د Nature.com د لیدنې لپاره مننه. هغه براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ د CSS لپاره محدود ملاتړ لري. د غوره تجربې لپاره، موږ سپارښتنه کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت بند کړئ). په ورته وخت کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ به سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه وښیو.
د انسان د کولمو مورفوجینیسیس د 3D اپیتیلیل مایکرو آرکیټیکچر او ځایي تنظیم د کریپټ-ویلوس ځانګړتیاوې رامینځته کوي. دا ځانګړی جوړښت د کولمو هومیوستاسیس ساتلو لپاره اړین دی چې د بیسال کریپټ کې د سټیم حجرو طاق د خارجي مایکروبیل انټيجنونو او د دوی میټابولایټونو څخه ساتي. سربیره پردې، د کولمو ویلی او پټونکی بلغم د کولمو د مغز په سطح کې د محافظتي خنډ سره په فعاله توګه توپیر لرونکي اپیتیلیل حجرات وړاندې کوي. له همدې امله، د 3D اپیتیلیل جوړښتونو بیا جوړول د ان ویټرو کولمو ماډلونو جوړولو لپاره خورا مهم دي. د پام وړ، عضوي میمیټیک کولمو-آن-ا-چپ کولی شي د کولمو اپیتیلیل ناڅاپي 3D مورفوجینیسیس د ښه شوي فیزولوژیکي دندو او بایومیکانیکونو سره رامینځته کړي. دلته، موږ د بیا تولید وړ پروتوکول چمتو کوو ترڅو په کولمو کې د مایکرو فلوایډیک چپ او همدارنګه د ټرانس ویل ایمبیډ شوي هایبرډ چپ کې د کولمو مورفوجینیسیس په قوي ډول هڅوي. موږ د وسیلې جوړولو لپاره مفصل میتودونه تشریح کوو، په دودیز ترتیباتو کې د کاکو-2 یا د کولمو ارګانایډ اپیتیلیل حجرو کلتور کول او همدارنګه په مایکرو فلوایډیک پلیټ فارم کې، د 3D مورفوجینیسیس شاملول، او د تاسیس شوي ځانګړتیاو مشخص کول. درې بعدي اپیتیلیا د څو امیجینګ طریقو په کارولو سره. دا پروتوکول د 5 ورځو لپاره د بیسولیټرل مایع جریان کنټرولولو سره د فعال کولمو مایکرو آرکیټیکچر بیا رغونه ترلاسه کوي. زموږ د ان ویټرو مورفوجینیسیس میتود د فزیولوژیکي پلوه اړونده شین فشار او میخانیکي حرکت کاروي او د حجرو پیچلي انجینرۍ یا لاسوهنې ته اړتیا نلري، کوم چې ممکن د نورو موجوده تخنیکونو څخه غوره وي. موږ تصور کوو چې زموږ وړاندیز شوی پروتوکول کولی شي د بایومیډیکل څیړنې ټولنې لپاره پراخه اغیزې ولري، د بایومیډیکل، کلینیکي، او درمل جوړولو غوښتنلیکونو لپاره د ویټرو کې د درې بعدي کولمو اپیتیلیل پرتونو بیا رغولو لپاره یوه میتود چمتو کوي.
تجربو ښودلې چې د کولمو اپیتیلیل کاکو-2 حجرات چې په کولمو کې د چپ په 1,2,3,4,5 یا دوه پوړیز مایکرو فلوایډیک وسیلو کې کرل شوي دي 6,7 کولی شي د اصلي میکانیزم روښانه پوهیدو پرته په ویټرو کې په ناڅاپي ډول 3D مورفوجینیسیس څخه تیر شي. زموږ په وروستي څیړنه کې، موږ وموندله چې د کلتور وسیلو څخه د بیسولټریلي پټ شوي مورفوجین ضدونو لرې کول اړین او کافي دي ترڅو په ویټرو کې د 3D اپیتیلیل مورفوجینیسیس هڅوي، کوم چې د کاکو-2 او د ناروغ څخه اخیستل شوي کولمو ارګانایډونو لخوا ښودل شوی. اپیتیلیل حجرات تایید شول. پدې څیړنه کې، موږ په ځانګړي ډول د قوي Wnt مخالف، ډیک کوف-1 (DKK-1) د حجرو تولید او غلظت ویش باندې تمرکز وکړ، په کولمو کې او د ټرانس ویل داخلونو سره تعدیل شوي مایکرو فلوایډیک وسایلو کې، چې "هایبرډ چپ" نومیږي. موږ دا په ډاګه کوو چې د چپ کولمو ته د خارجي Wnt مخالفانو (لکه DKK-1، Wnt ریپریسر 1، پټ شوی فریزلډ پورې اړوند پروټین 1، یا سوګي-1) اضافه کول مورفوجینیسیس مخنیوی کوي یا د جوړ شوي 3D اپیتیلیل طبقې ګډوډوي، وړاندیز کوي چې د کلتور په جریان کې د مخالف فشار د کولمو مورفوجینیسیس ان ویټرو لپاره مسؤل دی. له همدې امله، د اپیتیلیل انٹرفیس کې د قوي مورفوجینیسیس ترلاسه کولو لپاره یوه عملي لاره دا ده چې د فعال فلش کولو (د مثال په توګه، په کولمو کې په چپ یا هایبرډ-آن-چپ پلیټ فارمونو کې) یا خپریدو له لارې په بیسولیټرل کمپارټمینټ کې د Wnt مخالفانو کچه لرې کړئ یا لږترلږه وساتئ. بیسولیټرل میډیا (د مثال په توګه، د ټرانس ویل داخلونو څخه په لویو بیسولیټرل زیرمو کې په څاه ګانو کې).
په دې پروتوکول کې، موږ د کولمو اپیتیلیل حجرو د پولیډیمیتیل سیلوکسین (PDMS) پر بنسټ د سوري غشا (قدمونه 6A، 7A، 8، 9) یا د ټرانس ویل داخلونو (قدمونه 6B، 7B، 8، 9) او هڅول شوي 3D مورفوجینیسیس ان ویټرو (قدم 10) باندې د کولمو اپیتیلیل حجرو د کلتور لپاره د کولمو په چپ مایکرو وسیلو او ټرانس ویل داخلولو وړ هایبرډ چپس (قدم 1-5) جوړولو لپاره یوه مفصله طریقه چمتو کوو. موږ د څو امیجنگ طریقو (قدمونه 11-24) پلي کولو سره د نسج ځانګړي هسټوجینیسیس او نسب پورې تړلي سیلولر توپیر ښودلو سیلولر او مالیکولر ځانګړتیاوې هم پیژندلي. موږ د انسان د کولمو اپیتیلیل حجرو په کارولو سره مورفوجینیسیس هڅوو، لکه کاکو-2 یا د کولمو ارګانایډونه، په دوه کلتوري بڼو کې د تخنیکي توضیحاتو سره چې پکې د سوري غشا سطحي تعدیل، د 2D مونولیرونو رامینځته کول، او د کولمو بایو کیمیکل او د بایو میخانیکي مایکرو چاپیریال بیا تولید شامل دي. په ویټرو کې. د 2D اپیتیلیل مونولیرونو څخه د 3D مورفوجینیسیس هڅولو لپاره، موږ مورفوجینیس لرې کړ. په دواړو کلتوري بڼو کې د کلتور د بیسولیټرل برخې ته د میډیم په جریان کې د مخالفانو. په پای کې، موږ د بیا تولید وړ 3D اپیتیلیل طبقې د کارونې استازیتوب چمتو کوو چې د مورفوجن پورې تړلي اپیتیلیل ودې، اوږدمهاله کوربه-مایکروبیوم شریک کلتورونو، د رنځجن انتان، التهابي ټپ، د اپیتیلیل خنډ اختلال، او پروبیوټیک پر بنسټ درملنې ماډل کولو لپاره کارول کیدی شي. مثال. اغیزې.
زموږ پروتوکول ممکن د ساینس پوهانو پراخه لړۍ لپاره په بنسټیزو (د بیلګې په توګه، د کولمو د مخاطي بیولوژي، د سټیم حجرو بیولوژي، او پرمختیایي بیولوژي) او تطبیقي څیړنو (د بیلګې په توګه، د درملو دمخه ازموینه، د ناروغیو ماډلینګ، د نسج انجینرۍ، او د معدې انټرولوژي) پراخه اغیزو کې ګټور وي. زموږ د پروتوکول د تکثیر او پیاوړتیا له امله چې د کولمو اپیتیلیم په ویټرو کې د 3D مورفوجینیسیس هڅوي، موږ تصور کوو چې زموږ تخنیکي ستراتیژي د هغو لیدونکو لپاره خپره کیدی شي چې د کولمو پراختیا، بیا رغونه یا هوموستاسیس په جریان کې د حجرو سیګنال کولو متحرکات مطالعه کوي. برسېره پردې، زموږ پروتوکول د مختلفو انتاني اجنټانو لکه نورو ویروس 8، شدید حاد تنفسي سنډروم کورونویرس 2 (SARS-CoV-2)، کلستریډیم ډیفیسیل، سالمونیلا ټایفیموریم 9 یا ویبریو کولرا لاندې د انتاناتو د پوښتنې لپاره ګټور دی. د ناروغۍ رنځپوهنې او رنځپوهنې لیدونکي هم ګټور دي. د آن-چپ کولمو مایکروفیسولوژی سیسټم کارول ممکن د اوږدمهاله ګډ کلتور 10 او د هاضمې (GI) لارې 11 کې د کوربه دفاع، معافیت غبرګونونو او د رنځجن پورې اړوند ټپ ترمیم وروسته ارزونې ته اجازه ورکړي. د لیکي کولمو سنډروم، سیلیک ناروغي، د کرون ناروغي، السرسی کولیټس، پوچایټس، یا خارښ وړ کولمو سنډروم سره تړلي نور GI اختلالات هغه وخت سمول کیدی شي کله چې د ناروغ د 3D کولمو اپیتیلیل پرتونو په کارولو سره د 3D کولمو اپیتیلیل پرتونو چمتو شي، پدې ناروغیو کې ویلوس ایټروفي، کریپټ لنډول، د میوکوسل زیان، یا خراب اپیتیلیل خنډ شامل دي. بایوپسي یا د سټیم حجرو څخه اخیستل شوي کولمو ارګانایډونه 12,13. د ناروغۍ چاپیریال د لوړ پیچلتیا ښه ماډل کولو لپاره، لوستونکي ممکن د ناروغۍ پورې اړوند حجرو ډولونه، لکه د ناروغ پیری فیرل وینې مونو نیوکلیئر حجرې (PBMCs)، د 3D کولمو ویلوس-کریپټ مایکرو آرکیټیکچر لرونکي ماډلونو کې اضافه کولو په اړه فکر وکړي. د نسج ځانګړي معافیت حجرې، 5.
څرنګه چې د درې بعدي اپیتیلیل مایکروسټرکچر د برخې کولو پروسې پرته تنظیم او لیدل کیدی شي، هغه لیدونکي چې په فضايي ټرانسکرپټومکس او لوړ ریزولوشن یا سوپر ریزولوشن امیجنگ کار کوي ممکن د اپیتیلیل طاقونو کې د جینونو او پروټینونو د ځایي ټیمپورل ډینامیکونو زموږ نقشه کولو کې علاقه ولري. په ټیکنالوژۍ کې علاقه لري. د مایکروبیل یا معافیتي محرکاتو ځواب. سربیره پردې، د اوږدمهاله کوربه مایکروبیوم کراسټالک 10، 14 چې د کولمو هومیوستاسیس همغږي کوي د 3 بعدي کولمو میوکوسال پرت کې د مختلف مایکروبیل ډولونو، مایکروبیل ټولنو یا فیکل مایکروبیوټا سره په ګډه کلتور کولو سره رامینځته کیدی شي، په ځانګړي توګه د کولمو په چپ کې. په پلیټ فارم کې. دا طریقه په ځانګړي ډول د هغو لیدونکو لپاره زړه راښکونکې ده چې د میوکوسل معافیت، معدې، انساني مایکروبیوم، کلتورومیک او کلینیکي مایکروبیولوژي مطالعه کوي چې غواړي په لابراتوار کې د پخوانۍ غیر کلتوري کولمو مایکروبیوټا کښت وکړي. که زموږ د ان ویټرو مورفوجینیسیس پروتوکول د توزیع وړ کلتور فارمیټونو سره تطابق شي، لکه د 24، 96 یا 384 څاه پلیټونو کې ملټي ویل داخلونه چې په دوامداره توګه د بیسولیټرل برخې ډکوي، پروتوکول هم هغو کسانو ته توزیع کیدی شي چې د درملو، بایو میډیکل یا د خوړو صنعت لپاره د لوړ تروپټ سکرینینګ یا اعتبار پلیټ فارمونه رامینځته کوي. د اصولو د ثبوت په توګه، موږ پدې وروستیو کې د ملټي پلیکس لوړ تروپټ مورفوجینیسیس سیسټم امکانات وښودل چې د 24 څاه پلیټ فارمیټ ته توزیع وړ دي. برسېره پردې، د عضوي-آن-ا-چپ ډیری محصولات سوداګریز شوي دي 16,17,18. له همدې امله، زموږ د ان ویټرو مورفوجینیسیس میتود اعتبار ګړندی کیدی شي او په بالقوه توګه د ډیری څیړنیزو لابراتوارونو، صنعت یا حکومت او تنظیم کونکو ادارو لخوا د ټرانسکرپټومیک کچې کې د ان ویټرو کولمو مورفوجینیسیس سیلولر بیا پروګرام کولو پوهیدو لپاره غوره کیدی شي. درمل یا بایوتراپیوټیک د درملو نوماندانو جذب او لیږد د 3D کولمو سروګیټونو یا د ګمرکي یا سوداګریز ارګان-آن-ا-چپ ماډلونو په کارولو سره ارزول شوی ترڅو د کولمو مورفوجینیسیس پروسې د تکثیر وړتیا ارزونه وکړي.
د کولمو اپیتیلیل مورفوجینیسیس مطالعې لپاره محدود شمیر تجربوي ماډلونه کارول شوي دي، چې په عمده توګه د تطبیق وړ پروتوکولونو نشتوالي له امله دي چې په ویټرو کې د 3D مورفوجینیسیس هڅوي. په حقیقت کې، د کولمو مورفوجینیسیس په اړه د اوسني پوهې ډیره برخه د څارویو مطالعاتو پر بنسټ والړ ده (د مثال په توګه، زیبرا فش20، موږکان21 یا چرګان22). په هرصورت، دوی کار او لګښت لري، په اخلاقي توګه د پوښتنې وړ کیدی شي، او تر ټولو مهم، د انسان پراختیایي پروسې په سمه توګه نه ټاکي. دا ماډلونه د څو اړخیزه پیمانه وړ ډول د ازموینې وړتیا کې هم خورا محدود دي. له همدې امله، زموږ د ویټرو کې د 3D نسج جوړښتونو بیا رامینځته کولو پروتوکول د ویوو څارویو ماډلونو او همدارنګه د نورو دودیزو جامد 2D حجرو کلتور ماډلونو کې ښه فعالیت کوي. لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي، د 3D اپیتیلیل جوړښتونو کارول موږ ته اجازه راکړه چې د مختلفو میوکوسال یا معافیت محرکاتو په ځواب کې د کریپټ-ویلوس محور کې د توپیر شوي حجرو ځایی ځایی کول معاینه کړو. د 3D اپیتیلیل پرتونه کولی شي د مطالعې لپاره ځای چمتو کړي چې څنګه مایکروبیل حجرې د کوربه فکتورونو په ځواب کې د ځایی طاقونو او ایکولوژیکي ارتقا جوړولو لپاره سیالي کوي (د مثال په توګه، داخلي د بهرني بلغم پرتونو په مقابل کې، د ... IgA او انټي مایکروبیل پیپټایډونه). سربیره پردې، د 3D اپیتیلیل مورفولوژي موږ ته اجازه راکوي چې پوه شو چې د کولمو مایکروبیوټا څنګه خپلې ټولنې جوړوي او په همغږۍ سره مایکروبیل میټابولیتونه تولیدوي (د بیلګې په توګه، لنډ زنځیر غوړ اسیدونه) چې د بیسال کریپټونو کې د حجرو تنظیم او د سټیم حجرو طاقونه جوړوي. دا ځانګړتیاوې یوازې هغه وخت ښودل کیدی شي کله چې 3D اپیتیلیل پرتونه په ویټرو کې رامینځته شي.
د کولمو د درې بعدي اپیتیلیل جوړښتونو د جوړولو لپاره زموږ د طریقې سربیره، د ان ویټرو څو طریقې شتون لري. د کولمو ارګانایډ کلتور د نسج انجینرۍ یو عصري تخنیک دی چې د ځانګړو مورفوجن شرایطو لاندې د کولمو سټیم حجرو د کښت پر بنسټ ولاړ دی 23,24,25. په هرصورت، د ټرانسپورټ تحلیل یا کوربه مایکروبیوم شریک کلتورونو لپاره د درې بعدي ارګانایډ ماډلونو کارول ډیری وختونه ننګونکي وي ځکه چې د کولمو لیمین د ارګانایډ دننه تړل شوی او له همدې امله، د مایکروبیل حجرو یا خارجي انټيجنونو په څیر د لومینل اجزاو معرفي کول محدود دي. د مایکرو انجیکټر په کارولو سره ارګانایډ لیمینونو ته لاسرسی ښه کیدی شي، 26,27 مګر دا طریقه برید کوونکې او کار ته اړتیا لري او د ترسره کولو لپاره ځانګړي پوهې ته اړتیا لري. سربیره پردې، دودیز ارګانایډ کلتورونه چې د جامد شرایطو لاندې د هایدروجیل سکافولډونو کې ساتل کیږي په سمه توګه د ویوو بایومیخانیکونو کې فعال منعکس نه کوي.
د څو څیړنیزو ډلو لخوا کارول شوي نورې طریقې د جیل په سطحه د جلا شوي انساني کولمو حجرو د کلتور کولو له لارې د کولمو اپیتیلیل جوړښت تقلید کولو لپاره د مخکې جوړ شوي 3D هایدروجیل سکافولډونو څخه کار اخلي. د 3D چاپ شوي، مایکرو مل شوي، یا لیتوګرافیکي جوړ شوي مولډونو په کارولو سره د هایدروجیل سکافولډونه جوړ کړئ. دا طریقه د جلا شوي اپیتیلیل حجرو په ویټرو کې د فزیولوژیکي پلوه اړونده مورفوجن ګریډینټ سره د ځان تنظیم شوي ترتیب ښیې، د لوړ اړخ تناسب اپیتیلیل جوړښت او سټروما-اپیتیلیل کراسټالک رامینځته کوي په سکافولډ کې د سټرومل حجرو په شاملولو سره. په هرصورت، د مخکې جوړ شوي سکافولډونو طبیعت ممکن د ناڅاپي مورفوجینیټیک پروسې د ښودلو مخه ونیسي. دا ماډلونه هم متحرک لومینل یا انټرسټیټیل جریان نه چمتو کوي، د مایع شین فشار نشتوالی چې د کولمو حجرو ته اړتیا لري چې مورفوجینیسیس تیر شي او فیزیولوژیکي فعالیت ترلاسه کړي. یوې بلې وروستۍ مطالعې د مایکرو فلوایډیک پلیټ فارم کې د هایدروجیل سکافولډونه او د لیزر ایچینګ تخنیکونو په کارولو سره د کولمو اپیتیلیل جوړښتونو نمونه کارولي. د موږک کولمو ارګانایډونه د کولمو ټیوبلر جوړښتونو جوړولو لپاره د ایچ شوي نمونو تعقیبوي، او د انټرا لومینل مایع جریان د مایکرو فلوایډیکس په کارولو سره بیا تکرار کیدی شي. ماډل. په هرصورت، دا ماډل نه خوځنده مورفوجینیټیک پروسې ښیې او نه هم د کولمو میخانوبیولوژیکي حرکتونه پکې شامل دي. د ورته ګروپ څخه د 3D چاپ کولو تخنیکونه وکولی شول چې د نوځنده مورفوجینیټیک پروسو سره کوچني کولمو ټیوبونه رامینځته کړي. د ټیوب دننه د کولمو د مختلفو برخو پیچلي جوړښت سره سره، دا ماډل د لومینل مایع جریان او میخانیکي خرابوالی هم نلري. سربیره پردې، د ماډل فعالیت ممکن محدود وي، په ځانګړي توګه د بایوپرنټینګ پروسې بشپړیدو وروسته، د تجربوي شرایطو یا د حجرو څخه حجرو تعاملاتو ته زیان رسوي. پرځای یې، زموږ وړاندیز شوی پروتوکول د کولمو د حرکت تقلید کولو لپاره د نوځنده مورفوجینیسیس، فزیولوژیکي پلوه اړونده شین فشار، بایومیکانیکونه، د خپلواک اپیکل او بیسولیټرل برخو لاسرسی، او د ماډلریټي پیچلي بیولوژیکي مایکرو چاپیریالونو بیا رامینځته کول چمتو کوي. له همدې امله، زموږ د ان ویټرو 3D مورفوجینیسیس پروتوکول ممکن د موجوده میتودونو ننګونو باندې بریالي کیدو لپاره بشپړونکی چلند چمتو کړي.
زموږ پروتوکول په بشپړ ډول د 3D اپیتیلیل مورفوجینیسیس باندې متمرکز دی، یوازې په کلتور کې اپیتیلیل حجرات او د شاوخوا حجرو نور ډولونه لکه میسینچیمال حجرات، انډوتیلیل حجرات، او معافیت حجرات نشته. لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي، زموږ د پروتوکول اصلي برخه د معرفي شوي میډیم په بیسولټرل اړخ کې پټ شوي مورفوجن مخنیوی کونکو لرې کولو سره د اپیتیلیل مورفوجینیسیس هڅونه ده. پداسې حال کې چې زموږ د کولمو-آن-ا-چپ او هایبرډ-آن-ا-چپ قوي ماډلریټي موږ ته اجازه راکوي چې د ناڅاپي 3D اپیتیلیل طبقه بیا جوړه کړو، اضافي بیولوژیکي پیچلتیاوې لکه اپیتیلیل-میسینچیمال تعاملات 33,34، د خارجي حجرو میټریکس (ECM) جمع 35 او زموږ په ماډل کې، د کریپټ-ویلوس ځانګړتیاوې چې په بیسال کریپټونو کې د سټیم حجرو طاقونه لیږدوي نور هم په پام کې نیول کیږي. په میسینچیم کې سټرومل حجرات (د مثال په توګه، فایبروبلاستونه) د ECM پروټینونو تولید او په ویوو کې د کولمو مورفوجینیسیس تنظیم کې کلیدي رول لوبوي 35,37,38. زموږ ماډل ته د میسینچیمال حجرو اضافه کول د د مورفوجینټیک پروسې او د حجرو د ضمیمې موثریت. د انډوتیلیل طبقه (یعنې، کیپلیرۍ یا لمفاټیک) د کولمو مایکرو چاپیریال کې د مالیکولر ټرانسپورټ 39 او معافیتي حجرو ګمارنې 40 تنظیم کولو کې مهم رول لوبوي. سربیره پردې، د واسکولیچر اجزا چې د نسج ماډلونو ترمنځ وصل کیدی شي یو شرط دی کله چې د نسج ماډلونه د څو ارګانونو تعاملاتو ښودلو لپاره ډیزاین شوي وي. له همدې امله، د انډوتیلیل حجرو ته اړتیا لیدل کیدی شي ترڅو د عضوي کچې ریزولوشن سره ډیر دقیق فزیولوژیکي ځانګړتیاوې ماډل کړي. د ناروغ څخه ترلاسه شوي معافیت حجرې د کولمو ناروغۍ د تقلید په شرایطو کې د طبیعي معافیت غبرګونونو، انټيجن پریزنټیشن، طبیعي تطبیقي معافیت کراسټالک، او نسج ځانګړي معافیت ښودلو لپاره هم اړین دي.
د هایبرډ چپس کارول د ګیټ-آن-ا-چپ په پرتله ډیر ساده دي ځکه چې د وسیلې تنظیم ساده دی او د ټرانس ویل داخلونو کارول د کولمو اپیتیلیم د اندازې وړ کلتور ته اجازه ورکوي. په هرصورت، د پالیسټر غشا سره په سوداګریزه توګه شتون لرونکي ټرانس ویل داخلونه لچک لرونکي ندي او نشي کولی د پیریسټالټیک په څیر حرکتونه تقلید کړي. سربیره پردې، د هایبرډ چپ کې ځای پر ځای شوي د ټرانس ویل داخل اپیکل کمپارټمینټ د اپیکل اړخ کې د هیڅ شین فشار پرته ثابت پاتې شو. په څرګنده توګه، د اپیکل کمپارټمینټ کې جامد ملکیتونه په ندرت سره په هایبرډ چپس کې د اوږدمهاله باکتریا ګډ کلتور فعالوي. پداسې حال کې چې موږ کولی شو د هایبرډ چپس کارولو پرمهال په ټرانس ویل داخلونو کې د 3D مورفوجینیسیس قوي هڅونه وکړو، د فزیولوژیکي پلوه اړونده بایومیکانیکونو او اپیکل مایع جریان کمښت ممکن د احتمالي غوښتنلیکونو لپاره د هایبرډ چپ پلیټ فارمونو امکان محدود کړي.
د کولمو په چپ او هایبرډ په چپ کلتورونو کې د انسان د کریپټ ویلس محور بشپړ پیمانه بیارغونه په بشپړ ډول نه ده رامینځته شوې. څرنګه چې مورفوجینیسیس د اپیتیلیل مونولییر څخه پیل کیږي، د 3D مایکرو آرکیټیکچرونه په لازمي ډول د ویوو کریپټونو سره مورفولوژیکي ورته والی نه وړاندې کوي. که څه هم موږ په مایکرو انجینر شوي 3D اپیتیلیم کې د بیسال کریپټ ډومین ته نږدې د حجرو نفوس مشخص کړ، کریپټ او ویلوس سیمې په روښانه ډول نه وې ټاکل شوې. که څه هم په چپ کې لوړ پورتنۍ چینلونه د مایکرو انجینر شوي اپیتیلیم لوړوالي لامل کیږي، اعظمي لوړوالی لاهم ~300-400 µm پورې محدود دی. په کوچنیو او لویو کولمو کې د انسان د کولمو کریپټونو اصلي ژوروالی په ترتیب سره ~135 µm او ~400 µm دی، او د کوچني کولمو ویلس لوړوالی ~600 µm41 دی.
د انځور کولو له نظره، د درې بعدي مایکرو آرکیټیکچرونو د سوپر ریزولوشن امیجنگ ممکن په چپ کې د کولمو پورې محدود وي، ځکه چې د هدف لینز څخه د اپیتیلیل طبقې ته اړین کاري فاصله د څو ملی مترو په ترتیب کې ده. د دې ستونزې د لرې کولو لپاره، ممکن لرې هدف ته اړتیا وي. سربیره پردې، د عکس اخیستلو نمونې چمتو کولو لپاره د پتلو برخو جوړول د PDMS د لوړ لچک له امله ننګونکي دي. سربیره پردې، څرنګه چې په چپ کې د کولمو د پرت په پرت مایکرو فابریکیشن د هر پرت ترمنځ دایمي چپکولو سره تړاو لري، نو د اپیتیلیل طبقې د سطحې جوړښت معاینه کولو لپاره د پورتنۍ طبقې خلاصول یا لرې کول خورا ننګونکي دي. د مثال په توګه، د سکین کولو الکترون مایکروسکوپ (SEM) په کارولو سره.
د PDMS هایدروفوبیکیت د مایکرو فلوایډیک پر بنسټ مطالعاتو کې یو محدودونکی فاکتور دی چې د هایدروفوبیک کوچنیو مالیکولونو سره معامله کوي، ځکه چې PDMS کولی شي په غیر مشخص ډول داسې هایدروفوبیک مالیکولونه جذب کړي. د PDMS بدیلونه ممکن د نورو پولیمیریک موادو سره په پام کې ونیول شي. په بدیل سره، د PDMS سطحې تعدیل (د مثال په توګه، د لیپوفیلیک موادو 42 یا پولی (ایتیلین ګلایکول) 43 سره پوښل) د هایدروفوبیک مالیکولونو جذب کمولو لپاره په پام کې نیول کیدی شي.
په پای کې، زموږ طریقه د لوړ-تروپټ سکرینینګ یا "یو-سایز-فټ-ټول" کاروونکي دوستانه تجربوي پلیټ فارم چمتو کولو له پلوه ښه مشخص شوې نه ده. اوسنی پروتوکول په هر مایکرو وسیلې کې د سرنج پمپ ته اړتیا لري، کوم چې په CO2 انکیوبیټر کې ځای نیسي او د لوی پیمانه تجربو مخه نیسي. دا محدودیت د نوښتګر کلتور فارمیټونو د پیمانه کولو وړتیا لخوا د پام وړ ښه کیدی شي (د مثال په توګه، 24-څاه، 96-څاه، یا 384-څاه سوري داخلونه چې د بیسولیټرل میډیا دوامداره بیا ډکولو او لرې کولو ته اجازه ورکوي).
د انسان د کولمو د اپیتیلیل د درې بعدي مورفوجینیسیس هڅولو لپاره، موږ د مایکرو فلوایډیک چپ کولمو وسیله کارولې چې دوه موازي مایکرو چینلونه او په مینځ کې یو لچک لرونکی سوری غشا لري ترڅو د لیمن-کیپلیري انٹرفیس رامینځته کړي. موږ د یو واحد چینل مایکرو فلوایډیک وسیله (هایبرډ چپ) کارول هم ښیې چې د ټرانس ویل داخلونو کې وده شوي قطبي اپیتیلیل پرتونو لاندې دوامداره بیسولیټرل جریان چمتو کوي. په دواړو پلیټ فارمونو کې، د مختلفو انساني کولمو اپیتیلیل حجرو مورفوجینیسیس د بیسولیټرل برخې څخه د مورفوجین مخالفانو لرې کولو لپاره د جریان د سمتي لاسوهنې پلي کولو سره ښودل کیدی شي. ټوله تجربوي پروسیجر (شکل 1) پنځه برخې لري: (i) د کولمو چپ یا ټرانس ویل داخلولو وړ هایبرډ چپ مایکرو فابریکیشن (مرحلې 1-5؛ بکس 1)، (ii) د کولمو اپیتیلیل حجرو (کاکو-2 حجرو) یا د انسان د کولمو ارګانایډونو چمتو کول؛ بکسونه ۲-۵)، (iii) د کولمو په چپس یا هایبرډ چپس باندې د کولمو اپیتیلیل حجرو کلتور (مرحلې ۶-۹)، (iv) د ویټرو کې د درې بعدي مورفوجینیسیس (مرحله ۱۰) او (v) شاملول ترڅو د درې بعدي اپیتیلیل مایکروسټرکچر ځانګړتیا وکړي (مرحلې ۱۱-۲۴). په پای کې، یو مناسب کنټرول ګروپ (لاندې نور بحث شوی) د اپیتیلیل مورفوجینیسیس د ځایي، وختي، مشروط، یا طرزالعملي کنټرولونو سره پرتله کولو سره د ان ویټرو مورفوجینیسیس اغیزمنتوب تاییدولو لپاره ډیزاین شوی.
موږ دوه مختلف کلتوري پلیټ فارمونه کارولي دي: د مستقیم چینلونو یا غیر خطي کنولوټ شوي چینلونو سره د کولمو په چپ کې، یا هایبرډ چپس چې د مایکرو فلوایډیک وسیلې کې ټرانس ویل (TW) داخلونه لري، لکه څنګه چې په بکس 1 کې تشریح شوي، او مرحله 1-5. "د وسیلې جوړول" د یو واحد چپ یا هایبرډ چپ جوړولو اصلي مرحلې ښیې. "د انسان د کولمو اپیتیلیل حجرو کلتور" د حجرو سرچینه (کاکو-2 یا د انسان د کولمو ارګانایډونه) او د کلتور پروسیجر تشریح کوي چې پدې پروتوکول کې کارول کیږي." ان ویټرو مورفوجینیسیس "ټول هغه مرحلې ښیې چې په کې کاکو-2 یا ارګانایډ څخه اخیستل شوي اپیتیلیل حجرات د کولمو په چپ یا د هایبرډ چپ په ټرانس ویل داخلونو کې کرل کیږي، وروسته د 3D مورفوجینیسیس شاملول او د ځانګړتیا لرونکي اپیتیلیل جوړښت رامینځته کول. د پروګرام ګام شمیره یا د بکس شمیره د هر تیر لاندې ښودل شوې ده. غوښتنلیک د کولمو د اپیتیلیل پرتونو د رامینځته شوي کارولو مثالونه وړاندې کوي، د بیلګې په توګه، د حجرو توپیر ځانګړتیا، د کولمو فزیولوژي مطالعات، د کوربه مایکروبیوم ایکوسیستمونو رامینځته کول، او د ناروغۍ ماډلینګ کې. د معافیت عکسونه په "حجروي توپیر" کې، نیوکلی، F-actin او MUC2 ښودل شوي چې د کولمو په چپ کې رامینځته شوي 3D Caco-2 اپیتیلیل طبقه کې څرګند شوي. د MUC2 سیګنالینګ په ګوبلیټ حجرو او د میوکوسا سطحو څخه پټ شوي بلغم کې شتون لري. د کولمو فزیولوژي کې فلوروسینټ عکسونه د سیلیلیک اسید او N-acetylglucosamine پاتې شونو لپاره د رنګ کولو له لارې تولید شوي بلغم ښیې چې د فلوروسینټ غنمو جراثیم اګلوټینین کاروي. په "کوربه-مایکروب شریک کلتورونو" کې دوه متقابل عکسونه په چپ کې په کولمو کې د کوربه-مایکروبیوم شریک کلتورونه ښیې. کیڼ پینل د E. coli شریک کلتور ښیې چې د مایکرو انجینر شوي 3D Caco-2 اپیتیلیل حجرو سره شنه فلوروسینټ پروټین (GFP) څرګندوي. ښي پینل د GFP E. coli ځایی کول ښیې چې د 3D Caco-2 اپیتیلیل حجرو سره ګډ کلتور شوی، وروسته د F-actin (سور) او نیوکلی (نیلي) سره د امیونو فلوروسینس سټینګ. د ناروغۍ ماډلینګ د باکتریایی انټيجنونو (د مثال په توګه، لیپوپولیساکرایډ، LPS) او معافیت سره د فزیولوژیکي ننګونې لاندې د کولمو سوزش چپس کې د صحي برعکس لیکي کولمو ښیې. حجرات (د مثال په توګه، PBMC؛ شنه). د کاکو-2 حجرات د 3D اپیتیلیل طبقې د جوړولو لپاره کرل شوي وو. د پیمانه بار، 50 µm. په لاندې قطار کې انځورونه: "د حجرو توپیر" د حوالې په اجازه سره تطبیق شوی.2. د اکسفورډ پوهنتون پریس؛ د حوالې 5 څخه په اجازې سره بیا تولید شوی. NAS؛ "کوربه-مایکروب شریک کلتور" د حوالې 3 څخه په اجازې سره تطبیق شوی. NAS؛ "د ناروغۍ ماډلینګ" د حوالې په اجازه سره تطبیق شوی.5. NAS.
د کولمو په چپ او هایبرډ چپس دواړه د PDMS نقلونو په کارولو سره جوړ شوي وو چې د نرم لیتوګرافي 1,44 لخوا د سیلیکون مولډونو څخه تخریب شوي او د SU-8 سره نمونه شوي. په هر چپ کې د مایکرو چینلونو ډیزاین د هایدروډینامیکونو لکه د شییر فشار او هایدروډینامیک فشار 1,4,12 په پام کې نیولو سره ټاکل کیږي. د کولمو په چپ کې اصلي ډیزاین (غزول شوی ډیټا انځور 1a)، چې دوه متوازي مستقیم مایکرو چینلونه پکې شامل وو، په پیچلي کولمو په چپ کې رامینځته شوی (غزول شوی ډیټا انځور 1b) چې د منحني مایکرو چینلونو یوه جوړه پکې شامله ده ترڅو د مایع د استوګنې وخت زیات کړي، غیر خطي جریان نمونې، او د کلتور شوي حجرو څو محوري خرابوالی (انځور 2a-f) 12. کله چې د کولمو ډیر پیچلي بایومیخانیکونه بیا جوړولو ته اړتیا ولري، پیچلي کولمو په چپس غوره کیدی شي. موږ ښودلې چې کنول شوی کولمو په چپ کې هم د اپیتیلیل ودې ورته درجې سره په ورته وخت چوکاټ کې 3D مورفوجینیسیس په کلکه هڅوي. د اصلي Gut-Chip په پرتله، د کلتور شوي حجرو ډول ته په پام سره. له همدې امله، د 3D مورفوجینیسیس هڅولو لپاره، د 3D مورفوجینیسیس هڅولو لپاره، خطي او پیچلي آن-چپ کولمو ډیزاینونه د تبادلې وړ دي. د SU-8 نمونو سره په سیلیکون مولډونو کې درملنه شوي PDMS نقلونه د ډیمولډینګ وروسته منفي ځانګړتیاوې چمتو کړې (انځور 2a). په چپ باندې د کولمو جوړولو لپاره، چمتو شوی پورتنۍ PDMS طبقه په ترتیب سره د سوري PDMS فلم سره تړل شوې وه او بیا د کورونا ټریټر (انځور 2b-f) په کارولو سره د نه بدلیدونکي اړیکې له لارې د ښکته PDMS طبقې سره سمون لري. د هایبرډ چپس جوړولو لپاره، درملنه شوي PDMS نقلونه د شیشې سلایډونو سره تړل شوي ترڅو د واحد چینل مایکرو فلوایډیک وسایل رامینځته کړي چې کولی شي د ټرانس ویل داخلونه ځای په ځای کړي (انځور 2h او پراخ شوي ډیټا شکل 2). د اړیکې پروسه د PDMS نقل او شیشې سطحې د اکسیجن پلازما یا کورونا درملنې سره درملنه کولو سره ترسره کیږي. د سیلیکون ټیوب سره وصل شوي مایکرو فابریکیټ شوي وسیلې تعقیم کولو وروسته، د وسیلې تنظیم د کولمو اپیتیلیم (انځور 2g) د 3D مورفوجینیسیس ترسره کولو لپاره چمتو و.
الف، د SU-8 نمونې لرونکي سیلیکون مولډونو څخه د PDMS برخو د چمتو کولو سکیمیک انځور. د PDMS نه جوړ شوی محلول په سیلیکون مولډ (کیڼ اړخ) کې اچول شوی، په 60 °C (منځنی) کې روغ شوی او (ښي اړخ) تخریب شوی. تخریب شوی PDMS په ټوټو وویشل شو او د نورو کارولو لپاره پاک شو. ب، د سیلیکون مولډ عکس چې د PDMS پورتنۍ طبقې چمتو کولو لپاره کارول کیږي. ج، د سیلیکون مولډ عکس چې د PDMS سوري غشا جوړولو لپاره کارول کیږي. د، د پورتنۍ او ښکته PDMS اجزاو او راټول شوي آن-چپ کولمو وسیلې د عکسونو لړۍ. e، د پورتنۍ، جھلی، او ښکته PDMS اجزاو د سمون سکیمیک. هر پرت د پلازما یا کورونا درملنې لخوا په نه بدلیدونکي ډول تړل شوی. f، د جوړ شوي کولمو-آن-چپ وسیلې سکیمیک د سوپر امپوز شوي کنولوټ شوي مایکرو چینلونو او ویکیوم چیمبرونو سره. د مثال په توګه، د مایکرو فلوایډیک حجرو کلتور لپاره د کولمو-آن-چپ تنظیم کول. د سیلیکون ټیوب او سرنج سره راټول شوي په چپ کې جوړ شوی کولمو په پوښ ​​سلیپ کې ځای په ځای شوی و. د چپ وسیله په د پروسس لپاره د 150 ملي میتر پیټري ډش پوښ. باندر د سیلیکون ټیوب د تړلو لپاره کارول کیږي. h، د هایبرډ چپ جوړونې او د هایبرډ چپس په کارولو سره د 3D مورفوجینیسیس بصري سنیپ شاټونه. د ټرانس ویل داخلونه په خپلواکه توګه چمتو شوي ترڅو د کولمو اپیتیلیل حجرو 2D مونو لییرونه کلتور کړي ترڅو د کولمو 3D مورفوجینیسیس هڅوي. منځنی د ټرانس ویل داخل کې د رامینځته شوي حجرو پرت لاندې د مایکرو چینلونو له لارې پرفیوز کیږي. د پیمانه بار، 1 سانتي متره. h د حوالې څخه اجازه سره بیا چاپ شوی. 4. ایلسویر.
په دې پروتوکول کې، د کاکو-۲ حجرو لاین او د کولمو ارګانایډونه د اپیتیلیل سرچینو په توګه کارول شوي وو (انځور ۳a). دواړه ډوله حجرې په خپلواکه توګه کرل شوي (بکس ۲ او بکس ۵) او د آن-چپ کولمو یا ټرانس ویل داخلونو د ECM-لیپټ شوي مایکرو چینلونو تخم کولو لپاره کارول شوي. کله چې حجرې سره یوځای شي (> په فلاسکونو کې ۹۵٪ پوښښ)، په T-فلاسکونو کې په منظم ډول کرل شوي کاکو-۲ حجرې (د ۱۰ او ۵۰ لارو ترمنځ) د ټریپسینائزیشن مایع (بکس ۲) لخوا جلا شوي حجرو تعلیق چمتو کولو لپاره راټولیږي. د کولمو بایوپسي یا جراحي ریسیکشن څخه د انسان کولمو ارګانایډونه د میټریګل سکافولډ ډومونو کې په ۲۴ څاه پلیټونو کې کرل شوي ترڅو د جوړښتي مایکرو چاپیریال ملاتړ وکړي. هغه منځنی چې اړین مورفوجینونه لري (لکه Wnt، R-spondin، او Noggin) او د ودې عوامل چمتو شوي لکه څنګه چې په بکس ۳ کې تشریح شوي هره بله ورځ ضمیمه شوي تر هغه چې ارګانایډونه ~۵۰۰ µm قطر ته وده ورکړي. په بشپړ ډول وده شوي ارګانایډونه راټول شوي او په کولمو کې د تخم کولو لپاره په واحد حجرو کې جلا شوی یا په چپ کې ټرانس ویل داخلوي (بکس 5). لکه څنګه چې موږ مخکې راپور ورکړی، دا د ناروغۍ ډول 12,13 (د بیلګې په توګه د السرسی کولیټس، د کرون ناروغي، د کولوریکټل سرطان، یا نورمال ډونر)، د زخم ځای (د بیلګې په توګه، د زخم په مقابل کې د غیر زخم شوي ساحې) او په لاره کې د معدې موقعیت (د بیلګې په توګه، ډیوډینم، جیجونم، ایلیم، سیکم، کولون، یا مقعد) سره سم توپیر کیدی شي. موږ په 5 بکس کې د کولونیک ارګانایډونو (کولایډونو) د کښت کولو لپاره یو غوره شوی پروتوکول چمتو کوو چې معمولا د کوچني کولمو ارګانایډونو په پرتله د مورفوجن لوړ غلظت ته اړتیا لري.
a، د کولمو په چپ کې د کولمو مورفوجینیسیس د شاملولو لپاره کاري جریان. په دې پروتوکول کې د کاکو-2 د انسان د کولمو اپیتیلیم او د کولمو ارګانایډونه د 3D مورفوجینیسیس ښودلو لپاره کارول کیږي. جلا شوي اپیتیلیل حجرات د چمتو شوي کولمو په چپ وسیله (چپ چمتو کول) کې تخم شوي وو. یوځل چې حجرې تخم شي (تخم شي) او د PDMS مسام غشا سره وصل شي (وصل شي) په ورځ 0 (D0)، د اپیکل (AP) جریان د لومړیو 2 ورځو لپاره پیل او ساتل کیږي (بهیر، AP، D0-D2). د بیسولټرل (BL) جریان هم د سایکلیک سټرچینګ حرکتونو (غزیدل، جریان، AP او BL) سره پیل کیږي کله چې بشپړ 2D مونولیر جوړ شي. د کولمو 3D مورفوجینیسیس د مایکرو فلوایډیک کلتور (مورفوجینیسیس، D5) د 5 ورځو وروسته په ناڅاپي ډول رامینځته شو. د مرحلې برعکس انځورونه په هر تجربوي مرحله یا وخت نقطه کې د کاکو-2 حجرو نماینده مورفولوژي ښیې (د بار ګراف، 100 µm). څلور سکیماتیک ډیاګرامونه چې د کولمو مورفوجینیسیس اړونده کاسکیډونه ښیې (پورته ښي خوا ته). په سکیماتیک کې ډش شوي تیرونه د مایع جریان لوري استازیتوب کوي. b، د SEM انځور چې د تاسیس شوي 3D Caco-2 اپیتیلیم (کیڼ اړخ) د سطحې ټوپولوژي ښیې. هغه انسیټ چې لوی شوی ساحه (سپین ډیش شوی بکس) په 3D Caco-2 طبقه (ښي اړخ) کې بیا تولید شوی مایکروویلي ښیې. c، د تاسیس شوي Caco-2 3D افقی مخکینۍ لید، کلاډین (ZO-1، سور) او دوامداره برش سرحدي غشا چې د F-actin (شنه) او نیوکلی (نیلي) لیبل شوي د کولمو په چپسونو کې د اپیتیلیل حجرو امیونو فلوروسینس کنفوکال لید. تیرونه چې منځنۍ سکیماتیک ته اشاره کوي د هر کنفوکال لید لپاره د فوکل الوتکې موقعیت په ګوته کوي. d، د 3، 7، 9، 11، او 13 ورځو کې د مرحلې برعکس مایکروسکوپي لخوا ترلاسه شوي چپ باندې کلتور شوي ارګانایډونو کې د مورفولوژیکي بدلونونو وخت کورس. انسیټ (پورته ښیې) د چمتو شوي عکس لوړ میګنیفیکیشن ښیې. e، د 7 ورځې په ورځ اخیستل شوي ټوټې کې په کولمو کې رامینځته شوي د ارګانایډ 3D اپیتیلیم DIC فوټومیکروګراف. f، د امیونو فلوروسینس عکسونه چې د سټیم حجرو (LGR5؛ میجنټا)، ګوبلیټ حجرو (MUC2؛ شنه)، F-ایکټین (خړ) او نیوکلی (سیان) لپاره مارکرونه ښیې چې په ترتیب سره د 3 ورځو لپاره د کولمو په چپسونو کې کرل شوي، په ترتیب سره (کیڼ اړخ) او 13 ورځو (منځنی) ارګانایډونه د اپیتیلیل طبقې باندې. د پراخ شوي معلوماتو شکل 3 هم وګورئ، کوم چې د MUC2 سیګنال کولو پرته LGR5 سیګنالینګ روښانه کوي. د فلوروسینس عکسونه د 3D ارګانایډ اپیتیلیل اپیتیلیل مایکرو جوړښت (ښي اړخ) ښیې چې د کلتور په 13 ورځ د سیل ماسک رنګ (ښي اړخ) سره د پلازما جھلی رنګ کولو سره په چپ کې په کولمو کې رامینځته شوی. د پیمانه بار 50 μm دی پرته لدې چې بل ډول وویل شي. b د حوالې څخه د اجازې سره بیا چاپ شوی.2. د اکسفورډ پوهنتون پریس؛ c د حوالې څخه د اجازې سره تطبیق شوی.2. د اکسفورډ پوهنتون پریس؛ e او f د حوالې څخه د اجازې سره تطبیق شوی.12 د تخلیقي کامنز جواز CC BY 4.0 لاندې.
په یوه چپ کې په کولمو کې، د بریالي ECM کوټینګ لپاره د PDMS مسام لرونکي غشا هایدروفوبیک سطح تعدیل کول اړین دي. پدې پروتوکول کې، موږ د PDMS غشا هایدروفوبیکیت تعدیل کولو لپاره دوه مختلف میتودونه پلي کوو. د Caco-2 حجرو د کلتور کولو لپاره، یوازې د UV/اوزون درملنې لخوا د سطحې فعالول د PDMS سطحې هایدروفوبیکیت کمولو لپاره کافي وو، ECM پوښ کړئ او Caco-2 حجرې PDMS جھلی سره وصل کړئ. په هرصورت، د ارګانایډ اپیتیلیم مایکروفلوایډیک کلتور د کیمیاوي پر بنسټ د سطحې فعالیت ته اړتیا لري ترڅو د PDMS مایکرو چینلونو ته په ترتیب سره د پولیټیلینیمین (PEI) او ګلوټارالډیهایډ پلي کولو سره د ECM پروټینونو مؤثره زیرمه ترلاسه کړي. د سطحې تعدیل وروسته، د ECM پروټینونه د فعال شوي PDMS سطح پوښلو لپاره زیرمه شوي او بیا جلا شوي ارګانایډ اپیتیلیم ته معرفي شوي. وروسته له دې چې حجرې وصل شي، د مایکروفلوایډیک حجرو کلتور یوازې د پورتنۍ مایکرو چینل ته د میډیم په پرفیوز کولو سره پیل کیږي تر هغه چې حجرې بشپړ مونو لییر جوړ کړي، پداسې حال کې چې ټیټ مایکرو چینل جامد شرایط ساتي. د سطحې فعالولو او ECM کوټینګ لپاره دا غوره شوی میتود د ارګانایډ اپیتیلیم ضمیمه هڅوي ترڅو هڅونه وکړي. د PDMS په سطحه کې درې بعدي مورفوجینیسیس.
د ټرانس ویل کلتورونه د حجرو د تخم کولو دمخه د ECM پوښښ ته هم اړتیا لري؛ په هرصورت، د ټرانس ویل کلتورونه د سوري شوي داخلونو سطح فعالولو لپاره پیچلي دمخه درملنې مرحلو ته اړتیا نلري. د ټرانس ویل داخلونو کې د کاکو-2 حجرو د ودې لپاره، د سوري شوي داخلونو باندې د ECM پوښښ د جلا شوي کاکو-2 حجرو ضمیمه (<1 ساعت) او د سخت جنکشن خنډ جوړښت (<1-2 ورځې) ګړندی کوي. د ټرانس ویل داخلونو کې د کلتور ارګانایډونو لپاره، جلا شوي ارګانایډونه د ECM پوښ شوي داخلونو کې تخم کیږي، د غشا سطح سره وصل کیږي (<3 ساعته) او تر هغه وخته پورې ساتل کیږي چې ارګانایډونه د خنډ بشپړتیا سره بشپړ مونو لییر جوړ کړي. ټرانس ویل کلتورونه د هایبرډ چپس کارولو پرته په 24 څاه پلیټونو کې ترسره کیږي.
د ان ویټرو 3D مورفوجینیسیس د یو تاسیس شوي اپیتیلیل طبقې بیسولیټرل اړخ ته د مایع جریان پلي کولو سره پیل کیدی شي. په یوه چپ کې په کولمو کې، اپیتیلیل مورفوجینیسیس هغه وخت پیل شو کله چې میډیم په پورتنۍ او ښکته مایکرو چینلونو کې پرفیوز شو (انځور 3a). لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي، دا خورا مهمه ده چې د سمتي پټ شوي مورفوجین مخنیوی کونکو دوامداره لرې کولو لپاره په ټیټ (بیسولولیټرل) برخې کې د مایع جریان معرفي کړئ. د مسام غشا باندې تړلو حجرو ته کافي مغذي مواد او سیرم چمتو کولو او د لومینل شین فشار رامینځته کولو لپاره، موږ معمولا په کولمو کې دوه ګونی جریان په چپ کې پلي کوو. په هایبرډ چپس کې، د اپیتیلیل مونولیرونو لرونکي ټرانس ویل داخلونه هایبرډ چپس کې داخل شوي. بیا، میډیم د مایکرو چینل له لارې د مسام ټرانس ویل داخل د بیسولیټرل اړخ لاندې پلي شو. د کولمو مورفوجینیسیس په دواړو کلتوري پلیټ فارمونو کې د بیسولیټرل جریان پیل کولو څخه 3-5 ورځې وروسته رامینځته شو.
د مایکرو انجینر شوي 3D اپیتیلیل پرتونو مورفولوژیکي ځانګړتیاوې د مختلفو امیجنگ طریقو په پلي کولو سره تحلیل کیدی شي، پشمول د فیز کنټراسټ مایکروسکوپي، ډیفرینشل انټرفیرنس کنټراسټ (DIC) مایکروسکوپي، SEM، یا امیونو فلوروسینس کنفوکال مایکروسکوپي (انځورونه 3 او 4). د فیز کنټراسټ یا DIC امیجنگ په اسانۍ سره د کلتور په جریان کې په هر وخت کې ترسره کیدی شي ترڅو د 3D اپیتیلیل پرتونو شکل او پروټروژن وڅاري. د PDMS او پالیسټر فلمونو د نظري شفافیت له امله، د کولمو پر چپ او هایبرډ چپ پلیټ فارمونه دواړه کولی شي د وسیلې د برخې کولو یا جلا کولو اړتیا پرته په ریښتیني وخت کې په سیټو امیجنگ چمتو کړي. کله چې د امیونو فلوروسینس امیجنگ ترسره کیږي (انځورونه 1، 3c، f او 4b، c)، حجرې معمولا د 4٪ (wt/vol) پارافارمالډیهایډ (PFA) سره تنظیم شوي، وروسته د ټریټون X-100 او 2٪ (wt/vol)) د غواګانو سیرم البومین (BSA)، په ترتیب سره. د حجرو ډول پورې اړه لري، مختلف فکسیټیو، پارمیبلائزرونه، او بلاک کولو اجنټان کیدی شي کارول کیږي. لومړني انټي باډي چې د نسب پورې تړلي حجرو یا سیمې نښه کونکو په نښه کوي د چپ په موقعیت کې غیر فعال شوي حجرو روښانه کولو لپاره کارول کیږي، وروسته ثانوي انټي باډي د کاونټرسټین رنګ سره یوځای کیږي چې نیوکلیوس (د مثال په توګه، 4′، 6-diamidino-2-phenylene) indole، DAPI) یا F-actin (د مثال په توګه، فلوروسینټ لیبل شوی phalloidin) په نښه کوي. د فلوروسینس پر بنسټ ژوندی عکس اخیستل هم د بلغم تولید کشف کولو لپاره په موقعیت کې ترسره کیدی شي (شکل 1، "حجروي توپیر" او "د کولمو فزیولوژي")، د مایکروبیل حجرو تصادفي استعمار (شکل 1، "کوربه-مایکروب ګډ کلتور")، د معافیت حجرو استخدام (شکل 1، 'د ناروغۍ ماډلینګ') یا د 3D اپیتیلیل مورفولوژي شکلونه (شکل 3c، f او 4b، c). کله چې په چپ کې کولمو تعدیل کړئ ترڅو پورتنۍ طبقه د ټیټ مایکرو چینل پرت څخه جلا کړئ، لکه څنګه چې په ریف کې تشریح شوي. لکه څنګه چې په 2 شکل کې ښودل شوي، د 3D اپیتیلیل مورفولوژي او همدارنګه د اپیکل برش په سرحد کې مایکروویلي کولی شي د SEM لخوا لیدل کیدی شي (انځور 3b). د توپیر نښه کونکو څرګندونه د کمیتي PCR5 یا واحد حجروي RNA ترتیب کولو سره ارزول کیدی شي. پدې حالت کې، د کولمو چپس یا هایبرډ چپس کې کرل شوي اپیتیلیل حجرو 3D پرتونه د ټریپسینائزیشن لخوا راټول شوي او بیا د مالیکولر یا جینیاتي تحلیل لپاره کارول کیږي.
الف، په هایبرډ چپ کې د کولمو مورفوجینیسیس د شاملولو لپاره کاري جریان. په دې پروتوکول کې کاکو-2 او د کولمو ارګانایډونه کارول کیږي ترڅو په هایبرډ چپ پلیټ فارم کې د 3D مورفوجینیسیس وښیې. جلا شوي اپیتیلیل حجرات په چمتو شوي ټرانس ویل داخلونو کې تخم شوي وو (TW چمتووالی؛ لاندې انځور وګورئ). یوځل چې حجرات تخم شوي (تخم شوي) او په ټرانس ویل داخلونو کې د پالیسټر غشا سره وصل شول، ټول حجرات د جامد شرایطو لاندې کلتور شوي وو (TW کلتور). د 7 ورځو وروسته، د اپیتیلیل حجرو یو واحد ټرانس ویل داخل چې د 2D مونو لییر لري په هایبرډ چپ کې مدغم شو ترڅو د بیسولیټرل جریان (فلو، BL) معرفي کړي، کوم چې په نهایت کې د 3D اپیتیلیل پرت (مورفوجینیسیس) تولید لامل شو. د مرحلې برعکس مایکروګرافونه د انسان د عضوي اپیتیلیل حجرو مورفولوژیکي ځانګړتیاوې ښیې چې د عادي ډونر (C103 لاین) څخه اخیستل شوي چې په هر تجربوي مرحله یا وخت نقطه کې د پورته کیدو کولون. په پورتنیو طبقو کې سکیماتیکونه د هر ګام لپاره تجربوي ترتیب ښیې. ب، هایبرډ چپس (کیڼ سکیماتیک) کولی شي د پورته څخه ښکته کنفوکل مایکروسکوپي سره د ارګانایډ اپیتیلیل حجرو 3D مورفوجینیسیس ته لار هواره کړي. په مختلفو Z موقعیتونو کې اخیستل شوي لیدونه (پورته، منځنۍ، او ښکته؛ ښي سکیمیک او اړونده نقطې کرښې وګورئ). څرګند مورفولوژیکي ځانګړتیاوې ښیې. F-actin (سیان)، نیوکلیوس (خړ).c، د عضوي موادو څخه اخیستل شوي اپیتیلیل حجرو فلوروسینس کنفوکل مایکروګرافونه (3D زاویه لید) چې په جامد ټرانس ویل (TW؛ د سپینې ټوټې شوي بکس دننه داخل شوی) د هایبرډ چپ (تر ټولو لوی بشپړ شاټ) په پرتله د 2D په پرتله د 3D مورفولوژي پرتله کول، په ترتیب سره. د 2D عمودی کراس کټ لیدونو یوه جوړه (په پورتنۍ ښیې کونج کې داخل شوی؛ "XZ") هم د 2D او 3D ځانګړتیاوې ښیې. د پیمانه بار، 100 µm.c د حوالې څخه اجازه سره بیا چاپ شوی.4. ایلسویر.
کنټرولونه د ورته حجرو (کاکو-2 یا د کولمو عضوي اپیتیلیل حجرو) د دودیز جامد کلتور شرایطو لاندې په دوه اړخیزه مونو لییرونو کې د کلتور کولو له لارې چمتو کیدی شي. د پام وړ، د مغذي موادو کمښت ممکن د مایکرو چینلونو محدود حجم ظرفیت له امله رامینځته شي (د بیلګې په توګه د اصلي کولمو چپ ډیزاین کې په پورتنۍ چینل کې ~4 µL). له همدې امله، د بیسولیټرل جریان پلي کولو دمخه او وروسته د اپیتیلیل مورفولوژي هم پرتله کیدی شي.
د نرم لیتوګرافي پروسه باید په یوه پاکه خونه کې ترسره شي. د چپ د هرې طبقې (پورته او ښکته طبقې او غشا) او هایبرډ چپس لپاره، مختلف فوټوماسکونه کارول شوي او په جلا سیلیکون ویفرونو کې جوړ شوي ځکه چې د مایکرو چینلونو لوړوالی مختلف وو. په چپ کې د کولمو د پورتنۍ او ښکته مایکرو چینلونو هدف لوړوالی په ترتیب سره 500 µm او 200 µm دی. د هایبرډ چپ د چینل هدف لوړوالی 200 µm دی.
په یوه لوښي کې چې اسیټون لري ۳ انچه سیلیکون ویفر واچوئ. پلیټ په نرمۍ سره د ۳۰ ثانیو لپاره وګرځوئ، بیا ویفر په هوا کې وچ کړئ. ویفر د IPA سره پلیټ ته انتقال کړئ، بیا پلیټ د ۳۰ ثانیو لپاره وګرځوئ ترڅو پاک شي.
د پیرانها محلول (د هایدروجن پیرو اکسایډ او متمرکز سلفوریک اسید مخلوط، 1:3 (vol/vol)) په اختیاري ډول د سیلیکون ویفر سطحې څخه د عضوي پاتې شونو لرې کولو اعظمي کولو لپاره کارول کیدی شي.
د پیرانها محلول خورا زنګ وهونکی دی او تودوخه تولیدوي. د خوندیتوب اضافي احتیاطي تدابیر اړین دي. د کثافاتو د تصفیې لپاره، محلول ته اجازه ورکړئ چې سړه شي او پاک، وچ کثافاتو کانټینر ته انتقال شي. ثانوي کانټینرونه وکاروئ او د کثافاتو کانټینرونه په سمه توګه لیبل کړئ. مهرباني وکړئ د نورو مفصلو پروسیجرونو لپاره د تاسیساتو د خوندیتوب لارښوونې تعقیب کړئ.
ویفرونه د ۱۰ دقیقو لپاره په ۲۰۰ درجو سانتي ګراد ګرم پلیټ کې کیښودلو سره ډیهایډریټ کړئ. د ډیهایډریشن وروسته، ویفر پنځه ځله په هوا کې وخوځول شو ترڅو یخ شي.
د پاک شوي سیلیکون ویفر په مرکز کې شاوخوا ۱۰ ګرامه فوټوریزیسټ SU-8 2100 واچوئ. د ویفر په مساوي ډول د فوتوریزیسټ خپرولو لپاره ټویزر وکاروئ. کله ناکله ویفر په ۶۵ درجو سانتي ګراد ګرم پلیټ کې کیږدئ ترڅو فوټوریزیسټ لږ چپکونکی او د خپریدو لپاره اسانه شي. ویفر مستقیم په ګرم پلیټ کې مه کیږدئ.
SU-8 د سپن کوټینګ په چلولو سره په ویفر باندې په مساوي ډول ویشل شوی و. د SU-8 راتلونکی گردش د 5-10 ثانیو لپاره پروګرام کړئ ترڅو په 500 rpm کې د 100 rpm/s سرعت سره تبلیغ شي. اصلي سپن د 200 µm ضخامت نمونې لپاره په 1,500 rpm کې تنظیم کړئ، یا د 250 µm ضخامت ترلاسه کړئ (په چپ کې د کولمو د پورتنۍ طبقې لپاره 500 µm لوړوالی جوړول؛ لاندې "مهم ګامونه" وګورئ) د 300 rpm/s سرعت سره په 1,200 rpm کې 30 ثانیې.
د اصلي سپن سرعت د سیلیکون ویفر په SU-8 نمونې کې د هدف ضخامت سره سم تنظیم کیدی شي.
د چپ په پورتنۍ طبقه کې د SU-8 نمونې د جوړولو لپاره چې د 500 µm لوړوالی لري، د دې بکس (7 او 8 مرحلې) د سپین کوټینګ او نرم بیک کولو مرحلې په ترتیب سره تکرار شوې (9 ګام وګورئ) ترڅو د 250 µm دوه طبقې تولید کړي. د SU-8 یو موټی طبقه، کوم چې د دې بکس په 12 ګام کې د UV افشا کیدو سره پرت کیدی شي او یوځای کیدی شي، چې د 500 µm لوړوالی لرونکی طبقه جوړوي.
د SU-8 پوښل شوي ویفرونه په نرمۍ سره پخه کړئ، ویفرونه په احتیاط سره په ګرم پلیټ کې د 65 درجو سانتی ګراد په تودوخه کې د 5 دقیقو لپاره کیږدئ، بیا ترتیب 95 درجو سانتی ګراد ته واړوئ او د 40 نورو دقیقو لپاره یې پخه کړئ.
د پورتني مایکرو چینل کې د SU-8 نمونې د 500 μm لوړوالي ترلاسه کولو لپاره، د SU-8 دوه 250 μm ضخامت لرونکي طبقې رامینځته کولو لپاره 7 او 8 مرحلې تکرار کړئ.
د UV ماسک الاینر په کارولو سره، د ویفر د افشا کیدو وخت محاسبه کولو لپاره د جوړونکي لارښوونو سره سم د څراغ ازموینه ترسره کړئ. (د افشا کیدو وخت، ms) = (د افشا کیدو خوراک، mJ/cm2)/(د څراغ ځواک، mW/cm2).
د افشا کیدو وخت ټاکلو وروسته، فوټوماسک د UV ماسک الاینر په ماسک هولډر کې ځای په ځای کړئ او فوټوماسک د SU-8 پوښل شوي ویفر کې ځای په ځای کړئ.
د فوټو ماسک چاپ شوی سطح مستقیم د سیلیکون ویفر په SU-8 پوښل شوي اړخ کې ځای په ځای کړئ ترڅو د UV خپریدو کچه راټیټه شي.
د SU-8 پوښل شوی ویفر او فوټوماسک په عمودي ډول د UV رڼا 260 mJ/cm2 ته د مخکې ټاکل شوي افشا کولو وخت لپاره ښکاره کړئ (د دې بکس لسم ګام وګورئ).
د UV سره د تماس وروسته، د SU-8 پوښل شوي سیلیکون ویفرونه په هر ګرم پلیټ کې د 65 درجو سانتي ګراد په تودوخه کې د 5 دقیقو لپاره او د 95 درجو سانتي ګراد په تودوخه کې د 15 دقیقو لپاره پخه شوي ترڅو د 200 μm لوړوالي سره نمونې جوړې کړي. د 500 μm لوړوالي سره نمونې جوړولو لپاره د پخولو وروسته وخت په 95 درجو سانتي ګراد کې تر 30 دقیقو پورې وغځوئ.
ډویلپر په یوه شیشه يي لوښي کې اچول کیږي، او پخه شوې ویفر په لوښي کې ځای پر ځای کیږي. د SU-8 ډویلپر حجم ممکن د شیشه يي پلیټ د اندازې پورې اړه ولري. ډاډ ترلاسه کړئ چې د SU-8 ډویلپر کافي اندازه وکاروئ ترڅو ناڅرګند SU-8 په بشپړه توګه لرې کړئ. د مثال په توګه، کله چې د 150 ملي میتر قطر شیشه يي لوښي د 1 لیټر ظرفیت سره کاروئ، د SU-8 ډویلپر ~ 300 ملی لیتر وکاروئ. قالب د 25 دقیقو لپاره د کله ناکله نرم څرخیدو سره جوړ کړئ.
جوړ شوی قالب د ~10 ملی لیتر تازه پراختیا کونکي سره ومینځئ او بیا د پایپټ په کارولو سره محلول سپری کړئ.
ویفر په پلازما کلینر کې واچوئ او د ۱.۵ دقیقو لپاره یې د اکسیجن پلازما (اتموسفیر ګاز، هدف فشار ۱ × ۱۰-۵ تور، بریښنا ۱۲۵ واټ) ته واچوئ.
ویفر په ویکیوم ډیسیکیټر کې د شیشې سلایډ سره ځای په ځای کړئ. ویفرونه او سلایډونه څنګ په څنګ کېښودل کیدی شي. که چیرې ویکیوم ډیسیکیټر د پلیټ په واسطه په څو طبقو ویشل شوی وي، سلایډونه په ښکته خونه کې او ویفرونه په پورتنۍ خونه کې ځای په ځای کړئ. د 100 μL ټرایکلورو (1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyl) سیلین محلول په شیشې سلایډ کې واچوئ او د سیلین کولو لپاره ویکیوم تطبیق کړئ.
د کنګل شوي کاکو-۲ حجرو یوه بوتل د ۳۷ درجو سانتي ګراد په اوبو حمام کې واچوئ، بیا یې ویلي شوي حجرې د T75 فلاسک ته انتقال کړئ چې ۱۵ ملی لیتره د ۳۷ درجو سانتي ګراد دمخه ګرم شوي کاکو-۲ میډیم لري.
د کاکو-۲ حجرو د ~90٪ په ترکیب کې د تیریدو لپاره، لومړی د کاکو-2 منځنی، PBS، او 0.25٪ ټریپسین/1 mM EDTA د 37 درجو سانتي ګراد په اوبو حمام کې ګرم کړئ.
د ویکیوم اسپریشن په واسطه میډیم اسپریټ کړئ. حجرې دوه ځله د 5 ملی لیتر ګرم PBS سره ومینځئ د ویکیوم اسپریشن تکرارولو او تازه PBS اضافه کولو سره.