Nature.com saýtyna gireniňiz üçin sag boluň. Ulanýan brauzeriňiziň wersiýasynda CSS üçin çäkli goldaw bar. Iň gowy tejribe üçin täzelenen brauzer ulanmagyňyzy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de utgaşyklylyk režimini öçüriň). Şol bir wagtyň özünde, goldawy dowam etdirmegi üpjün etmek üçin saýty stillersiz we JavaScript-siz görkezeris.
Adam içegesiniň morfogenezi 3D epitelial mikroarhitekturasynyň we giňişlik gurluşynyň kripto-villus aýratynlyklaryny döredýär. Bu özboluşly gurluş, esasy kriptdäki kök öýjük nişasyny ekzogen mikrob antigenlerinden we olaryň metabolitlerinden goramak arkaly içege gomeostazyny saklamak üçin zerurdyr. Mundan başga-da, içege villuslary we bölünip çykýan mukus içege nemli bardasynyň ýüzünde gorag barýeri bilen funksional taýdan tapawutlanan epitelial öýjüklerini hödürleýär. Şonuň üçin, 3D epitelial gurluşlaryny täzeden döretmek in vitro içege modellerini gurmak üçin örän möhümdir. Aýratyn hem, organiki mimetik içege-çip, fiziologik funksiýalary we biomehanikasy güýçlendirilen içege epiteliýasynyň öz-özünden 3D morfogenezini döredip biler. Bu ýerde biz mikrofluid çipinde, şeýle hem Transwell gömülen gibrid çipinde içegede içege morfogenezini güýçli induksiýa etmek üçin gaýtalanýan protokol hödürleýäris. Enjam öndürmek, adaty şertlerde, şeýle hem mikrofluid platformasynda Caco-2 ýa-da içege organoid epitelial öýjüklerini ösdürmek, 3D morfogeneziniň induksiýasy we köp sanly suratlandyryş usullaryny ulanyp döredilen 3D epiteliýalarynyň häsiýetnamasy üçin jikme-jik usullary beýan edýäris. Bu protokol 5 gün dowamynda bazolateral suwuklyk akymyny gözegçilikde saklamak arkaly funksional içege mikroarhitekturasynyň dikeldilmegine ýetýär. Biziň in vitro morfogenez usulymyz fiziologik taýdan degişli kesiş stresini we mehaniki hereketi ulanýar we çylşyrymly öýjük inženerçiligini ýa-da manipulýasiýany talap etmeýär, bu bolsa beýleki bar bolan usullardan has gowy netije berip biler. Biz teklip edýän protokolymyzyň biolukmançylyk ylmy-barlag jemgyýeti üçin giň täsir edip biljekdigini, biolukmançylyk, kliniki we derman serişdeleri üçin in vitro 3D içege epiteliý gatlaklaryny dikeltmek usulyny hödürleýändigini göz öňünde tutýarys.
Eksperimentler, gut-on-a-chip1,2,3,4,5 ýa-da iki gatlakly mikrofluidik enjamlarda6,7 ösdürilip ýetişdirilen içege epitelial Caco-2 öýjükleriniň esasy mehanizmi anyk düşünmezden in vitro şertlerinde öz-özünden 3D morfogenezini başdan geçirip biljekdigini görkezýär. Soňky gözlegimizde, Caco-2 we hassalardan alynýan içege organoidleri tarapyndan görkezilişi ýaly, medeniýet enjamlaryndan bazolateral bölünip çykarylýan morfogen antagonistlerini aýyrmagyň in vitro şertlerinde 3D epitelial morfogenezini döretmek üçin zerur we ýeterlikdigini anykladyk. Epitelial öýjükler tassyklanyldy. Bu gözlegde, biz, esasan, "Gibrid Çip" diýlip atlandyrylýan, gut-on-a-çip we Transwell goýujylaryny öz içine alýan üýtgedilen mikrofluidik enjamlarda güýçli Wnt antagonisti Dickkopf-1 (DKK-1) öýjük önümçiligine we konsentrasiýasynyň paýlanyşyna ünsi jemledik. Biz çip içegesine ekzogen Wnt antagonistleriniň (meselem, DKK-1, Wnt repressor 1, bölünip çykarylan gyrymsy protein 1 ýa-da Soggy-1) goşulmagynyň morfogenezi bökdeýändigini ýa-da öňünden gurlan 3D epitelial gatlagyny bozýandygyny görkezýäris, bu bolsa medeniýet wagtynda antagonistik stressiň in vitro içege morfogenezi üçin jogapkärdigini görkezýär. Şonuň üçin, epitelial serhetde ygtybarly morfogeneze ýetmegiň amaly usuly, bazolateral bölümde Wnt antagonistleriniň derejesini aktiw ýuwmak (meselem, gut-on-a-çip ýa-da gibrid-on-a-çip platformalarynda) ýa-da diffuziýa arkaly aýyrmak ýa-da minimal derejede saklamakdyr. Bazolateral gurşawlar (meselem, Transwell goýujylaryndan guýulardaky uly bazolateral rezerwuarlara).
Bu protokolda biz içege epitelial öýjüklerini polidimetilsiloksan (PDMS) esasly gözenekli membranalarda (6A, 7A, 8, 9 ädimler) ýa-da Transwell goýujylarynyň poliester membranalarynda (6B, 7B, 8, 9 ädimler) ösdürip ýetişdirmek we in vitro 3D morfogenezi döretmek üçin içege-çip mikroenjamlaryny we Transwell goýlup bilýän gibrid çiplerini (1-5 ädimler) ýasamagyň jikme-jik usulyny hödürleýäris (10-njy ädim). Şeýle hem, köp sanly suratlandyryş usullaryny ulanmak arkaly dokumalara mahsus gistogenez we nesillere bagly öýjük differensiasiýasyny görkezýän öýjük we molekulýar aýratynlyklary anykladyk (11-24 ädimler). Biz Caco-2 ýa-da içege organoidleri ýaly adam içege epitelial öýjüklerini ulanyp, iki medeniýet formatynda gözenekli membranalaryň ýüzüni üýtgetmek, 2D monogatlaklary döretmek we içege biohimiki we biomehaniki mikro gurşawyň köpelmegi ýaly tehniki jikme-jiklikleri öz içine alýan morfogenez döredýäris. in vitro. 2D epitelial monogatlaklardan 3D morfogenez döretmek üçin, biz morfogen antagonistlerini aýyrdyk. iki ösdürilen görnüşiň hem gurşawy medeniýetiň bazolateral bölümine akdyrmak arkaly. Ahyrsoňy, biz morfogene bagly epitelial ösüşini, uzynlykdaky eýe-mikrobiom bilelikdäki medeniýetlerini, patogen infeksiýasyny, iltihaply zeperlenmäni, epitelial päsgelçilik disfunksiýasyny we probiotik esasly terapiýalary modelirlemek üçin ulanylyp bilinýän dikeldilýän 3D epitelial gatlagyň peýdasynyň görkezilişini hödürleýäris. Mysal. täsirler.
Biziň protokolymyz esasy (meselem, içege nemli bardasynyň biologiýasy, kök öýjük biologiýasy we ösüş biologiýasy) we amaly barlaglarda (meselem, klinikadan öňki derman synaglary, keselleri modelleşdirmek, dokumalaryň inženerçiligi we gastroenterologiýa) giň täsir edýän alymlaryň giň topary üçin peýdaly bolup biler. Içege epiteliýasynyň in vitro 3D morfogenezini döretmek üçin protokolymyzyň gaýtalanmagy we berkligi sebäpli, tehniki strategiýamyzyň içege ösüşi, regenerasiýa ýa-da gomeostaz döwründe öýjük signallarynyň dinamikasyny öwrenýän tomaşaçylara ýaýradylyp bilinjekdigini göz öňünde tutýarys. Mundan başga-da, protokolymyz Norowirus 8, Agyr Ýiti Respirator Sindromy Koronawirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ýa-da Vibrio cholerae ýaly dürli ýokanç agentleriň täsirindäki infeksiýany sorag etmek üçin peýdalydyr. Kesel patologiýasy we patogenezi boýunça auditoriýalar hem peýdalydyr. Çipdäki içege mikrofiziologiýa ulgamynyň ulanylmagy uzyn möhletli bilelikde medeniýetleşdirmäge 10 we soňra aşgazan-içege (AŞ) ýolundaky eýe goragynyň, immun jogaplarynyň we patogen bilen baglanyşykly zeperlenmeleriň bejerilmeginiň bahalandyrylmagyna mümkinçilik berip biler 11. Süzülen içege sindromy, çöliak keseli, Kron keseli, ýaraly kolit, puçit ýa-da gaharly içege sindromy bilen baglanyşykly beýleki AŞ buzulmalary, 3D içege epiteliý gatlaklary hassanyň 3D içege epiteliý gatlaklaryny ulanyp taýýarlanylanda simulýasiýa edilip bilner, bu kesellere villus atrofiýasy, kript gysgalmagy, nemli bardanyň zeperlenmegi ýa-da epiteliý päsgelçilikleriniň bozulmagy girýär. Biopsiýa ýa-da kök öýjüklerden alynýan içege organoidleri 12,13. Kesel gurşawynyň has çylşyrymlylygyny has gowy modelleşdirmek üçin okyjylar 3D içege villus-kript mikroarhitekturalaryny öz içine alýan modellere hassanyň periferik gan mononuklear öýjükleri (PBMC) ýaly kesel bilen baglanyşykly öýjük görnüşlerini goşmagy göz öňünde tutup bilerler. dokumalara mahsus immun öýjükleri 5.
3D epitelial mikrostrukturasyny bölümlere bölmek prosesi bolmazdan düzedip we görselleşdirip bolýanlygy sebäpli, giňişlik transkriptomikasy we ýokary çözgütli ýa-da ýokary çözgütli suratlar bilen işleýän tomaşaçylar epitelial nişlerdäki genleriň we beloklaryň giňişlik-wagt dinamikasynyň kartasyny düzmek bilen gyzyklanyp bilerler. Tehnologiýa bilen gyzyklanýarlar. Mikrob ýa-da immun stimullaryna jogap. Mundan başga-da, içege gomeostazyny utgaşdyrýan uzynlykdaky eýe-mikrobiom özara täsiri 10, 14, dürli mikrob görnüşlerini, mikrob jemgyýetlerini ýa-da fekal mikrobiotalary, esasanam çipdäki içegede bilelikde ösdürmek arkaly 3D içege nemli barda gatlagynda döredilip bilner. platformada. Bu çemeleşme, öň medeniýetleşdirilmedik içege mikrobiotasyny laboratoriýada ösdürip ýetişdirmek isleýän nemli barda immunologiýasyny, gastroenterologiýany, adam mikrobiomyny, kulturomikany we kliniki mikrobiologiýany öwrenýän diňleýjiler üçin has özüne çekijidir. Eger biziň in vitro morfogenez protokolymyz 24, 96 ýa-da 384 guýulyk plastinkalardaky köp guýulykly goýmalar ýaly ölçeklenip bilýän medeniýet formatlaryna uýgunlaşdyrylyp bilinse, olar bazolateral bölümleri yzygiderli doldurýarlar, bu protokol şeýle hem azyk senagaty üçin derman, biolukmançylyk ýa-da ýokary öndürijilikli skrining ýa-da tassyklama platformalaryny işläp düzýänlere ýaýradylyp bilner. Prinsipiň subutnamasy hökmünde, ýakynda biz 24 guýulyk plastinka formatyna ölçeklenip bilýän köpçülikleýin ýokary öndürijilikli morfogenez ulgamynyň mümkinçiligini görkezdik. Mundan başga-da, çipde köp organly önümler täjirçilik taýdan satuwa çykaryldy16,17,18. Şonuň üçin, biziň in vitro morfogenez usulymyzy tassyklamagy çaltlaşdyryp we köp sanly ylmy-barlag laboratoriýalary, senagat ýa-da hökümet we kadalaşdyryjy edaralar tarapyndan dermanlary synagdan geçirmek üçin transkriptomiki derejede in vitro içege morfogeneziniň öýjük gaýtadan programmalaşdyrylmagyny düşünmek üçin kabul edilip bilner. ýa-da bioterapewtikler Derman kandidatlarynyň siňdirilişi we daşalmagy içege morfogenez prosesiniň gaýtalanmagyny bahalandyrmak üçin 3D içege surrogatlary ýa-da ýörite ýa-da täjirçilik organ-çipdäki modeller ulanylyp bahalandyryldy.
Içege epiteliýasy morfogenezini öwrenmek üçin, esasan, in vitro 3D morfogenezini döretmek üçin amala aşyryp boljak protokollaryň ýoklugy sebäpli, adama degişli çäkli sanly tejribe modelleri ulanyldy. Aslynda, içege morfogenezi baradaky häzirki bilimleriň köpüsi haýwan barlaglaryna esaslanýar (meselem, zebrafish20, syçan21 ýa-da towuk22). Şeýle-de bolsa, olar zähmet we çykdajy talap edýär, etik taýdan şübheli bolup biler we iň esasysy, adamyň ösüş proseslerini takyk kesgitlemeýär. Bu modeller köp taraplaýyn ölçeklendirilip bilinýän usulda synagdan geçirmek ukybynda hem örän çäkli. Şonuň üçin, in vitro 3D dokuma gurluşlaryny dikeltmek üçin protokolymyz in vivo haýwan modellerinden, şeýle hem beýleki däp bolan statik 2D öýjük medeniýeti modellerinden has gowy netije görkezýär. Öň ​​beýan edilişi ýaly, 3D epiteliýa gurluşlaryny ulanmak bize dürli nemli barda ýa-da immun stimullaryna jogap hökmünde kripto-villus okunda tapawutlanan öýjükleriň giňişlikdäki ýerleşişini öwrenmäge mümkinçilik berdi. 3D epiteliýa gatlaklary mikrob öýjükleriniň giňişlik nişalaryny döretmek üçin nähili bäsleşýändigini we eýe faktorlaryna jogap hökmünde ekologik ewolýusiýany öwrenmek üçin giňişlik döredip biler (meselem, içki we daşarky nemli barda gatlaklary, bölünip çykarylýan...). IgA we antimikrob peptidler). Mundan başga-da, 3D epitelial morfologiýasy bize içege mikrobiotasynyň öz jemgyýetlerini nähili gurýandygyny we sinergetik usulda bazal kriptlerde öýjük gurluşyny we kök öýjük nişalaryny emele getirýän mikrob metabolitlerini (meselem, gysga zynjyrly ýag kislotalaryny) nähili öndürýändigini düşünmäge mümkinçilik berip biler. Bu aýratynlyklary diňe 3D epitelial gatlaklary in vitro döredilende görkezip bolýar.
3D içege epitelial gurluşlaryny döretmek usulymyzdan başga-da, birnäçe in vitro usullar bar. Içege organoid medeniýeti, belli bir morfogen şertlerde içege kök öýjüklerini ösdürip ýetişdirmäge esaslanýan iň täze dokuma inženerçilik usulydyr23,24,25. Şeýle-de bolsa, daşamak analizi ýa-da eýe-mikrobiom bilelikdäki medeniýetleri üçin 3D organoid modellerini ulanmak köplenç kynçylyk döredýär, sebäbi içege boşlugy organoidiň içinde ýerleşýär we şonuň üçin mikrob öýjükleri ýa-da ekzogen antigenler ýaly lüminal komponentleriň girizilmegi çäklidir. Organoid boşluklaryna elýeterliligi mikroinjektor arkaly gowulandyryp bolýar26,27, ýöne bu usul inwaziw we zähmet talap edýär we ýerine ýetirmek üçin ýöriteleşdirilen bilim talap edýär. Mundan başga-da, statik şertlerde gidrogel skeletlerinde saklanýan däp bolan organoid medeniýetleri in vivo işjeň biomehanikany takyk görkezmeýär.
Birnäçe ylmy toparlar tarapyndan ulanylýan beýleki çemeleşmeler gel ýüzünde aýratyn adam içege öýjüklerini ösdürip ýetişdirmek arkaly içege epiteliý gurluşyny gaýtalamak üçin öňünden gurlan 3D gidrogel skeletlerini ulanýarlar. 3D çap edilen, mikro-frezerlenen ýa-da litografik taýdan ýasalan galyplary ulanyp gidrogel skeletlerini ýasaň. Bu usul fiziologik taýdan degişli morfogen gradientleri bolan aýratyn epiteliý öýjükleriniň in vitro öz-özünden gurlan ulgamyny görkezýär, skeletlere stromal öýjükleri goşmak arkaly ýokary aspekt gatnaşygynyň epiteliý gurluşyny we stroma-epiteliý özara gatnaşygyny döredýär. Şeýle-de bolsa, öňünden gurlan skeletleriň tebigaty öz-özünden morfogenetik prosesiň özüniň görkezilmegine päsgel berip biler. Bu modeller şeýle hem dinamiki lüminal ýa-da interstisial akymy üpjün etmeýär, içege öýjükleriniň morfogenezden geçmegi we fiziologik funksiýany gazanmagy üçin zerur bolan suwuklyk kesiş stressi ýok. Ýakynda geçirilen başga bir gözlegde mikrofluid platformasynda gidrogel skeletleri ulanyldy we lazer bilen oýmak tehnikalaryny ulanyp, içege epiteliý gurluşlaryny nagyşlady. Syçan içege organoidleri içege turbajyk gurluşlaryny döretmek üçin oýlan nagyşlara eýerýär we iç içi suwuklyk akymy bolup biler. mikrofluidika moduly arkaly gaýtadan işlenip düzüldi. Şeýle-de bolsa, bu model öz-özünden morfogenetiki prosesleri görkezmeýär we içege mehanobiologiki hereketlerini öz içine almaýar. Şol bir toparyň 3D çap etmek usullary öz-özünden morfogenetiki prosesleri bolan kiçi içege turbalaryny döretmäge mümkinçilik berdi. Turbanyň içinde dürli içege bölekleriniň çylşyrymly ýasalmagyna garamazdan, bu modelde lüminal suwuklyk akymy we mehaniki deformasiýa hem ýok. Mundan başga-da, modeliň işlemegi çäkli bolup biler, esasanam bioprinting prosesi tamamlanandan soň, tejribe şertlerini bozýan ýa-da öýjük-öýjük özara täsirleri. Munuň ýerine, teklip edýän protokolymyz öz-özünden içege morfogenezini, fiziologik taýdan degişli kesiş stresini, içege hereketini gaýtalaýan biomehanikany, garaşsyz apikal we bazolateral bölümleriň elýeterliligini we modularlygyň çylşyrymly biologiki mikro gurşawyny täzeden döretmegi üpjün edýär. Şonuň üçin, biziň in vitro 3D morfogenez protokolymyz bar bolan usullaryň kynçylyklaryny ýeňip geçmek üçin goşmaça çemeleşme hödürläp biler.
Biziň protokolymyz doly 3D epitelial morfogeneze gönükdirilendir, medeniýetde diňe epitelial öýjükler bar we mezenhimal öýjükler, endotelial öýjükler we immun öýjükleri ýaly beýleki töwerek öýjükleri ýok. Öň beýan edilişi ýaly, protokolymyzyň esasy, girizilen gurşawyň bazolateral tarapynda bölünip çykýan morfogen ingibitorlaryny aýyrmak arkaly epitelial morfogeneziň induksiýasydyr. Içege-çipdäki we gibrid-çipdäki berk modulýarlygymyz tolkunly 3D epitelial gatlagyny täzeden döretmäge mümkinçilik berse-de, epitelial-mezenhimal özara täsirler 33,34, öýjük daşyndaky matrisa (ECM) çökündisi 35 we biziň modelimizde, bazal kriptlarda kök öýjük nişalaryny geçirýän kript-villus aýratynlyklary ýaly goşmaça biologiki kynçylyklar mundan beýläk göz öňünde tutulmaly. Mezenhimdäki stromal öýjükler (meselem, fibroblastlar) ECM beloklarynyň öndürilmeginde we in vivo içege morfogeneziniň düzgünleşdirilmeginde möhüm rol oýnaýar 35,37,38. Modelimize mezenhimal öýjükleriň goşulmagy morfogenetik prosesi we öýjük birikdiriş netijeliligi. Endotelial gatlak (ýagny kapilýar ýa-da limfa damarlary) içege mikro gurşawynda molekulýar daşamagy39 we immun öýjükleriniň işe alynmagyny40 düzgünleşdirmekde möhüm rol oýnaýar. Mundan başga-da, dokuma modelleri köp organly özara täsirleri görkezmek üçin döredilende, dokuma modelleriniň arasynda birikdirilip bilinýän damar komponentleri hökmany şert bolup durýar. Şonuň üçin, organ derejesindäki çözgüt bilen has takyk fiziologiki aýratynlyklary modelleşdirmek üçin endotelial öýjükleriň goşulmagy zerur bolup biler. Näsagdan alynýan immun öýjükleri içege keselini gaýtalamak kontekstinde dogabitdi immun jogaplaryny, antigen görkezilişini, dogabitdi adaptiw immun özara gatnaşygyny we dokumalara mahsus immuniteti görkezmek üçin hem möhümdir.
Gibrid çipleriň ulanylyşy "içege-çip"-e garanda has aňsat, sebäbi enjamyň gurluşy has ýönekeý we "Transwell" goýujylarynyň ulanylmagy içege epiteliýasynyň ölçeklenip bilýän medeniýetini döretmäge mümkinçilik berýär. Şeýle-de bolsa, söwda taýdan elýeterli bolan poliester membranalary bolan "Transwell" goýujylary elastik däl we peristaltik ýaly hereketleri simulýasiýa edip bilmeýär. Mundan başga-da, gibrid çipde ýerleşdirilen "Transwell" goýujysynyň apikal bölümi apikal tarapda kesiş stresi bolmazdan hereketsiz galdy. Elbetde, apikal bölümdäki statik häsiýetler gibrid çiplerde uzak möhletli bakteriýalaryň bilelikde medeniýetini seýrek ýagdaýda üpjün edýär. Gibrid çipleri ulanylanda "Transwell" goýujylarynda 3D morfogenezini güýçli döredip bilsek-de, fiziologik taýdan degişli biomehanikanyň we apikal suwuklyk akymynyň ýetmezçiligi gibrid çip platformalarynyň mümkin bolan ulanylyşlar üçin mümkinçiligini çäklendirip biler.
Iç-çipdäki we gibrid-çipdäki medeniýetlerde adam kripto-villus okunyň doly göwrümli täzeden gurulmagy doly esaslandyrylmady. Morfogenez epitelial monogatlakdan başlanýandygy sebäpli, 3D mikroarhitekturalar hökman in vivo kriptlere morfologiki meňzeşligi üpjün etmeýär. Mikroinženerleşdirilen 3D epiteliýada bazal kript domeniniň golaýyndaky köpelýän öýjük populýasiýasyny häsiýetlendirsek-de, kript we villus sebitleri aýdyň bölünmedi. Çipdäki ýokarky kanallar mikroinženerleşdirilen epiteliýiň beýikliginiň ýokarlanmagyna getirse-de, iň ýokary beýiklik henizem ~300–400 µm bilen çäklendirilen. Inçe we ýogyn içegelerdäki adam içege kriptlarynyň hakyky çuňlugy degişlilikde ~135 µm we ~400 µm, inçe içege villuslarynyň beýikligi bolsa ~600 µm41.
Suratlandyryş nukdaýnazaryndan, 3D mikroarhitekturalaryň in situ super çözgütli suratlandyrmasy çipdäki içege bilen çäklenip bilner, sebäbi obýektiw linzadan epiteliý gatlagyna çenli zerur iş aralygy birnäçe millimetr töweregi. Bu meseläni çözmek üçin uzakdaky obýektiw gerek bolup biler. Mundan başga-da, suratlandyryş nusgasyny taýýarlamak üçin inçe bölekleri ýasamak PDMS-iň ýokary elastikligi sebäpli kynçylyk döredýär. Mundan başga-da, çipdäki içegeleriň gatlak-gatlak mikroýaplanmagy her gatlagyň arasynda hemişelik ýelmeşmegi öz içine alýandygy sebäpli, epiteliý gatlagynyň ýüz gurluşyny barlamak üçin ýokarky gatlagy açmak ýa-da aýyrmak örän kyn. Mysal üçin, skanerleýji elektron mikroskopyny (SEM) ulanmak arkaly.
PDMS-iň gidrofoblygy gidrofob kiçi molekulalar bilen baglanyşykly mikrofluid esasly barlaglarda çäklendiriji faktor bolup durýar, sebäbi PDMS şeýle gidrofob molekulalary ýörite däl adsorbsiýa edip bilýär. PDMS-e alternatiwalary beýleki polimer materiallar bilen göz öňünde tutup bolýar. Alternatiw hökmünde, gidrofob molekulalaryň adsorbsiýasyny azaltmak üçin PDMS-iň ýüzüni üýtgetmek (meselem, lipofil materiallar 42 ýa-da poli (etilen glikol) 43 bilen örtmek) göz öňünde tutulyp bilner.
Ahyrsoňy, biziň usulymyz ýokary öndürijilikli skrining ýa-da "hemmelere laýyk gelýän" ulanyjy üçin amatly synag platformasyny üpjün etmek babatda gowy häsiýetlendirilmedi. Häzirki protokol her mikroenjam üçin şpris nasosyny talap edýär, ol CO2 inkubatorynda ýer tutýar we uly möçberli synaglaryň öňüni alýar. Bu çäklendirme innowasion medeniýet formatlarynyň ölçeklendirilmegi bilen ep-esli gowulandyrylyp bilner (meselem, bazolateral gurşawyň üznüksiz doldurylmagyna we aýrylmagyna mümkinçilik berýän 24-çukurly, 96-çukurly ýa-da 384-çukurly gözenekli goýujylar).
In vitro şertlerinde adam içege epiteliýasynyň 3D morfogenezini döretmek üçin, biz iki parallel mikrokanal we arasynda elastik gözenekli membrana bolan mikrofluidik çip içege enjamyny ulandyk we lümen-kapillar aralygyny döretdik. Şeýle hem, Transwell goýujylarynda ösdürilip ýetişdirilen polýarlaşdyrylan epitelial gatlaklaryň aşagynda üznüksiz bazolateral akymy üpjün edýän bir kanally mikrofluidik enjamyň (gibrid çip) ulanylyşyny görkezýäris. Iki platformada hem dürli adam içege epiteliýa öýjükleriniň morfogenezini bazolateral bölümden morfogen antagonistlerini aýyrmak üçin akymyň ugurly manipulýasiýasyny ulanmak arkaly görkezmek bolar. Tutuş synag prosedurasy (1-nji surat) bäş bölekden ybarat: (i) içege çipiniň ýa-da Transwell goýlup bilýän gibrid çipiniň mikrofabrikasiýasy (1-5 ädimler; 1-nji gutu), (ii) içege epiteliýa öýjüklerini (Caco-2 öýjükleri) ýa-da adam içege organoidlerini taýýarlamak; 2-5-nji gutujyklar), (iii) içege epitelial öýjüklerini içege çiplerinde ýa-da gibrid çiplerinde ösdürmek (6-9-njy ädimler), (iv) 3D epitelial mikrostrukturasyny häsiýetlendirmek üçin in vitro 3D morfogeneziniň induksiýasy (10-njy ädim) we (v)). Ahyrsoňy, epitelial morfogenezini giňişlik, wagt, şertli ýa-da prosedural gözegçilikler bilen deňeşdirmek arkaly in vitro morfogeneziniň netijeliligini barlamak üçin degişli gözegçilik topary (aşakda has giňişleýin ara alnyp maslahatlaşylýar) döredildi.
Biz iki dürli medeniýet platformasyny ulandyk: göni kanallary ýa-da çyzykly däl burma kanallary bolan içege-çip ýa-da 1-nji gutuda we 1-5-nji ädimde beýan edilişi ýaly öndürilen mikrofluidik enjamda Transwell (TW) goýmalaryny öz içine alýan gibrid çipler. “Enjamyň öndürilişi” ýeke çipi ýa-da gibrid çipi ýasamagyň esasy ädimlerini görkezýär. “Adam içege epitelial öýjükleriniň ösdürilmegi” bu protokolda ulanylýan öýjük çeşmesini (Caco-2 ýa-da adam içege organoidleri) we medeniýet tertibini düşündirýär. “In vitro morfogenezi” Caco-2 ýa-da organoidden alynýan epitelial öýjükleriň içege çipinde ýa-da gibrid çipiň Transwell goýmalarynda ösdürilip ýetişdirilmeginiň, soňra 3D morfogeneziniň induksiýasy we häsiýetli epitelial gurluşynyň emele gelmeginiň umumy ädimlerini görkezýär. Programmanyň ädim belgisi ýa-da gutu belgisi her bir okuň aşagynda görkezilýär. Programmada döredilen içege epitelial gatlaklarynyň nähili ulanylyp bilinjekdigi barada mysallar berilýär, mysal üçin, öýjük differensiasiýasyny häsiýetlendirmekde, içege fiziologiýasyny öwrenmekde, eýe-mikrobiom ekosistemalaryny döretmekde we keselleri modelirlemekde. “Öýjük” bölüminde immunofluoresensiýa suratlary. “Differensiýa” içege çipinde döredilen 3D Caco-2 epitelial gatlagynda ekspressiýa edilen ýadrolary, F-aktin we MUC2-ni görkezýär. MUC2 signallaşdyrmasy gumly öýjüklerde we nemli barda ýüzlerinden bölünip çykýan nemde bar. Içege fiziologiýasyndaky flüoresans suratlary flüoresans bugdaý mäziniň agglýutininini ulanyp, sial turşusy we N-asetilglýukozamin galyndylary üçin boýamak arkaly öndürilen nemdegi görkezýär. “Hoja-Mikrob Bilelikdäki Medeniýetler” bölüminde iki gezek gabat gelýän surat içegede çipde host-mikrobiom bilelikdäki medeniýetlerini görkezýär. Çep panelde mikroinženerleşdirilen 3D Caco-2 epitelial öýjükleri bilen ýaşyl flüoresans belogyny (GFP) ekspressiýa edýän E. coli-niň bilelikdäki medeniýeti görkezilýär. Sag panelde 3D Caco-2 epitelial öýjükleri bilen bilelikde ösdürilen GFP E. coli-niň ýerleşýän ýeri, soňra F-aktin (gyzyl) we ýadrolar (gök) bilen immunofluoresans boýamak görkezilýär. Kesel modelirlemesi bakteriýa antigenleri (meselem, lipopolisaharid,) bilen fiziologiki kynçylyk astynda içege iltihaplanma çiplerinde sagdyn we sızan içege görkezýär. LPS) we immun öýjükleri (meselem, PBMC; ýaşyl). Caco-2 öýjükleri 3D epitelial gatlagyny döretmek üçin ösdürilip ýetişdirildi. Ölçeg çyzygy, 50 µm. Aşakdaky setirde suratlar: “Öýjükleriň tapawutlanmagy” salgylanmadan rugsat bilen uýgunlaşdyryldy. 2. Oksford uniwersitet neşirýaty; 5-nji salgylanmadan rugsat bilen köpeldildi. NAS; “Hoste-Mikrob Bilelikde Ösdürmek” 3-nji salgylanmadan rugsat bilen uýgunlaşdyryldy. NAS; “Kesel Modelleşdirmesi” salgylanmadan rugsat bilen uýgunlaşdyryldy. 5. NAS.
Çipdäki içege we gibrid çipleriň ikisi hem ýumşak litografiýa1,44 arkaly kremniý galyplaryndan çykarylan we SU-8 bilen nagyşlanan PDMS nusgalaryny ulanyp öndürildi. Her çipdäki mikrokanallaryň dizaýny kesiş stresi we gidrodinamik basyş1,4,12 ýaly gidrodinamikany göz öňünde tutmak bilen kesgitlenýär. Iki sany gapdallaşdyrylan parallel göni mikrokanallardan ybarat bolan asyl içege çip dizaýny (Giňeldilen maglumatlar 1a surat), ösdürilip ýetişdirilen öýjükleriň suwuklygyň saklanma wagtynyň artmagyny, çyzykly däl akym nagyşlaryny we köp okly deformasiýasyny döretmek üçin egri mikrokanallaryň jübütini öz içine alýan çylşyrymly içege çipine (Giňeldilen maglumatlar 1b surat) öwrüldi (2a–f surat). Has çylşyrymly içege biomehanikasyny täzeden döretmek zerur bolanda, çylşyrymly içege çiplerini saýlap bolýar. Biz burulgan içege çipiniň asyl bilen deňeşdirilende epiteliý ösüşiniň meňzeş derejesi bilen meňzeş wagt aralygynda 3D morfogenezini hem güýçli döredýändigini görkezdik. Içege-Çip, ösdürilip ýetişdirilen öýjük görnüşine garamazdan. Şonuň üçin, 3D morfogenezi döretmek üçin, çyzykly we çylşyrymly çip içege dizaýnlary bir-birini çalşyryp bolýar. SU-8 nagyşlary bolan kremniý galyplarynda berkidilen PDMS replikalary demontaždan soň negatiw aýratynlyklary üpjün etdi (2a-njy surat). Içegeni çipde ýasamak üçin, taýýarlanan ýokarky PDMS gatlagy gözenekli PDMS plýonkasyna yzygiderli birikdirildi we soňra korona bejeriji ulanyp yzyna gaýtaryp bolmajak birikdirme arkaly aşaky PDMS gatlagy bilen deňleşdirildi (2b–f-njy surat). Gibrid çipleri ýasamak üçin, berkidilen PDMS replikalary Transwell goýujylaryny ýerleşdirip biljek bir kanally mikrofluidik enjamlary döretmek üçin aýna slaýdlaryna birikdirildi (2h-njy surat we giňeldilen maglumatlar 2-nji surat). Baglanyşyk prosesi PDMS replikasynyň we aýnasynyň ýüzlerini kislorod plazmasy ýa-da korona bejergisi bilen işläp, amala aşyrylýar. Silikon turbasyna berkidilen mikrofabrikasiýa edilen enjamyň sterilizasiýasyndan soň, enjamyň gurluşy içege epiteliýasynyň 3D morfogenezini ýerine ýetirmäge taýýar boldy (2g-nji surat).
a, SU-8 nagyşly kremniý galyplaryndan PDMS böleklerini taýýarlamagyň shematiki suraty. Gatmadyk PDMS ergini kremniý galypyna guýuldy (çepde), 60 °C-da (orta) guratyldy we demontaž edildi (sagda). Demontaž edilen PDMS böleklere bölündi we mundan beýläk ulanmak üçin arassalandy.b, PDMS ýokarky gatlagyny taýýarlamak üçin ulanylan kremniý galypynyň suraty.c, PDMS gözenekli membranasyny öndürmek üçin ulanylan kremniý galypynyň suraty.d, Ýokarky we aşaky PDMS bölekleriniň we ýygnalan çip içege enjamynyň suratlarynyň toplumy.e, Ýokarky, membranaly we aşaky PDMS bölekleriniň deňleşdirilmeginiň shematiki. Her gatlak plazma ýa-da korona bilen işleniş arkaly gaýtarylmaz derejede birikdirilýär.f, Üstüne goýlan burma mikrokanallar we wakuum kameralary bilen taýýarlanan çip içege enjamynyň shematiki.g, Mikrofluidik öýjük medeniýeti üçin çip içegesiniň gurnalmagy. Silikon turba we şpris bilen ýygnalan çip içege örtük gabyna goýuldy. Çip enjamy gapagyna goýuldy. Gaýtadan işlemek üçin 150 mm Petri gaby. Baglaýjy silikon turbany ýapmak üçin ulanylýar.h, Gibrid çipleriň öndürilişiniň we gibrid çipleri ulanyp 3D morfogeneziň wizual suratlary. Içege epitelial öýjükleriniň 2D monogatlaklaryny ösdürip ýetişdirmek üçin garaşsyz taýýarlanan Transwell goýujylary içege 3D morfogenezini döretmek üçin gibrid çipe girizildi. Serişde Transwell goýujygynda döredilen öýjük gatlagynyň aşagyndaky mikrokanallar arkaly perfuziýa edilýär. Ölçeg çyzygy, 1 sm.h Salgylanmadan rugsat bilen gaýtadan çap edildi.4. Elsevier.
Bu protokolda Caco-2 öýjük liniýasy we içege organoidleri epitelial çeşmeler hökmünde ulanyldy (3a-njy surat). Iki görnüşli öýjükler hem garaşsyz ösdürilip ýetişdirildi (2-nji gutu we 5-nji gutu) we çip içegesiniň ýa-da Transwell goýujylarynyň ECM bilen örtülen mikrokanallaryny ekmek üçin ulanyldy. Öýjükler birleşende (kolbalarda >95% örtük), T-flakonlardaky yzygiderli ösdürilip ýetişdirilen Caco-2 öýjükleri (10-njy we 50-nji geçelgeleriň arasynda) tripsinizasiýa suwuklygy arkaly bölünen öýjük suspenziýalaryny taýýarlamak üçin ýygnalýar (2-nji gutu). Içege biopsiýalaryndan ýa-da hirurgiki rezeksiýalardan alnan adam içege organoidleri gurluş mikro gurşawyny goldamak üçin 24 guýulykly plastinkalardaky Matrigel skelet gümmezlerinde ösdürilip ýetişdirildi. 3-nji gutuda beýan edilişi ýaly taýýarlanan esasy morfogenleri (meselem, Wnt, R-spondin we Noggin) we ösüş faktorlaryny öz içine alýan gurşaw, organoidler diametri ~500 µm çenli ulalýança her iki gün goşmaça berildi. Doly ösen organoidler ýygnalýar we bölünýär. içege ýa-da çipdäki Transwell goýmalaryna ekmek üçin ýeke öýjüklere (5-nji gutu). Öň habar berşimiz ýaly, ony keseliň görnüşine görä tapawutlandyryp bolýar12,13 (meselem, ýaraly kolit, Kron keseli, göni içege raky ýa-da adaty donor), zeperlenme ýerine (meselem, zeperlenme ýa-da zeperlenmeýän ýer) we ýoldaky aşgazan-içege ýerleşýän ýerine (meselem, on iki barmak içege, jejunum, ileum, kor içege, ýogyn içege ýa-da göni içege). Biz 5-nji gutuda inçe içege organoidlerine garanyňda morfogenleriň ýokary konsentrasiýasyny talap edýän ýogyn içege organoidlerini (koloidleri) ösdürmek üçin optimizirlenen protokol hödürleýäris.
a, Içege çipinde içege morfogeneziniň induksiýasy üçin iş akymy. Bu protokolda 3D morfogenezini görkezmek üçin Caco-2 adam içege epiteliýalary we içege organoidleri ulanylýar. Aýrylýlan epitelial öýjükler taýýarlanan içege-çip enjamyna (çip taýýarlamak) ekildi. Öýjükler 0-njy günde (D0) PDMS gözenekli membranasyna ekilenden (ekilenden) we birikdirilenden (berilenden) soň, apikal (AP) akym başlanýar we ilkinji 2 gün dowam edýär (akym, AP, D0-D2). Doly 2D monogatlak emele gelende, bazolateral (BL) akym hem sikliki dartgyn hereketler (uzynma, akym, AP we BL) bilen birlikde başlanýar. Içege 3D morfogenezi mikrofluidik medeniýetiň 5 gününden soň öz-özünden ýüze çykdy (morfogenez, D5). Faza kontrastly suratlar her bir synag ädiminde ýa-da wagt nokadynda Caco-2 öýjükleriniň wekilçilikli morfologiýasyny görkezýär (sütun grafik, 100 µm). Içege morfogeneziniň degişli kaskadlaryny görkezýän dört shematiki diagramma (ýokarky sagda). Şemadaky kesikli oklary suwuklyk akymynyň ugruny görkezýär.b, döredilen 3D Caco-2 epiteliýasynyň ýüz topologiýasyny görkezýän SEM suraty (çepde). Ulaldylan meýdany görkezýän goýma (ak kesikli gutu) 3D Caco-2 gatlagynda dikeldilen mikrowillileri görkezýär (sagda).c, döredilen Caco-2 3D, klaudin (ZO-1, gyzyl) we F-aktin (ýaşyl) we ýadrolar (gök) diýlip atlandyrylan üznüksiz çotga serhet membranalarynyň gorizontal frontal görnüşi. Içege böleklerindäki epitelial öýjükleriň immunofluoresensiýa konfokal wizualizasiýa. Ortaky shema gönükdirilen oklary her bir konfokal görnüş üçin fokus tekizliginiň ýerleşýän ýerini görkezýär.d, 3, 7, 9, 11 we 13-nji günlerde fazaly kontrast mikroskopiýa arkaly alnan çipde ösdürilip ýetişdirilen organoidlerde morfologiki üýtgeşmeleriň wagt boýunça gidişi.Goşma (ýokarky sagda) berlen suratyň ýokary ulaldylmagyny görkezýär.e, 7-nji gün çekilen dilimde içegede döredilen organoid 3D epiteliýasynyň DIC fotomikrografiýasy.f, Içegiň çiplerinde 3 gün (Çepde) we 13 günlük (orta) organoidleriň üstünde ösdürilip ýetişdirilen kök öýjükler (LGR5; gyrmyzy), goblet öýjükler (MUC2; ýaşyl), F-aktin (çal) we ýadrolar (mawy) üçin markerleri görkezýän örtülen immunofluoresensiýa suratlary. Şeýle hem MUC2 signaly bolmazdan LGR5 signalyny görkezýän giňeldilen maglumatlar 3-nji surata serediň. Içegiň 13-nji gününde plazma membranasyny CellMask boýagy (sagda) bilen boýamak arkaly çipde döredilen 3D organoid epiteliý mikrostrukturasyny (sagda) görkezýän fluoresensiýa suratlary. Başgaça görkezilmedik bolsa, ölçeg çyzygy 50 μm.b Salgylanmadan rugsat bilen gaýtadan çap edildi.2. Oxford University Press; c Salgylanmadan rugsat bilen uýgunlaşdyryldy.2. Oxford University Press; e we f salgylanmadan rugsat bilen uýgunlaşdyryldy.12 Creative Commons License CC BY 4.0 boýunça.
Çipdäki içegede, üstünlikli ECM örtügi üçin PDMS gözenekli membranasynyň gidrofob ýüzüni üýtgetmek zerurdyr. Bu protokolda PDMS membranalarynyň gidrofoblygyny üýtgetmek üçin iki dürli usuly ulanýarys. Caco-2 öýjüklerini ösdürmek üçin, diňe UV/ozon bilen işleniş arkaly ýüzi aktiwleşdirmek PDMS ýüzüniň gidrofoblygyny azaltmak, ECM-i örtmek we Caco-2 öýjüklerini PDMS membranasyna birikdirmek üçin ýeterlik boldy. Şeýle-de bolsa, organoid epiteliýiniň mikrofluidik medeniýeti polietilenimin (PEI) we glutaraldegidi PDMS mikrokanallaryna yzygiderli ulanmak arkaly ECM beloklarynyň netijeli çökündisini gazanmak üçin himiki esasly ýüzi funksionallaşdyrmany talap edýär. Ýüzi üýtgedilenden soň, ECM beloklary funksionallaşdyrylan PDMS ýüzüni örtmek üçin çökündi we soňra izolýasiýa edilen organoid epiteliýine girizildi. Öýjükler birikdirilenden soň, mikrofluidik öýjük medeniýeti diňe ortamy ýokarky mikrokanala perfuzirlemek bilen başlaýar, öýjükler doly monogatlak emele getirýänçä, aşaky mikrokanal bolsa statik şertleri saklaýar. Ýüzi aktiwleşdirmek we ECM örtügi üçin bu optimizirlenen usul organoid epiteliýiniň birikdirilmegine mümkinçilik berýär PDMS ýüzündäki 3D morfogenez.
Transwell medeniýetleri öýjük ekmezden öň ECM örtügini hem talap edýär; ýöne, Transwell medeniýetleri gözenekli goýujylaryň ýüzüni işjeňleşdirmek üçin çylşyrymly öňünden bejeriş ädimlerini talap etmeýär. Transwell goýujylarynda Caco-2 öýjüklerini ösdürmek üçin gözenekli goýujylarda ECM örtügi bölünen Caco-2 öýjükleriniň birikmegini (<1 sagat) we berk birleşme päsgelçilikleriniň emele gelmegini (<1-2 gün) çaltlaşdyrýar. Transwell goýujylarynda organoidleri ösdürmek üçin, izolýasiýa edilen organoidler ECM bilen örtülen goýujylarda ekilýär, membrananyň ýüzüne berkidilýär (<3 sagat) we organoidler päsgelçilik bitewiligine eýe bolan doly monogatlak emele gelýänçä saklanýar. Transwell medeniýetleri gibrid çipleri ulanmazdan 24 guýulyk plastinkalarda ýerine ýetirilýär.
In vitro 3D morfogenezine suwuklyk akymyny emele gelen epitelial gatlagyň bazolateral tarapyna ulanmak arkaly başlanyp bolýar. Çipdäki içegede epitelial morfogenez ortam ýokarky we aşaky mikrokanallara perfuzirlenende başlandy (3a-njy surat). Öň beýan edilişi ýaly, ugurly bölünip çykýan morfogen ingibitorlaryny üznüksiz aýyrmak üçin aşaky (bazolateral) bölüme suwuklyk akymyny girizmek möhümdir. Gözenekli membranalara baglanan öýjüklere ýeterlik iýmit maddalaryny we syworotkany bermek we lüminal kesiş stressini döretmek üçin, adatça çipdäki içegede goşa akymy ulanýarys. Gibrid çiplerde epitelial monogatlaklary öz içine alýan Transwell goýujylary gibrid çiplere goýuldy. Soňra ortam gözenekli Transwell goýujysynyň bazolateral tarapynyň aşagyna mikrokanal arkaly goýuldy. Içege morfogenezi iki medeniýet platformasynda hem bazolateral akymyň başlanmagyndan 3-5 gün soň boldy.
Mikroinženerçilikli 3D epitelial gatlaklaryň morfologik aýratynlyklary faza kontrast mikroskopiýasyny, differensial interferensiýa kontrast (DIC) mikroskopiýasyny, SEM-i ýa-da immunofluoresensiýa konfokal mikroskopiýasyny öz içine alýan dürli suratlandyryş usullaryny ulanmak arkaly seljerilip bilner (3-nji we 4-nji suratlar). 3D epitelial gatlaklaryň görnüşini we çykyp duran ýerini gözegçilikde saklamak üçin faza kontrast ýa-da DIC suratlandyryşy medeniýet wagtynda islendik wagtda aňsatlyk bilen ýerine ýetirilip bilner. PDMS-iň we poliester plýonkalaryň optiki açyklygy sebäpli, çipdäki içege we gibrid çip platformalary enjamyň kesilmegine ýa-da sökülmegine zerurlyk bolmazdan, hakyky wagtda ýerinde suratlandyryşy üpjün edip biler. Immunofluoresensiýa suratlandyryşyny ýerine ýetirende (1-nji surat, 3c, f we 4b, c), öýjükler adatça 4% (wt/vol) paraformaldegid (PFA) bilen, soňra Triton X-100 we 2% (wt/vol)) sygyr syworotkasy albumin (BSA) bilen berkidilýär. Öýjük görnüşine baglylykda, dürli fiksatorlar, geçirgenlik berijiler we blokirleýji agentler ulanylyp bilner. ulanyldy. Şejere bagly öýjük ýa-da sebit markerlerini nyşana alýan esasy antitela çipde hereketsizleşdirilen öýjükleri görkezmek üçin ulanylýar, soňra bolsa ikinji antitela çipde ýadrony (meselem, 4',6-diamidino-2-fenilen) indol, DAPI) ýa-da F-aktini (meselem, fluoresans bilen bellenen falloidin) nyşana alýan garşy reňkli boýag bilen birlikde ulanylýar. Fluoresans esasynda janly surat çekmek, şeýle hem, mukus öndürilişini (1-nji surat, “Öýjük differensiasiýa” we “Içege fiziologiýasy”), mikrob öýjükleriniň tötänleýin kolonizasiýasyny (1-nji surat, “Hoja-mikrob bilelikde medeniýet”), immun öýjükleriniň işe alynmagyny (1-nji surat, “Kesel modelleşdirmesi”) ýa-da 3D epitelial morfologiýasynyň konturlaryny (3c,f we 4b,c surat) anyklamak üçin in situasiýada hem amala aşyrylyp bilner. Çipde içege üýtgedilende, salgylanmada beýan edilişi ýaly, ýokarky gatlagy aşaky mikrokanal gatlagyndan aýyrmak üçin. 2-nji suratda görkezilişi ýaly, 3D epitelial morfologiýasy, şeýle hem apikal çotga serhedindäki mikrowilliler. SEM arkaly görselleşdirip bolýar (3b-nji surat). Differensial markerleriň ekspresiýasyny sanly PCR5 ýa-da bir öýjükli RNK yzygiderliligini geçirmek arkaly bahalandyryp bolýar. Bu ýagdaýda, içege böleklerinde ýa-da gibrid böleklerinde ösdürilip ýetişdirilen epitelial öýjükleriň 3D gatlaklary tripsinizasiýa arkaly ýygnalýar we soňra molekulýar ýa-da genetiki analiz üçin ulanylýar.
a, Gibrid çipde içege morfogeneziniň induksiýasy üçin iş akymy. Bu protokolda gibrid çip platformasynda 3D morfogenezini görkezmek üçin Caco-2 we içege organoidleri ulanylýar. Dissociated epitelial öýjükler taýýarlanan Transwell goýmalaryna ekildi (TW taýýarlygy; aşakdaky surata serediň). Transwell goýmalarynda öýjükler ekilip (ekilip), poliester membranalaryna berkidilenden soň, ähli öýjükler statik şertlerde ösdürilip ýetişdirildi (TW medeniýeti). 7 günden soň, epitelial öýjükleriň 2D monogatlagyny öz içine alýan ýeke-täk Transwell goýmasy bazolateral akymy (Flow, BL) girizmek üçin gibrid çipe birleşdirildi, bu bolsa ahyrsoňy 3D epitelial gatlagynyň döremegine getirdi (morfogenez). Her bir tejribe ädiminde ýa-da wagt nokadynda adaty donordan (C103 liniýasy) ýokary galýan ýogyn içegeden alynýan adam organ epitelial öýjükleriniň morfologik aýratynlyklaryny görkezýän faza kontrastly mikrograflar. Ýokarky gatlaklardaky shemalar her ädim üçin tejribe konfigurasiýasyny görkezýär. b, Gibrid çipler (çep shema) dürli Z-de alnan ýokardan aşak konfokal mikroskopiýa görnüşleri bilen organoid epitelial öýjükleriň 3D morfogenezine getirip biler. (ýokarky, ortaky we aşaky; sag shema we degişli nokatly çyzyklar serediň). aýdyň morfologiki häsiýetnamalary görkezdi. F-aktin (mawy reňk), ýadro (çal).c, statik Transwellde (TW; ak nokatly gutuda ýerleşdirilen) ösdürilip ýetişdirilen organoidlerden alynýan epitelial öýjükleriň fluoresensiýa konfokal mikrograflary (3D burçly görnüş) we gibrid çip (iň uly doly surat) degişlilikde 2D we 3D morfologiýasyny deňeşdirýär. 2D dik kesişli görnüşleriň jübütleri (ýokarky sag burçda ýerleşdirilen; "XZ") hem 2D we 3D aýratynlyklaryny görkezýär. Masştab çyzygy, 100 µm.c Salgylanmadan rugsat bilen gaýtadan çap edildi.4. Elsevier.
Kontrol görnüşlerini şol bir öýjükleri (Caco-2 ýa-da içege organoid epitelial öýjükleri) adaty statik medeniýet şertlerinde iki ölçegli monogatlaklara ösdürip ýetişdirmek arkaly taýýarlap bolýar. Belli bir zat, mikrokanallaryň çäkli göwrüm kuwwaty sebäpli iýmit maddalarynyň azalmagy mümkin (ýagny, asyl içege çip dizaýnyndaky ýokarky kanalda ~4 µL). Şonuň üçin, bazolateral akymyň ulanylmazdan öň we soň epitelial morfologiýasyny hem deňeşdirip bolýar.
Ýumşak litografiýa prosesi arassa otagda geçirilmelidir. Çipdäki her bir gatlak (ýokarky we aşaky gatlaklar we membranalar) we gibrid çipler üçin dürli fotomaskalar ulanyldy we mikrokanallaryň beýiklikleri dürli bolandygy sebäpli aýry-aýry kremniý plitalarynda öndürildi. Çipdäki içegeleriň ýokarky we aşaky mikrokanallarynyň maksatly beýiklikleri degişlilikde 500 µm we 200 µm. Gibrid çipiň kanalyň maksatly beýikligi 200 µm.
3 dýuýmlyk kremniý waferini asetonly gapda ýerleşdiriň. Plastinany 30 sekuntlap ​​ýuwaşlyk bilen aýlaň, soňra waferi howada guradyň. Waferi IPAly plastinka geçirip, arassalamak üçin 30 sekuntlap ​​aýlaň.
Kremniý plastinkasynyň ýüzünden organiki galyndylaryň aýrylmagyny iň ýokary derejä çykarmak üçin piranýa ergini (wodorod peroksidiniň we konsentrlenen kükürt kislotasynyň garyndysy, 1:3 (göwrüm/göwrüm)) isleg boýunça ulanylyp bilner.
Piranýa ergini örän poslaýjydyr we ýylylyk döredýär. Goşmaça howpsuzlyk çäreleri zerurdyr. Galyndylary ýok etmek üçin erginiň sowamagyna we arassa, gurak galyndy gaplaryna geçirilmegine rugsat beriň. Ikinji gaplary ulanyň we galyndy gaplaryny dogry etiketläň. Has jikme-jik amallar üçin desganyň howpsuzlyk görkezmelerine eýeriň.
Waflileri 200 °C gyzgyn plitanyň üstüne 10 minut goýup, suwsuzlandyryň. Suwsuzlandyrylandan soň, wafli sowamak üçin howada bäş gezek çaýkady.
Arassalanan kremniý waferiniň ortasyna ~10 g fotorezist SU-8 2100 guýuň. Fotorezisti waferiň üstüne deň ýaýratmak üçin pinset ulanyň. Wagtal-wagtal waferi 65°C gyzgyn plastina goýuň, bu bolsa fotorezistiň has ýapyşykly bolmagyny we ýaýramagyny aňsatlaşdyrýar. Waferi gönüden-göni gyzgyn plastina goýmaň.
SU-8 aýlanýan örtügi işletmek arkaly waferde deň paýlandy. SU-8-iň gelýän aýlanyşyny 5–10 sekuntlap ​​100 aýlanýan/s tizlenme bilen 500 aýlanýan/s tizlenme bilen ýaýratmak üçin programmalaň. Esasy aýlanyşy 1500 aýlanýan/s tizlenme bilen 200 µm galyňlykdaky nusga üçin sazlaň ýa-da 1200 aýlanýan/s tizlenme bilen 30 sekuntda 300 aýlanýan/s tizlenme bilen sazlap, 250 µm galyňlyga ýetiň (çipdäki içegeleriň ýokarky gatlagy üçin 500 µm beýiklik döredýär; aşakdaky “Kritiki ädimler” bölümine serediň).
Esasy aýlanma tizligini kremniý plastinkasyndaky SU-8 nusgasynyň maksatly galyňlygyna görä sazlap bolýar.
Çipdäki içegiň ýokarky gatlagy üçin 500 µm beýiklikdäki SU-8 nusgalaryny döretmek üçin, bu gutularyň aýlanyş örtügi we ýumşak bişirme ädimleri (7-nji we 8-nji ädimler) yzygiderli gaýtalandy (9-njy ädime serediň), 250 µm iki gatlak öndürildi. Bu gutunyň 12-nji ädiminde gatlaklanyp, UV şöhlelenmesi bilen birleşdirilip bilinýän SU-8 galyň gatlagy, 500 µm beýiklikdäki gatlak emele getirdi.
SU-8 örtülen waflileri ýumşak bişirmek üçin, waflileri 65 °C-da 5 minutlap gyzgyn tarelka goýuň, soňra sazlamany 95 °C-a geçirip, ýene-de 40 minutlap inkubasiýa ediň.
Ýokarky mikrokanalda SU-8 nusgasynyň 500 μm beýikligine ýetmek üçin, 250 μm galyňlykdaky iki SU-8 gatlagyny döretmek üçin 7-nji we 8-nji ädimleri gaýtalaň.
UV maska ​​deňleşdirijisini ulanyp, waferiň ekspozisiýa wagtyny hasaplamak üçin öndürijiň görkezmelerine laýyklykda lampa synagyny geçiriň. (ekspozitsiýa wagty, ms) = (ekspozitsiýa dozasy, mJ/sm2)/(çyranyň güýji, mW/sm2).
Ekspozitsiýa wagtyny kesgitländen soň, fotomaskany UV maska ​​deňleşdirijisiniň maska ​​saklaýjysyna goýuň we fotomaskany SU-8 örtülen plastinkanyň üstüne goýuň.
UV şöhleleriniň ýaýramagyny azaltmak üçin fotomaskanyň çap edilen ýüzüni gönüden-göni kremniý plastinkasynyň SU-8 bilen örtülen tarapyna goýuň.
SU-8 örtülen plastinkany we fotomaskany öňünden kesgitlenen ekspozisiýa wagty üçin dikligine 260 mJ/sm2 UV şöhlesine goýuň (şu gutunyň 10-njy ädimine serediň).
UV şöhlesine sezewar bolandan soň, SU-8 bilen örtülen kremniý waferleri her gyzdyryjy plastinada 65°C-da 5 minut we 95°C-da 15 minut bişirilip, 200 µm beýiklikdäki nusgalary öndürildi. 500 µm beýiklikdäki nusgalary öndürmek üçin 95°C-da bişirilenden soňky wagty 30 minuda çenli uzaldyň.
Işläp çykaryjy aýna gap-gaçlara guýulýar we bişirilen wafli gap-gaçlara goýulýar. SU-8 işläp çykaryjysynyň göwrümi aýna plastinkanyň ululygyna baglylykda üýtgeýär. Açylmadyk SU-8-i doly aýyrmak üçin ýeterlik SU-8 işläp çykaryjysyny ulanmagyňyzy üpjün ediň. Mysal üçin, 1 litr göwrümi bolan 150 mm diametrli aýna gap-gaç ulanylanda, ~300 ml SU-8 işläp çykaryjysyny ulanyň. Galypy wagtal-wagtal ýuwaşlyk bilen aýlap, 25 minutlap işläň.
Işlenip düzülen galypy takmynan 10 ml täze işläp düzüji bilen ýuwuň, soňra ergini pipetka bilen püskürdip, IPA ulanyň.
Plastinany plazma arassalaýjysyna goýuň we kislorod plazmasyna (atmosfera gazy, maksatly basyş 1 × 10−5 Torr, kuwwatlylygy 125 W) 1,5 minut goýuň.
Plastinany içinde aýna slaýd bolan wakuum desikatoryna goýuň. Plastinkalary we slaýdlary ýan-ýana goýup bolýar. Eger wakuum desikatory plastinka arkaly birnäçe gatlaga bölünen bolsa, slaýdlary aşaky kamerada, plastinalary bolsa ýokarky kamerada goýuň. Aýna slaýda 100 μL trihlor (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktyl)silan erginini damdyryň we silanizasiýa üçin wakuum ulanyň.
Doňdurylan Caco-2 öýjükleriniň flakonyny 37°C suw wannasynda erediň, soňra ereýän öýjükleri 15 ml 37°C öňünden gyzdyrylan Caco-2 gurşawly T75 kolbasyna geçirip goýuň.
Caco-2 öýjüklerini ~90% birleşme ýagdaýynda geçirmek üçin, ilki bilen 37°C suw wannasynda gyzgyn Caco-2 gurşawyny, PBS-i we 0.25% tripsin/1 mM EDTA-ny goşuň.
Suwuk aspirasiýa arkaly gurşawy sorup alyň. Wakuum aspirasiýasyny gaýtalap we täze PBS goşup, öýjükleri 5 ml ýyly PBS bilen iki gezek ýuwuň.