Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali izklopite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Morfogeneza človeškega črevesja vzpostavlja značilnosti kripto-resic s 3D epitelno mikroarhitekturo in prostorsko organizacijo. Ta edinstvena struktura je potrebna za vzdrževanje homeostaze črevesja z zaščito niše matičnih celic v bazalni kripti pred eksogenimi mikrobnimi antigeni in njihovimi presnovki. Poleg tega črevesne resice in izločajoča sluz predstavljajo funkcionalno diferencirane epitelijske celice z zaščitno pregrado na površini črevesne sluznice. Zato je poustvarjanje 3D epitelijskih struktur ključnega pomena za izdelavo in vitro modelov črevesja. Predvsem lahko organsko mimetično črevesje na čipu sproži spontano 3D morfogenezo črevesnega epitelija z izboljšanimi fiziološkimi funkcijami in biomehaniko. Tukaj ponujamo ponovljiv protokol za robustno indukcijo črevesne morfogeneze v črevesju na mikrofluidnem čipu, kot tudi na vgrajenem hibridnem čipu Transwell. Opisujemo podrobne metode za izdelavo naprav, gojenje Caco-2 ali črevesnih organoidnih epitelijskih celic v običajnih okoljih, kot tudi na mikrofluidni platformi, indukcijo 3D morfogeneze in karakterizacijo vzpostavljenega 3D epitelija z uporabo več slikovnih modalitet. Ta protokol doseže regeneracijo funkcionalne mikroarhitekture črevesja z nadzorom bazolateralnega pretoka tekočine 5 dni. Naša metoda morfogeneze in vitro uporablja fiziološko relevantno strižno napetost in mehansko gibanje ter ne zahteva kompleksnega celičnega inženiringa ali manipulacije, kar bi lahko preseglo druge obstoječe tehnike. Predvidevamo, da bi lahko imel naš predlagani protokol široke posledice za skupnost biomedicinskih raziskovalcev, saj bi zagotovil metodo za regeneracijo 3D črevesnih epitelijskih plasti in vitro za biomedicinske, klinične in farmacevtske aplikacije.
Poskusi kažejo, da lahko črevesne epitelijske celice Caco-2, gojene v napravah tipa "gut-on-a-chip"1,2,3,4,5 ali dvoslojnih mikrofluidnih napravah6,7, spontano doživijo 3D morfogenezo in vitro brez jasnega razumevanja osnovnega mehanizma. V naši nedavni študiji smo ugotovili, da je odstranitev bazolateralno izločenih antagonistov morfogenov iz gojilnih naprav potrebna in zadostna za indukcijo 3D epitelijske morfogeneze in vitro, kar so dokazali s Caco-2 in črevesnimi organoidi, pridobljenimi od pacientov. Epitelijske celice so bile validirane. V tej študiji smo se posebej osredotočili na celično produkcijo in porazdelitev koncentracije močnega antagonista Wnt, Dickkopf-1 (DKK-1), v napravah na čipu črevesja in modificiranih mikrofluidnih napravah, ki vsebujejo vložke Transwell, imenovane "hibridni čip". Pokazali smo, da dodajanje eksogenih antagonistov Wnt (kot so DKK-1, represor Wnt 1, izločeni protein 1, povezan s frizzledom, ali Soggy-1) v črevesje na čipu zavira morfogenezo ali moti predstrukturirano 3D epitelijsko plast, kar kaže na to, da je antagonistični stres med kulturo odgovoren za črevesno morfogenezo in vitro. Zato je praktičen pristop za doseganje robustne morfogeneze na epitelijskem vmesniku odstranitev ali minimalno vzdrževanje ravni antagonistov Wnt v bazolateralnem predelu z aktivnim izpiranjem (npr. v platformah črevesja na čipu ali hibrida na čipu) ali difuzijo v bazolateralnih medijih (npr. iz vložkov Transwell v velike bazolateralne rezervoarje v vdolbinicah).
V tem protokolu ponujamo podrobno metodo za izdelavo mikronaprav tipa črevesje na čipu in hibridnih čipov, ki jih je mogoče vstaviti v Transwell (koraki 1-5), za gojenje črevesnih epitelijskih celic na poroznih membranah na osnovi polidimetilsiloksana (PDMS) (koraki 6A, 7A, 8, 9) ali poliestrskih membranah vložkov Transwell (koraki 6B, 7B, 8, 9) in inducirano 3D morfogenezo in vitro (korak 10). Z uporabo več slikovnih modalitet (koraki 11-24) smo identificirali tudi celične in molekularne značilnosti, ki kažejo na tkivno specifično histogenezo in od linije odvisno celično diferenciacijo. Morfogenezo induciramo z uporabo človeških črevesnih epitelijskih celic, kot sta Caco-2 ali črevesni organoidi, v dveh oblikah gojenja s tehničnimi podrobnostmi, vključno s površinsko modifikacijo poroznih membran, ustvarjanjem 2D monoslojev ter črevesno biokemijsko in reprodukcijo biomehanskega mikrookolja in vitro. Za indukcijo 3D morfogeneze iz 2D epitelijskih monoslojev smo odstranili antagoniste morfogenov v obeh gojenih oblikah s pretokom. medij v bazolateralni predel kulture. Nazadnje predstavljamo uporabnost regenerativne 3D epitelijske plasti, ki jo je mogoče uporabiti za modeliranje od morfogenov odvisne rasti epitelija, vzdolžnih sokultur gostitelj-mikrobiom, okužbe s patogeni, vnetne poškodbe, disfunkcije epitelijske pregrade in terapij na osnovi probiotikov. Primer vplivov.
Naš protokol je lahko koristen za širok krog znanstvenikov na področju osnovnih (npr. biologija črevesne sluznice, biologija matičnih celic in razvojna biologija) in uporabnih raziskav (npr. predklinično testiranje zdravil, modeliranje bolezni, tkivno inženirstvo in gastroenterologija) s širokim vplivom. Zaradi ponovljivosti in robustnosti našega protokola za indukcijo 3D morfogeneze črevesnega epitelija in vitro predvidevamo, da se lahko naša tehnična strategija razširi na občinstvo, ki preučuje dinamiko celične signalizacije med črevesnim razvojem, regeneracijo ali homeostazo. Poleg tega je naš protokol uporaben za preiskovanje okužb z različnimi povzročitelji okužb, kot so norovirus 8, koronavirus 2, ki povzroča hud akutni respiratorni sindrom (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 ali Vibrio cholerae. Koristne so tudi ciljne skupine patologije in patogeneze bolezni. Uporaba sistema za mikrofiziologijo črevesja na čipu lahko omogoči longitudinalno sokulturo 10 in poznejšo oceno obrambe gostitelja, imunskih odzivov in popravila poškodb, povezanih s patogeni, v prebavilih (GI) 11. Druge GI motnje, povezane s sindromom prepustnega črevesja, celiakijo, Crohnovo boleznijo, ulceroznim kolitisom, pouchitisom ali sindromom razdražljivega črevesja, je mogoče simulirati, ko se 3D plasti črevesnega epitelija pripravijo z uporabo pacientovih 3D plasti črevesnega epitelija. Te bolezni vključujejo atrofijo resic, skrajšanje kript, poškodbo sluznice ali oslabljeno epitelijsko pregrado. Biopsija ali črevesni organoidi, pridobljeni iz matičnih celic 12,13. Za boljše modeliranje večje kompleksnosti bolezenskega okolja lahko bralci razmislijo o dodajanju vrst celic, pomembnih za bolezen, kot so mononuklearne celice periferne krvi (PBMC) pacienta, modelom, ki vsebujejo 3D mikroarhitekture črevesnih resic in kript. tkivno specifične imunske celice, 5.
Ker je 3D epitelijska mikrostruktura mogoče fiksirati in vizualizirati brez postopka seciranja, bi lahko gledalce, ki delajo na prostorski transkriptomiki in slikanju visoke ali super ločljivosti, zanimalo naše kartiranje prostorsko-časovne dinamike genov in beljakovin na epitelijskih nišah. Zanima me tehnologija. Odziv na mikrobne ali imunske dražljaje. Poleg tega je mogoče v 3D plasti črevesne sluznice vzpostaviti vzdolžno presluh med gostiteljem in mikrobiomom 10, 14, ki usklajuje homeostazo črevesja, s sokultiviranjem različnih mikrobnih vrst, mikrobnih združb ali fekalne mikrobiote, zlasti v črevesju na čipu. na platformi. Ta pristop je še posebej privlačen za občinstvo, ki preučuje imunologijo sluznice, gastroenterologijo, človeški mikrobiom, kulturomiko in klinično mikrobiologijo, ki želi v laboratoriju gojiti prej nekultivirano črevesno mikrobioto. Če je naš protokol morfogeneze in vitro mogoče prilagoditi skalabilnim formatom kultur, kot so vložki z več vdolbinami v 24-, 96- ali 384-vdolbinskih ploščah, ki nenehno dopolnjujejo bazolateralne predelke, se lahko protokol razširi tudi na tiste, ki razvijajo farmacevtske, biomedicinske ali visokozmogljive platforme za presejanje ali validacijo za živilsko industrijo. Kot dokaz načela smo nedavno dokazali izvedljivost multipleksnega visokozmogljivega sistema morfogeneze, ki ga je mogoče skalirati v format 24-vdolbinskih plošč. Poleg tega so bili komercializirani več izdelkov organ-na-čipu16,17,18. Zato se lahko validacija naše metode morfogeneze in vitro pospeši in jo potencialno sprejmejo številni raziskovalni laboratoriji, industrija ali vladne in regulativne agencije, da bi razumeli celično reprogramiranje črevesne morfogeneze in vitro na transkriptomski ravni za testiranje zdravil ali bioterapevtikov. Absorpcija in Transport kandidatov za zdravila je bil ocenjen z uporabo 3D nadomestkov črevesja ali z uporabo modelov organov na čipu po meri ali komercialnih modelov organov na čipu za oceno ponovljivosti procesa morfogeneze črevesja.
Za preučevanje morfogeneze črevesnega epitelija je bilo uporabljenih omejeno število eksperimentalnih modelov, pomembnih za ljudi, predvsem zaradi pomanjkanja izvedljivih protokolov za indukcijo 3D morfogeneze in vitro. Pravzaprav velik del trenutnega znanja o morfogenezi črevesja temelji na študijah na živalih (npr. zebrice20, miši21 ali piščanci22). Vendar so te študije delovno in stroškovno intenzivne, lahko etično vprašljive in, kar je najpomembneje, ne določajo natančno človeških razvojnih procesov. Ti modeli so tudi zelo omejeni v svoji zmožnosti testiranja na večsmerno skalabilen način. Zato naš protokol za regeneracijo 3D tkivnih struktur in vitro prekaša živalske modele in vivo ter druge tradicionalne statične 2D modele celičnih kultur. Kot smo že opisali, nam je uporaba 3D epitelijskih struktur omogočila preučevanje prostorske lokalizacije diferenciranih celic v osi kripta-vilus kot odziv na različne mukozne ali imunske dražljaje. 3D epitelijske plasti lahko zagotovijo prostor za preučevanje, kako mikrobne celice tekmujejo za oblikovanje prostorskih niš in ekološke evolucije kot odziv na dejavnike gostitelja (npr. notranje proti zunanjim plastem sluzi, izločanje IgA in protimikrobni peptidi). Poleg tega nam lahko 3D epitelijska morfologija omogoči razumevanje, kako črevesna mikrobiota strukturira svoje skupnosti in sinergistično proizvaja mikrobne presnovke (npr. kratkoverižne maščobne kisline), ki oblikujejo celično organizacijo in niše matičnih celic v bazalnih kriptah. Te značilnosti je mogoče dokazati le, če so 3D epitelijske plasti vzpostavljene in vitro.
Poleg naše metode ustvarjanja 3D črevesnih epitelijskih struktur obstaja več metod in vitro. Črevesna organoidna kultura je najsodobnejša tehnika tkivnega inženiringa, ki temelji na gojenju črevesnih matičnih celic v specifičnih morfogenih pogojih23,24,25. Vendar pa je uporaba 3D modelov organoidov za analizo transporta ali sokulture gostitelj-mikrobiom pogosto zahtevna, ker je črevesni lumen zaprt znotraj organoida in je zato vnos luminalnih komponent, kot so mikrobne celice ali eksogeni antigeni, omejen. Dostop do organoidnih lumnov je mogoče izboljšati z mikroinjektorjem26,27, vendar je ta metoda invazivna in delovno intenzivna ter zahteva specializirano znanje za izvedbo. Poleg tega tradicionalne organoidne kulture, ki se vzdržujejo v hidrogelnih odrih v statičnih pogojih, ne odražajo natančno aktivne biomehanike in vivo.
Drugi pristopi, ki jih uporablja več raziskovalnih skupin, uporabljajo predstrukturirane 3D hidrogelne odre za posnemanje strukture črevesnega epitelija z gojenjem izoliranih človeških črevesnih celic na površini gela. Izdelava hidrogelnih odrov z uporabo 3D-natisnjenih, mikrorezljanih ali litografsko izdelanih kalupov. Ta metoda prikazuje samoorganizirano razporeditev izoliranih epitelijskih celic in vitro s fiziološko ustreznimi gradienti morfogenov, pri čemer se vzpostavi epitelijska struktura z visokim razmerjem stranic in presluh strome in epitelija z vključitvijo stromalnih celic v oder. Vendar pa lahko narava predstrukturiranih odrov prepreči prikaz samega spontanega morfogenetskega procesa. Ti modeli tudi ne zagotavljajo dinamičnega luminalnega ali intersticijskega pretoka, saj jim manjka strižna napetost tekočine, ki jo črevesne celice potrebujejo za morfogenezo in pridobitev fiziološke funkcije. Druga nedavna študija je uporabila hidrogelne odre v mikrofluidni platformi in vzorčaste črevesne epitelijske strukture z uporabo tehnik laserskega jedkanja. Mišji črevesni organoidi sledijo jedkanim vzorcem, da tvorijo črevesne cevaste strukture, intraluminalni pretok tekočine pa je mogoče rekapitulirati z uporabo mikrofluidnega modula. Vendar pa ta model ne kaže niti spontanega morfogenetskih procesov niti ne vključuje mehanobioloških gibov črevesja. Tehnike 3D-tiskanja iz iste skupine so bile sposobne ustvariti miniaturne črevesne cevi s spontanimi morfogenetskimi procesi. Kljub kompleksni izdelavi različnih segmentov črevesja znotraj cevi temu modelu manjka tudi pretok luminalne tekočine in mehanska deformacija. Poleg tega je lahko delovanje modela omejeno, zlasti po končanem postopku biotiskanja, kar moti eksperimentalne pogoje ali interakcije med celicami. Namesto tega naš predlagani protokol zagotavlja spontano morfogenezo črevesja, fiziološko relevantno strižno napetost, biomehaniko, ki posnema gibljivost črevesja, dostopnost neodvisnih apikalnih in bazolateralnih predelkov ter poustvarjanje kompleksnih bioloških mikrookolij modularnosti. Zato lahko naš protokol 3D-morfogeneze in vitro zagotovi dopolnilni pristop k premagovanju izzivov obstoječih metod.
Naš protokol je v celoti osredotočen na 3D epitelno morfogenezo, pri čemer so v kulturi samo epitelijske celice in nobene druge vrste okoliških celic, kot so mezenhimske celice, endotelijske celice in imunske celice. Kot je bilo že opisano, je jedro našega protokola indukcija epitelijske morfogeneze z odstranitvijo inhibitorjev morfogenov, ki se izločajo na bazolateralni strani uvedenega medija. Medtem ko nam robustna modularnost našega črevesja na čipu in hibrida na čipu omogoča, da poustvarimo valovito 3D epitelno plast, je treba še preučiti dodatne biološke kompleksnosti, kot so epitelijsko-mezenhimske interakcije33,34, odlaganje zunajceličnega matriksa (ECM)35 in v našem modelu značilnosti kripte in resic, ki prenašajo niše matičnih celic v bazalnih kriptah. Stromalne celice (npr. fibroblasti) v mezenhimu igrajo ključno vlogo pri proizvodnji proteinov ECM in regulaciji črevesne morfogeneze in vivo35,37,38. Dodatek mezenhimskih celic našemu modelu je izboljšal morfogenetski proces in pritrditev celic. učinkovitost. Endolijska plast (tj. kapilare ali limfatične žile) igra pomembno vlogo pri uravnavanju molekularnega transporta39 in rekrutiranju imunskih celic40 v črevesnem mikrookolju. Poleg tega so komponente vaskulature, ki jih je mogoče povezati med tkivnimi modeli, predpogoj, ko so tkivni modeli zasnovani za prikaz interakcij med več organi. Zato bo morda treba vključiti endotelijske celice za modeliranje natančnejših fizioloških značilnosti z ločljivostjo na ravni organov. Imunske celice, pridobljene od pacienta, so bistvene tudi za prikaz prirojenih imunskih odzivov, predstavitve antigenov, prirojenega adaptivnega imunskega presluha in tkivno specifične imunosti v kontekstu posnemanja črevesne bolezni.
Uporaba hibridnih čipov je enostavnejša od uporabe črevesja na čipu, ker je nastavitev naprave enostavnejša, uporaba vložkov Transwell pa omogoča skalabilno kulturo črevesnega epitelija. Vendar komercialno dostopni vložki Transwell s poliestrskimi membranami niso elastični in ne morejo simulirati peristaltičnih gibov. Poleg tega je apikalni predel vložka Transwell, nameščenega v hibridni čip, ostal stacionaren brez strižne napetosti na apikalni strani. Jasno je, da statične lastnosti v apikalnem predelu le redko omogočajo dolgotrajno sokulturo bakterij v hibridnih čipih. Čeprav lahko pri uporabi hibridnih čipov robustno induciramo 3D morfogenezo v vložkih Transwell, lahko pomanjkanje fiziološko relevantne biomehanike in apikalnega pretoka tekočine omeji izvedljivost hibridnih platform čipov za potencialne aplikacije.
Popolne rekonstrukcije osi človeške kripte in resic v kulturah črevesja na čipu in hibrida na čipu še niso bile v celoti ugotovljene. Ker se morfogeneza začne iz epitelijske monosloje, 3D mikroarhitekture ne zagotavljajo nujno morfološke podobnosti s kriptami in vivo. Čeprav smo okarakterizirali populacijo proliferirajočih celic v bližini bazalne domene kripte v mikroinženirskem 3D epiteliju, območja kripte in resic niso bila jasno razmejena. Čeprav višji zgornji kanali na čipu vodijo do povečane višine mikroinženirskega epitelija, je največja višina še vedno omejena na ~300–400 µm. Dejanska globina človeških črevesnih kript v tankem in debelem črevesu je ~135 µm oziroma ~400 µm, višina resic tankega črevesa pa je ~600 µm41.
Z vidika slikanja je lahko slikanje 3D mikroarhitektur in situ s superločljivostjo omejeno na črevesje na čipu, saj je potrebna delovna razdalja od objektivne leče do epitelijske plasti reda velikosti nekaj milimetrov. Za premagovanje te težave je lahko potreben oddaljen objektiv. Poleg tega je izdelava tankih rezin za pripravo vzorcev za slikanje zahtevna zaradi visoke elastičnosti PDMS. Ker mikrofabrikacija črevesja na čipu po plasteh vključuje trajno adhezijo med posameznimi plastmi, je izjemno težko odpreti ali odstraniti zgornjo plast za pregled površinske strukture epitelijske plasti. Na primer z uporabo vrstičnega elektronskega mikroskopa (SEM).
Hidrofobnost PDMS je bila omejujoč dejavnik v mikrofluidnih študijah, ki se ukvarjajo s hidrofobnimi majhnimi molekulami, saj lahko PDMS nespecifično adsorbira takšne hidrofobne molekule. Alternative PDMS se lahko uporabijo z drugimi polimernimi materiali. Druga možnost je modifikacija površine PDMS (npr. premaz z lipofilnimi materiali 42 ali poli(etilen glikolom) 43), da se zmanjša adsorpcija hidrofobnih molekul.
Končno, naša metoda ni bila dobro okarakterizirana z vidika zagotavljanja visokozmogljivega presejanja ali uporabniku prijazne eksperimentalne platforme »univerzalne velikosti«. Trenutni protokol zahteva črpalko za brizgo na mikronapravo, kar zavzame prostor v inkubatorju s CO2 in preprečuje obsežne poskuse. To omejitev je mogoče znatno izboljšati z razširljivostjo inovativnih formatov kultur (npr. porozni vložki s 24 vdolbinicami, 96 vdolbinicami ali 384 vdolbinicami, ki omogočajo neprekinjeno dopolnjevanje in odstranjevanje bazolateralnih medijev).
Za indukcijo 3D morfogeneze človeškega črevesnega epitelija in vitro smo uporabili mikrofluidno čipno črevesno napravo, ki je vsebovala dva vzporedna mikrokanala in elastično porozno membrano vmes, da bi ustvarili lumensko-kapilarni vmesnik. Prav tako prikazujemo uporabo enokanalne mikrofluidne naprave (hibridnega čipa), ki zagotavlja neprekinjen bazolateralni pretok pod polariziranimi epitelijskimi plastmi, vzgojenimi na vložkih Transwell. Na obeh platformah je mogoče prikazati morfogenezo različnih človeških črevesnih epitelijskih celic z uporabo usmerjene manipulacije pretoka za odstranitev antagonistov morfogenov iz bazolateralnega predela. Celoten eksperimentalni postopek (slika 1) je sestavljen iz petih delov: (i) mikrofabrikacija črevesnega čipa ali vstavljivega hibridnega čipa Transwell (koraki 1-5; okvir 1), (ii) priprava črevesnih epitelijskih celic (celice Caco-2) ali človeških črevesnih organoidov; okvirji 2–5), (iii) gojenje črevesnih epitelijskih celic na črevesnih čipih ali hibridnih čipih (koraki 6–9), (iv) indukcija 3D morfogeneze in vitro (korak 10) in (v)) za karakterizacijo 3D epitelijske mikrostrukture (koraki 11–24). Nazadnje je bila zasnovana ustrezna kontrolna skupina (o kateri je podrobneje razpravljano spodaj) za potrditev učinkovitosti in vitro morfogeneze s primerjavo epitelijske morfogeneze s prostorskimi, časovnimi, pogojnimi ali proceduralnimi kontrolami.
Uporabili smo dve različni platformi za gojenje: črevesje na čipu z ravnimi kanali ali nelinearnimi zavitimi kanali ali hibridne čipe, ki vsebujejo vložke Transwell (TW) v mikrofluidni napravi, izdelani, kot je opisano v okvirju 1, in korak 1-5. »Izdelava naprave« prikazuje glavne korake pri izdelavi enega samega čipa ali hibridnega čipa. »Gulacija človeških črevesnih epitelijskih celic« pojasnjuje vir celic (Caco-2 ali človeške črevesne organoide) in postopek gojenja, uporabljen v tem protokolu. »Morfogeneza in vitro« prikazuje celotne korake, v katerih se epitelijske celice, pridobljene iz Caco-2 ali organoidov, gojijo na črevesnem čipu ali na vložkih Transwell hibridnega čipa, čemur sledi indukcija 3D morfogeneze in nastanek karakterizirane epitelijske strukture. Številka koraka programa ali številka polja je prikazana pod vsako puščico. Aplikacija ponuja primere, kako se lahko uporabijo vzpostavljene črevesne epitelijske plasti, na primer pri karakterizaciji celične diferenciacije, študijah fiziologije črevesja, vzpostavljanju ekosistemov gostitelj-mikrobiom in modeliranju bolezni. Imunofluorescenčne slike v »Celični diferenciaciji« Prikazuje jedra, F-aktin in MUC2, izražene v 3D epitelijski plasti Caco-2, ustvarjeni na črevesnem čipu. Signalizacija MUC2 je prisotna v vrčastih celicah in sluzi, ki se izloča iz površin sluznice. Fluorescentne slike v Gut Physiology prikazujejo sluz, ki nastane z barvanjem za ostanke sialne kisline in N-acetilglukozamina z uporabo fluorescentnega aglutinina pšeničnih kalčkov. Dve prekrivajoči se sliki v »Host-Microbe Co-Cultures« prikazujeta reprezentativne sokulture gostitelja in mikrobioma v črevesju na čipu. Leva plošča prikazuje sokulturo E. coli, ki izraža zeleni fluorescentni protein (GFP), z mikroinženirskimi 3D epitelijskimi celicami Caco-2. Desna plošča prikazuje lokalizacijo GFP E. coli, sokultivirane s 3D epitelijskimi celicami Caco-2, ki ji sledi imunofluorescenčno barvanje s F-aktinom (rdeča) in jedri (modra). Modeliranje bolezni prikazuje zdravo v primerjavi s prepustnim črevesjem v čipih z vnetjem črevesja pod fiziološkim izzivom z bakterijskimi antigeni (npr. lipopolisaharid, LPS) in imunskimi celicami (npr. PBMC; zelena). Celice Caco-2 so bile gojene za vzpostavitev 3D epitelijske plasti. Merilna lestvica, 50 µm. Slike v spodnji vrstici: »Diferenciacija celic« prirejeno z dovoljenjem iz reference.2. Oxford University Press; Reproducirano z dovoljenjem iz ref.5. NAS; »Sokultura gostitelja in mikroba« prirejeno z dovoljenjem iz ref.3. NAS; »Modeliranje bolezni« prirejeno z dovoljenjem iz reference.5. NAS.
Tako čipi tipa črevesja na čipu kot hibridni čipi so bili izdelani z uporabo replik PDMS, ki so bile iz silikonskih kalupov izvlečene z mehko litografijo1,44 in oblikovane s SU-8. Zasnova mikrokanalov v vsakem čipu je določena z upoštevanjem hidrodinamike, kot sta strižna napetost in hidrodinamični tlak1,4,12. Prvotna zasnova črevesja na čipu (razširjeni podatki, slika 1a), ki je bila sestavljena iz dveh sosednjih vzporednih ravnih mikrokanalov, se je razvila v kompleksno črevesje na čipu (razširjeni podatki, slika 1b), ki vključuje par ukrivljenih mikrokanalov za indukcijo povečanega časa zadrževanja tekočine, nelinearnih vzorcev pretoka in večosne deformacije gojenih celic (slika 2a–f)12. Ko je treba poustvariti bolj kompleksno biomehaniko črevesja, je mogoče izbrati kompleksno črevesje na čipu. Dokazali smo, da zaviti črevesni čip močno inducira tudi 3D morfogenezo v podobnem časovnem okviru s podobno stopnjo rasti epitelija v primerjavi z originalnim črevesnim čipom. ne glede na vrsto gojenih celic. Zato so za indukcijo 3D morfogeneze linearne in kompleksne zasnove črevesja na čipu zamenljive. Replike PDMS, utrjene na silicijevih kalupih z vzorci SU-8, so po razkalupljenju zagotovile negativne lastnosti (slika 2a). Za izdelavo črevesja na čipu je bila pripravljena zgornja plast PDMS zaporedno vezana na porozno folijo PDMS in nato poravnana s spodnjo plastjo PDMS z ireverzibilno vezavo z uporabo koronske obdelave (slika 2b–f). Za izdelavo hibridnih čipov so bile utrjene replike PDMS vezane na steklena stekelca, da so nastale enokanalne mikrofluidne naprave, ki bi lahko sprejele vložke Transwell (slika 2h in razširjeni podatki, slika 2). Postopek vezave se izvede z obdelavo površin replike PDMS in stekla s kisikovo plazmo ali koronsko obdelavo. Po sterilizaciji mikroizdelane naprave, pritrjene na silikonsko cev, je bila naprava pripravljena za izvedbo 3D morfogeneze črevesnega epitelija (slika 2g).
a, Shematski prikaz priprave delov PDMS iz silikonskih kalupov z vzorcem SU-8. Nestrjena raztopina PDMS je bila vlita v silikonski kalup (levo), strjena pri 60 °C (na sredini) in razkalupljena (desno). Razkalupljeni PDMS je bil razrezan na kose in očiščen za nadaljnjo uporabo.b, Fotografija silikonskega kalupa, uporabljenega za pripravo zgornje plasti PDMS.c, Fotografija silikonskega kalupa, uporabljenega za izdelavo porozne membrane PDMS.d, Serija fotografij zgornjih in spodnjih komponent PDMS ter sestavljene črevesne naprave na čipu.e, Shematski prikaz poravnave zgornjih, membranskih in spodnjih komponent PDMS. Vsaka plast je nepovratno vezana s plazemsko ali koronsko obdelavo.f, Shematski prikaz izdelane naprave črevesje na čipu z naloženimi zavitimi mikrokanali in vakuumskimi komorami.g, Postavitev črevesja na čipu za mikrofluidno celično kulturo. Izdelano črevesje na čipu, sestavljeno s silikonsko cevko in brizgo, je bilo nameščeno na krovno stekelce. Naprava s čipom je bila nameščena na pokrov 150 mm Petrijeve posode. posoda za obdelavo. Vezivo se uporablja za zapiranje silikonske cevke.h, Vizualni posnetki izdelave hibridnega čipa in 3D morfogeneze z uporabo hibridnih čipov. Vstavki Transwell, pripravljeni neodvisno za gojenje 2D monoslojev črevesnih epitelijskih celic, so bili vstavljeni v hibridni čip, da bi sprožili črevesno 3D morfogenezo. Medij se perfundira skozi mikrokanale pod celično plastjo, vzpostavljeno na vložku Transwell. Merilna lestvica, 1 cm.h Ponatisnjeno z dovoljenjem iz reference.4. Elsevier.
V tem protokolu sta bila celična linija Caco-2 in črevesni organoidi uporabljeni kot epitelijski viri (slika 3a). Obe vrsti celic sta bili gojeni neodvisno (okvir 2 in okvir 5) in uporabljeni za sejanje mikrokanalov, prevlečenih z ECM, v črevesju na čipu ali v vložkih Transwell. Ko so celice konfluentne (>95 % pokritost v bučkah), se rutinsko gojene celice Caco-2 (med pasažama 10 in 50) v T-bučkah poberejo za pripravo disociiranih celičnih suspenzij s tekočino za tripsinizacijo (okvir 2). Človeški črevesni organoidi iz črevesnih biopsij ali kirurških resekcij so bili gojeni v kupolastih Matrigelovih nosilcih v 24-jamičnih ploščah za podporo strukturnemu mikrookolju. Gojišče, ki je vsebovalo esencialne morfogene (kot so Wnt, R-spondin in Noggin) in rastne faktorje, pripravljene, kot je opisano v okvirju 3, so dodajali vsak drugi dan, dokler organoidi niso zrasli do premera ~500 µm. Popolnoma zrasli organoidi se poberejo in disociirajo v posamezne celice za sejanje na črevesje ali Vstavki Transwell na čipu (okvir 5). Kot smo že poročali, ga je mogoče razlikovati glede na vrsto bolezni12,13 (npr. ulcerozni kolitis, Crohnova bolezen, kolorektalni rak ali normalni darovalci), mesto lezije (npr. lezija v primerjavi z nepoškodovanim območjem) in lokacijo v prebavilih (npr. dvanajstnik, jejunum, ileum, cekum, debelo črevo ali danka). V okvirju 5 ponujamo optimiziran protokol za gojenje organoidov debelega črevesa (koloidov), ki običajno zahtevajo višje koncentracije morfogenov kot organoidi tankega črevesa.
a, Delovni potek za indukcijo črevesne morfogeneze v črevesnem čipu. V tem protokolu se za demonstracijo 3D morfogeneze uporabljata človeški črevesni epitelij Caco-2 in črevesni organoidi. Izolirane epitelijske celice so bile zasejane v pripravljeno napravo črevesje na čipu (priprava čipa). Ko so celice zasejane (sejane) in pritrjene (pritrjene) na porozno membrano PDMS na dan 0 (D0), se sproži apikalni (AP) pretok, ki se vzdržuje prva 2 dni (pretok, AP, D0-D2). Prav tako se sproži bazolateralni (BL) pretok skupaj s cikličnimi razteznimi gibi (raztezanje, pretok, AP in BL), ko se oblikuje celoten 2D monosloj. Črevesna 3D morfogeneza se je spontano pojavila po 5 dneh mikrofluidne kulture (morfogeneza, D5). Slike faznega kontrasta prikazujejo reprezentativno morfologijo celic Caco-2 v vsakem poskusnem koraku ali časovni točki (stolpični graf, 100 µm). Štirje shematski diagrami, ki prikazujejo ustrezne kaskade črevesne morfogeneze (zgoraj desno). Črtkane puščice Shematično predstavlja smer toka tekočine.b, SEM slika, ki prikazuje površinsko topologijo vzpostavljenega 3D epitelija Caco-2 (levo).Vložek, ki poudarja povečano območje (bela črtkana škatla), prikazuje regenerirane mikroresice na 3D plasti Caco-2 (desno).c, Horizontalni frontalni pogled na vzpostavljen 3D Caco-2, klavdin (ZO-1, rdeča) in neprekinjene membrane s krtačastim robom, označene z F-aktinom (zelena) in jedri (modra). Imunofluorescenčna konfokalna vizualizacija epitelijskih celic na črevesnih čipih. Puščice, ki kažejo na srednjo shemo, označujejo lokacijo goriščne ravnine za vsak konfokalni pogled.d, Časovni potek morfoloških sprememb v organoidih, gojenih na čipu, pridobljen s fazno kontrastno mikroskopijo 3., 7., 9., 11. in 13. dan.Vložek (zgoraj desno) prikazuje veliko povečavo podane slike.e, DIC fotomikrografija organoidnega 3D epitelija, vzpostavljenega v črevesju, na rezini, posneti 7. dan.f, Prekrivajoče se imunofluorescenčne slike, ki prikazujejo markerje za matične celice. (LGR5; magenta), vrčaste celice (MUC2; zelena), F-aktin (sivo) in jedra (cijan), gojene na črevesnih čipih 3 dni (levo) oziroma 13 dni (na sredini) organoidi na epitelijski plasti. Glej tudi sliko 3 z razširjenimi podatki, ki poudarja signalizacijo LGR5 brez signalizacije MUC2. Fluorescenčne slike, ki prikazujejo epitelijsko mikrostrukturo (desno) 3D organoidnega epitelija, vzpostavljenega v črevesju na čipu z obarvanjem plazemske membrane z barvilom CellMask (desno) 13. dan gojenja. Merilo je 50 μm, razen če ni navedeno drugače.b Ponatisnjeno z dovoljenjem iz reference.2. Oxford University Press; c Prirejeno z dovoljenjem iz reference.2. Oxford University Press; e in f prirejeno z dovoljenjem iz reference.12 Pod licenco Creative Commons CC BY 4.0.
V črevesju na čipu je potrebno modificirati hidrofobno površino porozne membrane PDMS za uspešno prevleko ECM. V tem protokolu uporabljamo dve različni metodi za modificiranje hidrofobnosti membran PDMS. Za gojenje celic Caco-2 je bila površinska aktivacija z UV/ozonsko obdelavo dovolj, da se zmanjša hidrofobnost površine PDMS, prevleče ECM in pritrdi celice Caco-2 na membrano PDMS. Vendar pa mikrofluidna kultura organoidnega epitelija zahteva kemično funkcionalizacijo površine, da se doseže učinkovito odlaganje proteinov ECM z zaporednim nanašanjem polietilenimina (PEI) in glutaraldehida na mikrokanale PDMS. Po modifikaciji površine so bili proteini ECM odloženi tako, da prekrijejo funkcionalizirano površino PDMS, nato pa vneseni v izolirani organoidni epitelij. Ko so celice pritrjene, se mikrofluidna celična kultura začne s perfuzijo samo medija v zgornji mikrokanal, dokler celice ne tvorijo popolne monosloje, medtem ko spodnji mikrokanal ohranja statične pogoje. Ta optimizirana metoda za površinsko aktivacijo in prevleko ECM omogoča pritrditev organoidnega epitelija, da se sproži 3D morfogeneza na površini PDMS.
Tudi kulture Transwell zahtevajo premaz z ECM pred setvijo celic; vendar kulture Transwell ne zahtevajo kompleksnih korakov predobdelave za aktivacijo površine poroznih vložkov. Za gojenje celic Caco-2 na vložkih Transwell premaz z ECM na poroznih vložkih pospeši pritrditev disociiranih celic Caco-2 (<1 ura) in nastanek tesne spojne pregrade (<1-2 dni). Za gojenje organoidov na vložkih Transwell se izolirani organoidi zasejejo na vložke, prevlečene z ECM, pritrdijo na površino membrane (<3 ure) in vzdržujejo, dokler organoidi ne tvorijo popolne monosloje z integriteto pregrade. Kulture Transwell se izvajajo na 24-jamskih ploščah brez uporabe hibridnih čipov.
In vitro 3D morfogenezo lahko sprožimo z uporabo pretoka tekočine na bazolateralni vidik že vzpostavljene epitelijske plasti. V črevesju na čipu se je epitelijska morfogeneza začela, ko je bil medij perfuziran v zgornji in spodnji mikrokanal (slika 3a). Kot je bilo že opisano, je ključnega pomena uvesti pretok tekočine v spodnji (bazolateralni) predel za neprekinjeno odstranjevanje usmerjeno izločenih zaviralcev morfogenov. Da bi celicam, vezanim na porozne membrane, zagotovili dovolj hranil in seruma ter ustvarili luminalno strižno napetost, običajno v črevesju na čipu uporabimo dvojni pretok. V hibridnih čipih so bili v hibridne čipe vstavljeni vložki Transwell, ki vsebujejo epitelijske monosloje. Nato je bil medij nanesen pod bazolateralno stran poroznega vložka Transwell skozi mikrokanal. Črevesna morfogeneza se je pojavila 3–5 dni po začetku bazolateralnega pretoka v obeh gojitvenih platformah.
Morfološke značilnosti mikroinženirskih 3D epitelijskih plasti je mogoče analizirati z uporabo različnih slikovnih modalitet, vključno s fazno kontrastno mikroskopijo, mikroskopijo z diferencialnim interferenčnim kontrastom (DIC), SEM ali imunofluorescenčno konfokalno mikroskopijo (sliki 3 in 4). Fazno kontrastno ali DIC slikanje je mogoče enostavno izvesti kadar koli med kulturo za spremljanje oblike in izbokline 3D epitelijskih plasti. Zaradi optične prosojnosti PDMS in poliestrskih filmov lahko tako platforma črevesje na čipu kot hibridna platforma čipa zagotavljata slikanje in situ v realnem času brez potrebe po rezanju ali razstavljanju naprave. Pri izvajanju imunofluorescenčnega slikanja (slike 1, 3c, f in 4b, c) se celice običajno fiksirajo s 4 % (m/vol) paraformaldehidom (PFA), nato s Tritonom X-100 in 2 % (m/vol) govejim serumskim albuminom (BSA) po vrsti. Glede na vrsto celice se lahko uporabijo različni fiksativi, permeabilizatorji in blokatorji. Primarna protitelesa, ki ciljajo na celico ali regijo, odvisno od linije. Za označevanje celic, imobiliziranih in situ na čipu, se uporabljajo markerji, sledijo pa jim sekundarna protitelesa skupaj s kontrastnim barvilom, ki cilja bodisi na jedro (npr. 4',6-diamidino-2-fenilen)indol, DAPI) bodisi na F-aktin (npr. fluorescentno označen faloidin). Slikanje v živo na osnovi fluorescence se lahko izvede tudi in situ za zaznavanje proizvodnje sluzi (slika 1, »Celična diferenciacija« in »Fiziologija črevesja«), naključne kolonizacije mikrobnih celic (slika 1, »Sokultura gostitelja in mikroba«), rekrutiranja imunskih celic (slika 1, »Modeliranje bolezni«) ali kontur 3D epitelijske morfologije (slika 3c, f in 4b, c). Pri spreminjanju črevesja na čipu za ločitev zgornje plasti od spodnje plasti mikrokanal, kot je opisano v ref. Kot je prikazano na sliki 2, je mogoče 3D epitelijska morfologija in mikrovile na apikalnem robu krtače vizualizirati s SEM (slika 3b). Izražanje Markerje diferenciacije je mogoče oceniti z izvedbo kvantitativne PCR5 ali sekvenciranja RNA posameznih celic. V tem primeru se 3D plasti epitelijskih celic, vzgojenih v črevesnih čipih ali hibridnih čipih, poberejo s tripsinizacijo in nato uporabijo za molekularno ali genetsko analizo.
a, Delovni potek za indukcijo črevesne morfogeneze v hibridnem čipu. Caco-2 in črevesni organoidi se v tem protokolu uporabljajo za demonstracijo 3D morfogeneze v hibridni čip platformi. Disociirane epitelijske celice so bile zasejane v pripravljene vložke Transwell (TW prep; glej spodnjo sliko). Ko so bile celice zasejane (sejane) in pritrjene na poliestrske membrane v vložkih Transwell, so bile vse celice gojene v statičnih pogojih (TW culture). Po 7 dneh je bil en sam vložek Transwell, ki je vseboval 2D monosloj epitelijskih celic, integriran v hibridni čip, da se uvede bazolateralni tok (Flow, BL), kar je na koncu privedlo do nastanka 3D epitelijske plasti (morfogeneza). Fazno kontrastne mikrografije, ki prikazujejo morfološke značilnosti epitelijskih celic človeških organov, pridobljenih iz ascendentnega kolona normalnega darovalca (linija C103) v vsakem eksperimentalnem koraku ali časovni točki. Sheme v zgornjih plasteh ponazarjajo eksperimentalno konfiguracijo za vsak korak. b, Hibridni čipi (leva shema) lahko vodijo do 3D morfogeneze organoidnih epitelijskih celic s konfokalnimi mikroskopskimi pogledi od zgoraj navzdol, posnetimi pri različnih Položaji Z (zgornji, srednji in spodnji; glej desno shemo in ustrezne pikčaste črte). so pokazali očitne morfološke značilnosti. F-aktin (cijan), jedro (sivo).c, Fluorescenčne konfokalne mikrografije (3D kotni pogled) epitelijskih celic, pridobljenih iz organoidov, gojenih v statičnem Transwellu (TW; vložek znotraj belega pikčastega okvirja) v primerjavi s hibridnim čipom (največji celoten posnetek), ki primerjajo 2D in 3D morfologijo. Par 2D navpičnih prečnih prerezov (vložek v zgornjem desnem kotu; "XZ") prav tako prikazuje 2D in 3D značilnosti. Merilo, 100 µm.c Ponatisnjeno z dovoljenjem reference.4. Elsevier.
Kontrole lahko pripravimo z gojenjem istih celic (Caco-2 ali črevesnih organoidnih epitelijskih celic) v dvodimenzionalne monosloje pod običajnimi statičnimi pogoji gojenja. Pomembno je omeniti, da lahko zaradi omejene prostornine mikrokanalov (tj. ~4 µL v zgornjem kanalu na originalni zasnovi črevesnega čipa) pride do izčrpavanja hranil. Zato je mogoče primerjati tudi morfologijo epitelija pred in po uporabi bazolateralnega pretoka.
Postopek mehke litografije je treba izvajati v čisti sobi. Za vsako plast na čipu (zgornjo in spodnjo plast ter membrane) in hibridnih čipih so bile uporabljene različne fotomaske, izdelane na ločenih silicijevih rezinah, ker so bile višine mikrokanalov različne. Ciljne višine zgornjih in spodnjih mikrokanalov črevesja na čipu so 500 µm oziroma 200 µm. Ciljna višina kanala hibridnega čipa je 200 µm.
7,6 cm veliko silicijevo rezino postavite v posodo z acetonom. Ploščo nežno vrtite 30 sekund, nato jo posušite na zraku. Rezino prenesite na ploščo z IPA in jo nato vrtite 30 sekund, da se očisti.
Za maksimiranje odstranitve organskih ostankov s površine silicijeve rezine se lahko po izbiri uporabi raztopina piranj (mešanica vodikovega peroksida in koncentrirane žveplove kisline, 1:3 (vol/vol)).
Raztopina Piranha je izjemno korozivna in ustvarja toploto. Potrebni so dodatni varnostni ukrepi. Za odstranjevanje odpadkov pustite, da se raztopina ohladi, in jo prelijte v čisto, suho posodo za odpadke. Uporabite sekundarne posode in ustrezno označite posode za odpadke. Za podrobnejše postopke upoštevajte varnostne smernice ustanove.
Oblate dehidrirajte tako, da jih za 10 minut postavite na vročo ploščo pri 200 °C. Po dehidraciji smo oblatno petkrat pretresli na zraku, da se ohladi.
Na sredino očiščene silicijeve rezine nalijte ~10 g fotorezista SU-8 2100. S pinceto enakomerno porazdelite fotorezist po rezini. Občasno rezino postavite na vročo ploščo s temperaturo 65 °C, da bo fotorezist manj lepljiv in ga boste lažje razmazali. Rezine ne postavljajte neposredno na vročo ploščo.
SU-8 je bil enakomerno porazdeljen po rezini z uporabo centrifugacijskega nanašanja. Programirajte vhodno vrtenje SU-8 za 5–10 sekund, da se širi s 500 vrt/min in pospeškom 100 vrt/min/s. Nastavite glavno vrtenje za vzorčenje debeline 200 µm pri 1500 vrt/min ali dosezite debelino 250 µm (z višino 500 µm za zgornjo plast črevesja na čipu; glejte »Kritični koraki« spodaj) in nastavite pospešek 300 vrt/min/s 30 sekund pri 1200 vrt/min.
Glavno hitrost vrtenja je mogoče prilagoditi glede na ciljno debelino vzorca SU-8 na silicijevem rezincu.
Za izdelavo vzorcev SU-8 višine 500 µm za zgornjo plast črevesja na čipu sta bila koraka centrifugiranja in mehkega pečenja te škatle (koraka 7 in 8) zaporedno ponovljena (glej korak 9), da sta nastali dve plasti SU-8 debeline 250 µm, ki ju je mogoče nanesti in združiti z UV-izpostavljanjem v 12. koraku te škatle, s čimer je nastala plast višine 500 µm.
Oblate, prevlečene s SU-8, nežno specite tako, da jih previdno položite na vročo ploščo pri 65 °C za 5 minut, nato nastavitev preklopite na 95 °C in inkubirajte še dodatnih 40 minut.
Za dosego višine vzorca SU-8 500 μm v zgornjem mikrokanalu ponovite koraka 7 in 8, da ustvarite dve plasti SU-8 debeline 250 μm.
Z uporabo naprave za poravnavo UV maske izvedite preizkus svetilke v skladu z navodili proizvajalca, da izračunate čas osvetlitve rezine. (čas osvetlitve, ms) = (doza osvetlitve, mJ/cm2) / (moč svetilke, mW/cm2).
Po določitvi časa osvetlitve namestite fotomasko na držalo maske na napravi za poravnavanje UV maske in jo namestite na rezino, prevlečeno s SU-8.
Natisnjeno površino fotomaske namestite neposredno na stran silicijeve rezine, prevlečeno s SU-8, da zmanjšate UV-disperzijo.
Rezino in fotomasko, prevlečeno s SU-8, navpično izpostavite UV-svetlobi s 260 mJ/cm2 za vnaprej določen čas osvetlitve (glejte 10. korak v tem okvirju).
Po izpostavitvi UV-žarkom so bile silicijeve rezine, prevlečene s SU-8, pečene pri 65 °C 5 minut in 95 °C 15 minut na vsaki vroči plošči, da so bili izdelani vzorci z višino 200 μm. Čas peke pri 95 °C je bil podaljšan na 30 minut, da so bili izdelani vzorci z višino 500 µm.
Razvijalec se vlije v stekleno posodo, pečena rezina pa se postavi v posodo. Količina razvijalca SU-8 se lahko razlikuje glede na velikost steklene plošče. Pazite, da uporabite dovolj razvijalca SU-8, da popolnoma odstranite neizpostavljeni SU-8. Na primer, če uporabljate stekleno posodo s premerom 150 mm in prostornino 1 l, uporabite ~300 ml razvijalca SU-8. Kalup razvijajte 25 minut z občasnim rahlim vrtenjem.
Razviti kalup sperite s ~10 ml svežega razvijalca, nato pa z IPA popršite raztopino s pipeto.
Rezino postavite v plazemski čistilec in jo 1,5 minute izpostavite kisikovi plazmi (atmosferski plin, ciljni tlak 1 × 10−5 Torr, moč 125 W).
Rezino postavite v vakuumski eksikator s steklenim stekelcem v notranjosti. Rezine in stekelca lahko postavite drug ob drugega. Če je vakuumski eksikator razdeljen na več plasti s ploščo, postavite stekelca v spodnjo komoro, rezine pa v zgornjo komoro. Na stekleno stekelce kanite 100 μL raztopine trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktil)silana in uporabite vakuum za silanizacijo.
Vialo z zamrznjenimi celicami Caco-2 odtajajte v vodni kopeli s temperaturo 37 °C, nato pa odtajane celice prenesite v bučko T75, ki vsebuje 15 ml gojišča Caco-2, predhodno segretega na 37 °C.
Za pasiranje celic Caco-2 pri ~90 % konfluentnosti najprej segrejte medij Caco-2, PBS in 0,25 % tripsina/1 mM EDTA v vodni kopeli pri 37 °C.
Gojišče posesajte z vakuumsko aspiracijo. Celice dvakrat sperite s 5 ml toplega PBS tako, da ponovite vakuumsko aspiracijo in dodate svež PBS.