Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез куллана торган браузер версиясендә CSS өчен чикләнгән ярдәм күрсәтелә. Иң яхшы тәҗрибә өчен, без сезгә яңартылган браузер кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'да туры килүчәнлек режимын сүндерегез). Шуңа кадәр, ярдәмне дәвам итү өчен, без сайтны стильләрсез һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Кеше эчәклеге морфогенезы 3D эпителий микроархитектурасының һәм киңлек оешмасының крипто-вилла үзенчәлекләрен билгели. Бу уникаль структура базаль криптадагы күзәнәк нишасын экзоген микроб антигеннарыннан һәм аларның метаболитларыннан саклау юлы белән эчәклек гомеостазын саклап калу өчен кирәк. Моннан тыш, эчәклек виллалары һәм бүлеп чыгаручы лайла эчәклек лайласы өслегендә саклагыч барьер белән функциональ яктан дифференциацияләнгән эпителий күзәнәкләрен тәкъдим итә. Шуңа күрә, 3D эпителий структураларын яңадан булдыру in vitro эчәклек модельләрен төзү өчен бик мөһим. Аерым алганда, органик миметик чиптагы эчәклек эчәклек эпителийының үзеннән-үзе 3D морфогенезын стимуллаштыра ала, физиологик функцияләрне һәм биомеханиканы яхшырта. Монда без микрофлюидик чипта, шулай ук ​​Трансвеллга кертелгән гибрид чипта эчәклектә эчәклек морфогенезын ныклы стимуллаштыру өчен кабатланырлык протокол тәкъдим итәбез. Без җайланмалар ясау, Caco-2 яки эчәклек органоид эпителий күзәнәкләрен гадәти шартларда, шулай ук ​​микрофлюидик платформада үстерү, 3D морфогенез индукциясе һәм күпсанлы сурәтләү ысулларын кулланып, билгеләнгән 3D эпителийларны характерлау өчен җентекле ысулларны тасвирлыйбыз. Бу протокол 5 көн дәвамында базолатераль сыеклык агымын контрольдә тоту юлы белән функциональ эчәк микроархитектурасын регенерацияләүгә ирешә. Безнең in vitro морфогенез ысулы физиологик яктан мөһим кисү көчәнешен һәм механик хәрәкәтне куллана һәм катлаулы күзәнәк инженериясен яки манипуляциясен таләп итми, бу башка булган ысуллардан яхшырак булырга мөмкин. Без тәкъдим иткән протокол биомедицина тикшеренүләре җәмгыяте өчен киң йогынты ясарга мөмкин дип уйлыйбыз, биомедицина, клиник һәм фармацевтика кушымталары өчен in vitro 3D эчәк эпителиаль катламнарын регенерацияләү ысулын тәкъдим итә.
Экспериментлар күрсәткәнчә, gut-on-a-chip1,2,3,4,5 яки ике катламлы микрофлюидик җайланмаларда6,7 үстерелгән эчәк эпителиаль Caco-2 күзәнәкләре, төп механизмны ачык аңламыйча, in vitro шартларында үзеннән-үзе 3D морфогенез кичерә ала. Күптән түгел үткәрелгән тикшеренүебездә без культура җайланмаларыннан базолатераль рәвештә бүленеп чыккан морфоген антагонистларын алу in vitro шартларында 3D эпителиаль морфогенезны стимуллаштыру өчен кирәкле һәм җитәрлек булуын ачыкладык, бу Caco-2 һәм пациенттан алынган эчәк органоидлары белән күрсәтелгән. Эпителиаль күзәнәкләр тикшерелде. Бу тикшеренүдә без, аерым алганда, көчле Wnt антагонисты Диккопф-1 (DKK-1) күзәнәк җитештерүенә һәм концентрациясен бүлүенә игътибар иттек, ул "Гибрид Чип" дип атала. Без экзоген Wnt антагонистларын (мәсәлән, DKK-1, Wnt репрессоры 1, бүленеп чыккан бөдрәләнгән аксым 1 яки Согги-1) чип эчәгенә өстәү морфогенезны тоткарлый яки алдан төзелгән 3D эпителий катламын боза икәнен күрсәтәбез, бу культура вакытында антагонистик стрессның in vitro эчәк морфогенезы өчен җаваплы булуын күрсәтә. Шуңа күрә, эпителиаль чиктә ныклы морфогенезга ирешүнең гамәли ысулы - базолатераль бүлектә Wnt антагонистлары дәрәҗәсен актив юу (мәсәлән, чип эчендәге эчәк яки чип эчендәге гибрид платформаларда) яки диффузия ярдәмендә бетерү яки минималь дәрәҗәдә саклап калу. Базолатераль мохит (мәсәлән, Трансвелл кертмәләреннән коелардагы зур базолатераль резервуарларга).
Бу протоколда без полидиметилсилоксан (PDMS) нигезендәге күзәнәкле мембраналарда (6A, 7A, 8, 9 адымнар) яки Transwell кертмәләренең полиэфир мембраналарында (6B, 7B, 8, 9 адымнар) эчәк эпителиаль күзәнәкләрен үстерү өчен чиптагы микроҗиһазлар һәм Transwell кертелә торган гибрид чиплар ясауның җентекле ысулын тәкъдим итәбез (1-5 адымнар). Шулай ук, без күп санлы сурәтләү ысулларын кулланып (11-24 адымнар), тукымага хас гистогенез һәм нәселгә бәйле күзәнәк дифференциациясен күрсәтүче күзәнәк һәм молекуляр үзенчәлекләрне ачыкладык. Без Caco-2 яки эчәк органоидлары кебек кеше эчәк эпителиаль күзәнәкләрен кулланып, ике культура форматында морфогенезны индукциялибез, шул исәптән күзәнәкле мембраналарның өслек модификациясе, 2D монокатламнар булдыру һәм эчәк биохимик һәм биомеханик микротирәлекне репродукцияләү кебек техник детальләр белән. in vitro. 2D эпителиаль монокатламнардан 3D морфогенезны индукцияләү өчен, без морфоген антагонистларын бетердек. ике культура формаларын да культураның базолатераль бүлегенә мохитне агызып. Ниһаять, без морфогенга бәйле эпителий үсешен, озынлыктагы хуҗа-микробиом бергә культураларын, патоген инфекциясен, ялкынсыну җәрәхәтен, эпителий барьеры дисфункциясен һәм пробиотикларга нигезләнгән терапияләрне модельләштерү өчен кулланылырга мөмкин булган регенерацияләнә торган 3D эпителий катламының файдалылыгын күрсәтәбез. Мисал. йогынтылар.
Безнең протокол төп (мәсәлән, эчәк лайлалы тышчасы биологиясе, күзәнәк күзәнәкләре биологиясе һәм үсеш биологиясе) һәм гамәли тикшеренүләрдә (мәсәлән, клиникка кадәрге даруларны тикшерү, авыруларны модельләштерү, тукымалар инженериясе һәм гастроэнтерология) киң йогынты ясаучы галимнәрнең киң даирәсенә файдалы булырга мөмкин. Эчәк эпителийының 3D морфогенезын in vitro шартларында стимуллаштыру протоколыбызның кабатланучанлыгы һәм ныклыгы аркасында, без техник стратегиябезне эчәк үсеше, регенерация яки гомеостаз вакытында күзәнәк сигнализациясе динамикасын өйрәнүче аудиториягә таратырга мөмкин дип күз алдына китерәбез. Моннан тыш, безнең протокол төрле йогышлы агентлар, мәсәлән, Норовирус 8, Авыр кискен респиратор синдромы коронавирус 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 яки Vibrio cholerae астында инфекцияне тикшерү өчен файдалы. Авыру патологиясе һәм патогенезы аудиторияләре дә файдалы. Чиптагы эчәк микрофизиология системасын куллану озынлыктагы бергә культуралаштыру 10 һәм аннан соң ашказаны-эчәк трактында хуҗа саклануын, иммун җавапларын һәм патогеннар белән бәйле җәрәхәтләрне төзәтүне бәяләү мөмкинлеген бирә ала 11. Агып торган эчәк синдромы, целиакия авыруы, Крон авыруы, җәрәхәтле колит, пухит яки ярсыган эчәк синдромы белән бәйле башка ашказаны-эчәк авыруларын пациентның 3D эчәк эпителий катламнарын кулланып 3D эчәк эпителий катламнары әзерләнгәндә симуляцияләргә мөмкин, бу авыруларга виллалар атрофиясе, крипта кыскаруы, лайлалы тышча зыяны яки эпителий барьерының бозылуы керә. Биопсия яки күзәнәктән алынган эчәк органоидлары 12,13. Авыру мохитенең югарырак катлаулылыгын яхшырак модельләштерү өчен, укучылар 3D эчәк виллалары-крипта микроархитектураларын үз эченә алган модельләргә пациентның периферик кан мононуклеар күзәнәкләре (PBMC) кебек авыруга кагылышлы күзәнәк төрләрен өстәргә мөмкин. тукымага хас иммун күзәнәкләр, 5.
3D эпителий микроструктурасын кисем процессыннан башка фиксацияләргә һәм визуализацияләргә мөмкин булганлыктан, киңлек транскриптомикасы һәм югары сыйфатлы яки супер сыйфатлы сурәтләү өстендә эшләүче тамашачылар эпителий нишаларындагы геннар һәм аксымнарның киңлек-вакыт динамикасын карталаштыру белән кызыксынырга мөмкин. Технология белән кызыксына. Микроб яки иммун стимулларга җавап. Моннан тыш, эчәк гомеостазын координацияләүче озынлыктагы хуҗа-микробиом үзара бәйләнеше 10, 14 3D эчәк лайлалы катламында төрле микроб төрләрен, микроб җәмгыятьләрен яки фекаль микробиотаны, бигрәк тә чиптагы эчәктә бергәләп үстерү юлы белән урнаштырылырга мөмкин. платформада. Бу алым, бигрәк тә, лабораториядә элек культуралаштырылмаган эчәк микробиотасын үстерергә омтылучы лайлалы тышча иммунологиясен, гастроэнтерологиясен, кеше микробиомасын, културомиканы һәм клиник микробиологияне өйрәнүче аудиторияләр өчен җәлеп итә. Әгәр безнең in vitro морфогенез протоколы масштабланырлык культура форматларына, мәсәлән, базолатераль бүлекләрне өзлексез тулыландыра торган 24, 96 яки 384 коелы пластинкалардагы күп чокырлы кертмәләргә җайлаштырылса, протокол шулай ук ​​азык-төлек сәнәгате өчен фармацевтика, биомедицина яки югары җитештерүчәнлекле скрининг яки валидация платформаларын эшләүчеләргә дә таратылырга мөмкин. Принципны исбатлау буларак, без күптән түгел 24 чокырлы пластинка форматына масштабланырлык күп күләмле югары җитештерүчәнлекле морфогенез системасының мөмкинлеген күрсәттек. Моннан тыш, чиптагы күп органлы продуктлар коммерцияләштерелде16,17,18. Шуңа күрә, безнең in vitro морфогенез ысулын валидацияләү тизләтелергә һәм күп тикшеренү лабораторияләре, сәнәгать яки хөкүмәт һәм көйләүче органнар тарафыннан даруларны сынау өчен in vitro эчәк морфогенезының күзәнәкле репрограммалавын аңлау өчен кулланылырга мөмкин. яки биотерапияләр Дару кандидатларының сеңүе һәм ташылуы эчәк морфогенез процессының кабатланучанлыгын бәяләү өчен 3D эчәк суррогатлары яки махсус яки коммерция орган-чиптагы модельләр ярдәмендә бәяләнде.
Эчәк эпителиаль морфогенезын өйрәнү өчен чикләнгән сандагы кеше өчен эксперименталь модельләр кулланылды, нигездә, in vitro 3D морфогенезын стимуллаштыру өчен гамәлгә ашырыла торган протоколлар булмау сәбәпле. Чынлыкта, эчәк морфогенезы турындагы хәзерге белемнәрнең күбесе хайваннарны өйрәнүгә нигезләнгән (мәсәлән, зебра балыгы20, тычканнар21 яки тавыклар22). Ләкин алар күп хезмәт һәм чыгым таләп итә, этик яктан шикле булырга мөмкин, һәм иң мөһиме, кеше үсеш процессларын төгәл билгеләми. Бу модельләр шулай ук ​​күп яклы масштаблана торган ысул белән сынап карау мөмкинлеге буенча бик чикләнгән. Шуңа күрә, in vitro 3D тукыма структураларын регенерацияләү протоколыбыз in vivo хайван модельләреннән, шулай ук ​​башка традицион статик 2D күзәнәк культурасы модельләреннән яхшырак эшли. Элегрәк тасвирланганча, 3D эпителиаль структураларны куллану безгә төрле лайлалы тышча яки иммун стимулларына җавап итеп криптовилла күчәрендә дифференциацияләнгән күзәнәкләрнең киңлек локализациясен тикшерергә мөмкинлек бирде. 3D эпителиаль катламнар микроб күзәнәкләренең киңлек нишаларын формалаштыру өчен ничек көндәшлек итүен һәм хуҗа факторларына җавап итеп экологик эволюцияне өйрәнү өчен урын бирә ала (мәсәлән, эчке һәм тышкы лайла катламнары, секреция... IgA һәм антимикроб пептидлар). Моннан тыш, 3D эпителий морфологиясе безгә эчәк микробиотасы үз җәмгыятьләрен ничек төзегәнен һәм синергетик рәвештә базаль крипталарда күзәнәк оешмасын һәм күзәнәк нишаларын формалаштыра торган микроб метаболитларын (мәсәлән, кыска чылбырлы май кислоталары) ничек җитештергәнен аңларга мөмкинлек бирә. Бу үзенчәлекләрне in vitro 3D эпителий катламнары урнаштырылганда гына күрсәтергә мөмкин.
Безнең 3D эчәк эпителиаль структураларын булдыру ысулыннан тыш, берничә in vitro ысул бар. Эчәк органоид культурасы - билгеле бер морфоген шартларында эчәк күзәнәкләрен үстерүгә нигезләнгән иң алдынгы тукыма инженериясе ысулы23,24,25. Ләкин транспорт анализы яки хуҗа-микробиом бергә культуралаштыру өчен 3D органоид модельләрен куллану еш кына катлаулы, чөнки эчәк люмены органоид эчендә урнашкан һәм шуңа күрә микроб күзәнәкләре яки экзоген антигеннар кебек люменаль компонентларны кертү чикләнгән. Органоид люменнарына керүне микроинжектор ярдәмендә яхшыртырга мөмкин,26,27 ләкин бу ысул инвазив һәм күп хезмәт таләп итә һәм аны башкару өчен махсус белем таләп итә. Моннан тыш, гидрогель каркасларында статик шартларда сакланган традицион органоид культуралары in vivo актив биомеханикасын төгәл чагылдырмый.
Берничә тикшеренү төркеме тарафыннан кулланыла торган башка ысуллар гель өслегендә изоляцияләнгән кеше эчәк күзәнәкләрен үстерү юлы белән эчәк эпителиаль структурасын имитацияләү өчен алдан структуралаштырылган 3D гидрогель каркасларын кулланалар. 3D бастырылган, микро-фрезерланган яки литографик рәвештә ясалган калыплар кулланып гидрогель каркасларын ясагыз. Бу ысул физиологик яктан мөһим морфоген градиентлары белән in vitro изоляцияләнгән эпителиаль күзәнәкләрнең үз-үзен оешкан урнашуын күрсәтә, каркаска стромаль күзәнәкләрне кертү юлы белән югары аспект нисбәте эпителиаль структураны һәм строма-эпителиаль үзара бәйләнешне булдыра. Ләкин алдан структуралаштырылган каркасларның табигате үзеннән-үзе морфогенетик процессның үзен күрсәтүенә комачауларга мөмкин. Бу модельләр шулай ук ​​динамик люминаль яки интерстициаль агым бирми, эчәк күзәнәкләренә морфогенез кичерү һәм физиологик функция алу өчен кирәкле сыеклык кисү көчәнеше юк. Соңгы вакытта үткәрелгән тагын бер тикшеренүдә микрофлюидик платформадагы гидрогель каркаслары һәм лазер белән эшкәртү ысулларын кулланып, эчәк эпителиаль структуралары кулланылган. Тычкан эчәк органоидлары эчәк торбасы структураларын формалаштыру өчен киселгән үрнәкләргә иярә, һәм эчәк эчендәге сыеклык агымы мөмкин. микрофлюидика модуле ярдәмендә кабатланган. Ләкин бу модель үзеннән-үзе морфогенетик процессларны күрсәтми һәм эчәк механобиологик хәрәкәтләрен дә үз эченә алмый. Шул ук төркемнең 3D бастыру ысуллары үзеннән-үзе морфогенетик процесслар белән миниатюр эчәк торбаларын булдыра алды. Торба эчендәге төрле эчәк сегментларын катлаулы ясауга карамастан, бу модельдә шулай ук ​​люминаль сыеклык агымы һәм механик деформация юк. Моннан тыш, модельнең эшләве чикләнгән булырга мөмкин, бигрәк тә биобастырып чыгару процессы тәмамланганнан соң, эксперименталь шартларны бозганнан яки күзәнәк-күзәнәк үзара бәйләнешләрен бозганнан соң. Киресенчә, безнең тәкъдим ителгән протокол үзеннән-үзе эчәк морфогенезын, физиологик яктан мөһим кисү көчәнешен, эчәклек хәрәкәтчәнлеген имитацияләүче биомеханиканы, бәйсез апикаль һәм базолатераль бүлекләрнең мөмкинлеген һәм модульлелекнең катлаулы биологик микромөхитен яңадан булдыруны тәэмин итә. Шуңа күрә безнең in vitro 3D морфогенез протоколы гамәлдәге ысулларның кыенлыкларын җиңү өчен өстәмә ысул тәкъдим итә ала.
Безнең протокол тулысынча 3D эпителиаль морфогенезга юнәлтелгән, культурада бары тик эпителиаль күзәнәкләр генә бар, һәм мезенхималь күзәнәкләр, эндотелиаль күзәнәкләр һәм иммун күзәнәкләр кебек башка төр күзәнәкләр юк. Элегрәк тасвирланганча, безнең протоколның төп өлеше кертелгән мохитнең базолатераль ягында бүленеп чыккан морфоген ингибиторларын бетерү юлы белән эпителиаль морфогенезны индукцияләүдән гыйбарәт. Безнең "чиптагы эчәк" һәм "чиптагы гибрид"ның ныклы модульлеге безгә дулкынлы 3D эпителиаль катламны яңадан торгызырга мөмкинлек бирсә дә, эпителиаль-мезенхималь үзара бәйләнешләр 33,34, тышкы матрица (ECM) урнаштыру 35 һәм безнең модельдә базаль крипталарда кәүсә күзәнәк нишаларын җиткерүче криптовиллалар кебек өстәмә биологик катлаулылыклар әле дә каралырга тиеш. Мезенхимадагы стромаль күзәнәкләр (мәсәлән, фибробластлар) ECM аксымнары җитештерүдә һәм in vivo эчәк морфогенезын көйләүдә төп роль уйный 35,37,38. Безнең модельгә мезенхималь күзәнәкләр өстәү морфогенетик процессны һәм күзәнәкне көчәйтте. Беркетү нәтиҗәлелеге. Эндотелий катламы (ягъни капиллярлар яки лимфа тамырлары) эчәк микротирәлегендә молекуляр транспортны көйләүдә39 һәм иммун күзәнәкләрне җәлеп итүдә40 мөһим роль уйный. Моннан тыш, тукыма модельләре күп органнарның үзара бәйләнешен күрсәтү өчен эшләнгәндә, тукыма модельләре арасында тоташтырыла алырлык кан тамырлары компонентлары алшарт булып тора. Шуңа күрә, орган дәрәҗәсендәге чишелеш белән төгәлрәк физиологик үзенчәлекләрне модельләштерү өчен эндотелий күзәнәкләрен кертергә кирәк булырга мөмкин. Пациенттан алынган иммун күзәнәкләр шулай ук ​​тумыштан килгән иммун җавапларны, антиген презентациясен, тумыштан килгән адаптив иммун үзара бәйләнешне һәм эчәк авыруларын имитацияләү контекстында тукымага хас иммунитетны күрсәтү өчен дә бик мөһим.
Гибрид чипларны куллану "ичәк-чип"ка караганда гадирәк, чөнки җайланманы урнаштыру гадирәк һәм Transwell өстәмәләрен куллану эчәк эпителийын масштаблау мөмкинлеген бирә. Шулай да, полиэстер мембраналы коммерциядә сатыла торган Transwell өстәмәләре эластик түгел һәм перисталтик хәрәкәтләрне симуляцияли алмый. Моннан тыш, гибрид чипка урнаштырылган Transwell өстәмәсенең апикаль бүлеге апикаль якта кисү көчәнеше булмыйча хәрәкәтсез калды. Әлбәттә, апикаль бүлектәге статик үзенчәлекләр гибрид чипларда озак вакытлы бактерияләрне бергәләп үстерү мөмкинлеген бирә. Гибрид чипларны кулланганда, без Transwell өстәмәләрендә 3D морфогенезны ныклы рәвештә стимуллаштыра алсак та, физиологик яктан мөһим биомеханика һәм апикаль сыеклык агымы җитмәү гибрид чип платформаларының потенциаль кушымталар өчен мөмкинлеген чикләргә мөмкин.
Кеше криптовиллалары күчәренең тулы масштаблы реконструкцияләре чиптагы эчәк һәм чиптагы гибрид культураларда тулысынча билгеләнмәгән. Морфогенез эпителиаль монокатламнан башланганлыктан, 3D микроархитектуралар in vivo криптларга морфологик охшашлык бирми. Микроинженерлык 3D эпителийда базаль крипт домены янындагы үрчүче күзәнәк популяциясен характерласак та, крипта һәм вилла өлкәләре ачык билгеләнмәгән. Чиптагы югарырак өске каналлар микроинженерлык эпителийның биеклегенең артуына китерсә дә, максималь биеклек әле дә ~300–400 мкм белән чикләнгән. Нечкә һәм юан эчәктәге кеше эчәк криптларының чын тирәнлеге ~135 мкм һәм ~400 мкм, ә нечкә эчәк виллаларының биеклеге ~600 мкм41.
Сурәтләү ягыннан караганда, 3D микроархитектураларның in situ суперчишелешле сурәтләүләре чиптагы эчәклек белән чикләнергә мөмкин, чөнки объектив линзадан эпителий катламына кадәр кирәкле эш арасы берничә миллиметр чамасы. Бу проблеманы хәл итү өчен ерак объектив кирәк булырга мөмкин. Моннан тыш, PDMS югары эластиклыгы аркасында сурәтләү үрнәген әзерләү өчен нечкә кисемнәр ясау катлаулы. Моннан тыш, чиптагы эчәклекнең катлам-катлам микрофабрикациясе һәр катлам арасында даими ябышуны үз эченә алганлыктан, эпителий катламының өслек структурасын тикшерү өчен өске катламны ачу яки алу бик авыр. Мәсәлән, сканерлаучы электрон микроскоп (SEM) кулланып.
PDMS гидрофоблыгы гидрофоб кечкенә молекулалар белән бәйле микрофлюид нигезендәге тикшеренүләрдә чикләүче фактор булып тора, чөнки PDMS мондый гидрофоб молекулаларны специфик булмаган рәвештә адсорбцияли ала. PDMSка альтернатив вариантларны башка полимер материаллар белән дә карарга мөмкин. Альтернатив вариант буларак, гидрофоб молекулаларның адсорбциясен минимальләштерү өчен PDMS өслеген модификацияләү (мәсәлән, липофиль материаллар 42 яки поли(этиленгликоль) 43 белән каплау) каралырга мөмкин.
Ниһаять, безнең ысул югары җитештерүчәнлекле скрининг яки "бер үлчәмдә барысы өчен дә яраклы" кулланучыга уңайлы эксперименталь платформа тәэмин итү ягыннан яхшы характерланмаган. Хәзерге протокол һәр микроҗиһазга шприц насосы таләп итә, ул CO2 инкубаторында урын алып тора һәм зур күләмле экспериментларны булдырмый. Бу чикләүне инновацион культура форматларының масштаблануы белән сизелерлек яхшыртырга мөмкин (мәсәлән, базолатераль мохитне өзлексез тулыландыру һәм алу мөмкинлеген бирә торган 24 коелы, 96 коелы яки 384 коелы поролонлы кертмәләр).
Кеше эчәк эпителийының in vitro 3D морфогенезын индукцияләү өчен, без ике параллель микроканал һәм арасында эластик күзәнәкле мембрана булган микрофлюидик чиплы эчәк җайланмасын кулландык, бу люмен-капилляр интерфейсын булдырды. Шулай ук ​​без Transwell кертмәләрендә үстерелгән поляризацияләнгән эпителий катламнары астында өзлексез базолатераль агым тәэмин итүче бер каналлы микрофлюидик җайланманы (гибрид чип) куллануны күрсәтәбез. Ике платформада да төрле кеше эчәк эпителий күзәнәкләренең морфогенезын базолатераль бүлектән морфоген антагонистларын чыгару өчен агымның юнәлешле манипуляциясен кулланып күрсәтергә мөмкин. Бөтен эксперименталь процедура (1 нче рәсем) биш өлештән тора: (i) эчәк чипын яки Transwell кертелә торган гибрид чипын микрофабрикацияләү (1-5 адымнар; 1 нче тартма), (ii) эчәк эпителий күзәнәкләрен (Caco-2 күзәнәкләре) яки кеше эчәк органоидларын әзерләү; 2-5 нче тартмалар), (iii) эчәк эпителиаль күзәнәкләрен эчәк чипларында яки гибрид чипларда үстерү (6-9 нчы адымнар), (iv) 3D эпителиаль микроструктураны характерлау өчен in vitro 3D морфогенез индукциясе (10 нчы адым) һәм (v)). Ниһаять, эпителиаль морфогенезны киңлек, вакыт, шартлы яки процедура контрольләре белән чагыштырып, in vitro морфогенезының нәтиҗәлелеген раслау өчен тиешле контроль төркем (түбәндә тагын да каралачак) төзелде.
Без ике төрле культура платформасын кулландык: туры каналлар яки сызыклы булмаган бормалы каналлар белән чиптагы эчәк, яки 1 нче тартмада тасвирланганча ясалган микрофлюидик җайланмада Transwell (TW) өстәмәләрен үз эченә алган гибрид чиплар, һәм 1 нче адым - 5. "Җайланма ясау" бер чип яки гибрид чип ясауның төп адымнарын күрсәтә. "Кеше эчәк эпителиаль күзәнәкләрен үстерү" бу протоколда кулланылган күзәнәк чыганагын (Caco-2 яки кеше эчәк органоидлары) һәм культура процедурасын аңлата. "In vitro морфогенез" Caco-2 яки органоидлардан алынган эпителиаль күзәнәкләрнең эчәк чипында яки гибрид чипның Transwell өстәмәләрендә культуралаштырылуының гомуми адымнарын күрсәтә, аннары 3D морфогенез индукциясе һәм характерлы эпителиаль структура формалашуы. Программа адымы номеры яки тартма номеры һәр ук астында күрсәтелә. Кушымтада урнаштырылган эчәк эпителиаль катламнарының ничек кулланылырга мөмкинлегенә мисаллар китерелә, мәсәлән, күзәнәк дифференциациясен характерлауда, эчәк физиологиясен өйрәнүдә, хуҗа-микробиом экосистемаларын булдыруда һәм авыруларны модельләштерүдә. "Күзәнәк"тә иммунофлуоресценция рәсемнәре. "Дифференциация" эчәк чипында барлыкка килгән 3D Caco-2 эпителий катламында экспрессияләнгән ядроларны, F-актинны һәм MUC2ны күрсәтә. MUC2 сигнализациясе бокал күзәнәкләрендә һәм лайлалы тышча өслекләреннән бүленеп чыккан лайлада бар. Эчәк физиологиясендәге флуоресцент рәсемнәрдә флуоресцент бодай үсемлеге агглютининын кулланып сиал кислотасы һәм N-ацетилглюкозамин калдыклары өчен буяу нәтиҗәсендә барлыкка килгән лайла күрсәтелә. "Хуҗа-микроб бергә культуралары"ндагы ике капланган рәсемдә чипта эчәклектә хуҗа-микробиом бергә культуралары күрсәтелә. Сул панельдә микроинженерлык ярдәмендә эшләнгән 3D Caco-2 эпителий күзәнәкләре белән яшел флуоресцент аксымны (GFP) экспрессияләүче E. coli бергә культурасы күрсәтелгән. Уң панельдә 3D Caco-2 эпителий күзәнәкләре белән бергә культураланган GFP E. coli локализациясе күрсәтелгән, аннары F-актин (кызыл) һәм ядролар (зәңгәр) белән иммунофлуоресценция буявы күрсәтелгән. Авыру модельләштерү бактериаль антигеннар (мәсәлән, липополисахарид,) белән физиологик каршылык астында эчәк ялкынсынуы чипларында сәламәт һәм агып торган эчәклекне күрсәтә. LPS) һәм иммун күзәнәкләр (мәсәлән, PBMC; яшел). Caco-2 күзәнәкләре 3D эпителий катламын булдыру өчен үстерелде. Масштаблы сызык, 50 мкм. Аскы рәттәге рәсемнәр: "Күзәнәкләрнең дифференциациясе" сылтамадан рөхсәт белән үзгәртелде. 2. Oxford University Press; 5 нче сылтамадан рөхсәт белән күчерелде. NAS; "Хуҗа-микроб бергә культурасы" 3 нче сылтамадан рөхсәт белән үзгәртелде. NAS; "Авыру модельләштерүе" сылтамадан рөхсәт белән үзгәртелде. 5. NAS.
Чиптагы эчәк һәм гибрид чиплар йомшак литография ярдәмендә кремний калыпларыннан сүтелгән PDMS репликалары ярдәмендә ясалган1,44 һәм SU-8 белән бизәлгән. Һәр чиптагы микроканалларның дизайны гидродинамиканы, мәсәлән, кисү көчәнешен һәм гидродинамик басымны исәпкә алып билгеләнә1,4,12. Ике янәшә куелган параллель туры микроканаллардан торган оригиналь чиптагы эчәк дизайны (Киңәйтелгән мәгълүматлар 1a рәсем), сыеклыкның артуын, сызыклы булмаган агым үрнәкләрен һәм культура күзәнәкләренең күп күчәрле деформациясен китереп чыгару өчен пар кәкре микроканалларны үз эченә алган катлаулы чиптагы эчәккә (Киңәйтелгән мәгълүматлар 1b рәсем) әверелгән (2a–f рәсем). 12. Катлаулырак эчәк биомеханикасын яңадан төзергә кирәк булганда, катлаулы чиптагы эчәкне сайларга мөмкин. Без оригиналь белән чагыштырганда эпителиаль үсешнең охшаш дәрәҗәсендә охшаш вакыт аралыгында 3D морфогенезны көчле рәвештә этәрә торган эчәк-чипны күрсәттек. Эчәк-Чип, культураланган күзәнәк төренә карамастан. Шуңа күрә, 3D морфогенезны стимуллаштыру өчен, сызыклы һәм катлаулы чип эчендәге эчәк конструкцияләре бер-берсен алыштыра ала. SU-8 үрнәкләре белән кремний калыпларында катыртылган PDMS репликалары демонтажланганнан соң тискәре үзенчәлекләр бирде (2a рәсем). Эчәкне чипта ясау өчен, әзерләнгән өске PDMS катламы эзлекле рәвештә күзәнәкле PDMS пленкасына беркетелде һәм аннары корона эшкәртү җайланмасы ярдәмендә кире кайтарып булмый торган бәйләнеш ярдәмендә аскы PDMS катламы белән тигезләнде (2b–f рәсем). Гибрид чиплар ясау өчен, катырылган PDMS репликалары пыяла слайдларга беркетелде, бу Transwell өстәмәләрен урнаштыра алырлык бер каналлы микрофлюидик җайланмалар булдырды (2h рәсем һәм киңәйтелгән мәгълүматлар 2 нче рәсем). Бәйләү процессы PDMS репликасы һәм пыяла өслекләрен кислород плазмасы яки корона эшкәртү белән эшкәртү юлы белән башкарыла. Силикон трубкага беркетелгән микрофабрикацион җайланманы стерилизацияләгәннән соң, җайланма эчәк эпителийының 3D морфогенезын башкарырга әзер иде (2g рәсем).
a, SU-8 бизәкле кремний калыпларыннан PDMS детальләрен әзерләүнең схематик иллюстрациясе. Катырылмаган PDMS эремәсе кремний калыпка (сулда) коелды, 60 °C температурада катырылды (уртада) һәм сүтелде (уңда). Җимерелгән PDMS кисәкләргә киселде һәм алга таба куллану өчен чистартылды.b, PDMS өске катламын әзерләү өчен кулланылган кремний калыпның фотосурәте.c, PDMS күзәнәкле мембранасын ясау өчен кулланылган кремний калыпның фотосурәте.d, Өске һәм аскы PDMS компонентларының һәм җыелган чиплы эчәк җайланмасының фотосурәтләре сериясе.e, Өске, мембрана һәм аскы PDMS компонентларының тигезләнеше схемасы. Һәр катлам плазма яки корона белән эшкәртү ярдәмендә кире кайтарып булмый торган рәвештә бәйләнгән.f, Өстәмә бормалы микроканаллар һәм вакуум камералары белән ясалган чиплы эчәк җайланмасының схемасы.g, Микрофлюидик күзәнәк культурасы өчен чиплы эчәк җайланмасын урнаштыру. Силикон трубка һәм шприц белән җыелган чиплы эчәк капкачына урнаштырылды. Чип җайланмасы капкачына урнаштырылды. эшкәртү өчен 150 мм Петри савыты. Бәйләүче матдә силикон көпшәне ябу өчен кулланыла. h, Гибрид чип ясауның һәм гибрид чиплар кулланып 3D морфогенезның визуаль күренешләре. Эчәк эпителиаль күзәнәкләренең 2D монокатламнарын үстерү өчен мөстәкыйль рәвештә әзерләнгән Трансвелл өстәмәләре гибрид чипка эчәк 3D морфогенезын стимуллаштыру өчен кертелде. Уртача Трансвелл өстәмәсендә урнаштырылган күзәнәк катламы астындагы микроканаллар аша перфузияләнә. Масштаблы сызык, 1 см. h Сылтамадан рөхсәт белән кабат бастырылган. 4. Elsevier.
Бу протоколда Caco-2 күзәнәк линиясе һәм эчәк органоидлары эпителий чыганаклары буларак кулланылды (3a рәсем). Ике төр күзәнәк тә бәйсез рәвештә үстерелде (2 нче һәм 5 нче тартма) һәм чип эчендәге эчәк яки Трансвелл кертмәләренең ECM белән капланган микроканалларын чәчү өчен кулланылды. Күзәнәкләр кушылганда (колбаларда >95% каплау), Т-колбалардагы даими үстерелгән Caco-2 күзәнәкләре (10 һәм 50 нче юллар арасында) трипсинизация сыекчасы ярдәмендә диссоциацияләнгән күзәнәк суспензияләрен әзерләү өчен җыела (2 нче тартма). Эчәк биопсияләреннән яки хирургик кисеп алулардан алынган кеше эчәк органоидлары структураль микротирәлекне тәэмин итү өчен 24 чокырлы пластиналардагы Matrigel каркас гөмбәзләрендә үстерелде. 3 нче тартмада тасвирланганча әзерләнгән мөһим морфогеннар (мәсәлән, Wnt, R-спондин һәм Ноггин) һәм үсеш факторларын үз эченә алган мохит органоидлар диаметры ~500 мкм га кадәр үскәнче көнаралаш өстәлде. Тулысынча үскән органоидлар җыела һәм диссоциацияләнә. чиптагы эчәккә яки Трансвелл өстәмәләренә урнаштыру өчен аерым күзәнәкләргә (5 нче тартма). Элегрәк хәбәр иткәнебезчә, аны авыру төренә карап аерырга мөмкин12,13 (мәсәлән, җәрәхәтле колит, Крон авыруы, колоректаль яман шеш яки нормаль донор), җәрәхәтләнү урынына (мәсәлән, җәрәхәт яки җәрәхәтләнмәгән өлкә) һәм тракттагы ашказаны-эчәк урнашуына (мәсәлән, уникеилле эчәк, ачы эчәк, йомырка, көр эчәк, юан эчәк яки туры эчәк) карап. Без 5 нче тартмада нечкә эчәк органоидларына караганда морфогеннарның югарырак концентрациясен таләп итә торган юан эчәк органоидларын (колоидларны) үстерү өчен оптимальләштерелгән протокол тәкъдим итәбез.
а, Эчәк чипында эчәк морфогенезын индукцияләү өчен эш процессы. Бу протоколда 3D морфогенезны күрсәтү өчен Caco-2 кеше эчәк эпителие һәм эчәк органоидлары кулланыла. Аерым алынган эпителий күзәнәкләре әзерләнгән эчәк-чип җайланмасында (чип әзерләү) чәчелде. Күзәнәкләр 0 нче көнне (D0) PDMS күзәнәкле мембранасына чәчелгәннән (чәчелгәннән) һәм беркетелгәннән (беркетелгәннән) соң, апикаль (AP) агым башлана һәм беренче 2 көн дәвамында саклана (агым, AP, D0-D2). Тулы 2D монокатлам барлыкка килгәч, базолатераль (BL) агым да циклик сузылу хәрәкәтләре (сузылу, агым, AP һәм BL) белән бергә башлана. Эчәк 3D морфогенезы 5 көнлек микрофлюидик культурадан соң үзеннән-үзе барлыкка килде (морфогенез, D5). Фаза контраст рәсемнәре һәр эксперименталь адымда яки вакыт ноктасында Caco-2 күзәнәкләренең типик морфологиясен күрсәтә (баганалы график, 100 мкм). Эчәк морфогенезының тиешле каскадларын күрсәтүче дүрт схема диаграммасы (өстә) уңда). Схемадагы өзекле уклар сыеклык агымы юнәлешен күрсәтә.b, урнаштырылган 3D Caco-2 эпителийының өслек топологиясен күрсәтүче SEM рәсеме (сулда). Зурайтылган өлкәне күрсәтүче өстәмә рәсемдә (ак өзекле рамка) 3D Caco-2 катламындагы регенерацияләнгән микроворсинкалар күрсәтелгән (уңда).c, урнаштырылган Caco-2 3D, клаудин (ZO-1, кызыл) һәм F-актин (яшел) һәм төшләр (зәңгәр) дип билгеләнгән өзлексез щеткалы чик мембраналарының горизонталь фронталь күренеше. Эчәк кисәкләрендәге эпителий күзәнәкләренең иммунофлуоресценция конфокаль визуализациясе. Урта схемага юнәлтелгән уклар һәр конфокаль күренеш өчен фокаль яссылыкның урнашуын күрсәтә.d, 3, 7, 9, 11 һәм 13 көннәрдә фазалы контраст микроскопиясе ярдәмендә алынган чипта үстерелгән органоидлардагы морфологик үзгәрешләрнең вакытлы барышы. Өстәмә рәсемдә (өске уңда) бирелгән рәсемнең югары зурайтылганлыгы күрсәтелгән.e, 7 нче көнне төшерелгән кисемтәдә эчәктә урнашкан органоид 3D эпителийның DIC фотомикрографиясе.f, Эпителий катламында 3 көн дәвамында (сулда) һәм 13 көнлек (уртада) органоидлар үстерелгән, күзәнәкләр (LGR5; кызгылт-сары), бокал күзәнәкләр (MUC2; яшел), F-актин (соры) һәм төшләр (зәңгәрсу) маркерларын күрсәтүче капланган иммунофлуоресценция рәсемнәре. Шулай ук ​​MUC2 сигнализациясе булмаган LGR5 сигнализациясен яктырткан киңәйтелгән мәгълүмат 3 нче рәсемне карагыз. 13 нче көнне культурада плазма мембранасын CellMask буявы белән буяу юлы белән чипта урнаштырылган 3D органоид эпителий эпителий микроструктурасын (уңда) күрсәтүче флуоресценция рәсемнәре. Башкача күрсәтелмәгән очракта масштаб сызыгы 50 мкм.b Сылтамадан рөхсәт белән бастырылган.2. Oxford University Press; c Сылтамадан рөхсәт белән җайлаштырылган.2. Oxford University Press; e һәм f сылтама буенча рөхсәт белән җайлаштырылган.12 Creative Commons лицензиясе буенча CC BY 4.0.
Чиптагы эчәктә, уңышлы ECM каплавы өчен PDMS күзәнәкле мембранасының гидрофоб өслеген үзгәртү кирәк. Бу протоколда без PDMS мембраналарының гидрофоблыгын үзгәртү өчен ике төрле ысул кулланабыз. Caco-2 күзәнәкләрен үстерү өчен, PDMS өслегенең гидрофоблыгын киметү, ECMны каплау һәм Caco-2 күзәнәкләрен PDMS мембранасына беркетү өчен UV/озон белән эшкәртү белән өслекне активлаштыру гына җитә иде. Ләкин, органоид эпителийның микрофлюидик культурасы полиэтиленимин (PEI) һәм глутаральдегидны PDMS микроканалларына эзлекле куллану юлы белән ECM аксымнарын нәтиҗәле урнаштыруга ирешү өчен химик нигезле өслек функционализациясен таләп итә. Өслекне модификацияләгәннән соң, ECM аксымнары функциональләштерелгән PDMS өслеген каплау өчен урнаштырылды һәм аннары изоляцияләнгән органоид эпителийга кертелде. Күзәнәкләр беркетелгәннән соң, микрофлюидик күзәнәк культурасы күзәнәкләр тулы монокатлам барлыкка китергәнче, өске микроканалга мохитне генә перфузияләүдән башлана, ә аскы микроканал статик шартларны саклый. Өслекне активлаштыру һәм ECM каплавы өчен бу оптимальләштерелгән ысул органоид эпителийның беркетелүен стимуллаштырырга мөмкинлек бирә. PDMS өслегендә 3D морфогенез.
Трансвелл культуралары күзәнәк чәчү алдыннан ECM каплавын да таләп итә; шулай да, Трансвелл культуралары күзәнәкле кертемнәрнең өслеген активлаштыру өчен катлаулы алдан эшкәртү адымнарын таләп итми. Трансвелл кертемнәрендә Caco-2 күзәнәкләрен үстерү өчен, күзәнәкле кертемнәрдә ECM каплавы диссоциацияләнгән Caco-2 күзәнәкләренең беркетелүен (<1 сәгать) һәм тыгыз тоташу киртәләренең барлыкка килүен (<1-2 көн) тизләтә. Трансвелл кертемнәрендә органоидларны үстерү өчен, изоляцияләнгән органоидлар ECM белән капланган кертемнәргә чәчелә, мембрана өслегенә беркетелә (<3 сәгать) һәм органоидлар киртә бөтенлеге белән тулы монокатлам барлыкка китергәнче саклана. Трансвелл культуралары гибрид чиплар кулланмыйча 24 коелы пластиналарда башкарыла.
In vitro 3D морфогенезын сыеклык агымын билгеләнгән эпителий катламының базолатераль ягына куллану белән башлап җибәрергә мөмкин. Чиптагы эчәклектә эпителий морфогенезы мохит өске һәм аскы микроканалларга перфузияләнгәндә башланган (3a рәсем). Элегрәк тасвирланганча, юнәлешле бүленеп чыккан морфоген ингибиторларын өзлексез бетерү өчен аскы (базолатераль) бүлеккә сыеклык агымын кертү бик мөһим. Күзәнәкле мембраналарга бәйләнгән күзәнәкләргә җитәрлек туклыклы матдәләр һәм сыворотка бирү һәм люменаль кисү стрессын тудыру өчен, без гадәттә чиптагы эчәклектә икеләтә агым кулланабыз. Гибрид чипларда эпителий монокатламнарын үз эченә алган Трансвелл өстәмәләре гибрид чипларга кертелде. Аннары мохит микроканал аша күзәнәкле Трансвелл өстәмәсенең базолатераль ягы астына кертелде. Эчәклек морфогенезы ике культура платформасында да базолатераль агым башланганнан соң 3-5 көн үткәч булды.
Микроинженерияләнгән 3D эпителий катламнарының морфологик үзенчәлекләрен төрле сурәтләү ысулларын, шул исәптән фазалы контраст микроскопиясен, дифференциаль интерференция контраст (DIC) микроскопиясен, SEM яки иммунофлуоресценция конфокаль микроскопиясен кулланып анализларга мөмкин (3 һәм 4 нче рәсемнәр). Фазалы контраст яки DIC сурәтләү 3D эпителий катламнарының формасын һәм чыгып торуын күзәтү өчен культура вакытында теләсә кайсы вакытта җиңел башкарылырга мөмкин. PDMS һәм полиэстер пленкаларының оптик үтә күренмәлелеге аркасында, чиптагы эчәк һәм гибрид чип платформалары җайланманы кисемгә яки сүтүгә мохтаҗлыксыз реаль вакыт режимында in situ сурәтләүне тәэмин итә ала. Иммунофлуоресценция сурәтләү башкарганда (1, 3c, f һәм 4b, c рәсемнәре), күзәнәкләр гадәттә 4% (авырлык/күләм) параформальдегид (PFA) белән фиксацияләнә, аннары Triton X-100 һәм 2% (авырлык/күләм)) сыер кан сарысуы альбумины (BSA) белән, тәртип буенча. Күзәнәк төренә карап, төрле фиксаторлар, үткәргечлек бирүчеләр һәм блоклаучы агентлар кулланырга мөмкин. кулланыла. Чипта иммобилизацияләнгән күзәнәк яки өлкә маркерларына юнәлтелгән беренчел антитәнчекләр чипта in situ иммобилизацияләнгән күзәнәкләрне аеру өчен кулланыла, аннары икенчел антитәнчекләр, шулай ук ​​​​ядрәгә (мәсәлән, 4',6-диамидино-2-фенилен) индол, DAPI) яки F-актинга (мәсәлән, флуоресцент белән билгеләнгән фаллоидин) юнәлтелгән контраст буяу белән бергә кулланыла. Флуоресценция нигезендәге тере сурәтләү шулай ук ​​​​in situ режимында лайла җитештерүне (1 нче рәсем, "Күзәнәк дифференциациясе" һәм "Эчәк физиологиясе"), микроб күзәнәкләренең очраклы колонизациясен (1 нче рәсем, "Хуҗа-микроб бергә культурасы"), иммун күзәнәкләрнең җәлеп ителүен (1 нче рәсем, "Авыру модельләштерүе") яки 3D эпителиаль морфология контурларын (3c, f һәм 4b, c рәсемнәре) ачыклау өчен башкарылырга мөмкин. Чипта эчәклекне өске катламны аскы микроканал катламыннан аеру өчен үзгәрткәндә, сылтамада тасвирланганча. 2 нче рәсемдә күрсәтелгәнчә, 3D эпителиаль морфология, шулай ук ​​апикаль щетка чигендәге микроворсинкалар SEM ярдәмендә күз алдына китерергә мөмкин (3б рәсем). Дифференциация маркерларының экспрессиясен санлы PCR5 яки бер күзәнәкле РНК секвенирлавы ярдәмендә бәяләргә мөмкин. Бу очракта, эчәк кисәкләрендә яки гибрид кисәкләрдә үстерелгән эпителий күзәнәкләренең 3D катламнары трипсинизация ярдәмендә җыела һәм аннары молекуляр яки генетик анализ өчен кулланыла.
а, Гибрид чипта эчәк морфогенезын индукцияләү өчен эш процессы. Бу протоколда Caco-2 һәм эчәк органоидлары гибрид чип платформасында 3D морфогенезны күрсәтү өчен кулланыла. Аерылган эпителий күзәнәкләре әзерләнгән Transwell кертмәләренә чәчелде (TW әзерлеге; астагы рәсемне карагыз). Transwell кертмәләрендә күзәнәкләр чәчелгәннән (орлыкландырылганнан) һәм полиэстер мембраналарына беркетелгәннән соң, барлык күзәнәкләр дә статик шартларда үстерелде (TW үстерелде). 7 көннән соң, эпителий күзәнәкләренең 2D монокатламын үз эченә алган бер Transwell кертмәсе гибрид чипка базолатераль агымны (Flow, BL) кертү өчен берләштерелде, бу нәтиҗәдә 3D эпителий катламы барлыкка килүгә китерде (морфогенез). Һәр эксперименталь адымда яки вакыт ноктасында нормаль донордан (C103 сызыгы) күтәрелүче юан эчәктән алынган кеше органы эпителий күзәнәкләренең морфологик үзенчәлекләрен күрсәтүче фазалы контрастлы микрографлар. Өске катламнардагы схемалар һәр адым өчен эксперименталь конфигурацияне күрсәтә. б, Гибрид чиплар (сул схема) төрле Z нокталарында югарыдан аска конфокаль микроскопия күренешләре белән органоид эпителий күзәнәкләренең 3D морфогенезына китерә ала. позицияләр (өске, урта һәм аскы; уң схеманы һәм аңа туры килгән нокталы сызыкларны карагыз). ачык морфологик үзенчәлекләр күрсәтте. F-актин (зәңгәрсу), төш (соры).c, статик Transwell (TW; ак нокталы рамка эчендәге өстәмә) белән гибрид чипта (иң зур тулы кадр) үстерелгән органоидлардан алынган эпителий күзәнәкләренең флуоресценция конфокаль микрографияләре (3D почмаклы күренеш), ​​2D һәм 3D морфологиясен чагыштыра. 2D вертикаль кисемтә күренешләре пары (өске уң почмакта өстәмә; "XZ") шулай ук ​​2D һәм 3D үзенчәлекләрен күрсәтә. Масштаблы сызык, 100 мкм.c Сылтамадан рөхсәт белән кабат бастырылган.4. Elsevier.
Контроль күзәнәкләрне шул ук күзәнәкләрне (Caco-2 яки эчәк органоид эпителий күзәнәкләре) гадәти статик культура шартларында ике үлчәмле монокатламнарга культуралаштыру юлы белән әзерләргә мөмкин. Шунысы игътибарга лаек, микроканалларның чикләнгән күләм сыйдырышлыгы аркасында туклыклы матдәләр азаюы мөмкин (мәсәлән, оригиналь эчәк чип дизайнындагы өске каналда ~4 µL). Шуңа күрә, базолатераль агымны куллану алдыннан һәм аннан соң эпителий морфологиясен дә чагыштырырга мөмкин.
Йомшак литография процессы чиста бүлмәдә башкарылырга тиеш. Чиптагы һәр катлам (өске һәм аскы катламнар һәм мембраналар) һәм гибрид чиплар өчен төрле фотомаскалар кулланылган һәм аерым кремний пластиналарында ясалган, чөнки микроканалларның биеклекләре төрле булган. Чиптагы эчәкнең өске һәм аскы микроканалларының максатчан биеклекләре 500 мкм һәм 200 мкм тәшкил итә. Гибрид чипның каналның максатчан биеклеге 200 мкм.
3 дюймлы силикон пластинасын ацетонлы савытка салыгыз. Тәрелмәне 30 секунд дәвамында йомшак кына әйләндерегез, аннары һавада киптерегез. Тәрелмәне IPA белән тәлинкәгә күчерегез, аннары чистарту өчен тәлинкәне 30 секунд әйләндерегез.
Кремний пластинасы өслегеннән органик калдыкларны максималь рәвештә бетерү өчен, пиранья эремәсен (водород перекисе һәм концентрлы күкерт кислотасы катнашмасы, 1:3 (күләм/күләм)) кулланырга мөмкин.
Пиранья эремәсе бик коррозияле һәм җылылык чыгара. Өстәмә куркынычсызлык чаралары кирәк. Чүп-чарны юк итү өчен, эремәне суытырга һәм чиста, коры чүп контейнерына күчерергә кирәк. Икенчел контейнерлар кулланыгыз һәм чүп контейнерларын тиешенчә этикеткалагыз. Тулырак процедуралар өчен, зинһар, корылманың куркынычсызлык күрсәтмәләрен үтәгез.
Вафлиларны 200°C җылылыктагы плитәгә 10 минутка куеп, сусызландырыгыз. Сусызландырганнан соң, вафли биш тапкыр һавада селкетелде, суыныр өчен.
Чистартылган силикон пластинаның уртасына якынча 10 г фоторезист SU-8 2100 салыгыз. Фоторезистны пластинага тигез итеп җәю өчен пинцет кулланыгыз. Вакыт-вакыт пластинаны 65°C җылылыктагы плитәгә куегыз, фоторезистны ябыштырмый һәм җәюне җиңеләйтә. Плитаны турыдан-туры җылылык плитасына куймагыз.
SU-8 пластина өстендә әйләндергеч каплау ярдәмендә тигез бүленгән. SU-8нең керү әйләнешен 5–10 секундка 100 әйләнгеч/с тизләнеш белән 500 әйләнгеч/мин тизләнеш белән таралу өчен программалаштырыгыз. Төп әйләнүне 1500 әйләнгеч/мин тизләнеш белән 200 мкм калынлыктагы үрнәккә урнаштырыгыз, яки 1200 әйләнгеч/мин тизләнеш белән 30 секунд эчендә 300 әйләнгеч/с тизләнеш белән 250 мкм калынлыкка ирешегез (чиптагы эчәклекнең өске катламы өчен 500 мкм биеклек ясагыз; астагы "Критик адымнар"ны карагыз).
Төп әйләнү тизлеген кремний пластинасындагы SU-8 үрнәгенең максатчан калынлыгына карап көйләргә мөмкин.
Чиптагы эчәкнең өске катламы өчен 500 мкм биеклектәге SU-8 үрнәкләрен ясау өчен, бу тартманың спираль белән каплау һәм йомшак пешерү адымнары (7 һәм 8 адымнар) бер-бер артлы кабатланды (9 адымны карагыз), 250 мкм калынлыктагы ике катлам барлыкка килде. SU-8 калын катламы, аны бу тартманың 12 адымында ультрафиолет нурлары белән катламлап һәм тоташтырып була, шуның белән 500 мкм биеклектәге катлам барлыкка килә.
SU-8 белән капланган вафлиларны йомшак итеп пешерегез, вафлиларны 65 °C температурада 5 минутка эссе итеп куегыз, аннары көйләүне 95 °C ка күчерегез һәм тагын 40 минут инкубацияләгез.
Өске микроканалда SU-8 үрнәгенең 500 мкм биеклегенә ирешү өчен, 250 мкм калынлыктагы ике SU-8 катламын булдыру өчен 7 һәм 8 адымнарны кабатлагыз.
УФ битлек тигезләгечен кулланып, пластинаның экспозиция вакытын исәпләү өчен җитештерүче күрсәтмәләренә туры китереп лампа сынауын үткәрегез. (экспозиция вакыты, мс) = (экспозиция дозасы, мДж/см2)/(лампа көче, мВт/см2).
Экспозиция вакытын билгеләгәннән соң, фотомасканы УВ битлек тигезләгеченең битлек тотучысына куегыз һәм фотомасканы SU-8 белән капланган пластинага куегыз.
Ультрафиолет дисперсиясен минимальләштерү өчен фотомасканың басылган өслеген турыдан-туры кремний пластинасының SU-8 белән капланган ягына урнаштырыгыз.
SU-8 белән капланган пластинаны һәм фотомасканы билгеләнгән экспозиция вакыты өчен вертикаль рәвештә 260 мДж/см2 ультрафиолет нурына чыгарыгыз (бу тартманың 10 нчы адымын карагыз).
Ультрафиолет нурлары тәэсиреннән соң, SU-8 белән капланган кремний пластиналары һәр плитада 65°C температурада 5 минут һәм 95°C температурада 15 минут пешерелде, биеклеге 200 мкм булган бизәкләр ясалды. Биеклеге 500 мкм булган бизәкләр ясалу өчен, 95°C температурада пешерү вакытын 30 минутка кадәр озайтыгыз.
Эшкәрткеч пыяла савытка салына, ә пешкән вафли савытка салына. SU-8 эшкәрткеченең күләме пыяла пластинаның зурлыгына карап төрлечә булырга мөмкин. Ачыкланмаган SU-8не тулысынча алып ташлар өчен җитәрлек SU-8 эшкәрткеч куллануны тәэмин итегез. Мәсәлән, 1 литр сыйдырышлы 150 мм диаметрлы пыяла савыт кулланганда, якынча 300 мл SU-8 эшкәрткеч кулланыгыз. Калыпны 25 минут дәвамында вакыт-вакыт йомшак әйләндереп эшләгез.
Эшләнгән форманы якынча 10 мл яңа эремә белән чайкатыгыз, аннары эремәне пипетка ярдәмендә сиптереп, IPA белән чистартыгыз.
Пластинаны плазма чистарткычка салыгыз һәм кислород плазмасына (атмосфера газы, максатчан басым 1 × 10−5 Торр, куәт 125 Вт) 1,5 минутка куегыз.
Вафлины эчендә пыяла слайд булган вакуум эксикаторына урнаштырыгыз. Вафлиларны һәм слайдларны янәшә куярга мөмкин. Әгәр вакуум эксикаторы пластина белән берничә катламга бүленгән булса, слайдларны аскы камерага, ә пластиналарны өске камерага урнаштырыгыз. Пыяла слайдка 100 мкл трихлор(1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил)силан эремәсен тамызыгыз һәм силанизация өчен вакуум кулланыгыз.
Туңдырылган Caco-2 күзәнәкләре тутырылган флаконны 37°C су мунчасында эретегез, аннары эретелгән күзәнәкләрне 15 мл 37°C алдан җылытылган Caco-2 мохите салынган T75 колбасына күчерегез.
Caco-2 күзәнәкләрен якынча 90% кушылу белән үткәрү өчен, башта 37°C су мунчасында җылы Caco-2 мохитен, PBS һәм 0,25% трипсин/1 мМ EDTA салыгыз.
Вакуум-аспирация ярдәмендә мохитне сорыгыз. Вакуум-аспирацияне кабатлап һәм яңа ПБС өстәп, күзәнәкләрне ике тапкыр 5 мл җылы ПБС белән юыгыз.