Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. İstifadə etdiyiniz brauzer versiyasında CSS dəstəyi məhduddur. Ən yaxşı təcrübə üçün yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də uyğunluq rejimini söndürməyinizi) tövsiyə edirik. Bu vaxt ərzində davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stillər və JavaScript olmadan göstərəcəyik.
İnsan bağırsağının morfogenezi 3D epitelial mikroarxitekturasının və məkan təşkilatının kript-villus xüsusiyyətlərini müəyyən edir. Bu unikal struktur, bazal kriptdəki kök hüceyrə yuvasını ekzogen mikrob antigenlərindən və onların metabolitlərindən qorumaqla bağırsaq homeostazını qorumaq üçün tələb olunur. Bundan əlavə, bağırsaq villi və ifraz edən selik, bağırsaq mukozasının səthində qoruyucu bir baryer ilə funksional olaraq fərqlənmiş epitel hüceyrələri təqdim edir. Buna görə də, 3D epitelial strukturların yenidən yaradılması in vitro bağırsaq modellərinin qurulması üçün çox vacibdir. Xüsusilə, üzvi mimetik çip üzərində bağırsaq, inkişaf etmiş fizioloji funksiyalar və biomekanika ilə bağırsaq epitelinin spontan 3D morfogenezini induksiya edə bilər. Burada, bağırsaqda mikrofluidik çipdə, eləcə də Transwell hibrid çipində bağırsaq morfogenezini güclü şəkildə induksiya etmək üçün təkrarlana bilən bir protokol təqdim edirik. Cihaz istehsalı, ənənəvi şəraitdə, eləcə də mikrofluidik platformada Caco-2 və ya bağırsaq orqanoid epitelial hüceyrələrinin becərilməsi, 3D morfogenezinin induksiyası və birdən çox görüntüləmə üsulundan istifadə edərək qurulmuş 3D epitelialların xarakteristikası üçün ətraflı metodları təsvir edirik. Bu protokol, 5 gün ərzində bazolateral maye axınını idarə etməklə funksional bağırsaq mikroarxitekturasının bərpasına nail olur. Bizim in vitro morfogenez metodumuz fizioloji cəhətdən müvafiq kəsmə gərginliyi və mexaniki hərəkətdən istifadə edir və digər mövcud texnikalardan daha yaxşı nəticə göstərə biləcək mürəkkəb hüceyrə mühəndisliyi və ya manipulyasiya tələb etmir. Təklif etdiyimiz protokolun biotibbi tədqiqat icması üçün geniş təsirlərə malik ola biləcəyini və biotibbi, klinik və əczaçılıq tətbiqləri üçün in vitro 3D bağırsaq epitel təbəqələrini bərpa etmək üçün bir metod təqdim edə biləcəyini düşünürük.
Təcrübələr göstərir ki, gut-on-a-chip1,2,3,4,5 və ya ikiqat mikrofluidik cihazlarda6,7 becərilən bağırsaq epitelial Caco-2 hüceyrələri, əsas mexanizmi dəqiq başa düşmədən in vitro şəraitdə spontan 3D morfogenezə məruz qala bilər. Son tədqiqatımızda, Caco-2 və xəstədən əldə edilən bağırsaq orqanoidləri tərəfindən nümayiş etdirilən, becərilən cihazlardan bazolateral ifraz olunan morfogen antaqonistlərinin çıxarılması in vitro şəraitdə 3D epitelial morfogenezini induksiya etmək üçün zəruri və kifayətdir. Epitel hüceyrələri təsdiqləndi. Bu tədqiqatda biz xüsusilə güclü Wnt antaqonisti Dickkopf-1 (DKK-1)-in hüceyrə istehsalına və konsentrasiyasının paylanmasına diqqət yetirdik, bu cihazlarda Transwell əlavələri olan gut-on-a-chip və modifikasiya olunmuş mikrofluidik cihazlar var, onlar "Hibrid Çip" adlanır. Biz nümayiş etdiririk ki, ekzogen Wnt antaqonistlərinin (məsələn, DKK-1, Wnt repressoru 1, ifraz olunan qıvrımla əlaqəli protein 1 və ya Soggy-1) çip bağırsağına əlavə edilməsi morfogenezi inhibə edir və ya əvvəlcədən qurulmuş 3D epitel təbəqəsini pozur, bu da kultura zamanı antaqonist stressin in vitro şəraitdə bağırsaq morfogenezi üçün məsuliyyət daşıdığını göstərir. Buna görə də, epitelial interfeysdə güclü morfogenezə nail olmaq üçün praktik yanaşma, aktiv yuyulma (məsələn, gut-on-a-chip və ya hibrid-on-a-chip platformalarında) və ya diffuziya yolu ilə bazolateral bölmədəki Wnt antaqonistlərinin səviyyələrini çıxarmaq və ya minimum səviyyədə saxlamaqdır. Bazolateral mühit (məsələn, Transwell əlavələrindən quyulardakı böyük bazolateral rezervuarlara).
Bu protokolda, bağırsaq epitel hüceyrələrini polidimetilsiloksan (PDMS) əsaslı məsaməli membranlarda (6A, 7A, 8, 9-cu addımlar) və ya Transwell əlavələrinin polyester membranlarında (6B, 7B, 8, 9-cu addımlar) becərmək və in vitro 3D morfogenezi induksiya etmək üçün bağırsaq-on-a-chip mikrocihazlarının və Transwell-insertləşdirilə bilən hibrid çiplərin (1-5-ci addımlar) hazırlanması üçün ətraflı bir üsul təqdim edirik və in vitro 3D morfogenezi induksiya etdik (10-cu addım). Həmçinin, çoxsaylı görüntüləmə üsullarını tətbiq etməklə (11-24-cü addımlar) toxumaya xas histogenez və nəsildən asılı hüceyrə differensiasiyasını göstərən hüceyrə və molekulyar xüsusiyyətləri müəyyən etdik. Caco-2 və ya bağırsaq orqanoidləri kimi insan bağırsaq epitel hüceyrələrindən istifadə edərək morfogenezi induksiya etdik, texniki detalları məsaməli membranların səth modifikasiyası, 2D monolayerlərin yaradılması və bağırsaq biokimyəvi və biomexaniki mikromühitin reproduksiyası da daxil olmaqla iki becərmə formatında. 2D epitelial monolayerlərdən 3D morfogenez induksiya etmək üçün morfogen antaqonistlərini çıxardıq. Hər iki becərilən formanı mühiti becərin bazolateral bölməsinə axdırmaqla əldə etmək olar. Nəhayət, morfogendən asılı epiteliya böyüməsini, uzununa sahib-mikrobiom birgə becərilməsini, patogen infeksiyasını, iltihabi zədələnməni, epiteliya baryer disfunksiyasını və probiotik əsaslı terapiyaları modelləşdirmək üçün istifadə edilə bilən bərpa olunan 3D epiteliya təbəqəsinin faydalılığının təsvirini təqdim edirik. Məsələn, təsirlər.
Protokolumuz əsas (məsələn, bağırsaq mukozası biologiyası, kök hüceyrə biologiyası və inkişaf biologiyası) və tətbiqi tədqiqatlar (məsələn, klinikayaqədər dərman testi, xəstəliklərin modelləşdirilməsi, toxuma mühəndisliyi və qastroenterologiya) sahəsində geniş spektrli elm adamları üçün faydalı ola bilər. Bağırsaq epitelinin in vitro 3D morfogenezini stimullaşdırmaq üçün protokolumuzun təkrarlana bilməsi və möhkəmliyi səbəbindən texniki strategiyamızın bağırsaq inkişafı, regenerasiyası və ya homeostaz zamanı hüceyrə siqnalının dinamikasını öyrənən auditoriyaya yayıla biləcəyini düşünürük. Bundan əlavə, protokolumuz Norovirus 8, Ağır Kəskin Tənəffüs Sindromu Koronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 və ya Vibrio cholerae kimi müxtəlif infeksion agentlər altında infeksiyanın araşdırılması üçün faydalıdır. Xəstəlik patologiyası və patogenezi ilə bağlı auditoriyalar da faydalıdır. Çip üzərində bağırsaq mikrofiziologiyası sisteminin istifadəsi uzunmüddətli birgə kulturaya 10 və sonradan mədə-bağırsaq (Mİ) traktında sahib müdafiəsinin, immun reaksiyalarının və patogenlə əlaqəli zədələnmənin bərpasının qiymətləndirilməsinə imkan verə bilər. Sızan bağırsaq sindromu, çölyak xəstəliyi, Kron xəstəliyi, xoralı kolit, puxit və ya qıcıqlanmış bağırsaq sindromu ilə əlaqəli digər Mİ xəstəlikləri xəstənin 3D bağırsaq epitelial təbəqələri istifadə edilərək 3D bağırsaq epitelial təbəqələri hazırlandıqda simulyasiya edilə bilər, bu xəstəliklərə xovlu atrofiya, kriptin qısalması, selikli qişanın zədələnməsi və ya epitelial baryerin pozulması daxildir. Biopsiya və ya kök hüceyrədən əldə edilən bağırsaq orqanoidləri12,13. Xəstəlik mühitinin daha yüksək mürəkkəbliyini daha yaxşı modelləşdirmək üçün oxucular 3D bağırsaq xovlu-kript mikroarxitekturalarını ehtiva edən modellərə xəstənin periferik qan mononükleer hüceyrələri (PBMC) kimi xəstəliyə aid hüceyrə növlərini əlavə etməyi düşünə bilərlər. toxumaya xas immun hüceyrələr, 5.
3D epitelial mikrostruktur bölmə prosesi olmadan sabitlənə və vizuallaşdırıla bildiyindən, məkan transkriptomikası və yüksək qətnaməli və ya super qətnaməli görüntüləmə üzərində işləyən izləyicilər epitel nişlərindəki genlərin və zülalların məkan-zaman dinamikasının xəritələşdirilməsi ilə maraqlana bilərlər. Texnologiya ilə maraqlanırlar. Mikrob və ya immun stimullarına cavab verirlər. Bundan əlavə, bağırsaq homeostazını əlaqələndirən uzununa sahib-mikrobiom çarpazlığı 10, 14, xüsusilə çipdəki bağırsaqda müxtəlif mikrob növlərini, mikrob icmalarını və ya nəcis mikrobiotalarını birgə becərməklə 3D bağırsaq mukoza təbəqəsində qurula bilər. platformada. Bu yanaşma, əvvəllər becərilməmiş bağırsaq mikrobiotasını laboratoriyada becərməyə çalışan selikli qişa immunologiyası, qastroenterologiya, insan mikrobiomu, kulturomika və klinik mikrobiologiyanı öyrənən auditoriyalar üçün xüsusilə cəlbedicidir. Əgər in vitro morfogenez protokolumuz, bazolateral bölmələri davamlı olaraq dolduran 24, 96 və ya 384 quyu lövhələrindəki çoxçuxurlu əlavələr kimi miqyaslı becərmə formatlarına uyğunlaşdırıla bilərsə, protokol qida sənayesi üçün əczaçılıq, biotibbi və ya yüksək məhsuldarlıqlı skrininq və ya validasiya platformaları hazırlayanlara da yayıla bilər. Prinsipin sübutu olaraq, bu yaxınlarda 24 quyulu lövhə formatına miqyaslı edilə bilən çoxfunksiyalı yüksək məhsuldarlıqlı morfogenez sisteminin mümkünlüyünü nümayiş etdirdik. Bundan əlavə, çip üzərində çoxlu orqan məhsulları kommersiyalaşdırılıb16,17,18. Buna görə də, in vitro morfogenez metodumuzun validasiyası sürətləndirilə və dərmanları sınaqdan keçirmək üçün transkriptomik səviyyədə in vitro bağırsaq morfogenezinin hüceyrə yenidən proqramlaşdırılmasını anlamaq üçün bir çox tədqiqat laboratoriyaları, sənaye və ya hökumət və tənzimləyici orqanlar tərəfindən potensial olaraq qəbul edilə bilər. və ya bioterapevtiklər Dərman namizədlərinin absorbsiyası və daşınması bağırsaq morfogenezi prosesinin təkrarlanabilirliyini qiymətləndirmək üçün 3D bağırsaq surroqatları və ya xüsusi və ya kommersiya orqan-on-a-chip modelləri istifadə edilərək qiymətləndirilmişdir.
Bağırsaq epitelinin morfogenezini öyrənmək üçün məhdud sayda insanla əlaqəli eksperimental model istifadə edilmişdir ki, bu da əsasən in vitro şəraitində 3D morfogenezini stimullaşdırmaq üçün tətbiq oluna bilən protokolların olmaması ilə əlaqədardır. Əslində, bağırsaq morfogenezi haqqında mövcud biliklərin çoxu heyvan tədqiqatlarına əsaslanır (məsələn, zebrafiş20, siçanlar21 və ya toyuqlar22). Lakin, onlar əmək və xərc tələb edir, etik cəhətdən şübhəli ola bilər və ən əsası, insanın inkişaf proseslərini dəqiq müəyyən etmir. Bu modellər həmçinin çoxşaxəli şəkildə sınaqdan keçirilmə qabiliyyəti baxımından çox məhduddur. Buna görə də, in vitro şəraitində 3D toxuma strukturlarının bərpası üçün protokolumuz in vivo heyvan modellərindən, eləcə də digər ənənəvi statik 2D hüceyrə kulturası modellərindən daha yaxşı nəticə göstərir. Əvvəllər təsvir edildiyi kimi, 3D epitelial strukturlardan istifadə bizə müxtəlif selikli qişa və ya immun stimullarına cavab olaraq kript-villus oxundakı fərqli hüceyrələrin məkan lokalizasiyasını araşdırmağa imkan verdi. 3D epitelial təbəqələr mikrob hüceyrələrinin məkan nişləri yaratmaq üçün necə rəqabət apardığını və ev sahibi amillərə (məsələn, daxili və xarici selik təbəqələri, ifrazatı) cavab olaraq ekoloji təkamülü öyrənmək üçün bir yer təmin edə bilər. IgA və antimikrob peptidlər). Bundan əlavə, 3D epitelial morfologiya bizə bağırsaq mikrobiotasının öz icmalarını necə qurduğunu və bazal kriptlərdə hüceyrə quruluşunu və kök hüceyrə nişlərini formalaşdıran mikrob metabolitlərini (məsələn, qısa zəncirli yağ turşuları) sinergetik şəkildə necə istehsal etdiyini anlamağa imkan verə bilər. Bu xüsusiyyətlər yalnız 3D epitelial təbəqələr in vitro şəraitində qurulduqda nümayiş etdirilə bilər.
3D bağırsaq epitelial strukturları yaratmaq metodumuzdan əlavə, bir neçə in vitro metod mövcuddur. Bağırsaq orqanoid kulturası, müəyyən morfogen şəraitdə bağırsaq kök hüceyrələrinin becərilməsinə əsaslanan ən müasir toxuma mühəndisliyi texnikasıdır23,24,25. Lakin, nəqliyyat təhlili və ya sahib-mikrobiom birgə kulturası üçün 3D orqanoid modellərinin istifadəsi çox vaxt çətin olur, çünki bağırsaq lümeni orqanoidin içərisindədir və buna görə də mikrob hüceyrələri və ya ekzogen antigenlər kimi lümen komponentlərinin daxil edilməsi məhduddur. Orqanoid lümenlərinə giriş mikroinjektor istifadə edərək yaxşılaşdırıla bilər26,27, lakin bu metod invaziv və əmək tələb edir və yerinə yetirmək üçün xüsusi bilik tələb edir. Bundan əlavə, statik şəraitdə hidrogel iskelelərində saxlanılan ənənəvi orqanoid kulturaları aktiv in vivo biomekanikasını dəqiq əks etdirmir.
Bir neçə tədqiqat qrupu tərəfindən istifadə edilən digər yanaşmalar, gel səthində təcrid olunmuş insan bağırsaq hüceyrələrini becərməklə bağırsaq epitelial quruluşunu təqlid etmək üçün əvvəlcədən qurulmuş 3D hidrogel iskelelərindən istifadə edir. 3D çap olunmuş, mikro frezelənmiş və ya litoqrafik olaraq hazırlanmış qəliblərdən istifadə edərək hidrogel iskeleləri hazırlayın. Bu metod, iskeleyə stromal hüceyrələri daxil etməklə yüksək aspekt nisbəti epitelial quruluş və stroma-epitelial çarpazlıq yaradan fizioloji cəhətdən müvafiq morfogen qradiyentlərlə in vitro təcrid olunmuş epitelial hüceyrələrin öz-özünə təşkil olunmuş düzülüşünü göstərir. Lakin, əvvəlcədən qurulmuş iskelelərin təbiəti spontan morfogenetik prosesin özünün nümayişinə mane ola bilər. Bu modellər həmçinin dinamik luminal və ya interstisial axın təmin etmir, bağırsaq hüceyrələrinin morfogenezdən keçməsi və fizioloji funksiya qazanması üçün lazım olan maye kəsmə stressindən məhrumdur. Başqa bir son tədqiqatda mikrofluidik platformada hidrogel iskelelərindən istifadə edilmiş və lazerlə oyma üsullarından istifadə edərək naxışlı bağırsaq epitelial strukturları yaradılmışdır. Siçan bağırsaq orqanoidləri bağırsaq borulu strukturlarını yaratmaq üçün oyulmuş naxışları izləyir və intraluminal maye axını ola bilər. mikrofluidika modulundan istifadə edərək təkrarlanmışdır. Lakin, bu model nə spontan morfogenetik proseslər nümayiş etdirir, nə də bağırsaq mexaniki bioloji hərəkətlərini əhatə edir. Eyni qrupdan olan 3D çap üsulları spontan morfogenetik prosesləri olan miniatür bağırsaq boruları yarada bilmişdir. Boru daxilində müxtəlif bağırsaq seqmentlərinin mürəkkəb istehsalına baxmayaraq, bu modeldə lümen maye axını və mexaniki deformasiya da yoxdur. Bundan əlavə, modelin işləmə qabiliyyəti, xüsusən də bioçap prosesi başa çatdıqdan sonra, eksperimental şəraiti pozduqdan və ya hüceyrələrarası qarşılıqlı təsirlərdən sonra məhdud ola bilər. Bunun əvəzinə, təklif etdiyimiz protokol spontan bağırsaq morfogenezi, fizioloji cəhətdən müvafiq kəsmə stressi, bağırsaq hərəkətliliyini təqlid edən biomekanika, müstəqil apikal və bazolateral bölmələrin əlçatanlığı və modulyarlığın mürəkkəb bioloji mikromühitlərinin yenidən yaradılmasını təmin edir. Buna görə də, in vitro 3D morfogenez protokolumuz mövcud metodların çətinliklərini aradan qaldırmaq üçün tamamlayıcı bir yanaşma təmin edə bilər.
Protokolumuz tamamilə 3D epitelial morfogenezinə yönəlmişdir, kulturada yalnız epitelial hüceyrələr və mezenximal hüceyrələr, endotel hüceyrələr və immun hüceyrələri kimi ətrafdakı hüceyrələr yoxdur. Əvvəllər təsvir edildiyi kimi, protokolumuzun əsasını daxil edilmiş mühitin bazolateral tərəfində ifraz olunan morfogen inhibitorlarını çıxarmaqla epitelial morfogenezin induksiyası təşkil edir. Bağırsaq-çip üzərində və hibrid-çip üzərində möhkəm modulyarlığımız dalğalı 3D epitelial təbəqəni yenidən yaratmağa imkan versə də, epitelial-mezenximal qarşılıqlı təsirlər33,34, hüceyrədənkənar Matris (ECM) çökməsi35 və modelimizdə bazal kriptlərdə kök hüceyrə nişlərini daşıyan kript-villus xüsusiyyətləri kimi əlavə bioloji mürəkkəbliklər daha da nəzərdən keçirilməlidir. Mezenximadakı stromal hüceyrələr (məsələn, fibroblastlar) ECM zülallarının istehsalında və in vivo bağırsaq morfogenezinin tənzimlənməsində əsas rol oynayır35,37,38. Modelimizə mezenximal hüceyrələrin əlavə edilməsi morfogenetik prosesi və hüceyrəni gücləndirdi. bağlanma səmərəliliyi. Endotel təbəqəsi (yəni kapilyarlar və ya limfa damarları) bağırsaq mikro mühitində molekulyar nəqliyyatın39 və immun hüceyrələrinin işə götürülməsinin40 tənzimlənməsində mühüm rol oynayır. Bundan əlavə, toxuma modelləri çoxorqanlı qarşılıqlı təsirləri nümayiş etdirmək üçün hazırlandıqda toxuma modelləri arasında əlaqələndirilə bilən damar komponentləri ilkin şərtdir. Buna görə də, orqan səviyyəsində həll yolu ilə daha dəqiq fizioloji xüsusiyyətləri modelləşdirmək üçün endotel hüceyrələrinin daxil edilməsi lazım ola bilər. Xəstədən əldə edilən immun hüceyrələri həmçinin bağırsaq xəstəliyini təqlid etmək kontekstində fitri immun reaksiyalarını, antigen təqdimatını, fitri adaptiv immun çarpazlığını və toxumaya xas immuniteti nümayiş etdirmək üçün vacibdir.
Hibrid çiplərin istifadəsi bağırsaq üzərində çipdən daha sadədir, çünki cihazın quraşdırılması daha sadədir və Transwell əlavələrinin istifadəsi bağırsaq epitelinin miqyaslı becərilməsinə imkan verir. Bununla belə, kommersiya baxımından mövcud olan poliester membranlı Transwell əlavələri elastik deyil və peristaltik kimi hərəkətləri simulyasiya edə bilmir. Bundan əlavə, hibrid çipə yerləşdirilmiş Transwell əlavəsinin apikal bölməsi apikal tərəfdə kəsmə gərginliyi olmadan hərəkətsiz qalmışdır. Aydındır ki, apikal bölmədəki statik xüsusiyyətlər nadir hallarda hibrid çiplərdə uzunmüddətli bakteriya birgə becərilməsinə imkan verir. Hibrid çiplərdən istifadə edərkən Transwell əlavələrində 3D morfogenezini güclü şəkildə induksiya edə bilsək də, fizioloji cəhətdən müvafiq biomekanika və apikal maye axınının çatışmazlığı potensial tətbiqlər üçün hibrid çip platformalarının mümkünlüyünü məhdudlaşdıra bilər.
Bağırsaq-on-a-çip və hibrid-on-a-çip kulturalarında insan kript-villus oxunun tam miqyaslı rekonstruksiyaları tam olaraq müəyyən edilməmişdir. Morfogenez epitelial monolayerdən başladığı üçün 3D mikroarxitekturalar mütləq in vivo kriptlərə morfoloji oxşarlıq təmin etmir. Mikromühəndislik edilmiş 3D epiteldə bazal kript domeninin yaxınlığında çoxalan hüceyrə populyasiyasını xarakterizə etsək də, kript və villus bölgələri dəqiq şəkildə ayrılmamışdır. Çipdəki daha yüksək yuxarı kanallar mikromühəndislik edilmiş epitelin hündürlüyünün artmasına səbəb olsa da, maksimum hündürlük hələ də ~300–400 µm ilə məhdudlaşır. Nazik və yoğun bağırsaqlarda insan bağırsaq kriptlərinin faktiki dərinliyi müvafiq olaraq ~135 µm və ~400 µm, nazik bağırsaq villuslarının hündürlüyü isə ~600 µm-dir41.
Görüntüləmə baxımından, 3D mikroarxitekturaların yerində super qətnaməli görüntüləməsi çipdəki bağırsaqla məhdudlaşa bilər, çünki obyektiv linzadan epitel təbəqəsinə qədər tələb olunan iş məsafəsi bir neçə millimetrdir. Bu problemi həll etmək üçün uzaq obyektiv tələb oluna bilər. Bundan əlavə, görüntüləmə nümunəsinin hazırlanması üçün nazik hissələr hazırlamaq PDMS-in yüksək elastikliyinə görə çətindir. Bundan əlavə, çipdəki bağırsağın təbəqə-təbəqə mikrofabrikasiyası hər təbəqə arasında daimi yapışmanı əhatə etdiyindən, epitel təbəqəsinin səth quruluşunu araşdırmaq üçün üst təbəqəni açmaq və ya çıxarmaq olduqca çətindir. Məsələn, skan edən elektron mikroskopundan (SEM) istifadə etməklə.
PDMS-in hidrofobluğu, hidrofob kiçik molekullarla əlaqəli mikrofluidik əsaslı tədqiqatlarda məhdudlaşdırıcı amil olmuşdur, çünki PDMS bu cür hidrofob molekulları qeyri-spesifik şəkildə adsorbsiya edə bilər. PDMS-ə alternativlər digər polimer materiallarla nəzərdən keçirilə bilər. Alternativ olaraq, hidrofob molekulların adsorbsiyasını minimuma endirmək üçün PDMS-in səth modifikasiyası (məsələn, lipofil materiallar 42 və ya poli(etilen glikol) 43 ilə örtülməsi) nəzərdən keçirilə bilər.
Nəhayət, metodumuz yüksək məhsuldarlıqlı skrininq və ya "hamıya uyğun" istifadəçi dostu eksperimental platforma təmin etmək baxımından yaxşı xarakterizə olunmayıb. Mövcud protokol hər mikrocihaz üçün bir şpris nasosu tələb edir ki, bu da CO2 inkubatorunda yer tutur və genişmiqyaslı təcrübələrin qarşısını alır. Bu məhdudiyyət innovativ becərmə formatlarının (məsələn, bazolateral mühitin davamlı şəkildə doldurulmasına və çıxarılmasına imkan verən 24 quyulu, 96 quyulu və ya 384 quyulu məsaməli əlavələr) miqyaslanması ilə əhəmiyyətli dərəcədə yaxşılaşdırıla bilər.
İnsan bağırsaq epitelinin in vitro 3D morfogenezini induksiya etmək üçün, lümen-kapilyar interfeys yaratmaq üçün iki paralel mikrokanal və aralarında elastik məsaməli membran olan mikrofluidik çipli bağırsaq cihazından istifadə etdik. Həmçinin, Transwell əlavələrində yetişdirilən polyarlaşdırılmış epitel təbəqələrinin altında davamlı bazolateral axın təmin edən tək kanallı mikrofluidik cihazın (hibrid çip) istifadəsini nümayiş etdiririk. Hər iki platformada müxtəlif insan bağırsaq epitel hüceyrələrinin morfogenezini, morfogen antaqonistlərini bazolateral bölmədən çıxarmaq üçün axının istiqamətli manipulyasiyasını tətbiq etməklə nümayiş etdirmək olar. Bütün eksperimental prosedur (Şəkil 1) beş hissədən ibarətdir: (i) bağırsaq çipinin və ya Transwell daxil edilə bilən hibrid çipinin mikrofabrikasiyası (1-5-ci addımlar; Qutu 1), (ii) bağırsaq epitel hüceyrələrinin (Caco-2 hüceyrələri) və ya insan bağırsaq orqanoidlərinin hazırlanması; qutular 2-5), (iii) bağırsaq epitelial hüceyrələrinin bağırsaq çipləri və ya hibrid çiplər üzərində becərilməsi (addımlar 6-9), (iv) 3D epitelial mikrostrukturunu xarakterizə etmək üçün in vitro 3D morfogenezinin induksiyası (addım 10) və (v) (addımlar 11-24). Nəhayət, epitelial morfogenezini məkan, zaman, şərti və ya prosedur nəzarətləri ilə müqayisə etməklə in vitro morfogenezinin effektivliyini təsdiqləmək üçün müvafiq nəzarət qrupu (aşağıda daha ətraflı müzakirə olunacaq) hazırlanmışdır.
Biz iki fərqli becərmə platformasından istifadə etdik: düz kanalları və ya qeyri-xətti burulğan kanalları olan bağırsaq-on-a-chip və ya Qutu 1-də təsvir edildiyi kimi hazırlanmış mikrofluidik cihazda Transwell (TW) əlavələri olan hibrid çiplər və 1-ci addım 1-5. “Cihazın İstehsalı” tək çip və ya hibrid çip hazırlamağın əsas addımlarını göstərir. “İnsan Bağırsaq Epitel Hüceyrələrinin Becərilməsi” bu protokolda istifadə olunan hüceyrə mənbəyini (Caco-2 və ya insan bağırsaq orqanoidləri) və becərmə prosedurunu izah edir. “İn vitro morfogenezi” Caco-2 və ya orqanoiddən əldə edilən epitel hüceyrələrinin bağırsaq çipində və ya hibrid çipin Transwell əlavələrində becərildiyi, ardınca 3D morfogenezinin induksiyası və xarakterik epitelial strukturun formalaşması ilə müşayiət olunan ümumi addımları göstərir. Proqram addım nömrəsi və ya qutu nömrəsi hər oxun altında göstərilir. Tətbiqdə qurulmuş bağırsaq epitel təbəqələrinin necə istifadə oluna biləcəyinə dair nümunələr təqdim olunur, məsələn, hüceyrə differensiasiyasının xarakteristikasında, bağırsaq fiziologiyası tədqiqatlarında, ev sahibi-mikrobiom ekosistemlərinin yaradılmasında və xəstəliklərin modelləşdirilməsində. “Hüceyrə”də immunofluoresensiya şəkilləri "Differensiasiya" bağırsaq çipində əmələ gələn 3D Caco-2 epitel təbəqəsində ifadə olunan nüvələri, F-aktin və MUC2-ni göstərir. MUC2 siqnalı qədəh hüceyrələrində və selikli qişa səthlərindən ifraz olunan selikdə mövcuddur. Bağırsaq Fiziologiyasındakı flüoresan şəkillər, flüoresan buğda rüşeyminin aglütininindən istifadə edərək sial turşusu və N-asetilqlükozamin qalıqları üçün boyanma yolu ilə istehsal olunan seliyi göstərir. "Ev Sahibi-Mikrob Birgə Mədəniyyətləri"ndəki iki üst-üstə düşən şəkil, çipdə bağırsaqda nümayəndəli ev sahibi-mikrobiom birgə mədəniyyətlərini göstərir. Sol panel, mikromühəndislik edilmiş 3D Caco-2 epitel hüceyrələri ilə yaşıl flüoresan zülal (GFP) ifadə edən E. coli-nin birgə mədəniyyətini göstərir. Sağ panel, 3D Caco-2 epitel hüceyrələri ilə birgə mədəniyyət edilən GFP E. coli-nin lokalizasiyasını, ardınca F-aktin (qırmızı) və nüvələr (mavi) ilə immunoflüoresan boyanmasını göstərir. Xəstəlik modelləşdirməsi, bakterial antigenlərlə (məsələn, lipopolisaxarid, məsələn) fizioloji çətinlik altında bağırsaq iltihabı çiplərində sağlam və sızan bağırsağı göstərir. LPS) və immun hüceyrələri (məsələn, PBMC; yaşıl). Caco-2 hüceyrələri 3D epitel təbəqəsi yaratmaq üçün becərildi. Ölçü zolağı, 50 µm. Alt sətirdəki şəkillər: “Hüceyrələrin diferensiasiyası” istinaddan icazə ilə uyğunlaşdırılıb.2. Oxford University Press; 5-ci istinaddan icazə ilə çoxaldılıb. NAS; “Host-Microb Co-Culture” istinaddan icazə ilə uyğunlaşdırılıb. 3-cü istinad. NAS; “Xəstəlik Modelləşdirməsi” istinaddan icazə ilə uyğunlaşdırılıb.5. NAS.
Həm bağırsaq-çip, həm də hibrid çiplər yumşaq litoqrafiya1,44 ilə silikon qəliblərdən sökülmüş və SU-8 ilə naxışlanmış PDMS replikalarından istifadə edilməklə hazırlanmışdır. Hər bir çipdəki mikrokanalların dizaynı kəsmə gərginliyi və hidrodinamik təzyiq1,4,12 kimi hidrodinamik amillər nəzərə alınmaqla müəyyən edilir. İki yan-yana düzülmüş paralel düz mikrokanaldan ibarət olan orijinal bağırsaq-çip dizaynı (Genişləndirilmiş Məlumat Şəkil 1a), artan maye qalma müddətinə, qeyri-xətti axın nümunələrinə və becərilən hüceyrələrin çoxoxlu deformasiyasına səbəb olmaq üçün bir cüt əyri mikrokanaldan ibarət olan mürəkkəb bağırsaq-çipə (Genişləndirilmiş Məlumat Şəkil 1b) çevrilmişdir (Şəkil 2a–f).12 Daha mürəkkəb bağırsaq biomekanikasının yenidən qurulması lazım olduqda, mürəkkəb bağırsaq-çiplər seçilə bilər. Biz nümayiş etdirdik ki, dolaşıq bağırsaq-çip də orijinalla müqayisədə oxşar dərəcədə epitelial böyümə ilə oxşar zaman çərçivəsində 3D morfogenezi güclü şəkildə induksiya edir. Bağırsaq Çipi, becərilən hüceyrə növündən asılı olmayaraq. Buna görə də, 3D morfogenezi yaratmaq üçün xətti və mürəkkəb çip üzərində bağırsaq dizaynları bir-birini əvəz edə bilər. SU-8 naxışlı silikon qəliblərdə bərkidilmiş PDMS replikaları söküldükdən sonra mənfi xüsusiyyətlər təmin etdi (Şəkil 2a). Bağırsağı çip üzərində hazırlamaq üçün hazırlanmış yuxarı PDMS təbəqəsi ardıcıl olaraq məsaməli PDMS filminə yapışdırıldı və sonra korona təmizləyicisindən istifadə edərək dönməz yapışdırma yolu ilə aşağı PDMS təbəqəsi ilə hizalandı (Şəkil 2b–f). Hibrid çiplər hazırlamaq üçün bərkidilmiş PDMS replikaları Transwell əlavələrini yerləşdirə bilən tək kanallı mikrofluidik cihazlar yaratmaq üçün şüşə slaydlara yapışdırıldı (Şəkil 2h və Genişləndirilmiş Məlumatlar Şəkil 2). Yapışdırma prosesi PDMS replikasının və şüşəsinin səthlərini oksigen plazması və ya korona müalicəsi ilə müalicə etməklə həyata keçirilir. Silikon boruya birləşdirilmiş mikrofabrik cihazın sterilizasiyasından sonra cihazın quraşdırılması bağırsaq epitelinin 3D morfogenezini yerinə yetirməyə hazır idi (Şəkil 2g).
a, SU-8 naxışlı silikon qəliblərdən PDMS hissələrinin hazırlanmasının sxematik təsviri. Bərkiməmiş PDMS məhlulu silikon qəlibə töküldü (solda), 60 °C-də bərkidildi (orta) və demontaj edildi (sağda). Demontaj edilmiş PDMS hissələrə bölündü və sonrakı istifadə üçün təmizləndi.b, PDMS üst təbəqəsini hazırlamaq üçün istifadə edilən silikon qəlibin fotoşəkili.c, PDMS məsaməli membranının hazırlanması üçün istifadə edilən silikon qəlibin fotoşəkili.d, Üst və alt PDMS komponentlərinin və yığılmış çip üzərində bağırsaq cihazının bir sıra fotoşəkilləri.e, Üst, membran və alt PDMS komponentlərinin uyğunlaşdırılmasının sxemi. Hər təbəqə plazma və ya korona müalicəsi ilə dönməz şəkildə bağlanır.f, Üst-üstə qoyulmuş qıvrılmış mikrokanallar və vakuum kameraları ilə hazırlanmış çip üzərində bağırsaq cihazının sxemi.g, Mikroflüid hüceyrə kulturası üçün çip üzərində bağırsaq qurğusunun quraşdırılması. Silikon boru və şpris ilə yığılmış çip üzərində hazırlanmış bağırsaq örtük üzərinə yerləşdirildi. Çip cihazı qapağına yerləşdirildi. emal üçün 150 mm-lik Petri qabı. Bağlayıcı silikon borunu bağlamaq üçün istifadə olunur.h, Hibrid çip istehsalının və hibrid çiplərdən istifadə edərək 3D morfogenezinin vizual görüntüləri. Bağırsaq epitelial hüceyrələrinin 2D monolayerlərini becərmək üçün müstəqil olaraq hazırlanmış Transwell əlavələri bağırsaq 3D morfogenezini induksiya etmək üçün hibrid çipə daxil edilmişdir. Mühit Transwell əlavəsində qurulmuş hüceyrə təbəqəsinin altındakı mikrokanallar vasitəsilə perfuziya olunur. Ölçü zolağı, 1 sm.h İstinaddan icazə ilə yenidən çap olunub.4. Elsevier.
Bu protokolda Caco-2 hüceyrə xətti və bağırsaq orqanoidləri epitelial mənbələr kimi istifadə edilmişdir (Şəkil 3a). Hər iki növ hüceyrə müstəqil şəkildə becərilmiş (Qutu 2 və Qutu 5) və çip üzərindəki bağırsaq və ya Transwell əlavələrinin ECM ilə örtülmüş mikrokanallarını əkmək üçün istifadə edilmişdir. Hüceyrələr birləşdikdə (flakonlarda >95% örtük), T-flakonlarda müntəzəm olaraq becərilən Caco-2 hüceyrələri (10 və 50 keçidləri arasında) tripsinizləşmə mayesi ilə dissosiasiya olunmuş hüceyrə suspenziyalarını hazırlamaq üçün yığılır (qutu 2). Bağırsaq biopsiyalarından və ya cərrahi rezeksiyalardan alınan insan bağırsaq orqanoidləri struktur mikromühiti dəstəkləmək üçün 24 quyulu lövhələrdə Matrigel iskele günbəzlərində becərilmişdir. Qutu 3-də təsvir edildiyi kimi hazırlanmış əsas morfogenlər (məsələn, Wnt, R-spondin və Noggin) və böyümə faktorları olan mühit, orqanoidlər diametri ~500 µm-ə qədər böyüyənə qədər hər iki gün əlavə edilmişdir. Tam yetişmiş orqanoidlər yığılır və dissosiasiya olunur. çip üzərində bağırsaq və ya Transwell əlavələrinə əkmək üçün tək hüceyrələrə (Qutu 5). Əvvəllər bildirdiyimiz kimi, xəstəlik növünə12,13 (məsələn, xoralı kolit, Kron xəstəliyi, kolorektal xərçəng və ya normal donor), lezyon yerinə (məsələn, lezyon və ya lezyon olmayan sahə) və traktdakı mədə-bağırsaq yerinə (məsələn, onikibarmaq bağırsaq, jejunum, ileum, kor bağırsaq, yoğun bağırsaq və ya rektum) görə fərqləndirilə bilər. Qutu 5-də adətən nazik bağırsaq orqanoidlərinə nisbətən daha yüksək morfogen konsentrasiyaları tələb edən yoğun bağırsaq orqanoidlərinin (koloidlərin) becərilməsi üçün optimallaşdırılmış protokol təqdim edirik.
a, Bağırsaq çipində bağırsaq morfogenezinin induksiyası üçün iş axını. Bu protokolda 3D morfogenezini nümayiş etdirmək üçün Caco-2 insan bağırsaq epiteli və bağırsaq orqanoidləri istifadə olunur. Təcrid olunmuş epitel hüceyrələri hazırlanmış bağırsaq-on-a-çip cihazında (çip hazırlanması) əkilmişdir. Hüceyrələr 0-cı gündə (D0) PDMS məsaməli membranına əkildikdən (əkildikdən) və birləşdirildikdən (birləşdirildikdən) sonra apikal (AP) axın başlanır və ilk 2 gün ərzində saxlanılır (axın, AP, D0-D2). Tam 2D ​​monolayer əmələ gəldikdə, tsiklik dartılma hərəkətləri (gərilmə, axın, AP və BL) ilə birlikdə bazolateral (BL) axın da başlanır. Bağırsaq 3D morfogenezi 5 günlük mikrofluidik kulturadan sonra kortəbii olaraq baş vermişdir (morfogenez, D5). Faza kontrastlı şəkillər hər bir eksperimental mərhələdə və ya zaman nöqtəsində Caco-2 hüceyrələrinin nümayəndəli morfologiyasını göstərir (sütun qrafiki, 100 µm). Bağırsaq morfogenezinin müvafiq kaskadlarını göstərən dörd sxematik diaqram (yuxarı) sağda). Sxematik kəsikli oxlar maye axınının istiqamətini göstərir.b, Qurulmuş 3D Caco-2 epitelinin səth topologiyasını göstərən SEM təsviri (solda). Böyüdülmüş sahəni vurğulayan əlavə hissə (ağ kəsikli qutu) 3D Caco-2 təbəqəsindəki regenerasiya olunmuş mikrovilliləri göstərir (sağda).c, Qurulmuş Caco-2 3D, klaudin (ZO-1, qırmızı) və F-aktin (yaşıl) və nüvələr (mavi) ilə işarələnmiş davamlı fırça sərhəd membranlarının üfüqi frontal görünüşü. Bağırsaq qırıntılarında epitel hüceyrələrinin immunofluoresensiya konfokal vizuallaşdırılması.Orta sxemaya işarə edən oxlar hər bir konfokal görünüş üçün fokus müstəvisinin yerini göstərir.d, 3, 7, 9, 11 və 13-cü günlərdə fazalı kontrast mikroskopiya ilə əldə edilmiş bir çipdə becərilən orqanoidlərdə morfoloji dəyişikliklərin zaman gedişatı. Əlavə hissə (yuxarı sağda) təqdim olunan təsvirin yüksək böyüdülməsini göstərir.e, 7-ci gündə çəkilmiş dilim üzərində bağırsaqda qurulmuş orqanoid 3D epitelinin DIC fotomikroqrafı.f, Bağırsaq çiplərində müvafiq olaraq 3 gün (Sol) və 13 günlük (orta) orqanoidlər yetişdirilən kök hüceyrələri (LGR5; magenta), qədəh hüceyrələri (MUC2; yaşıl), F-aktin (boz) və nüvələr (firuzəyi) üçün markerləri göstərən üst-üstə düşmüş immunoflüoresans şəkilləri, epitel təbəqəsində müvafiq olaraq 3 gün (Sol) və 13 günlük (orta) orqanoidlərdir. Həmçinin MUC2 siqnalı olmadan LGR5 siqnalını vurğulayan Genişləndirilmiş Məlumat Şəkil 3-ə baxın. Kultivasiyanın 13-cü günündə plazma membranını CellMask boyası (sağda) ilə boyamaqla çip üzərində bağırsaqda qurulan 3D orqanoid epitelinin epitel mikrostrukturunu (sağda) göstərən flüoresans şəkilləri. Başqa cür göstərilmədiyi təqdirdə miqyas zolağı 50 μm-dir.b İstinaddan icazə ilə yenidən çap olunub.2. Oxford University Press; c İstinaddan icazə ilə uyğunlaşdırılıb.2. Oxford University Press; e və f istinaddan icazə ilə uyğunlaşdırılıb.12 Creative Commons Lisenziyası CC BY 4.0 altında.
Çip üzərindəki bağırsaqda, uğurlu ECM örtüyü üçün PDMS məsaməli membranının hidrofob səthini dəyişdirmək lazımdır. Bu protokolda, PDMS membranlarının hidrofobluğunu dəyişdirmək üçün iki fərqli metod tətbiq edirik. Caco-2 hüceyrələrinin becərilməsi üçün yalnız UB/ozon müalicəsi ilə səth aktivləşdirilməsi PDMS səthinin hidrofobluğunu azaltmaq, ECM-i örtmək və Caco-2 hüceyrələrini PDMS membranına birləşdirmək üçün kifayət idi. Lakin, orqanoid epitelin mikrofluidik becərilməsi, polietilenimin (PEI) və qlutaraldehidi ardıcıl olaraq PDMS mikrokanallarına tətbiq etməklə ECM zülallarının səmərəli şəkildə çökdürülməsinə nail olmaq üçün kimyəvi əsaslı səth funksionalizasiyasını tələb edir. Səth modifikasiyasından sonra ECM zülalları funksionallaşdırılmış PDMS səthini örtmək üçün çökdürüldü və sonra təcrid olunmuş orqanoid epiteliyə daxil edildi. Hüceyrələr birləşdirildikdən sonra, mikrofluidik hüceyrə kulturası, hüceyrələr tam monolayer əmələ gətirənə qədər yalnız mühiti yuxarı mikrokanala perfuziya etməklə başlayır, aşağı mikrokanal isə statik şəraiti saxlayır. Səth aktivləşdirilməsi və ECM örtüyü üçün bu optimallaşdırılmış metod orqanoid epitelin birləşməsini induksiya etməyə imkan verir. PDMS səthində 3D morfogenez.
Transwell kulturaları da hüceyrə əkilməsindən əvvəl ECM örtüyü tələb edir; lakin, Transwell kulturaları məsaməli əlavələrin səthini aktivləşdirmək üçün mürəkkəb ilkin emal addımlarını tələb etmir. Transwell əlavələrində Caco-2 hüceyrələrinin yetişdirilməsi üçün məsaməli əlavələr üzərində ECM örtüyü dissosiasiya olunmuş Caco-2 hüceyrələrinin yapışmasını (<1 saat) və sıx birləşmə baryerinin əmələ gəlməsini (<1-2 gün) sürətləndirir. Transwell əlavələrində orqanoidlərin becərilməsi üçün təcrid olunmuş orqanoidlər ECM ilə örtülmüş əlavələrə əkilir, membran səthinə yapışdırılır (<3 saat) və orqanoidlər baryer bütövlüyünə malik tam monolayer əmələ gətirənə qədər saxlanılır. Transwell kulturaları hibrid çiplərdən istifadə etmədən 24 quyulu lövhələrdə aparılır.
In vitro 3D morfogenezi, müəyyən bir epitel təbəqəsinin bazolateral aspektinə maye axını tətbiq etməklə başlana bilər. Çip üzərindəki bağırsaqda, epitelial morfogenez, mühit yuxarı və aşağı mikrokanallara perfuziya edildikdə başladı (Şəkil 3a). Əvvəllər təsvir edildiyi kimi, istiqamətli ifraz olunan morfogen inhibitorlarının davamlı olaraq çıxarılması üçün aşağı (bazolateral) bölməyə maye axını daxil etmək vacibdir. Məsaməli membranlara bağlı hüceyrələrə kifayət qədər qida və serum təmin etmək və lüminal kəsmə stressi yaratmaq üçün, adətən çip üzərində bağırsaqda ikili axın tətbiq edirik. Hibrid çiplərdə, epitelial monolayerləri olan Transwell əlavələri hibrid çiplərə daxil edildi. Daha sonra, mühit mikrokanal vasitəsilə məsaməli Transwell əlavəsinin bazolateral tərəfinin altına tətbiq edildi. Bağırsaq morfogenezi hər iki mədəniyyət platformasında bazolateral axının başlamasından 3-5 gün sonra baş verdi.
Mikromühəndislikli 3D epitelial təbəqələrin morfoloji xüsusiyyətləri faz kontrast mikroskopiyası, diferensial interferensiya kontrast (DIC) mikroskopiyası, SEM və ya immunoflüoresans konfokal mikroskopiyası daxil olmaqla müxtəlif görüntüləmə üsulları tətbiq etməklə təhlil edilə bilər (Şəkil 3 və 4). 3D epitelial təbəqələrin formasını və çıxıntısını izləmək üçün faz kontrastı və ya DIC görüntüləməsi istənilən vaxt becərmə zamanı asanlıqla həyata keçirilə bilər. PDMS və poliester filmlərin optik şəffaflığına görə, həm çip üzərində bağırsaq, həm də hibrid çip platformaları cihazın kəsilməsinə və ya sökülməsinə ehtiyac olmadan real vaxt yerində görüntüləmə təmin edə bilər. İmmunoflüoresans görüntüləməsi aparılarkən (Şəkil 1, 3c, f və 4b, c) hüceyrələr adətən 4% (çəki/həcm) paraformaldehid (PFA) ilə fiksasiya olunur, ardınca Triton X-100 və 2% (çəki/həcm)) mal-qara serum albumin (BSA) ardıcıllıqla tətbiq olunur. Hüceyrə növündən asılı olaraq, müxtəlif fiksatorlar, keçiricilik artırıcılar və bloklayıcı maddələr istifadə edilə bilər. istifadə olunur. Çipdə yerində immobilizasiya olunmuş hüceyrələri vurğulamaq üçün soydan asılı hüceyrə və ya bölgə markerlərini hədəf alan ilkin antikorlar, ardınca nüvəni (məsələn, 4′,6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) və ya F-aktini (məsələn, flüoresan etiketli falloidin) hədəf alan əks boya ilə birlikdə ikincil antikorlar istifadə olunur. Flüoresan əsaslı canlı görüntüləmə, selik istehsalını (Şəkil 1, “Hüceyrə differensiasiyası” və “Bağırsaq fiziologiyası”), mikrob hüceyrələrinin təsadüfi kolonizasiyasını (Şəkil 1, “Ev sahibi-mikrob birgəkulturası”), immun hüceyrələrinin cəlb olunmasını (Şəkil 1, “Xəstəlik Modelləşdirməsi”) və ya 3D epitelial morfologiyanın konturlarını (Şəkil 3c,f və 4b,c) aşkar etmək üçün yerində də həyata keçirilə bilər. İstinadda təsvir edildiyi kimi, yuxarı təbəqəni aşağı mikrokanal təbəqəsindən ayırmaq üçün çipdəki bağırsağı dəyişdirərkən. Şəkil 2-də göstərildiyi kimi, 3D epitelial morfologiyası, eləcə də apikal fırça sərhədindəki mikroxovlar. SEM ilə vizuallaşdırıla bilər (Şəkil 3b). Differensiasiya markerlərinin ifadəsi kəmiyyət PCR5 və ya tək hüceyrəli RNT ardıcıllığı ilə qiymətləndirilə bilər. Bu halda, bağırsaq çiplərində və ya hibrid çiplərdə yetişdirilən epitelial hüceyrələrin 3D təbəqələri tripsinizləşmə yolu ilə toplanır və sonra molekulyar və ya genetik analiz üçün istifadə olunur.
a, Hibrid çipdə bağırsaq morfogenezinin induksiyası üçün iş axını. Bu protokolda hibrid çip platformasında 3D morfogenezini nümayiş etdirmək üçün Caco-2 və bağırsaq orqanoidlərindən istifadə olunur. Dissosiasiya olunmuş epitel hüceyrələri hazırlanmış Transwell əlavələrinə əkilmişdir (TW hazırlığı; aşağıdakı şəklə baxın). Transwell əlavələrində hüceyrələr əkilib (əkilmiş) və poliester membranlara birləşdirildikdən sonra bütün hüceyrələr statik şəraitdə əkilmişdir (TW kulturası). 7 gündən sonra, 2D monoqatlı epitel hüceyrələri olan tək bir Transwell əlavəsi bazolateral axını (Flow, BL) daxil etmək üçün hibrid çipə inteqrasiya edilmişdir ki, bu da nəticədə 3D epitelial təbəqənin yaranmasına (morfogenez) səbəb olmuşdur. Hər bir eksperimental mərhələdə və ya zaman nöqtəsində normal donordan (C103 xətti) yüksələn yoğun bağırsaqdan əldə edilən insan orqan epitel hüceyrələrinin morfoloji xüsusiyyətlərini göstərən fazalı kontrast mikroqrafları. Yuxarı təbəqələrdəki sxemlər hər addım üçün eksperimental konfiqurasiyanı göstərir. b, Hibrid çiplər (sol sxem) müxtəlif Z nöqtələrində çəkilmiş yuxarıdan aşağıya konfokal mikroskopiya görünüşləri ilə orqanoid epitel hüceyrələrinin 3D morfogenezinə səbəb ola bilər. mövqelər (yuxarı, orta və aşağı; sağ sxematik və müvafiq nöqtəli xətlərə baxın). aşkar morfoloji xüsusiyyətlər göstərdi. F-aktin (firuzəyi), nüvə (boz).c, statik Transwell-də (TW; ağ nöqtəli qutunun içərisindəki əlavə) becərilən orqanoid mənşəli epitel hüceyrələrinin flüoresan konfokal mikroqrafikləri (3D bucaqlı görünüş) və hibrid çip (ən böyük tam görüntü), müvafiq olaraq 2D və 3D morfologiyasını müqayisə edir. Bir cüt 2D şaquli kəsik görünüşləri (yuxarı sağ küncdə əlavə; "XZ") də 2D və 3D xüsusiyyətləri göstərir. Miqyas zolağı, 100 µm.c İstinaddan icazə ilə yenidən çap olunub.4. Elsevier.
Kontrol hüceyrələri, eyni hüceyrələri (Caco-2 və ya bağırsaq orqanoid epitelial hüceyrələri) ənənəvi statik becərmə şəraitində ikiölçülü monolayerlərə becərməklə hazırlana bilər. Xüsusilə, mikrokanalların məhdud həcm tutumu (yəni orijinal bağırsaq çipi dizaynındakı üst kanalda ~4 µL) səbəbindən qida maddələrinin tükənməsi baş verə bilər. Buna görə də, bazolateral axının tətbiqindən əvvəl və sonra epitelial morfologiya da müqayisə edilə bilər.
Yumşaq litoqrafiya prosesi təmiz otaqda aparılmalıdır. Çipdəki hər bir təbəqə (üst və alt təbəqələr və membranlar) və hibrid çiplər üçün mikrokanalların hündürlükləri fərqli olduğundan fərqli fotomaskalardan istifadə edilmiş və ayrı-ayrı silikon lövhələrdə hazırlanmışdır. Çipdəki bağırsağın yuxarı və aşağı mikrokanallarının hədəf hündürlükləri müvafiq olaraq 500 µm və 200 µm-dir. Hibrid çipdəki kanalın hədəf hündürlüyü 200 µm-dir.
3 düymlük silikon lövhəni asetonlu bir qaba qoyun. Lövhəni 30 saniyə ərzində yumşaq bir şəkildə fırladın, sonra lövhəni havada qurudun. Lövhəni IPA olan bir boşqaba köçürün, sonra təmizləmək üçün boşqabı 30 saniyə fırladın.
Silikon lövhənin səthindən üzvi qalıqların təmizlənməsini maksimum dərəcədə artırmaq üçün piranya məhlulu (hidrogen peroksid və konsentratlaşdırılmış sulfat turşusunun qarışığı, 1:3 (həcm/həcm)) isteğe bağlı olaraq istifadə edilə bilər.
Piranya məhlulu son dərəcə aşındırıcıdır və istilik yaradır. Əlavə təhlükəsizlik tədbirləri zəruridir. Tullantıların atılması üçün məhlulun soyumasına və təmiz, quru tullantı qabına köçürülməsinə icazə verin. İkinci dərəcəli qablardan istifadə edin və tullantı qablarını düzgün etiketləyin. Daha ətraflı prosedurlar üçün müəssisənin təhlükəsizlik qaydalarına əməl edin.
Vafliləri 200 °C-lik qızdırıcı lövhəyə 10 dəqiqə qoyaraq susuzlaşdırın. Susuzlaşdırıldıqdan sonra vafli soyumaq üçün havada beş dəfə çalxalandı.
Təmizlənmiş silikon lövhənin mərkəzinə təxminən 10 q fotorezist SU-8 2100 tökün. Fotorezisti lövhənin üzərinə bərabər şəkildə yaymaq üçün cımbızdan istifadə edin. Fotorezisti daha az yapışqan və daha asan yaymaq üçün lövhəni vaxtaşırı 65°C istilik plitəsinə qoyun. Lövhəni birbaşa istilik plitəsinə qoymayın.
SU-8, spin örtüyü işlədərək lövhə üzərində bərabər paylanmışdır. SU-8-in daxil olan fırlanmasını 5-10 saniyə ərzində 100 rpm/s sürətlənmə ilə 500 rpm sürətlə yayılmaq üçün proqramlaşdırın. Əsas fırlanmanı 1500 rpm-də 200 µm qalınlıqda naxışlama üçün təyin edin və ya 1200 rpm-də 30 saniyə ərzində 300 rpm/s sürətlənmə ilə təyin edərək 250 µm qalınlığa nail olun (çipdəki bağırsağın yuxarı təbəqəsi üçün 500 µm hündürlük yaradın; aşağıdakı "Kritik addımlar"a baxın).
Əsas fırlanma sürəti silikon lövhədəki SU-8 naxışının hədəf qalınlığına uyğun olaraq tənzimlənə bilər.
Çipdəki bağırsağın yuxarı təbəqəsi üçün 500 µm hündürlükdə SU-8 naxışları hazırlamaq üçün, bu Qutunun fırlanma örtüyü və yumşaq bişirmə addımları (7 və 8-ci addımlar) ardıcıl olaraq təkrarlanaraq (9-cu addıma baxın) iki 250 µm qalınlığında təbəqə əmələ gətirildi. Bu qutunun 12-ci addımında qat-qat düzülə və UB şüalanması ilə birləşdirilə bilən qalın SU-8 təbəqəsi 500 µm hündürlükdə təbəqə əmələ gətirdi.
SU-8 örtüklü vafliləri 65 °C-də 5 dəqiqə ərzində isti boşqaba diqqətlə qoyaraq yumşaldın, sonra parametri 95 °C-yə keçirin və əlavə 40 dəqiqə inkubasiya edin.
Üst mikrokanalda SU-8 naxışının 500 μm hündürlüyünə nail olmaq üçün 250 μm qalınlığında iki SU-8 təbəqəsi yaratmaq üçün 7 və 8-ci addımları təkrarlayın.
UV Maska Düzləndiricisindən istifadə edərək, lövhənin məruz qalma müddətini hesablamaq üçün istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq lampa sınağı aparın. (məruz qalma müddəti, ms) = (məruz qalma dozası, mJ/sm2)/(lampa gücü, mV/sm2).
Ekspozisiya müddətini təyin etdikdən sonra, fotomaskanı UV maska ​​​​hizalayıcısının maska ​​​​tutucuna və fotomaskanı SU-8 örtüklü lövhəyə yerləşdirin.
UB dispersiyasını minimuma endirmək üçün fotomaskın çap olunmuş səthini birbaşa SU-8 örtüklü silikon lövhənin üzərinə qoyun.
SU-8 örtüklü lövhəni və fotomaskanı əvvəlcədən müəyyən edilmiş məruz qalma müddəti üçün şaquli olaraq 260 mJ/sm2 UB işığına məruz qoyun (bu qutunun 10-cu addımına baxın).
UB şüalarına məruz qaldıqdan sonra, SU-8 örtüklü silikon lövhələr hər bir qızdırıcı lövhədə 65°C-də 5 dəqiqə və 95°C-də 15 dəqiqə bişirildi ki, 200 µm hündürlükdə naxışlar hazırlansın. 500 µm hündürlükdə naxışlar hazırlamaq üçün 95°C-də bişirmə sonrası müddəti 30 dəqiqəyə qədər uzadın.
Tərtibatçı şüşə qaba tökülür və bişmiş vafli qaba yerləşdirilir. SU-8 tərtibatçısının həcmi şüşə lövhənin ölçüsündən asılı olaraq dəyişə bilər. Açılmamış SU-8-i tamamilə çıxarmaq üçün kifayət qədər SU-8 tərtibatçısından istifadə etdiyinizə əmin olun. Məsələn, 1 litr tutumlu 150 mm diametrli şüşə qabdan istifadə edərkən təxminən 300 ml SU-8 tərtibatçısından istifadə edin. Qəlibi 25 dəqiqə ərzində ara sıra yumşaq fırlatmaqla hazırlayın.
Hazırlanmış qəlibi təxminən 10 ml təzə geliştirici ilə yuyun, ardınca məhlulu pipet istifadə edərək IPA ilə püskürdün.
Plastinanı plazma təmizləyicisinə qoyun və 1,5 dəqiqə ərzində oksigen plazmasına (atmosfer qazı, hədəf təzyiqi 1 × 10−5 Torr, gücü 125 Vt) məruz qoyun.
Plitəni içərisində şüşə slayd olan vakuum quruducuya qoyun. Plitələri və slaydları yan-yana yerləşdirmək olar. Vakuum quruducusu lövhə ilə bir neçə təbəqəyə bölünübsə, slaydları aşağı kameraya, plitələr isə yuxarı kameraya qoyun. Şüşə slayda 100 μL triklor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silan məhlulu damladın və silanizasiya üçün vakuum tətbiq edin.
Dondurulmuş Caco-2 hüceyrələri olan bir flakonu 37°C su hamamında əridin, sonra əridilmiş hüceyrələri 15 ml 37°C əvvəlcədən isidilmiş Caco-2 mühiti olan T75 kolbasına köçürün.
Caco-2 hüceyrələrini təxminən 90% qarışıqlıqda keçirmək üçün əvvəlcə 37°C su hamamında Caco-2 mühitini, PBS-i və 0,25% tripsin/1 mM EDTA-nı ilıqlaşdırın.
Vakuum aspirasiyası ilə mühiti sorun. Vakuum aspirasiyasını təkrarlayaraq və təzə PBS əlavə edərək hüceyrələri iki dəfə 5 ml ilıq PBS ilə yuyun.