (iv) 3D எபிதீலியல் நுண் கட்டமைப்பை வகைப்படுத்த இன் விட்ரோவில் 3D உருவவியல் தூண்டல் (படி 10) மற்றும் (v) ) (படிகள் 11-24). இறுதியாக, எபிதீலியல் மார்போஜெனீசிஸை இடஞ்சார்ந்த, தற்காலிக, நிபந்தனை அல்லது நடைமுறைக் கட்டுப்பாடுகளுடன் ஒப்பிடுவதன் மூலம் இன் விட்ரோ மார்போஜெனீசிஸின் செயல்திறனை சரிபார்க்க ஒரு பொருத்தமான கட்டுப்பாட்டுக் குழு (கீழே மேலும் விவாதிக்கப்பட்டது) வடிவமைக்கப்பட்டது.
நாங்கள் இரண்டு வெவ்வேறு கலாச்சார தளங்களைப் பயன்படுத்தினோம்: நேரான சேனல்கள் அல்லது நேரியல் அல்லாத சுருண்ட சேனல்களைக் கொண்ட குட்-ஆன்-எ-சிப், அல்லது மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சாதனத்தில் டிரான்ஸ்வெல் (TW) செருகல்களைக் கொண்ட கலப்பின சில்லுகள், பெட்டி 1 இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி தயாரிக்கப்பட்டது, மற்றும் படி 1 -5. "சாதன உற்பத்தி" என்பது ஒற்றை சிப் அல்லது கலப்பின சிப்பை உருவாக்குவதில் முக்கிய படிகளைக் காட்டுகிறது." மனித குடல் எபிதீலியல் செல்களின் கலாச்சாரம்" இந்த நெறிமுறையில் பயன்படுத்தப்படும் செல் மூலத்தை (Caco-2 அல்லது மனித குடல் ஆர்கனாய்டுகள்) மற்றும் கலாச்சார செயல்முறையை விளக்குகிறது." இன் விட்ரோ மோர்போஜெனெசிஸ்" என்பது Caco-2 அல்லது ஆர்கனாய்டு-பெறப்பட்ட எபிதீலியல் செல்கள் ஒரு குடல் சிப்பில் அல்லது ஒரு கலப்பின சிப்பின் டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களில் வளர்க்கப்படும் ஒட்டுமொத்த படிகளைக் காட்டுகிறது, அதைத் தொடர்ந்து 3D மார்போஜெனெசிஸின் தூண்டல் மற்றும் ஒரு வகைப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் கட்டமைப்பை உருவாக்குகிறது. நிரல் படி எண் அல்லது பெட்டி எண் ஒவ்வொரு அம்புக்குறிக்கும் கீழே காட்டப்படும். நிறுவப்பட்ட குடல் எபிதீலியல் அடுக்குகளை எவ்வாறு பயன்படுத்தலாம் என்பதற்கான எடுத்துக்காட்டுகளை பயன்பாடு வழங்குகிறது, எடுத்துக்காட்டாக, செல் வேறுபாடு தன்மை, குடல் உடலியல் ஆய்வுகள், ஹோஸ்ட்-நுண்ணுயிர் சுற்றுச்சூழல் அமைப்புகளை நிறுவுதல் மற்றும் நோய் ஆகியவற்றில். மாதிரியாக்கம். "செல் வேறுபாடு" இல் உள்ள இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் படங்கள், குடல் சிப்பில் உருவாக்கப்படும் 3D Caco-2 எபிதீலியல் அடுக்கில் வெளிப்படுத்தப்படும் கருக்கள், F-ஆக்டின் மற்றும் MUC2 ஆகியவற்றைக் காட்டுகின்றன. MUC2 சமிக்ஞை கோப்லெட் செல்கள் மற்றும் சளி மேற்பரப்புகளிலிருந்து சுரக்கும் சளியில் உள்ளது. குடல் உடலியலில் உள்ள ஃப்ளோரசன்ட் படங்கள், ஃப்ளோரசன்ட் கோதுமை கிருமி அக்லூட்டினினைப் பயன்படுத்தி சியாலிக் அமிலம் மற்றும் N-அசிடைல்குளுக்கோசமைன் எச்சங்களுக்கு சாயமிடுவதன் மூலம் உற்பத்தி செய்யப்படும் சளியைக் காட்டுகின்றன. "ஹோஸ்ட்-மைக்ரோப் கோ-கல்ச்சர்ஸ்" இல் உள்ள இரண்டு ஒன்றுடன் ஒன்று படங்கள், ஒரு சிப்பில் குடலில் பிரதிநிதித்துவ ஹோஸ்ட்-மைக்ரோபயோம் இணை-கலாச்சாரங்களைக் காட்டுகின்றன. இடது பலகம், நுண்ணிய பொறியியல் 3D Caco-2 எபிதீலியல் செல்களுடன் பச்சை ஃப்ளோரசன்ட் புரதத்தை (GFP) வெளிப்படுத்தும் E. கோலியின் இணை-கலாச்சாரத்தைக் காட்டுகிறது. வலது பலகம், 3D Caco-2 எபிதீலியல் செல்களுடன் இணைந்து வளர்க்கப்பட்ட GFP E. கோலியின் உள்ளூர்மயமாக்கலைக் காட்டுகிறது, அதைத் தொடர்ந்து F-ஆக்டின் (சிவப்பு) மற்றும் கருக்கள் (நீலம்) உடன் இணைந்து வளர்க்கப்பட்ட இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் கறை படிதல் ஆகியவற்றைக் காட்டுகிறது. பாக்டீரியாவுடன் உடலியல் சவாலின் கீழ் குடல் அழற்சி சில்லுகளில் ஆரோக்கியமான மற்றும் கசியும் குடலை நோய் மாதிரியாக்கம் விளக்குகிறது. ஆன்டிஜென்கள் (எ.கா., லிப்போபோலிசாக்கரைடு, LPS) மற்றும் நோயெதிர்ப்பு செல்கள் (எ.கா., PBMC; பச்சை). 3D எபிதீலியல் அடுக்கை நிறுவ Caco-2 செல்கள் வளர்க்கப்பட்டன. அளவுகோல், 50 µm. கீழ் வரிசையில் உள்ள படங்கள்: "செல்களின் வேறுபாடு" குறிப்பிலிருந்து அனுமதியுடன் தழுவி எடுக்கப்பட்டது.2. ஆக்ஸ்போர்டு பல்கலைக்கழக அச்சகம்; Ref.5 இன் அனுமதியுடன் மீண்டும் உருவாக்கப்பட்டது. NAS; "ஹோஸ்ட்-மைக்ரோப் கோ-கல்ச்சர்" ref.3 இன் அனுமதியுடன் தழுவி எடுக்கப்பட்டது. NAS; "நோய் மாடலிங்" குறிப்பிலிருந்து அனுமதியுடன் தழுவி எடுக்கப்பட்டது.5. NAS.
குட்-ஆன்-சிப் மற்றும் ஹைப்ரிட் சில்லுகள் இரண்டும் PDMS பிரதிகளைப் பயன்படுத்தி உருவாக்கப்பட்டன, அவை மென்மையான லித்தோகிராஃபி மூலம் சிலிக்கான் அச்சுகளிலிருந்து பிரிக்கப்பட்டு SU-8 உடன் வடிவமைக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு சிப்பிலும் உள்ள மைக்ரோ சேனல்களின் வடிவமைப்பு, ஷியர் ஸ்ட்ரெஸ் மற்றும் ஹைட்ரோடைனமிக் பிரஷர் போன்ற ஹைட்ரோடைனமிக்ஸைக் கருத்தில் கொண்டு தீர்மானிக்கப்படுகிறது. இரண்டு இணைக்கப்பட்ட இணையான நேரான மைக்ரோ சேனல்களைக் கொண்ட அசல் குட்-ஆன்-எ-சிப் வடிவமைப்பு (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 1a), தூண்டுவதற்கு ஒரு ஜோடி வளைந்த மைக்ரோ சேனல்களை உள்ளடக்கிய ஒரு சிக்கலான குட்-ஆன்-எ-சிப்பாக (விரிவாக்கப்பட்ட தரவு படம் 1b) உருவாகியுள்ளது. அதிகரித்த திரவ குடியிருப்பு நேரம், நேரியல் அல்லாத ஓட்ட வடிவங்கள் மற்றும் வளர்ப்பு செல்களின் மல்டிஆக்சியல் சிதைவு (படம் 2a–f) 12. மிகவும் சிக்கலான குடல் உயிரியக்கவியல் மீண்டும் உருவாக்கப்பட வேண்டியிருக்கும் போது, ​​சிக்கலான குட்-ஆன்-எ-சிப்களைத் தேர்ந்தெடுக்கலாம். சுருண்ட குடல்-சிப் இதேபோன்ற அளவிலான எபிதீலியல் கொண்ட ஒத்த கால கட்டத்தில் 3D உருவவியல் உருவாக்கத்தையும் வலுவாகத் தூண்டுகிறது என்பதை நாங்கள் நிரூபித்துள்ளோம். வளர்ப்பு செல் வகையைப் பொருட்படுத்தாமல், அசல் குடல்-சிப்புடன் ஒப்பிடும்போது வளர்ச்சி. எனவே, 3D உருவவியல் தூண்டுவதற்கு, நேரியல் மற்றும் சிக்கலான ஆன்-சிப் குடல் வடிவமைப்புகள் ஒன்றுக்கொன்று மாறக்கூடியவை. SU-8 வடிவங்களைக் கொண்ட சிலிக்கான் அச்சுகளில் குணப்படுத்தப்பட்ட PDMS பிரதிகள், சிதைவுக்குப் பிறகு எதிர்மறை அம்சங்களை வழங்கின (படம் 2a). ஒரு சிப்பில் குடலை உருவாக்க, தயாரிக்கப்பட்ட மேல் PDMS அடுக்கு ஒரு நுண்துளை PDMS படலத்துடன் தொடர்ச்சியாக பிணைக்கப்பட்டு, பின்னர் ஒரு கொரோனா சிகிச்சையாளரைப் பயன்படுத்தி மீளமுடியாத பிணைப்பு மூலம் கீழ் PDMS அடுக்குடன் சீரமைக்கப்பட்டது (படம் 2b–f). கலப்பின சில்லுகளை உருவாக்க, குணப்படுத்தப்பட்ட PDMS பிரதிகள் கண்ணாடி ஸ்லைடுகளுடன் பிணைக்கப்பட்டு, டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களுக்கு இடமளிக்கக்கூடிய ஒற்றை-சேனல் மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் சாதனங்களை உருவாக்கின (படம் 2h மற்றும் நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு படம் 2). PDMS பிரதி மற்றும் கண்ணாடியின் மேற்பரப்புகளை ஆக்ஸிஜன் பிளாஸ்மா அல்லது கொரோனா சிகிச்சையுடன் சிகிச்சையளிப்பதன் மூலம் பிணைப்பு செயல்முறை செய்யப்படுகிறது. சிலிகான் குழாயுடன் இணைக்கப்பட்ட மைக்ரோஃபேப்ரிகேட்டட் சாதனத்தை கிருமி நீக்கம் செய்த பிறகு, சாதன அமைப்பு குடல் எபிட்டிலியத்தின் 3D உருவவியல் செய்ய தயாராக இருந்தது (படம் 2g).
a, SU-8 வடிவமைக்கப்பட்ட சிலிக்கான் அச்சுகளிலிருந்து PDMS பாகங்களைத் தயாரிப்பதற்கான திட்ட விளக்கப்படம். குணப்படுத்தப்படாத PDMS கரைசல் ஒரு சிலிக்கான் அச்சு மீது (இடது) ஊற்றப்பட்டு, 60 °C (நடுவில்) குணப்படுத்தப்பட்டு (வலது) இடிக்கப்பட்டது. இடிக்கப்பட்ட PDMS துண்டுகளாக வெட்டப்பட்டு மேலும் பயன்பாட்டிற்காக சுத்தம் செய்யப்பட்டது.b, PDMS மேல் அடுக்கைத் தயாரிக்கப் பயன்படுத்தப்படும் சிலிக்கான் அச்சு புகைப்படம்.c, PDMS நுண்துளை சவ்வை உருவாக்கப் பயன்படுத்தப்படும் சிலிக்கான் அச்சு புகைப்படம்.d, மேல் மற்றும் கீழ் PDMS கூறுகள் மற்றும் கூடியிருந்த ஆன்-சிப் குடல் சாதனத்தின் தொடர் புகைப்படங்கள்.e, மேல், சவ்வு மற்றும் கீழ் PDMS கூறுகளின் சீரமைப்பின் திட்ட வரைபடம்.ஒவ்வொரு அடுக்கும் பிளாஸ்மா அல்லது கொரோனா சிகிச்சையால் மீளமுடியாத வகையில் பிணைக்கப்பட்டுள்ளது.f, மிகைப்படுத்தப்பட்ட சுருண்ட மைக்ரோசேனல்கள் மற்றும் வெற்றிட அறைகளுடன் புனையப்பட்ட குடல்-ஆன்-எ-சிப் சாதனத்தின் திட்ட வரைபடம்.g, மைக்ரோஃப்ளூய்டிக் செல் வளர்ப்பிற்கான குட்-ஆன்-எ-சிப்பை அமைத்தல்.சிலிகான் குழாய் மற்றும் சிரிஞ்சுடன் கூடிய ஒரு சிப்பில் புனையப்பட்ட குடல் a இல் வைக்கப்பட்டது. கவர்ஸ்லிப்.சிப் சாதனம் செயலாக்கத்திற்காக 150 மிமீ பெட்ரி டிஷின் மூடியில் வைக்கப்பட்டது. பைண்டர் சிலிகான் குழாயை மூடப் பயன்படுகிறது.h, கலப்பின சில்லுகளைப் பயன்படுத்தி கலப்பின சில்லு உற்பத்தி மற்றும் 3D உருவவியல் உருவாக்கத்தின் காட்சி ஸ்னாப்ஷாட்கள்.குடல் 3D உருவவியல் உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்காக குடல் எபிடெலியல் செல்களின் 2D மோனோலேயர்களை வளர்ப்பதற்கு சுயாதீனமாக தயாரிக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்வெல் செருகல்கள் கலப்பின சிப்பில் செருகப்பட்டன.டிரான்ஸ்வெல் செருகலில் நிறுவப்பட்ட செல் அடுக்கின் கீழ் மைக்ரோசேனல்கள் மூலம் ஊடகம் துளைக்கப்படுகிறது.அளவீட்டுப் பட்டி, 1 செ.மீ.h குறிப்பிலிருந்து அனுமதியுடன் மறுபதிப்பு செய்யப்பட்டது.4. எல்சேவியர்.
இந்த நெறிமுறையில், Caco-2 செல் வரிசை மற்றும் குடல் ஆர்கனாய்டுகள் எபிதீலியல் மூலங்களாகப் பயன்படுத்தப்பட்டன (படம் 3a). இரண்டு வகையான செல்களும் சுயாதீனமாக வளர்க்கப்பட்டன (பெட்டி 2 மற்றும் பெட்டி 5) மற்றும் ஆன்-சிப் குடல் அல்லது டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களின் ECM-பூசப்பட்ட மைக்ரோசேனல்களை விதைக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டன. செல்கள் சங்கமிக்கும் போது (> பிளாஸ்க்குகளில் 95% கவரேஜ்), டி-பிளாஸ்க்குகளில் வழக்கமாக வளர்க்கப்பட்ட Caco-2 செல்கள் (பாதைகள் 10 மற்றும் 50 க்கு இடையில்) அறுவடை செய்யப்படுகின்றன, இது ட்ரிப்சினைசேஷன் திரவத்தால் பிரிக்கப்பட்ட செல் இடைநீக்கங்களைத் தயாரிக்கிறது (பெட்டி 2). குடல் பயாப்ஸிகள் அல்லது அறுவை சிகிச்சை பிரிவுகளிலிருந்து மனித குடல் ஆர்கனாய்டுகள் கட்டமைப்பு நுண்ணிய சூழலை ஆதரிக்க 24-கிணறு தகடுகளில் உள்ள மேட்ரிகல் ஸ்காஃபோல்ட் டோம்களில் வளர்க்கப்பட்டன. அத்தியாவசிய மார்போஜென்கள் (Wnt, R-spondin மற்றும் Noggin போன்றவை) கொண்ட நடுத்தர மற்றும் பெட்டி 3 இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி தயாரிக்கப்பட்ட வளர்ச்சி காரணிகள் கொண்ட நடுத்தர அளவு ஆர்கனாய்டுகள் ~500 µm விட்டம் வரை வளரும் வரை ஒவ்வொரு நாளும் கூடுதலாக வழங்கப்பட்டன. முழுமையாக வளர்ந்த ஆர்கனாய்டுகள் அறுவடை செய்யப்பட்டு பிரிக்கப்படுகின்றன. ஒரு சிப்பில் குடல் அல்லது டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களில் விதைப்பதற்காக ஒற்றை செல்களாக (பெட்டி 5). முன்னர் நாங்கள் தெரிவித்தபடி, நோய் வகை 12, 13 (எ.கா. அல்சரேட்டிவ் பெருங்குடல் அழற்சி, கிரோன் நோய், பெருங்குடல் புற்றுநோய் அல்லது சாதாரண நன்கொடையாளர்), புண் தளம் (எ.கா., புண் மற்றும் புண் இல்லாத பகுதி) மற்றும் பாதையில் இரைப்பை குடல் இருப்பிடம் (எ.கா., டியோடெனம், ஜெஜூனம், இலியம், சீகம், பெருங்குடல் அல்லது மலக்குடல்) ஆகியவற்றின் படி இதை வேறுபடுத்தலாம். சிறுகுடல் ஆர்கனாய்டுகளை விட அதிக செறிவுள்ள மார்போஜென்கள் தேவைப்படும் பெருங்குடல் ஆர்கனாய்டுகளை (கொலாய்டுகள்) வளர்ப்பதற்கு பெட்டி 5 இல் உகந்த நெறிமுறையை நாங்கள் வழங்குகிறோம்.
a, குடல் சிப்பில் குடல் உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்கான பணிப்பாய்வு. 3D உருவ உருவாக்கத்தை நிரூபிக்க Caco-2 மனித குடல் எபிட்டிலியம் மற்றும் குடல் ஆர்கனாய்டுகள் இந்த நெறிமுறையில் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. தனிமைப்படுத்தப்பட்ட எபிதீலியல் செல்கள் தயாரிக்கப்பட்ட குடல்-ஆன்-எ-சிப் சாதனத்தில் (சிப் தயாரிப்பு) விதைக்கப்பட்டன. செல்கள் விதைக்கப்பட்டு (விதைக்கப்பட்டு) 0 (D0) நாளில் PDMS நுண்துளை சவ்வுடன் இணைக்கப்பட்டவுடன் (இணைக்கப்பட்டவுடன்), முதல் 2 நாட்களுக்கு (ஓட்டம், AP, D0-D2) நுண்துளை (AP) ஓட்டம் தொடங்கப்பட்டு பராமரிக்கப்படுகிறது. முழுமையான 2D மோனோலேயர் உருவாகும்போது, ​​சுழற்சி நீட்சி இயக்கங்களுடன் (நீட்சி, ஓட்டம், AP மற்றும் BL) பாசோலேட்டரல் (BL) ஓட்டமும் தொடங்கப்படுகிறது. 5 நாட்கள் மைக்ரோஃப்ளூயிடிக் கலாச்சாரத்திற்குப் பிறகு (மார்போஜெனிசிஸ், D5) குடல் 3D உருவ உருவாக்கம் தன்னிச்சையாக நிகழ்ந்தது. கட்ட மாறுபாடு படங்கள் ஒவ்வொரு சோதனை படி அல்லது நேரப் புள்ளியிலும் Caco-2 செல்களின் பிரதிநிதித்துவ உருவ அமைப்பைக் காட்டுகின்றன (பார் வரைபடம், 100 µm). குடலின் தொடர்புடைய அடுக்குகளை விளக்கும் நான்கு திட்ட வரைபடங்கள். உருவவியல் (மேல் வலது). திட்டவரைவில் உள்ள கோடுள்ள அம்புகள் திரவ ஓட்டத்தின் திசையைக் குறிக்கின்றன.b, நிறுவப்பட்ட 3D Caco-2 எபிட்டிலியத்தின் (இடது) மேற்பரப்பு இடவியலைக் காட்டும் SEM படம். பெரிதாக்கப்பட்ட பகுதியை (வெள்ளை கோடுள்ள பெட்டி) முன்னிலைப்படுத்தும் செருகல், 3D Caco-2 அடுக்கில் (வலது) மீளுருவாக்கம் செய்யப்பட்ட மைக்ரோவில்லியைக் காட்டுகிறது.c, நிறுவப்பட்ட Caco-2 3D, கிளாடின் (ZO-1, சிவப்பு) மற்றும் தொடர்ச்சியான தூரிகை எல்லை சவ்வுகளின் கிடைமட்ட முன்பக்கக் காட்சி மற்றும் F-ஆக்டின் (பச்சை) மற்றும் கருக்கள் (நீலம்) என்று பெயரிடப்பட்ட குடல் சில்லுகளில் எபிதீலியல் செல்களின் இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் கன்ஃபோகல் காட்சிப்படுத்தல். நடுத்தர திட்டவரைவைச் சுட்டிக்காட்டும் அம்புகள் ஒவ்வொரு கன்ஃபோகல் பார்வைக்கும் குவியத் தளத்தின் இருப்பிடத்தைக் குறிக்கின்றன.d, 3, 7, 9, 11, மற்றும் 13 நாட்களில் கட்ட மாறுபாடு நுண்ணோக்கி மூலம் பெறப்பட்ட ஒரு சிப்பில் வளர்க்கப்பட்ட ஆர்கனாய்டுகளில் உருவ மாற்றங்களின் நேரப் போக்கு. செருகல் (மேல் வலது) வழங்கப்பட்ட படத்தின் உயர் உருப்பெருக்கத்தைக் காட்டுகிறது.e, நாளில் எடுக்கப்பட்ட துண்டில் குடலில் நிறுவப்பட்ட ஆர்கனாய்டு 3D எபிட்டிலியத்தின் DIC ஃபோட்டோமிக்ரோகிராஃப். 7.f, எபிதீலியல் அடுக்கில் முறையே 3 நாட்களுக்கு (இடது) மற்றும் 13-நாள் (நடுத்தர) ஆர்கனாய்டுகளை குடல் சில்லுகளில் வளர்க்கப்பட்ட ஸ்டெம் செல்கள் (LGR5; மெஜந்தா), கோப்லெட் செல்கள் (MUC2; பச்சை), F-ஆக்டின் (சாம்பல்) மற்றும் கருக்கள் (சியான்) ஆகியவற்றிற்கான குறிப்பான்களைக் காட்டும் மேலடுக்கு இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் படங்கள். MUC2 சிக்னலிங் இல்லாமல் LGR5 சிக்னலிங் சிறப்பித்துக் காட்டும் நீட்டிக்கப்பட்ட தரவு படம் 3 ஐயும் காண்க. கலாச்சாரத்தின் 13 வது நாளில் செல்மாஸ்க் சாயத்துடன் (வலது) பிளாஸ்மா சவ்வை கறைபடுத்துவதன் மூலம் ஒரு சிப்பில் குடலில் நிறுவப்பட்ட 3D ஆர்கனாய்டு எபிட்டிலியத்தின் எபிதீலியல் நுண் அமைப்பை (வலது) காட்டும் ஃப்ளோரசன்ஸ் படங்கள். வேறுவிதமாகக் கூறப்படாவிட்டால் அளவுகோல் 50 μm ஆகும்.b குறிப்பிலிருந்து அனுமதியுடன் மறுபதிப்பு செய்யப்பட்டது.2. ஆக்ஸ்போர்டு பல்கலைக்கழக அச்சகம்; c குறிப்பிலிருந்து அனுமதியுடன் தழுவப்பட்டது.2. ஆக்ஸ்போர்டு பல்கலைக்கழக அச்சகம்; e மற்றும் f குறிப்பிலிருந்து அனுமதியுடன் தழுவப்பட்டது.12 கிரியேட்டிவ் காமன்ஸ் உரிமம் CC BY 4.0 இன் கீழ்.
ஒரு சிப்பில் உள்ள குடலில், வெற்றிகரமான ECM பூச்சுக்காக PDMS நுண்துளை சவ்வின் ஹைட்ரோபோபிக் மேற்பரப்பை மாற்றியமைக்க வேண்டியது அவசியம். இந்த நெறிமுறையில், PDMS சவ்வுகளின் ஹைட்ரோபோபிக்சிட்டியை மாற்ற இரண்டு வெவ்வேறு முறைகளைப் பயன்படுத்துகிறோம். Caco-2 செல்களை வளர்ப்பதற்கு, UV/ஓசோன் சிகிச்சை மூலம் மேற்பரப்பு செயல்படுத்தல் மட்டுமே PDMS மேற்பரப்பின் ஹைட்ரோபோபிக்சிட்டியைக் குறைக்கவும், ECM ஐ பூசவும், Caco-2 செல்களை PDMS மென்படலத்துடன் இணைக்கவும் போதுமானதாக இருந்தது. இருப்பினும், ஆர்கனாய்டு எபிட்டிலியத்தின் மைக்ரோஃப்ளூயிடிக் கலாச்சாரத்திற்கு, PDMS மைக்ரோசேனல்களுக்கு பாலிஎதிலினிமைன் (PEI) மற்றும் குளுடரால்டிஹைடை தொடர்ச்சியாகப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் ECM புரதங்களின் திறமையான படிவை அடைய வேதியியல் அடிப்படையிலான மேற்பரப்பு செயல்பாட்டுமயமாக்கல் தேவைப்படுகிறது. மேற்பரப்பு மாற்றத்திற்குப் பிறகு, ECM புரதங்கள் செயல்பாட்டு PDMS மேற்பரப்பை மறைக்க டெபாசிட் செய்யப்பட்டு, பின்னர் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட ஆர்கனாய்டு எபிட்டிலியத்தில் அறிமுகப்படுத்தப்பட்டன. செல்கள் இணைக்கப்பட்ட பிறகு, செல்கள் ஒரு முழுமையான மோனோலேயரை உருவாக்கும் வரை, கீழ் மைக்ரோசேனல் நிலையான நிலைமைகளைப் பராமரிக்கும் வரை, மேல் மைக்ரோசேனலில் ஊடகத்தை மட்டும் ஊடுருவி மைக்ரோஃப்ளூயிடிக் செல் கலாச்சாரம் தொடங்குகிறது. மேற்பரப்பு செயல்படுத்தல் மற்றும் ECM பூச்சுக்கான இந்த உகந்த முறை ஆர்கனாய்டு எபிட்டிலியத்தின் இணைப்பை செயல்படுத்துகிறது. PDMS மேற்பரப்பில் 3D உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்கு.
டிரான்ஸ்வெல் வளர்ப்புகளுக்கு செல் விதைப்பதற்கு முன் ECM பூச்சு தேவைப்படுகிறது; இருப்பினும், டிரான்ஸ்வெல் வளர்ப்புகளுக்கு நுண்துளை செருகிகளின் மேற்பரப்பை செயல்படுத்த சிக்கலான முன் சிகிச்சை படிகள் தேவையில்லை. டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளில் Caco-2 செல்களை வளர்ப்பதற்கு, நுண்துளை செருகிகளில் ECM பூச்சு பிரிக்கப்பட்ட Caco-2 செல்களின் இணைப்பை (<1 மணிநேரம்) மற்றும் இறுக்கமான சந்திப்பு தடை உருவாக்கத்தை (<1-2 நாட்கள்) துரிதப்படுத்துகிறது. டிரான்ஸ்வெல் செருகிகளில் கரிமத்தை வளர்க்க, தனிமைப்படுத்தப்பட்ட கரிமத்தை ECM-பூசப்பட்ட செருகிகளில் விதைக்கப்பட்டு, சவ்வு மேற்பரப்பில் (<3 மணிநேரம்) இணைக்கப்பட்டு, கரிமத்தை தடை ஒருமைப்பாட்டுடன் முழுமையான ஒற்றை அடுக்கை உருவாக்கும் வரை பராமரிக்கப்படுகிறது. கலப்பின சில்லுகளைப் பயன்படுத்தாமல் 24-கிணறு தட்டுகளில் டிரான்ஸ்வெல் வளர்ப்பு செய்யப்படுகிறது.
நிறுவப்பட்ட எபிதீலியல் அடுக்கின் பாசோலேட்டரல் அம்சத்திற்கு திரவ ஓட்டத்தைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் இன் விட்ரோ 3D மோர்போஜெனிசிஸைத் தொடங்கலாம். ஒரு சிப்பில் உள்ள குடலில், மேல் மற்றும் கீழ் மைக்ரோசேனல்களில் ஊடகம் ஊடுருவும்போது எபிதீலியல் மோர்போஜெனிசிஸ் தொடங்கியது (படம் 3a). முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி, திசை சுரக்கும் மார்போஜென் தடுப்பான்களைத் தொடர்ந்து அகற்றுவதற்கு கீழ் (பாசோலேட்டரல்) பெட்டியில் திரவ ஓட்டத்தை அறிமுகப்படுத்துவது மிகவும் முக்கியமானது. நுண்துளை சவ்வுகளில் பிணைக்கப்பட்ட செல்களுக்கு போதுமான ஊட்டச்சத்துக்கள் மற்றும் சீரம் வழங்கவும், லுமினல் ஷியர் அழுத்தத்தை உருவாக்கவும், நாங்கள் பொதுவாக ஒரு சிப்பில் குடலில் இரட்டை ஓட்டத்தைப் பயன்படுத்துகிறோம். கலப்பின சில்லுகளில், எபிதீலியல் மோனோலேயர்களைக் கொண்ட டிரான்ஸ்வெல் செருகல்கள் கலப்பின சில்லுகளில் செருகப்பட்டன. பின்னர், மைக்ரோசேனல் வழியாக நுண்துளை டிரான்ஸ்வெல் செருகலின் பாசோலேட்டரல் பக்கத்தின் கீழ் ஊடகம் பயன்படுத்தப்பட்டது. இரண்டு கலாச்சார தளங்களிலும் பாசோலேட்டரல் ஓட்டத்தைத் தொடங்கிய 3-5 நாட்களுக்குப் பிறகு குடல் மோர்போஜெனிசிஸ் ஏற்பட்டது.
நுண்பொறியியல் செய்யப்பட்ட 3D எபிதீலியல் அடுக்குகளின் உருவவியல் அம்சங்களை, கட்ட மாறுபாடு நுண்ணோக்கி, வேறுபட்ட குறுக்கீடு மாறுபாடு (DIC) நுண்ணோக்கி, SEM அல்லது இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் கன்ஃபோகல் நுண்ணோக்கி (படங்கள் 3 மற்றும் 4) உள்ளிட்ட பல்வேறு இமேஜிங் முறைகளைப் பயன்படுத்துவதன் மூலம் பகுப்பாய்வு செய்யலாம். 3D எபிதீலியல் அடுக்குகளின் வடிவம் மற்றும் நீட்டிப்பைக் கண்காணிக்க, கலாச்சாரத்தின் போது எந்த நேரத்திலும் கட்ட மாறுபாடு அல்லது DIC இமேஜிங் எளிதாகச் செய்ய முடியும். PDMS மற்றும் பாலியஸ்டர் படங்களின் ஒளியியல் வெளிப்படைத்தன்மை காரணமாக, குட்-ஆன்-எ-சிப் மற்றும் ஹைப்ரிட் சிப் தளங்கள் இரண்டும் சாதனத்தைப் பிரித்தல் அல்லது பிரித்தல் தேவையில்லாமல் நிகழ்நேரத்தில் இமேஜிங்கை வழங்க முடியும். இம்யூனோஃப்ளோரசன்ஸ் இமேஜிங்கைச் செய்யும்போது (படங்கள் 1, 3c, f மற்றும் 4b, c), செல்கள் பொதுவாக 4% (wt/vol) பாராஃபோர்மால்டிஹைடு (PFA), அதைத் தொடர்ந்து ட்ரைடன் X-100 மற்றும் 2% (wt/vol) ) போவின் சீரம் அல்புமின் (BSA) உடன் வரிசையாக சரி செய்யப்படுகின்றன. செல் வகையைப் பொறுத்து, வெவ்வேறு ஃபிக்ஸேட்டிவ்கள், ஊடுருவும் பொருட்கள் மற்றும் தடுக்கும் முகவர்கள் பயன்படுத்தப்பட்டது. பரம்பரை சார்ந்த செல் அல்லது பிராந்திய குறிப்பான்களை இலக்காகக் கொண்ட முதன்மை ஆன்டிபாடிகள், சிப்பில் உள்ள இடத்தில் அசையாமல் இருக்கும் செல்களை முன்னிலைப்படுத்தப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன, அதைத் தொடர்ந்து இரண்டாம் நிலை ஆன்டிபாடிகள், கருவை (எ.கா., 4′,6-டயமிடினோ-2-ஃபீனைலீன்) இண்டோல், DAPI) அல்லது F-ஆக்டின் (எ.கா., ஃப்ளோரசன்ட் முறையில் பெயரிடப்பட்ட ஃபல்லாய்டின்) குறிவைக்கும் எதிர் கறை சாயத்துடன் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. சளி உற்பத்தியைக் கண்டறிய (படம் 1, “செல் வேறுபாடு” மற்றும் “குடல் உடலியல்”), நுண்ணுயிர் செல்களின் சீரற்ற காலனித்துவம் (படம் 1, “ஹோஸ்ட்-மைக்ரோப் இணை-வளர்ப்பு”), நோயெதிர்ப்பு செல்களை ஆட்சேர்ப்பு செய்தல் (படம் 1, 'நோய் மாதிரியாக்கம்') அல்லது 3D எபிதீலியல் உருவவியலின் வரையறைகள் (படம் 3c,f மற்றும் 4b,c) ஆகியவற்றைக் கண்டறிய ஃப்ளோரசன்ஸ் அடிப்படையிலான நேரடி இமேஜிங் சிட்டுவிலும் செய்யப்படலாம். குறிப்பு விவரிக்கப்பட்டுள்ளபடி, கீழ் மைக்ரோசேனல் அடுக்கிலிருந்து மேல் அடுக்கைப் பிரிக்க சிப்பில் உள்ள குடலை மாற்றியமைக்கும்போது. படம் 2 இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, 3D எபிதீலியல் உருவவியல் மற்றும் நுனி தூரிகை எல்லையில் உள்ள மைக்ரோவில்லி. SEM மூலம் காட்சிப்படுத்த முடியும் (படம் 3b). அளவு PCR5 அல்லது ஒற்றை செல் RNA வரிசைமுறையைச் செய்வதன் மூலம் வேறுபாடு குறிப்பான்களின் வெளிப்பாட்டை மதிப்பிடலாம். இந்த வழக்கில், குடல் சில்லுகள் அல்லது கலப்பின சில்லுகளில் வளர்க்கப்படும் எபிதீலியல் செல்களின் 3D அடுக்குகள் ட்ரிப்சினைசேஷன் மூலம் அறுவடை செய்யப்பட்டு பின்னர் மூலக்கூறு அல்லது மரபணு பகுப்பாய்விற்குப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன.
a, ஒரு கலப்பின சிப்பில் குடல் உருவ உருவாக்கத்தைத் தூண்டுவதற்கான பணிப்பாய்வு. கலப்பின சிப் தளத்தில் 3D உருவ உருவாக்கத்தை நிரூபிக்க Caco-2 மற்றும் குடல் ஆர்கனாய்டுகள் இந்த நெறிமுறையில் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. பிரிக்கப்பட்ட எபிடெலியல் செல்கள் தயாரிக்கப்பட்ட டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களில் விதைக்கப்பட்டன (TW தயாரிப்பு; கீழே உள்ள படத்தைப் பார்க்கவும்). செல்கள் விதைக்கப்பட்டவுடன் (விதைக்கப்பட்ட) டிரான்ஸ்வெல் செருகல்களில் பாலியஸ்டர் சவ்வுகளுடன் இணைக்கப்பட்டவுடன், அனைத்து செல்கள் நிலையான நிலைமைகளின் கீழ் வளர்க்கப்பட்டன (TW கலாச்சாரம்). 7 நாட்களுக்குப் பிறகு, எபிடெலியல் செல்களின் 2D மோனோலேயரைக் கொண்ட ஒரு ஒற்றை டிரான்ஸ்வெல் செருகல் ஒரு கலப்பின சிப்பில் ஒருங்கிணைக்கப்பட்டு ஒரு பாசோலேட்டரல் ஓட்டத்தை (ஓட்டம், BL) அறிமுகப்படுத்தியது, இது இறுதியில் ஒரு 3D எபிடெலியல் அடுக்கை (மார்போஜெனிசிஸ்) உருவாக்க வழிவகுத்தது. ஒவ்வொரு சோதனை படியிலும் அல்லது நேரப் புள்ளியிலும் சாதாரண நன்கொடையாளர் (C103 கோடு) ஏறும் பெருங்குடலில் இருந்து பெறப்பட்ட மனித உறுப்பு எபிடெலியல் செல்களின் உருவவியல் அம்சங்களைக் காட்டும் கட்ட மாறுபாடு மைக்ரோகிராஃப்கள். மேல் அடுக்குகளில் உள்ள திட்ட வரைபடங்கள் ஒவ்வொரு படிக்கும் சோதனை உள்ளமைவை விளக்குகின்றன.b, கலப்பின சில்லுகள் (இடது திட்ட வரைபடம்) மேல்-கீழ் கன்ஃபோகல் நுண்ணோக்கி காட்சிகளுடன் ஆர்கனாய்டு எபிடெலியல் செல்களின் 3D உருவ உருவாக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும். வெவ்வேறு Z நிலைகளில் (மேல், நடு மற்றும் கீழ்; வலது திட்டவட்டமான மற்றும் தொடர்புடைய புள்ளியிடப்பட்ட கோடுகளைப் பார்க்கவும்) எடுக்கப்பட்டவை. வெளிப்படையான உருவவியல் பண்புகளைக் காட்டின. நிலையான டிரான்ஸ்வெல்லில் வளர்க்கப்பட்ட ஆர்கனாய்டு-பெறப்பட்ட எபிதீலியல் செல்களின் F-ஆக்டின் (சியான்), நியூக்ளியஸ் (சாம்பல்).c, ஃப்ளோரசன்ஸ் கன்ஃபோகல் மைக்ரோகிராஃப்கள் (3D கோணக் காட்சி) (TW; வெள்ளை கோடு பெட்டிக்குள் செருகப்பட்டது) மற்றும் கலப்பின சிப் (மிகப்பெரிய முழு ஷாட்) முறையே 2D மற்றும் 3D உருவ அமைப்பை ஒப்பிடுகிறது. 2D செங்குத்து குறுக்கு வெட்டு காட்சிகளின் ஒரு ஜோடி (மேல் வலது மூலையில் செருகப்பட்டது; "XZ") 2D மற்றும் 3D அம்சங்களையும் காட்டுகிறது. அளவுகோல் பட்டை, 100 µm.c குறிப்பிலிருந்து அனுமதியுடன் மறுபதிப்பு செய்யப்பட்டது.4. எல்சேவியர்.
வழக்கமான நிலையான வளர்ப்பு நிலைமைகளின் கீழ் அதே செல்களை (Caco-2 அல்லது குடல் ஆர்கனாய்டு எபிதீலியல் செல்கள்) இரு பரிமாண ஒற்றை அடுக்குகளாக வளர்ப்பதன் மூலம் கட்டுப்பாடுகளைத் தயாரிக்கலாம். குறிப்பாக, நுண் சேனல்களின் வரையறுக்கப்பட்ட அளவு திறன் காரணமாக ஊட்டச்சத்து குறைவு ஏற்படலாம் (அதாவது அசல் குடல்-சிப் வடிவமைப்பில் மேல் சேனலில் ~4 µL). எனவே, பாசோலேட்டரல் ஓட்டத்தைப் பயன்படுத்துவதற்கு முன்னும் பின்னும் எபிதீலியல் உருவ அமைப்பையும் ஒப்பிடலாம்.
மென்மையான லித்தோகிராஃபி செயல்முறை ஒரு சுத்தமான அறையில் செய்யப்பட வேண்டும். சிப்பில் உள்ள ஒவ்வொரு அடுக்குக்கும் (மேல் மற்றும் கீழ் அடுக்குகள் மற்றும் சவ்வுகள்) மற்றும் கலப்பின சில்லுகளுக்கும், மைக்ரோ சேனல்களின் உயரங்கள் வேறுபட்டதால், தனித்தனி சிலிக்கான் செதில்களில் வெவ்வேறு ஃபோட்டோமாஸ்க்குகள் பயன்படுத்தப்பட்டு தயாரிக்கப்பட்டன. சிப்பில் உள்ள குடலின் மேல் மற்றும் கீழ் மைக்ரோ சேனல்களின் இலக்கு உயரங்கள் முறையே 500 µm மற்றும் 200 µm ஆகும். கலப்பின சிப்பின் சேனல் இலக்கு உயரம் 200 µm ஆகும்.
அசிட்டோன் உள்ள ஒரு பாத்திரத்தில் 3 அங்குல சிலிக்கான் வேஃபரை வைக்கவும். தட்டை 30 வினாடிகள் மெதுவாகச் சுழற்றி, பின்னர் வேஃபரை காற்றில் உலர வைக்கவும். வேஃபரை IPA உள்ள ஒரு தட்டில் மாற்றி, பின்னர் தட்டை சுத்தம் செய்ய 30 வினாடிகள் சுழற்றுங்கள்.
சிலிக்கான் வேஃபர் மேற்பரப்பில் இருந்து கரிம எச்சங்களை அதிகபட்சமாக அகற்றுவதற்கு, ஒரு பிரன்ஹா கரைசல் (ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு மற்றும் செறிவூட்டப்பட்ட சல்பூரிக் அமிலத்தின் கலவை, 1:3 (தொகுதி/தொகுதி)) விருப்பமாகப் பயன்படுத்தப்படலாம்.
பிரன்ஹா கரைசல் மிகவும் அரிக்கும் தன்மை கொண்டது மற்றும் வெப்பத்தை உருவாக்குகிறது. கூடுதல் பாதுகாப்பு முன்னெச்சரிக்கைகள் அவசியம். கழிவுகளை அகற்றுவதற்கு, கரைசலை குளிர்வித்து சுத்தமான, உலர்ந்த கழிவு கொள்கலனுக்கு மாற்ற அனுமதிக்கவும். இரண்டாம் நிலை கொள்கலன்களைப் பயன்படுத்தவும் மற்றும் கழிவு கொள்கலன்களை சரியாக லேபிளிடவும். மேலும் விரிவான நடைமுறைகளுக்கு வசதியின் பாதுகாப்பு வழிகாட்டுதல்களைப் பின்பற்றவும்.
200 °C சூடான தட்டில் 10 நிமிடங்கள் வைப்பதன் மூலம் வேஃபர்களை நீரிழப்பு செய்யுங்கள். நீரிழப்புக்குப் பிறகு, வேஃபர் குளிர்விக்க காற்றில் ஐந்து முறை அசைக்கப்பட்டது.
சுத்தம் செய்யப்பட்ட சிலிக்கான் வேஃபரின் மையத்தில் ~10 கிராம் ஃபோட்டோரெசிஸ்ட் SU-8 2100 ஐ ஊற்றவும். வேஃபரின் மீது ஃபோட்டோரெசிஸ்ட்டை சமமாக பரப்ப ட்வீசரைப் பயன்படுத்தவும். எப்போதாவது வேஃபரை 65°C சூடான தட்டில் வைக்கவும், இதனால் ஃபோட்டோரெசிஸ்ட் ஒட்டும் தன்மையைக் குறைக்கவும் பரவ எளிதாகவும் இருக்கும். வேஃபரை நேரடியாக ஹாட் பிளேட்டில் வைக்க வேண்டாம்.
சுழல் பூச்சு இயக்குவதன் மூலம் வேஃபரில் SU-8 சமமாக விநியோகிக்கப்பட்டது. 100 rpm/s முடுக்கத்தில் 500 rpm இல் பரவ SU-8 இன் உள்வரும் சுழற்சியை 5-10 வினாடிகளுக்கு நிரல் செய்யவும். 1,500 rpm இல் 200 µm தடிமன் வடிவமைப்பிற்கு பிரதான சுழற்சியை அமைக்கவும், அல்லது 250 µm தடிமன் அடையவும் (சிப்பில் உள்ள குடலின் மேல் அடுக்குக்கு 500 µm உயரத்தை உருவாக்குகிறது; கீழே உள்ள "முக்கியமான படிகள்" ஐப் பார்க்கவும்) 1,200 rpm இல் 30 வினாடிகள் 300 rpm/s முடுக்கத்தில் அமைக்கவும்.
சிலிக்கான் வேஃபரில் உள்ள SU-8 வடிவத்தின் இலக்கு தடிமனுக்கு ஏற்ப பிரதான சுழல் வேகத்தை சரிசெய்யலாம்.
சிப்பில் உள்ள குடலின் மேல் அடுக்குக்கு 500 µm உயரமுள்ள SU-8 வடிவங்களை உருவாக்க, இந்த பெட்டியின் சுழல் பூச்சு மற்றும் மென்மையான பேக்கிங் படிகள் (படிகள் 7 மற்றும் 8) தொடர்ச்சியாக மீண்டும் மீண்டும் செய்யப்பட்டன (படி 9 ஐப் பார்க்கவும்) 250 µm இரண்டு அடுக்குகளை உருவாக்கின. SU-8 இன் தடிமனான அடுக்கு, இந்தப் பெட்டியின் படி 12 இல் UV வெளிப்பாடு மூலம் அடுக்கி இணைக்கப்படலாம், இதனால் 500 µm உயரமுள்ள அடுக்கு உருவாகிறது.
SU-8 பூசப்பட்ட வேஃபர்களை 65 °C வெப்பநிலையில் ஒரு சூடான தட்டில் 5 நிமிடங்களுக்கு கவனமாக வைப்பதன் மூலம் மென்மையாக சுடவும், பின்னர் அமைப்பை 95 °C க்கு மாற்றி கூடுதலாக 40 நிமிடங்கள் அடைகாக்கவும்.
மேல் மைக்ரோசேனலில் SU-8 வடிவத்தின் 500 μm உயரத்தை அடைய, இரண்டு 250 μm தடிமன் கொண்ட SU-8 அடுக்குகளை உருவாக்க 7 மற்றும் 8 படிகளை மீண்டும் செய்யவும்.
UV மாஸ்க் அலைனரைப் பயன்படுத்தி, வேஃபரின் வெளிப்பாடு நேரத்தைக் கணக்கிட உற்பத்தியாளரின் அறிவுறுத்தல்களின்படி ஒரு விளக்கு சோதனையைச் செய்யுங்கள். (வெளிப்பாடு நேரம், ms) = (வெளிப்பாடு அளவு, mJ/cm2)/(விளக்கு சக்தி, mW/cm2).
வெளிப்பாடு நேரத்தை தீர்மானித்த பிறகு, UV முகமூடி அலைனரின் முகமூடி வைத்திருப்பவரின் மீது புகைப்பட முகமூடியை வைக்கவும், மேலும் SU-8 பூசப்பட்ட வேஃபரின் மீது புகைப்பட முகமூடியை வைக்கவும்.
UV பரவலைக் குறைக்க, சிலிக்கான் வேஃபரின் SU-8 பூசப்பட்ட பக்கத்தில் நேரடியாக ஃபோட்டோமாஸ்க்கின் அச்சிடப்பட்ட மேற்பரப்பை வைக்கவும்.
முன்னரே தீர்மானிக்கப்பட்ட வெளிப்பாடு நேரத்திற்கு SU-8 பூசப்பட்ட வேஃபர் மற்றும் ஃபோட்டோமாஸ்க்கை செங்குத்தாக 260 mJ/cm2 UV ஒளியில் வெளிப்படுத்தவும் (இந்தப் பெட்டியின் படி 10 ஐப் பார்க்கவும்).
UV வெளிப்பாட்டிற்குப் பிறகு, 200 μm உயரமுள்ள வடிவங்களை உருவாக்க, SU-8-பூசப்பட்ட சிலிக்கான் வேஃபர்கள் ஒவ்வொரு சூடான தட்டிலும் 65°C வெப்பநிலையில் 5 நிமிடங்களுக்கும், 95°C வெப்பநிலையில் 15 நிமிடங்களுக்கும் சுடப்பட்டன. 500 μm உயரமுள்ள வடிவங்களை உருவாக்க, சுட்ட பிறகு நேரத்தை 95°C முதல் 30 நிமிடங்களுக்கு நீட்டிக்கவும்.
டெவலப்பர் ஒரு கண்ணாடி பாத்திரத்தில் ஊற்றப்பட்டு, சுடப்பட்ட வேஃபர் டிஷ்ஷில் வைக்கப்படுகிறது. கண்ணாடித் தகட்டின் அளவைப் பொறுத்து SU-8 டெவலப்பரின் அளவு மாறுபடலாம். வெளிப்படாத SU-8 ஐ முழுவதுமாக அகற்ற போதுமான SU-8 டெவலப்பரைப் பயன்படுத்துவதை உறுதிசெய்யவும். எடுத்துக்காட்டாக, 1 லிட்டர் கொள்ளளவு கொண்ட 150 மிமீ விட்டம் கொண்ட கண்ணாடி டிஷ்ஷைப் பயன்படுத்தும்போது, ​​~300 மில்லி SU-8 டெவலப்பரைப் பயன்படுத்தவும். அவ்வப்போது மென்மையான சுழற்சியுடன் 25 நிமிடங்களுக்கு அச்சுகளை உருவாக்கவும்.
உருவாக்கப்பட்ட அச்சுகளை ~10 மிலி புதிய டெவலப்பருடன் துவைக்கவும், பின்னர் ஒரு பைப்பெட்டைப் பயன்படுத்தி கரைசலை தெளிப்பதன் மூலம் ஐபிஏ செய்யவும்.
வேஃபரை ஒரு பிளாஸ்மா கிளீனரில் வைத்து, ஆக்ஸிஜன் பிளாஸ்மாவிற்கு (வளிமண்டல வாயு, இலக்கு அழுத்தம் 1 × 10−5 டோர், சக்தி 125 W) 1.5 நிமிடங்களுக்கு வெளிப்படுத்தவும்.
ஒரு வெற்றிட உலர்த்தி உள்ளே ஒரு கண்ணாடி சறுக்குடன் கூடிய ஒரு வெற்றிட உலர்த்தி பெட்டியில் வேஃபரை வைக்கவும். வேஃபர்கள் மற்றும் சறுக்குகளை அருகருகே வைக்கலாம். வெற்றிட உலர்த்தி பெட்டி ஒரு தட்டால் பல அடுக்குகளாகப் பிரிக்கப்பட்டால், சறுக்குகளை கீழ் அறையிலும், சறுக்குகளை மேல் அறையிலும் வைக்கவும். 100 μL ட்ரைக்ளோரோ(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) சிலேன் கரைசலை ஒரு கண்ணாடி சறுக்கில் விட்டு, சிலானைசேஷனுக்கு வெற்றிடத்தைப் பயன்படுத்துங்கள்.
உறைந்த Caco-2 செல்களின் குப்பியை 37°C நீர் குளியலில் கரைக்கவும், பின்னர் கரைந்த செல்களை 37°C வெப்பநிலையில் 15 மில்லி முன்கூட்டியே சூடாக்கப்பட்ட Caco-2 ஊடகம் கொண்ட T75 பிளாஸ்கிற்கு மாற்றவும்.
~90% சங்கமத்தில் Caco-2 செல்களைக் கடக்க, முதலில் Caco-2 ஊடகம், PBS மற்றும் 0.25% டிரிப்சின்/1 mM EDTA ஆகியவற்றை 37°C நீர் குளியலில் சூடாக்கவும்.
வெற்றிட ஆஸ்பிரேஷன் மூலம் ஊடகத்தை சுவாசிக்கவும். வெற்றிட ஆஸ்பிரேஷன் மீண்டும் செய்து புதிய PBS ஐச் சேர்ப்பதன் மூலம் 5 மிலி சூடான PBS உடன் செல்களை இரண்டு முறை கழுவவும்.