Ẹ ṣeun fún ṣíbẹ̀wò sí Nature.com. Ẹ̀yà ẹ̀rọ ìṣàwárí tí ẹ ń lò ní àtìlẹ́yìn díẹ̀ fún CSS. Fún ìrírí tí ó dára jùlọ, a gbà yín nímọ̀ràn pé kí ẹ lo ẹ̀rọ ìṣàwárí tí a ti mú gbóná (tàbí kí ẹ pa ipò ìbáramu nínú Internet Explorer). Ní àkókò yìí, láti rí i dájú pé a ń tẹ̀síwájú láti ṣe àtìlẹ́yìn, a ó máa fi ojú-ọ̀nà náà hàn láìsí àwọn àṣà àti JavaScript.
Ìṣẹ̀dá ìfun ènìyàn ń fi àwọn ànímọ́ crypt-villus ti microarchitecture epithelial 3D àti ìṣètò ààyè hàn. Ìṣẹ̀dá aláìlẹ́gbẹ́ yìí ṣe pàtàkì láti mú kí ìfun dúró nípa dídáàbòbò ibi tí ó wà nínú ìṣẹ̀dá ìpìlẹ̀ basal kúrò nínú àwọn antigens microbial exogenous àti àwọn metabolites wọn. Ní àfikún, ìfun inú àti ìtújáde mucus ní àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial tí ó yàtọ̀ síra pẹ̀lú ìdènà ààbò lórí ojú mucosal ìfun. Nítorí náà, ṣíṣe àtúnṣe àwọn ètò epithelial 3D ṣe pàtàkì fún ìkọ́lé àwọn àpẹẹrẹ ìfun in vitro. Lóòótọ́, ìṣẹ̀dá ìfun in vitro organic le fa ìṣẹ̀dá ìfun 3D láìròtẹ́lẹ̀ ti epithelium ìfun pẹ̀lú àwọn iṣẹ́ ìṣègùn tí ó dára síi àti biomechanics. Níbí, a pèsè ìlànà àtúnṣe láti fa ìṣẹ̀dá ìfun nínú ikùn lágbára lórí ìfúnpọ̀ microfluidic àti nínú ìfúnpọ̀ hybrid Transwell. A ṣe àpèjúwe àwọn ọ̀nà kíkún fún ṣíṣe ẹ̀rọ, ṣíṣe àgbékalẹ̀ àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial Caco-2 tàbí ìfun organoid ní àwọn ètò ìbílẹ̀ àti lórí ìpìlẹ̀ microfluidic, ṣíṣe àgbékalẹ̀ morphogenesis 3D, àti ìṣàfihàn 3D tí a ti fi ìdí múlẹ̀. epithelia nípa lílo ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ọ̀nà àwòrán. Ìlànà yìí ń ṣe àtúnṣe ìṣàn microarchitecture ti ikùn nípa ṣíṣàkóso ìṣàn omi basolateral fún ọjọ́ 5. Ọ̀nà in vitro morphogenesis wa lo ìdààmú shear àti ìṣípo ẹ̀rọ tí ó yẹ fún ara, kò sì nílò ìmọ̀ ẹ̀rọ sẹ́ẹ̀lì tàbí ìṣàtúnṣe, èyí tí ó lè ṣe àṣeyọrí àwọn ọ̀nà míràn tí ó wà tẹ́lẹ̀. A fojú inú wò pé ìlànà tí a dábàá wa lè ní àwọn ìtumọ̀ gbígbòòrò fún àwùjọ ìwádìí biomedical, tí ó ń pèsè ọ̀nà láti tún àwọn fẹlẹfẹlẹ epithelial ìfun 3D ṣe ní vitro fún àwọn ohun èlò biomedical, ìṣègùn, àti oògùn.
Àwọn àyẹ̀wò fihàn pé àwọn sẹ́ẹ̀lì Caco-2 ti inú ìfun tí a gbìn sínú ikùn-on-a-chip1,2,3,4,5 tàbí àwọn ẹ̀rọ microfluidic bilayer6,7 lè fara da morphogenesis 3D láìsí òye kedere nípa ìlànà ìpìlẹ̀. Nínú ìwádìí wa láìpẹ́ yìí, a rí i pé yíyọ àwọn antagonists morphogen tí a tú jáde láti inú àwọn ẹ̀rọ àṣà jẹ́ pàtàkì ó sì tó láti fa morphogenesis epithelial 3D nínú vitro, èyí tí Caco-2 àti àwọn organoids ìfun tí a ti mú láti ọ̀dọ̀ aláìsàn ti fihàn. A ti fi idi awọn sẹẹli epithelial mulẹ. Ninu iwadi yii, a dojukọ pataki lori iṣelọpọ sẹẹli ati pinpin ifọkansi ti alatako Wnt ti o lagbara, Dickkopf-1 (DKK-1), ninu gut-on-a-chip ati awọn ẹrọ microfluidic ti a yipada ti o ni awọn ifibọ Transwell, ti a pe ni "Idapọpọ Adapọ". A fihan pe afikun awọn alatako Wnt exogenous (bii DKK-1, Wnt repressor 1, amuaradagba ti o ni ibatan frizzled 1, tabi Soggy-1) si ikun on-chip n ṣe idiwọ morphogenesis tabi da ipele epithelial 3D ti a ti ṣeto tẹlẹ, ni imọran pe wahala alatako lakoko asa jẹ lodidi fun morphogenesis inu inu ni vitro. Nitorinaa, ọna ti o wulo lati ṣaṣeyọri morphogenesis ti o lagbara ni wiwo epithelial ni lati yọkuro tabi ṣetọju awọn ipele ti awọn alatako Wnt ni apakan basolateral nipasẹ fifọ ti nṣiṣe lọwọ (fun apẹẹrẹ, ninu awọn iru ẹrọ gut-on-a-chip tabi hybrid-on-a-chip) tabi itankale .Basolateral media (fun apẹẹrẹ, lati awọn ifibọ Transwell sinu awọn ibi ipamọ basolateral nla ninu awọn kanga).
Nínú ìlànà yìí, a pèsè ọ̀nà tó kún fún ṣíṣe àwọn microdevices inú-on-a-chip àti Transwell-insertable hybrid chips (igbesẹ̀ 1-5) sí culture intestinal cells lórí polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membranes (igbesẹ̀ 6A, 7A, 8, 9) tàbí polyester membranes ti Transwell inserts (igbesẹ̀ 6B, 7B, 8, 9) àti increased 3D morphogenesis in vitro (igbesẹ̀ 10). A tún ṣàwárí àwọn ẹ̀yà ara cellular àti molikula tí ó ń fihàn histogenesis pàtó ti àsopọ àti ìyàtọ̀ cellular tí ó sinmi lórí ìlà nípa lílo ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwòrán (igbesẹ̀ 11-24). A ń fa morphogenesis nípa lílo àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial inú ènìyàn, bíi Caco-2 tàbí intestinal organoids, ní àwọn ọ̀nà àṣà méjì pẹ̀lú àwọn àlàyé ìmọ̀-ẹ̀rọ pẹ̀lú ìyípadà ojú ilẹ̀ ti àwọn porous membranes, ìṣẹ̀dá àwọn monolayers 2D, àti intestinal biochemical àti Àtúnṣe ti biomechanical microenvironment.in vitro. Láti fa 3D morphogenesis láti inú àwọn monolayers epithelial 2D, a yọ kúrò Àwọn apànìyàn morphogen ní àwọn ìrísí méjèèjì tí a ti ṣẹ̀dá nípa ṣíṣàn àárín sínú apá basolateral ti àṣà náà. Níkẹyìn, a pèsè àfihàn àǹfààní ti ìpele epithelial 3D tí a lè tún ṣe tí a lè lò láti ṣe àpẹẹrẹ ìdàgbàsókè epithelial tí ó gbára lé morphogen, àwọn àjọ-àjọṣepọ̀ host-microbiome longitudinal, àkóràn pathogen, ìpalára ìgbóná ara, àìṣiṣẹ́ ìdènà epithelial, àti àwọn ìtọ́jú tí ó dá lórí probiotic Example.influences.
Ilana wa le wulo fun ọpọlọpọ awọn onimọ-jinlẹ ni ipilẹ (fun apẹẹrẹ, isedale inu ikun, isedale sẹẹli stem, ati isedale idagbasoke) ati iwadii ti a lo (fun apẹẹrẹ, idanwo oogun ṣaaju iṣegun, awoṣe arun, imọ-ẹrọ tissue, ati gastroenterology) ipa gbooro. Nitori iyipada ati agbara ti ilana wa lati fa morphogenesis 3D ti epithelium inu in vitro, a fojuinu pe a le tan ọgbọn imọ-ẹrọ wa kaakiri si awọn olugbọ ti n kẹkọọ awọn agbara ti ifihan sẹẹli lakoko idagbasoke inu, isọdọtun tabi homeostasis. Ni afikun, ilana wa wulo fun wiwa ikolu labẹ awọn aṣoju àkóràn oriṣiriṣi bii Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 tabi Vibrio cholerae. Àwọn olùwòran nípa àrùn àti ìṣẹ̀dá àrùn náà tún wúlò. Lílo ètò ìṣiṣẹ́ ìṣàpẹẹrẹ inú ikùn lórí chip lè gba àṣà ìbílẹ̀ gígùn 10 àti àyẹ̀wò lẹ́yìn náà ti ààbò ogun, àwọn ìdáhùn àjẹ́mọ́ ara àti àtúnṣe ìpalára tí ó ní í ṣe pẹ̀lú àrùn nínú ọ̀nà ìfun (GI) 11. Àwọn àrùn GI mìíràn tí ó ní í ṣe pẹ̀lú àrùn ìfun jíjó, àrùn celiac, àrùn Crohn, ulcerative colitis, pouchitis, tàbí àrùn ìfun rírora ni a lè ṣe àfarawé nígbà tí a bá pèsè àwọn fẹlẹfẹlẹ epithelial ìfun 3D nípa lílo àwọn fẹlẹfẹlẹ epithelial ìfun 3D ti aláìsàn, àwọn àrùn wọ̀nyí ní àìlera villous, crypt shortening, ìbàjẹ́ mucosal, tàbí ìdènà epithelial tí ó ní ìbàjẹ́. Biopsy tàbí stem cell-derived intestinal organoids12,13. Láti ṣe àwòkọ́ṣe àyíká àrùn náà dáadáa, àwọn òǹkàwé lè ronú nípa fífi àwọn irú sẹ́ẹ̀lì tí ó bá àrùn mu, gẹ́gẹ́ bí àwọn sẹ́ẹ̀lì mononuclear blood peripheral patient blood cells (PBMCs), sí àwọn àpẹẹrẹ tí ó ní microarchitectures ìfun 3D. àwọn sẹ́ẹ̀lì àjẹ́mọ́ ara pàtó, 5.
Níwọ́n ìgbà tí a lè túnṣe àgbékalẹ̀ epithelial 3D láìsí ìlànà ìpínyà, àwọn olùwòran tí wọ́n ń ṣiṣẹ́ lórí transcriptomics spatiomics àti àwòrán gíga tàbí gíga-resolution le ní ìfẹ́ sí àwòrán wa ti spatiotemporal dynamics ti àwọn jiini àti àwọn protein lórí epithelial niches. Ní ìfẹ́ sí ìmọ̀-ẹ̀rọ. Ìdáhùn sí àwọn microbiome tàbí immune stimuli. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 tí ó ń ṣàtúnṣe homeostasis ikùn le fìdí múlẹ̀ nínú ìpele mucosal intestinal 3D nípa ṣíṣe àgbékalẹ̀ onírúurú microbial species, microbial communities tàbí fecal microbiota, pàápàá jùlọ nínú gut-on-a-chip. Nínú pẹpẹ náà. Ọ̀nà yìí fani mọ́ra gan-an fún àwọn olùgbọ́ tí wọ́n ń kẹ́kọ̀ọ́ nípa ìjẹ́mọ́ ara mucosal, gastroenterology, human microbiome, culturomics àti clinical microbiology tí wọ́n ń wá láti gbin microbiota ikùn tí a kò tíì gbó tẹ́lẹ̀ nínú yàrá ìwádìí. Tí a bá lè ṣe àtúnṣe ìlànà morphogenesis in vitro wa sí àwọn ìrísí àṣà tí a lè yípadà, bí àwọn ohun èlò tí a fi sínú multiwell nínú àwọn àwo 24, 96 tàbí 384 tí ó ń tún àwọn ibi ìṣàn basolateral ṣe nígbà gbogbo, a tún lè pín ìlànà náà sí àwọn tí ń ṣe àgbékalẹ̀ oògùn, biomedical tàbí àwọn ìṣàyẹ̀wò gíga tàbí àwọn ìpìlẹ̀ ìfọwọ́sowọ́pọ̀ fún ilé iṣẹ́ oúnjẹ. Gẹ́gẹ́ bí ẹ̀rí ìlànà, a ṣẹ̀ṣẹ̀ fi hàn pé ó ṣeé ṣe fún ètò morphogenesis gíga multiplex tí a lè yípadà sí ìrísí àwo 24. Ní àfikún, a ti ṣe ìpolówó ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ọjà organ-on-a-chip 16, 17, 18. Nítorí náà, ìfìdí múlẹ̀ ọ̀nà morphogenesis in vitro wa lè yára kí ó sì ṣeé ṣe kí ọ̀pọ̀ ilé iṣẹ́ ìwádìí, ilé iṣẹ́ tàbí ìjọba àti àwọn ilé iṣẹ́ ìlànà gba láti lóye àtúnṣe sẹ́ẹ̀lì ti in vitro in vitro in transcriptomic láti dán àwọn oògùn tàbí biotherapeutics wò. àti ìrìnàjò àwọn olóògùn ni a ṣe àyẹ̀wò nípa lílo àwọn ohun èlò ìtọ́jú 3D tàbí lílo àwọn àpẹẹrẹ organ-on-a-chip àṣà tàbí ti ìṣòwò láti ṣe àyẹ̀wò bí ìyípadà ti ilana ìṣàpẹẹrẹ ìfun ṣe lè wáyé.
Àwọn àpẹẹrẹ àyẹ̀wò díẹ̀ tí ó bá ènìyàn mu ni a ti lò láti ṣe ìwádìí nípa ìṣẹ̀dá epithelial inú, pàápàá jùlọ nítorí àìsí àwọn ìlànà tí a lè lò láti fa ìṣẹ̀dá 3D nínú vitro. Ní gidi, ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìmọ̀ lọ́wọ́lọ́wọ́ nípa ìṣẹ̀dá ikùn dá lórí àwọn ìwádìí ẹranko (fún àpẹẹrẹ, zebrafish20, eku21 tàbí adie22). Síbẹ̀síbẹ̀, wọ́n jẹ́ iṣẹ́ àti owó tí ó gba àkókò, wọ́n lè jẹ́ ìbéèrè nípa ìwà rere, àti èyí tí ó ṣe pàtàkì jùlọ, wọn kò pinnu àwọn ìlànà ìdàgbàsókè ènìyàn ní pàtó. Àwọn àpẹẹrẹ wọ̀nyí tún ní ààlà púpọ̀ nínú agbára wọn láti ṣe ìdánwò ní ọ̀nà tí ó ní ọ̀pọ̀lọpọ̀ ọ̀nà tí ó lè yípadà. Nítorí náà, ìlànà wa fún àtúnṣe àwọn ètò àsopọ 3D nínú vitro dára ju àwọn àpẹẹrẹ ẹranko lọ ní vivo àti àwọn àpẹẹrẹ àṣà ìṣẹ̀dá sẹ́ẹ̀lì 2D mìíràn. Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀, lílo àwọn ètò epithelial 3D jẹ́ kí a ṣàyẹ̀wò ibi tí àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó yàtọ̀ síra wà nínú axis crypt-villus ní ìdáhùn sí onírúurú ìdàgbàsókè mucosal tàbí immune stimulus. Àwọn fẹlẹfẹlẹ epithelial 3D lè pèsè ààyè láti kẹ́kọ̀ọ́ bí àwọn sẹ́ẹ̀lì microbial ṣe ń díje láti ṣẹ̀dá àwọn ibi tí ó ní ààyè àti ìdàgbàsókè àyíká ní ìdáhùn sí àwọn ohun tí ó níí ṣe pẹ̀lú àwọn ohun tí ó níí ṣe pẹ̀lú ìṣẹ̀dá (fún àpẹẹrẹ, àwọn fẹlẹfẹlẹ mucus inú tàbí ti òde, ìtújáde IgA àti Àwọn peptides antimicrobial). Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ìrísí epithelial 3D lè jẹ́ kí a lóye bí microbiota inú ṣe ń ṣètò àwọn agbègbè rẹ̀ àti bí ó ṣe ń ṣe àwọn metabolites microbial (fún àpẹẹrẹ, àwọn acids ọrá onígun kúkúrú) tí ó ń ṣe àgbékalẹ̀ ìṣètò sẹ́ẹ̀lì àti àwọn ibi tí ó wà nínú àwọn ìkọ̀kọ̀ basal. Àwọn ànímọ́ wọ̀nyí ni a lè fihàn nígbà tí a bá fi àwọn fẹlẹfẹlẹ epithelial 3D múlẹ̀ nínú vitro.
Ní àfikún sí ọ̀nà wa láti ṣẹ̀dá àwọn ẹ̀yà epithelial ìfun 3D, ọ̀pọ̀lọpọ̀ ọ̀nà in vitro ló wà. Àṣà ìfun organoid jẹ́ ọ̀nà ìmọ̀ ẹ̀rọ àsopọ̀ ìgbàlódé tí ó dá lórí gbígbin àwọn sẹ́ẹ̀lì ìfun lábẹ́ àwọn ipò morphogen pàtó23,24,25. Síbẹ̀síbẹ̀, lílo àwọn àpẹẹrẹ organoid 3D fún ìwádìí ìrìnnà tàbí àwọn àjọ-microbiome host-microbiome sábà máa ń ṣòro nítorí pé lumen ìfun wà nínú organoid, nítorí náà, ìfìhàn àwọn èròjà luminal bíi àwọn sẹ́ẹ̀lì microbial tàbí àwọn antigens exogenous ní ààlà. A lè mú kí lílo microinjector sunwọ̀n síi, ṣùgbọ́n ọ̀nà yìí jẹ́ èyí tí ó ń gbajúmọ̀ tí ó sì gba agbára púpọ̀, ó sì nílò ìmọ̀ pàtàkì láti ṣe. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, àwọn àṣà ìbílẹ̀ organoid tí a ń tọ́jú nínú àwọn hydrogel scaffolds lábẹ́ àwọn ipò tí kò dúró ṣinṣin kò ṣe àfihàn bíóménékáníìkì tí ń ṣiṣẹ́ nínú vivo dáadáa.
Àwọn ọ̀nà míì tí ọ̀pọ̀ àwọn ẹgbẹ́ ìwádìí ń lò lo àwọn ìkọ́lé hydrogel 3D tí a ti ṣètò tẹ́lẹ̀ láti fara wé ìkọ́lé epithelial inú nípa ṣíṣe àwọn sẹ́ẹ̀lì ìfun ènìyàn tí a yà sọ́tọ̀ lórí ojú gel. Ṣe àwọn ìkọ́lé hydrogel nípa lílo àwọn ìkọ́lé tí a tẹ̀ jáde 3D, micro-milled, tàbí lithographically. Ọ̀nà yìí fi ìṣètò ara ẹni hàn ti àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial tí a yà sọ́tọ̀ in vitro pẹ̀lú àwọn ìpele morphogen tí ó yẹ fún ìṣiṣẹ́ ara, tí ó ń fi ìpele epithelial tí ó ga hàn àti stroma-epithelial crosstalk nípa fífi àwọn sẹ́ẹ̀lì stromal kún ìkọ́lé náà. Síbẹ̀síbẹ̀, ìrísí àwọn ìkọ́lé tí a ti ṣètò tẹ́lẹ̀ lè dènà ìfihàn ìṣiṣẹ́ morphogenetic fúnrarẹ̀. Àwọn àwòṣe wọ̀nyí kò tún pèsè ìṣàn ìmọ́lẹ̀ tàbí ìṣàn àárín, láìní ìdààmú ìfọ́ omi tí àwọn sẹ́ẹ̀lì ìfun nílò láti fara da morphogenesis kí wọ́n sì jèrè iṣẹ́ ti ara. Ìwádìí tuntun mìíràn lo àwọn ìkọ́lé hydrogel nínú ìpele microfluidic àti àwọn ìpele epithelial ìfun tí a ṣe àpẹẹrẹ nípa lílo àwọn ọ̀nà ìkọ́lé laser. Àwọn ìkọ́lé intestinal mouse tẹ̀lé àwọn àpẹẹrẹ tí a ti gé láti ṣẹ̀dá àwọn ìpele tubular ìfun, àti pé a lè tún ṣàtúnṣe ìṣàn omi inú intraluminal nípa lílo module microfluidics. Síbẹ̀síbẹ̀, àwòṣe yìí kò fi hàn Àwọn ìlànà ìṣẹ̀dá ara aláìlera tàbí àwọn ìṣípo onímọ̀ nípa ìfun. Àwọn ọ̀nà ìtẹ̀wé 3D láti inú ẹgbẹ́ kan náà ni wọ́n lè ṣẹ̀dá àwọn ọ̀nà ìfun kékeré pẹ̀lú àwọn ọ̀nà ìṣẹ̀dá ara aláìlera. Láìka ìṣẹ̀dá onírúurú ẹ̀yà ìfun tó yàtọ̀ síra nínú ọ̀nà ìfun sí, àpẹẹrẹ yìí kò ní ìṣàn omi ìmọ́lẹ̀ àti ìyípadà ẹ̀rọ. Ní àfikún, iṣẹ́ àwòṣe lè ní ààlà, pàápàá jùlọ lẹ́yìn tí ìlànà ìtẹ̀wé bá ti parí, tí ó ń da àwọn ipò ìwádìí tàbí ìbáṣepọ̀ sẹ́ẹ̀lì sí sẹ́ẹ̀lì rú. Dípò bẹ́ẹ̀, ìlànà tí a dámọ̀ràn fún wa ń pèsè ìṣẹ̀dá ara aláìlera, ìdààmú ìṣẹ́dá ara tí ó bá ara mu, àwọn ọ̀nà ìṣiṣẹ́ ara tí ó fara wé ìṣiṣẹ́ ara, wíwọlé sí àwọn ìpín apical àti basolateral aláìlágbára, àti àtúndá àwọn àyíká onímọ̀ nípa ìṣẹ̀dá ara aláìlera ti modularity. Nítorí náà, ìlànà ìṣẹ̀dá ara aláìlera 3D wa nínú vitro lè pèsè ọ̀nà àfikún láti borí àwọn ìpèníjà àwọn ọ̀nà tó wà.
Ilana wa dojukọ patapata lori morphogenesis epithelial 3D, pẹlu awọn sẹẹli epithelial nikan ni asa ati pe ko si awọn iru awọn sẹẹli miiran ti o wa ni ayika bi awọn sẹẹli mesenchymal, awọn sẹẹli endothelial, ati awọn sẹẹli ajẹsara. Gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ, ipilẹ ilana wa ni fifasi morphogenesis epithelial nipa yiyọkuro awọn inhibitors morphogen ti a tu silẹ ni apa basolateral ti alabọde ti a ṣafihan. Lakoko ti modularity ti o lagbara ti gut-on-a-chip ati hybrid-on-a-chip wa gba wa laaye lati tun ṣe fẹlẹfẹlẹ epithelial 3D ti o wa ni undolating, awọn idiju ti ara afikun gẹgẹbi awọn ibaraẹnisọrọ epithelial-mesenchymal33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition 35 ati, ninu awoṣe wa, awọn ẹya crypt-villus ti o gbe awọn niche sẹẹli stem ni awọn crypts basal wa ni a ko gbọdọ gbero siwaju sii. Awọn sẹẹli Stromal (fun apẹẹrẹ, fibroblasts) ninu mesenchyme ṣe ipa pataki ninu iṣelọpọ awọn ọlọjẹ ECM ati ilana ti morphogenesis inu inu ni vivo35,37,38. Afikun awọn sẹẹli mesenchymal si awoṣe wa mu ilana morphogenetic ati isopọ sẹẹli pọ si Ìṣiṣẹ́. Ìpele endothelial (ìyẹn ni, capillaries tàbí lymphatics) ń kó ipa pàtàkì nínú ṣíṣàkóso ìrìn àjò molikula39 àti ìgbàsílẹ̀ sẹ́ẹ̀lì ajẹsara40 nínú àyíká ikùn. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, àwọn ẹ̀yà ara tí a lè so pọ̀ láàárín àwọn àpẹẹrẹ àsopọ jẹ́ ohun pàtàkì nígbà tí a bá ṣe àwọn àpẹẹrẹ àsopọ láti fi ìbáṣepọ̀ onírúurú ẹ̀yà ara hàn. Nítorí náà, àwọn sẹ́ẹ̀lì endothelial lè nílò láti fi àwọn ànímọ́ ara tí ó péye síi hàn pẹ̀lú ìpinnu ipele ẹ̀yà ara. Àwọn sẹ́ẹ̀lì ajẹsara tí a ti rí láti ọ̀dọ̀ aláìsàn tún ṣe pàtàkì fún fífi àwọn ìdáhùn àjẹsára àjẹsára hàn, ìfihàn antigen, ìdàpọ̀ àjẹsára àjẹsára àjẹsára àjẹsára àjẹsára àjẹsára àjẹsára àjẹsára àjẹsára ní ìbámu pẹ̀lú àrùn ìfun.
Lílo àwọn ègé aláwọ̀ ara jẹ́ ohun tó rọrùn ju ìfun-lórí-ẹ̀rọ lọ nítorí pé ìṣètò ẹ̀rọ náà rọrùn, lílo àwọn ègé aláwọ̀ ara Transwell sì ń jẹ́ kí a lè ṣe àgbékalẹ̀ epithelium inú ikùn. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn ègé aláwọ̀ ara Transwell tó wà ní ọjà pẹ̀lú àwọn ègé aláwọ̀ ara polyester kò ní ìrọ̀rùn, wọn kò sì lè ṣe àfarawé àwọn ìṣípo bíi peristaltic. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ègé aláwọ̀ ara Transwell tó wà nínú ègé aláwọ̀ ara náà kò dúró ṣinṣin láìsí ìdààmú ìfọ́ lórí ègé aláwọ̀ ara. Dájúdájú, àwọn ohun ìní tó dúró ṣinṣin nínú ègé aláwọ̀ ara kò sábà mú kí bakitéríà máa bá ara wọn ṣiṣẹ́ pọ̀ nínú ègé aláwọ̀ ara. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a lè fa morphogenesis 3D nínú àwọn ègé aláwọ̀ ara Transwell nígbà tí a bá ń lo ègé aláwọ̀ ara, àìtó àwọn ègé aláwọ̀ ara àti ìṣàn omi apical lè dín agbára ìṣe àwọn ègé aláwọ̀ ara pọ̀ kù fún àwọn ohun èlò tó ṣeé ṣe.
Àwọn àtúnṣe pípé ti agbékalẹ̀ crypt-villus ti ènìyàn nínú àwọn àṣà gut-on-a-chip àti hybrid-on-a-chip kò tí ì fìdí múlẹ̀ pátápátá. Níwọ́n ìgbà tí morphogenesis bẹ̀rẹ̀ láti inú epithelial monolayer kan, àwọn microarchitectures 3D kò ṣe dandan fún ìfarajọra morphological pẹ̀lú àwọn crypts ní vivo. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé a ṣe àfihàn iye àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ń pọ̀ sí i nítòsí agbègbè basal crypt nínú microengineered 3D epithelium, a kò ṣe àfihàn àwọn agbègbè crypt àti villous kedere. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn ikanni òkè gíga lórí chip náà mú kí gíga epithelium microengineered pọ̀ sí i, gíga tí ó pọ̀ jùlọ ṣì wà ní ìwọ̀n ~300–400 µm. Jíjìn gidi ti crypts ìfun ènìyàn nínú ìfun kékeré àti ńlá jẹ́ ~135 µm àti ~400 µm, lẹ́sẹẹsẹ, gíga villi ìfun kékeré sì jẹ́ ~600 µm41.
Láti ojú ìwòye àwòrán, àwòrán onípele-ìpele 3D tí ó ní ìpele gíga lè wà ní ìsàlẹ̀ sí ikùn lórí ìṣẹ́po kan, nítorí pé ìjìnnà iṣẹ́ tí a nílò láti lẹ́ńsì àfojúsùn sí ìṣẹ́po epithelial jẹ́ ní ìwọ̀n mítà díẹ̀. Láti borí ìṣòro yìí, a lè nílò ohun tí ó jìnnà. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ṣíṣe àwọn apá tín-ín-rín fún ìpèsè àpẹẹrẹ àwòrán jẹ́ ìpèníjà nítorí pé lílágbára gíga ti PDMS. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, níwọ̀n ìgbà tí ìṣẹ́po-lẹ́sẹẹsẹ ti ìfun lórí ìṣẹ́po kan ní ìsopọ̀ títí láé láàárín ìṣẹ́po kọ̀ọ̀kan, ó ṣòro gidigidi láti ṣí tàbí yọ ìṣẹ́po òkè kúrò láti ṣàyẹ̀wò ìṣètò ojú ti ìṣẹ́po epithelial. Fún àpẹẹrẹ, nípa lílo microscope electron scanning (SEM).
Àìlera omi ara ti PDMS ti jẹ́ ìdínkù nínú àwọn ìwádìí tí ó dá lórí microfluidic tí ó ń ṣe pẹ̀lú àwọn molecule kékeré hydrophobic, nítorí pé PDMS lè fa àwọn molecule hydrophobic bẹ́ẹ̀ láìsí pàtó. A lè gbé àwọn ohun mìíràn sí PDMS yẹ̀ wò pẹ̀lú àwọn ohun èlò polymeric mìíràn. Ní ọ̀nà mìíràn, àtúnṣe ojú ilẹ̀ ti PDMS (fún àpẹẹrẹ, fífi àwọn ohun èlò lipophilic 42 tàbí poly(ethylene glycol) 43 bo) le dín ìfàmọ́ra àwọn molecule hydrophobic kù.
Níkẹyìn, ọ̀nà wa kò tíì ní àfihàn dáadáa ní ti pípèsè ìṣàyẹ̀wò gíga tàbí ìpele ìdánwò “ìwọ̀n kan-bá-gbogbo” tí ó rọrùn fún olùlò. Ìlànà ìsinsìnyìí nílò fifa syringe fún ẹ̀rọ microdevice, èyí tí ó gba ààyè nínú incubator CO2 tí ó sì ń dènà àwọn àdánwò ńlá. A lè mú ààlà yìí sunwọ̀n síi ní pàtàkì nípa lílo àwọn ọ̀nà ìṣẹ̀dá àṣà tuntun (fún àpẹẹrẹ, àwọn ìfikún oníhò 24, 96-well, tàbí 384-well porous tí ó gba àtúnṣe àti yíyọ àwọn media basolateral kúrò nígbà gbogbo).
Láti fa ìṣẹ̀dá 3D ti epithelium inu ènìyàn nínú vitro, a lo ẹ̀rọ ìfun microfluidic chip kan tí ó ní àwọn microchannels méjì tí ó jọra àti awọ ara tí ó ní ihò elastic láàárín láti ṣẹ̀dá ìsopọ̀ lumen-capillary. A tún fi lílo ẹ̀rọ microfluidic kan ṣoṣo hàn (ìṣẹ̀dá ara hybrid kan) tí ó ń pèsè ìṣàn basolateral tí ń bá a lọ lábẹ́ àwọn ìpele epithelial polarized tí a gbìn lórí àwọn ìfikún Transwell. Nínú àwọn ìpele méjèèjì, a lè fi morphogenesis ti onírúurú àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial inu ènìyàn hàn nípa lílo ìṣàtúnṣe ìṣàn láti yọ àwọn antagonists morphogen kúrò nínú ìpín basolateral. Gbogbo ìlànà ìwádìí náà (Àwòrán 1) ní àwọn apá márùn-ún: (i) microfabrication ti ikùn chip tàbí Transwell insertable hybrid chip (àwọn ìgbésẹ̀ 1-5; Àpótí 1), (ii) ìpèsè àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial inu (àwọn sẹ́ẹ̀lì Caco-2) tàbí àwọn organoids inu ènìyàn; Àpótí 2-5), (iii) àṣà ìṣẹ̀dá àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial ìfun lórí àwọn eerun ìfun tàbí àwọn eerun ìdajì (àwọn ìgbésẹ̀ 6-9), (iv) ìfàsẹ́yìn morphogenesis 3D nínú vitro (ìgbésẹ̀ 10) àti (v)) láti ṣe àpèjúwe microstructure epithelial 3D (àwọn ìgbésẹ̀ 11-24). Níkẹyìn, a ṣe àgbékalẹ̀ ẹgbẹ́ ìṣàkóso tó yẹ (tí a jíròrò síwájú sí i ní ìsàlẹ̀) láti fìdí ìṣiṣẹ́ morphogenesis in vitro múlẹ̀ nípa fífi epithelial morphogenesis wé àwọn ìṣàkóso ààyè, ìgbà, ipò, tàbí ìlànà.
A lo awọn iru ẹrọ asa oriṣiriṣi meji: ikun-lori-a-chip pẹlu awọn ikanni taara tabi awọn ikanni ti ko ni ila, tabi awọn eerun arabara ti o ni awọn ifibọ Transwell (TW) ninu ẹrọ microfluidic kan, ti a ṣe gẹgẹ bi a ti ṣalaye ninu Apoti 1, ati igbesẹ 1 -5. “Iṣẹda Ẹrọ” fihan awọn igbesẹ akọkọ ni ṣiṣe eerun kan tabi eerun arabara.” Asa ti Awọn sẹẹli Epithelial Inu Eniyan” ṣalaye orisun sẹẹli (Caco-2 tabi awọn organoids inu eniyan) ati ilana asa ti a lo ninu ilana yii. “Morfogenesis In vitro” fihan awọn igbesẹ gbogbogbo ninu eyiti a gbin awọn sẹẹli epithelial Caco-2 tabi awọn sẹẹli epithelial ti a gba lati inu organoid lori eerun inu tabi lori awọn ifibọ Transwell ti eerun arabara, atẹle nipa fifa morphogenesis 3D ati dida eto epithelial ti a ṣe afihan. Nọmba igbesẹ eto tabi nọmba apoti ni a fihan ni isalẹ ọfà kọọkan. Ohun elo naa pese awọn apẹẹrẹ ti bi a ṣe le lo awọn fẹlẹfẹlẹ epithelial inu ifun ti a ṣeto, fun apẹẹrẹ, ninu idanimọ iyatọ sẹẹli, awọn ẹkọ nipa eto-ara inu ikun, idasile awọn eto-aye microbiome host-microbiome, ati awoṣe arun. Awọn aworan immunofluorescence ni “Sell Ìyàtọ̀” tó ń fi àwọn nuclei, F-actin àti MUC2 hàn nínú ìpele epithelial Caco-2 3D tí a ṣẹ̀dá lórí ìpele ikùn. Ìfihàn MUC2 wà nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì goblet àti ìpara tí a tú jáde láti inú àwọn ojú ilẹ̀ mucosal. Àwọn àwòrán fluorescent nínú Gut Physiology fi ìpara tí a ṣe nípa fífi àwọ̀ síalic acid àti N-acetylglucosamine resizes nípa lílo fluorescent wheat germ agglutinin. Àwọn àwòrán méjì tí ó wọ́pọ̀ nínú “Host-Microbe Co-Cultures” fi àwọn àjọ-olùgbàlejò-microbiome hàn nínú ìfun lórí ìpele kan. Pẹpẹ òsì fi ìṣọ̀kan ti E. coli tí ń fihàn àwọ̀ ewéko fluorescent protein (GFP) pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial Caco-2 microengineered. Pẹpẹ ọ̀tún fi ibi tí GFP E. coli ti ṣẹ̀dá pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial 3D Caco-2 hàn, lẹ́yìn náà ni ìpara immunofluorescence pẹ̀lú F-actin (pupa) àti nuclei (blue). Àwòrán àrùn fi ìlera àti jíjó inú ìfun hàn nínú àwọn ìpara ìgbóná inú ìfun lábẹ́ ìpèníjà ti ara pẹ̀lú àwọn antigens bakiterial (fún àpẹẹrẹ, lipopolysaccharide, LPS) àti àwọn sẹ́ẹ̀lì àjẹ́sára (fún àpẹẹrẹ, PBMC; àwọ̀ ewé). A gbin àwọn sẹ́ẹ̀lì Caco-2 láti fi ìpele epithelial 3D múlẹ̀. Páàtì ìwọ̀n, 50 µm. Àwọn àwòrán ní ìlà ìsàlẹ̀: “Ìyàtọ̀ àwọn sẹ́ẹ̀lì” tí a ṣe pẹ̀lú àṣẹ láti ọ̀dọ̀ ìtọ́kasí.2. Oxford University Press; A tún ṣe àtúnṣe pẹ̀lú àṣẹ láti ọ̀dọ̀ Ref.5. NAS; “Olùgbàlejò-Microbe Co-Culture” tí a ṣe pẹ̀lú àṣẹ láti ọ̀dọ̀ ref.3. NAS; “Àwòrán Àrùn” tí a ṣe pẹ̀lú àṣẹ láti ọ̀dọ̀ ìtọ́kasí.5. NAS.
A ṣe àwọn ègé gut-on-chip àti hybrid chips nípa lílo àwọn àtúnṣe PDMS tí a yọ kúrò nínú àwọn mílíkọ́nì nípa líthography soft1,44 tí a sì fi SU-8 ṣe àwòrán wọn. A ṣe àwọn ègé microchannels nínú ègé kọ̀ọ̀kan nípa gbígbé àwọn hydrodynamics yẹ̀ wò gẹ́gẹ́ bí ìdààmú shear àti pressure hydrodynamic1,4,12. Apẹrẹ gut-on-a-chip àtilẹ̀wá (Àwòrán Ìdáhùn 1a), èyí tí ó ní àwọn microchannels méjì tí ó jọra, ti yípadà sí ègé gut-on-a-chip kan (Àwòrán Ìdáhùn 1b) tí ó ní méjì àwọn microchannels tí ó tẹ̀ láti fa àkókò gbígbé omi pọ̀ sí i, àwọn àpẹẹrẹ ìṣàn tí kì í ṣe linear, àti ìyípadà multiaxial ti àwọn sẹ́ẹ̀lì tí a gbin (Àwòrán 2a–f) 12. Nígbà tí ó bá yẹ kí a tún àwọn biomechanics ikùn tí ó díjú jù ṣe, a lè yan àwọn ègé gut-on-a-chips tí ó díjú. A ti fihàn pé ègé Gut-Chip tí a ti para pọ̀ tún ń fa morphogenesis 3D gidigidi ní àkókò kan náà pẹ̀lú ìwọ̀n ìdàgbàsókè epithelial kan náà ní ìfiwéra pẹ̀lú ìpilẹ̀ṣẹ̀ Ikùn-Ẹ̀rọ, láìka irú sẹ́ẹ̀lì tí a ti gbin sí. Nítorí náà, láti fa ìṣẹ̀dá 3D, àwọn àpẹẹrẹ ìfun onílà àti onípele lórí ni a lè yípadà. Àwọn àtúnṣe PDMS tí a ti tọ́jú lórí àwọn mọ́ọ̀lù silicon pẹ̀lú àwọn àpẹẹrẹ SU-8 pèsè àwọn àmì odi lẹ́yìn tí a ti wó lulẹ̀ (Àwòrán 2a). Láti ṣe ìfun lórí ìṣẹ̀dá ërún kan, a so ìpele PDMS òkè tí a ti pèsè mọ́ fíìmù PDMS oníhò ní ìtẹ̀léra, lẹ́yìn náà a so mọ́ ìpele PDMS ìsàlẹ̀ nípa lílo ìdènà tí kò ṣeé yípadà nípa lílo ohun èlò corona treatment (Àwòrán 2b–f). Láti ṣe àwọn ìpele adàpọ̀, a so àwọn àtúnṣe PDMS tí a ti tọ́jú mọ́ àwọn ìṣàn gilasi láti ṣẹ̀dá àwọn ẹ̀rọ microfluidic ikanni kan ṣoṣo tí ó lè gba àwọn ohun èlò Transwell (Àwòrán 2h àti Ìdáhùn Tí Ó Gún Sí I Àwòrán 2). A ṣe ìlànà ìdènà nípa títọ́jú àwọn ojú ilẹ̀ ti àdàpọ̀ PDMS àti gilasi pẹ̀lú plasma oxygen tàbí ìtọ́jú corona. Lẹ́yìn ìtọ́jú microfabricated ẹ̀rọ microfabricated tí a so mọ́ tube silicone, ètò ẹ̀rọ náà ti ṣetán láti ṣe ìṣẹ̀dá 3D ti epithelium ìfun (Àwòrán 2g).
a, Àwòrán àwòrán ti ìpèsè àwọn ẹ̀yà PDMS láti inú àwọn mọ́ọ̀dì silikoni tí a fi àwòrán SU-8 ṣe. A da omi PDMS tí kò tíì tọ́jú sí orí mọ́ọ̀dì silikoni (òsì), a tọ́jú rẹ̀ ní 60 °C (àárín) a sì yọ́ ọ (ọ̀tún). A gé PDMS tí a ti yọ́ ọ sí wẹ́wẹ́ a sì fọ̀ ọ́ fún lílò síwájú sí i.b, Àwòrán mọ́ọ̀dì silikoni tí a lò láti pèsè PDMS òkè.c, Àwòrán mọ́ọ̀dì silikoni tí a lò láti ṣe membrane oníhò PDMS.d, Àkójọ àwọn fọ́tò ti àwọn ẹ̀yà PDMS òkè àti ìsàlẹ̀ àti ẹ̀rọ ìfun tí a kó jọ lórí ìyẹ̀fun.e, Àwòrán ti ìtòlẹ́sẹẹsẹ àwọn ẹ̀yà PDMS òkè, membrane, àti ìsàlẹ̀. A so ìpele kọ̀ọ̀kan pọ̀ mọ́ plasma tàbí corona treatment láìyípadà.f, Àwòrán ti ẹ̀rọ gut-on-a-chip tí a ṣe pẹ̀lú àwọn microchannels onípọ̀pọ̀ àti àwọn yàrá vacuum.g, Ṣíṣeto gut-on-a-chip fún àṣà sẹ́ẹ̀lì microfluidic. A fi ìfun tí a ṣe lórí ìyẹ̀fun tí a kó jọ pẹ̀lú tube silikoni àti syringe sórí ìbòrí. A gbé ẹ̀rọ chip náà sí orí ìbòrí Àwo Petri 150 mm fún ṣíṣe. A lo ìdìpọ̀ náà láti ti ọ̀nà silicone.h, Àwọn àwòrán ìrísí ti ìṣẹ̀dá ërún aláwọ̀ ara àti morphogenesis 3D nípa lílo àwọn ërún aláwọ̀ ara. Àwọn ìfikún Transwell tí a pèsè sílẹ̀ lọ́tọ̀ọ̀tọ̀ sí ìṣẹ̀dá. A fi àwọn 2D monolayer ti àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial ìfun sínú ërún aláwọ̀ ara ara láti fa morphogenesis 3D ìfun. A fi èérún náà kún inú àwọn ikanni kékeré lábẹ́ ìpele sẹ́ẹ̀lì tí a gbé kalẹ̀ lórí àfikún Transwell. Àmì ìpele, 1 cm.h A tún tẹ̀ ẹ́ jáde pẹ̀lú àṣẹ láti ọ̀dọ̀ ìtọ́kasí.4. Elsevier.
Nínú ìlànà yìí, a lo ìlà sẹ́ẹ̀lì Caco-2 àti àwọn organoids ìfun gẹ́gẹ́ bí orísun epithelial (Àwòrán 3a). A gbin àwọn irú sẹ́ẹ̀lì méjèèjì lọ́tọ̀ọ̀tọ̀ (Àpótí 2 àti Àpótí 5) a sì lò wọ́n láti gbìn àwọn microchannels tí a fi ECM bo ti inú ìfun tàbí àwọn ohun tí a fi Transwell sínú. Nígbà tí àwọn sẹ́ẹ̀lì bá para pọ̀ (tí ó ju 95% ìbòrí nínú àwọn ìgò), a máa ń kó àwọn sẹ́ẹ̀lì Caco-2 tí a máa ń gbìn déédéé (láàrín àwọn ìpín 10 àti 50) nínú àwọn ìgò T láti pèsè àwọn ìdádúró sẹ́ẹ̀lì tí a ti pín sí wẹ́wẹ́ nípasẹ̀ omi trypsinization (àpótí 2). A gbin àwọn organoids ìfun ènìyàn láti inú biopsies ìfun tàbí àwọn ìyọkúrò iṣẹ́-abẹ ní àwọn ilé ìtọ́jú Matrigel ní àwọn àwo 24-well láti ṣe àtìlẹ́yìn fún àyíká onípele structural. Agbára tí ó ní àwọn morphogens pàtàkì (bíi Wnt, R-spondin, àti Noggin) àti àwọn ohun tí ó ń mú ìdàgbàsókè wá gẹ́gẹ́ bí a ṣe ṣàlàyé rẹ̀ nínú Àpótí 3 ni a ń fi kún gbogbo ọjọ́ kejì títí àwọn organoids yóò fi dàgbà sí ~500 µm ní ìwọ̀n ìlà. Àwọn organoids tí a ti dàgbà pátápátá ni a ń kó, a sì ń pín wọn sí wẹ́wẹ́ Àwọn sẹ́ẹ̀lì kan ṣoṣo fún ìrúgbìn sí inú ìfun tàbí àwọn ohun tí a fi sínú Transwell lórí ìṣẹ́po kan (Àpótí 5). Gẹ́gẹ́ bí a ti ròyìn tẹ́lẹ̀, a lè yà á sọ́tọ̀ gẹ́gẹ́ bí àrùn type12,13 (fún àpẹẹrẹ ulcerative colitis, àrùn Crohn, àrùn jẹjẹrẹ inú, tàbí olùfúnni déédéé), ibi tí àrùn náà ti ṣẹlẹ̀ (fún àpẹẹrẹ, ìpalára lòdì sí agbègbè tí kò ní ìpalára) àti ibi tí ìfun wà nínú ọ̀nà ìtọ̀ (fún àpẹẹrẹ, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, tàbí rectum). A pèsè ìlànà tí a ṣe àtúnṣe nínú Àpótí 5 fún ṣíṣe àwọn organoids inú ìfun (coloids) tí ó sábà máa ń nílò àwọn ìfọ́pọ̀ morphogens tí ó ga ju àwọn organoids inú ìfun kékeré lọ.
a, Iṣẹ́ fún ìfàsẹ́yìn ìṣàn ẹ̀jẹ̀ inú ìfun. A lo Caco-2 epithelium ìfun ènìyàn àti àwọn ohun ọ̀gbọ̀ inú ìfun nínú ìlànà yìí láti fi ìṣàn ẹ̀jẹ̀ 3D hàn. A gbìn àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelium tí a yà sọ́tọ̀ sínú ẹ̀rọ ìfúnpọ̀ inú tí a ti pèsè sílẹ̀ (ìpèsè ìfúnpọ̀). Nígbà tí a bá ti gbìn (ìfúnpọ̀) tí a sì so mọ́ (so mọ́) awọ ara PDMS ní ọjọ́ 0 (D0), a bẹ̀rẹ̀ sí ní ṣàtúnṣe ìṣàn ẹ̀jẹ̀ (AP) fún ọjọ́ méjì àkọ́kọ́ (ìṣàn ẹ̀jẹ̀, AP, D0-D2). A tún bẹ̀rẹ̀ ìṣàn ẹ̀jẹ̀ (BL) pẹ̀lú àwọn ìṣípo ìfàsẹ́yìn cyclic (na, ìṣàn ẹ̀jẹ̀, AP àti BL) nígbà tí a bá ṣẹ̀dá àpapọ̀ 2D kan. Ìṣàn ẹ̀jẹ̀ 3D ìfun wáyé láìròtẹ́lẹ̀ lẹ́yìn ọjọ́ márùn-ún ti àṣà microfluidic (morphogenesis, D5). Àwọn àwòrán ìyàtọ̀ ìpele fi ìṣàn ẹ̀jẹ̀ Caco-2 hàn ní ìgbésẹ̀ tàbí àkókò ìwádìí kọ̀ọ̀kan (àwòrán ọ̀pá, 100 µm). Àwọn àwòrán onípele mẹ́rin tí ó ń ṣàfihàn àwọn ìṣàn ẹ̀jẹ̀ inú tí ó báramu morphogenesis (òkè ọ̀tún). Àwọn ọfà onígun mẹ́ta nínú àwòrán náà dúró fún ìtọ́sọ́nà ìṣàn omi.b, àwòrán SEM tó ń fi ìpìlẹ̀ ojú ilẹ̀ ti epithelium Caco-2 3D tó ti wà tẹ́lẹ̀ hàn (òsì). Àwòrán tó ń fi agbègbè tó ti pọ̀ sí i hàn (àpótí funfun onígun mẹ́rin) fi microvilli tó ti tún padà hàn lórí ìpele Caco-2 3D (ọ̀tún).c, Ìwòran iwájú Caco-2 3D tó ti wà tẹ́lẹ̀, claudin (ZO-1, pupa) àti àwọn awọ ara brush tó ń tẹ̀síwájú tí wọ́n fi àmì sí F-actin (àwọ̀ ewé) àti nuclei (blúù) Immunofluorescence confocal visual ti àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial lórí àwọn ìṣù ìfun. Àwọn ọfà tó ń tọ́ka sí àwòrán àárín fi ibi tí ojú ìfọ́síwájú wà hàn fún gbogbo ìwò confocal.d, Àkókò ìyípadà morphological nínú àwọn organoids tí a gbìn sórí ìṣù kan tí a rí nípasẹ̀ phase contrast microscopy ní ọjọ́ kẹta, keje, keje, kọkànlá, àti kẹtàlá. Àwòrán (òkè ọ̀tún) fi ìtóbi gíga ti àwòrán tí a pèsè hàn.e, DIC photomicrograph ti organoid 3D epithelium tó ti wà nínú ikùn hàn lórí gé tí a yà ní ọjọ́ 7.f, Àwọn àwòrán immunofluorescence tí a bojútó tí ó ń fi àwọn àmì hàn fún àwọn sẹ́ẹ̀lì ìpìlẹ̀ (LGR5; magenta), àwọn sẹ́ẹ̀lì goblet (MUC2; aláwọ̀ ewé), F-actin (grẹy) àti nuclei (cyan) tí a gbìn lórí àwọn organoids inú ikùn fún ọjọ́ mẹ́ta, ní ìtẹ̀léra (Òsì) àti organoids ọjọ́ 13 (àárín) lórí ìpele epithelial. Wo Àwòrán Dáta Tí Ó Gbòòrò 3, èyí tí ó ń fi àmì LGR5 hàn láìsí àmì MUC2. Àwọn àwòrán fluorescence tí ó ń fi àpẹẹrẹ microstructure epithelial (ọtun) ti epithelium organoid 3D tí a gbé kalẹ̀ nínú ikùn lórí ërún kan nípa fífi àwọ̀ CellMask (ọtun) sí awọ ara plasma membrane ní ọjọ́ 13 ti àṣà. Ìwọ̀n ìpele jẹ́ 50 μm àyàfi tí a bá sọ bí kò ṣe bẹ́ẹ̀.b A tún tẹ̀ ẹ́ jáde pẹ̀lú àṣẹ láti ọ̀dọ̀ ìtọ́kasí.2. Oxford University Press; c A ṣe àtúnṣe pẹ̀lú àṣẹ láti ọ̀dọ̀ Ìtọ́kasí.2. Oxford University Press; e àti f a ṣe àtúnṣe pẹ̀lú àṣẹ nípasẹ̀ ìtọ́kasí.12 Lábẹ́ Ìwé-àṣẹ Creative Commons CC BY 4.0.
Nínú ikùn lórí ìyẹ̀fun, ó ṣe pàtàkì láti ṣe àtúnṣe ojú omi hydrophobic ti awo ara PDMS fún àwọ̀ ECM tó dára. Nínú ìlànà yìí, a lo ọ̀nà méjì tó yàtọ̀ láti ṣe àtúnṣe hydrophobic ti awo ara PDMS. Fún ṣíṣe àwọn sẹ́ẹ̀lì Caco-2, ìṣiṣẹ́ ojú ilẹ̀ nípasẹ̀ ìtọ́jú UV/ozone nìkan tó láti dín hydrophobicity ti ojú ilẹ̀ PDMS kù, bo ECM kí ó sì so àwọn sẹ́ẹ̀lì Caco-2 mọ́ awo ara PDMS. Síbẹ̀síbẹ̀, àṣà microfluidic ti epithelium organoid nílò iṣẹ́ ìṣiṣẹ́ ojú ilẹ̀ tó dá lórí kẹ́míkà láti ṣe àṣeyọrí ìfipamọ́ tó dára ti àwọn protein ECM nípa lílo polyethyleneimine (PEI) àti glutaraldehyde sí àwọn ikanni microMS PDMS. Lẹ́yìn àtúnṣe ojú ilẹ̀, a fi àwọn protein ECM pamọ́ láti bo ojú ilẹ̀ PDMS tó ṣiṣẹ́, lẹ́yìn náà a fi wọ́n sínú epithelium organoid tó ya sọ́tọ̀. Lẹ́yìn tí a bá so àwọn sẹ́ẹ̀lì náà pọ̀, àṣà microfluidic cell bẹ̀rẹ̀ nípa fífún àwọn ohun èlò sínú microchannel òkè títí tí àwọn sẹ́ẹ̀lì náà yóò fi di monolayer pípé, nígbà tí microchannel ìsàlẹ̀ ń ṣe àtúnṣe àwọn ipò àìdúróṣinṣin. Ọ̀nà tó dára jùlọ yìí fún ìṣiṣẹ́ ojú ilẹ̀ àti ìbòrí ECM ń jẹ́ kí ìsopọ̀ organoid jẹ́ ti organoid. epithelium láti fa morphogenesis 3D lórí ojú PDMS.
Àwọn àṣà Transwell tún nílò ìbòrí ECM kí wọ́n tó gbìn sẹ́ẹ̀lì; síbẹ̀síbẹ̀, àwọn àṣà Transwell kò nílò àwọn ìgbésẹ̀ ìtọ́jú tó díjú láti mú kí ojú àwọn ohun tí a fi sínú ihò ṣiṣẹ́. Fún gbígbìn àwọn sẹ́ẹ̀lì Caco-2 lórí àwọn ohun tí a fi sínú Transwell, ìbòrí ECM lórí àwọn ohun tí a fi sínú ihò mú kí ìsopọ̀ àwọn sẹ́ẹ̀lì Caco-2 tí a ti ya sọ́tọ̀ (
A le ṣe àyẹ̀wò àwọn ànímọ́ ìrísí ti àwọn fẹlẹfẹlẹ epithelial 3D microengineered nípa lílo onírúurú àwọn ọ̀nà àwòrán, títí bí phase contrast microscopy, differential interference contrast contrast (DIC), SEM, tàbí immunofluorescence confocal microscopy (Àwòrán 3 àti 4). A le ṣe ìyàtọ̀ Phase tàbí DIC imagering ní ìgbàkigbà nígbà tí a bá ń ṣe àṣà láti ṣe àyẹ̀wò ìrísí àti ìtẹ̀síwájú àwọn fẹlẹfẹlẹ epithelial 3D. Nítorí ìfarahàn opitika ti PDMS àti àwọn fíìmù polyester, àwọn ìpìlẹ̀ gut-on-a-chip àti hybrid chip méjèèjì le pèsè àwòrán ní àkókò gidi láìsí àìní ìpín tàbí ìtúpalẹ̀ ẹ̀rọ náà. Nígbà tí a bá ń ṣe àwòrán immunofluorescence (Àwòrán 1, 3c, f àti 4b, c), a sábà máa ń so àwọn sẹ́ẹ̀lì pọ̀ mọ́ paraformaldehyde 4% (wt/vol) (PFA), lẹ́yìn náà ni Triton X-100 àti 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA) tẹ̀lé e, ní ìtòlẹ́sẹẹsẹ. Ní ìbámu pẹ̀lú irú sẹ́ẹ̀lì, àwọn ohun èlò ìtúnṣe, àwọn permeabilizers, àti ìdènà. Ní ìbámu pẹ̀lú irú sẹ́ẹ̀lì, àwọn ohun èlò ìtúnṣe onírúurú, àwọn permeabilizers, àti ìdènà. Àwọn ohun èlò ìdènà ara ni a lè lò. Àwọn ohun èlò ìdènà ara àkọ́kọ́ tí a ń lò tí wọ́n ń fojú sí àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó gbára lé ìlà tàbí àwọn àmì agbègbè ni a ń lò láti fi àwọn sẹ́ẹ̀lì tí wọ́n ti dúró ní ipò lórí ìkọ́ náà hàn, lẹ́yìn náà ni àwọn ohun èlò ìdènà ara kejì pẹ̀lú àwọ̀ ìdènà tí ó ń dojú kọ nucleus (fún àpẹẹrẹ, 4′, 6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) tàbí F-actin (fún àpẹẹrẹ, phalloidin tí a fi àmì fluorescent ṣe). A tún lè ṣe àwòrán alààyè tí ó dá lórí fluorescence ní ipò láti ṣàwárí ìṣẹ̀dá mucus (Fíìgì 1, “Ìyàtọ̀ sẹ́ẹ̀lì” àti “Ìmọ̀ nípa Ikùn”), ìṣètò àwọn sẹ́ẹ̀lì microbial láìròtẹ́lẹ̀ (Fíìgì 1, “Olùgbàlejò-microbe co-culture”), gbígba àwọn sẹ́ẹ̀lì ìdènà ara (Fíìgì 1, ‘Àwòrán Àrùn’) tàbí àwọn ìlà ti ìkọ́ ara epithelial 3D (Fíìgì 3c, f àti 4b,c). Nígbà tí a bá ń yí ìfun padà láti ya ìpele òkè kúrò nínú ìpele microchannel ìsàlẹ̀, gẹ́gẹ́ bí a ṣe ṣàlàyé rẹ̀ nínú àtúnṣe. Gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn nínú Àwòrán 2, ìkọ́ ara epithelial 3D àti microvilli lórí A le fi SEM ṣe àfihàn ààlà ìfọ́ apical brush (Àwòrán 3b). A le ṣe àyẹ̀wò ìfihàn àwọn àmì ìyàtọ̀ nípa ṣíṣe ìtẹ̀léra PCR5 tàbí sẹ́ẹ̀lì kan ṣoṣo ti RNA. Nínú ọ̀ràn yìí, a máa ń kó àwọn fẹlẹfẹlẹ 3D ti àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial tí a gbìn nínú àwọn ìyẹ̀fun ìfun tàbí àwọn ìyẹ̀fun adàpọ̀ nípa trypsinization, lẹ́yìn náà a máa ń lò ó fún ìwádìí molecular tàbí genetic.
a, Iṣẹ́ fún ìfàsẹ́yìn ìṣàn ẹ̀jẹ̀ inú ìfun nínú ìfúnpọ̀ ìfun. A lo Caco-2 àti àwọn ohun ọ̀gbìn inú ìfun nínú ìlànà yìí láti fi ìṣàn ẹ̀jẹ̀ 3D hàn nínú ìpele ìfúnpọ̀ ìfun. A fi àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial tí a yà sọ́tọ̀ sínú àwọn ìfikún Transwell tí a ti pèsè sílẹ̀ (ìpalẹ̀mọ́ TW; wo àwòrán ní ìsàlẹ̀). Nígbà tí a bá ti gbìn àwọn sẹ́ẹ̀lì (ìfọ́) tí a sì so mọ́ àwọn awọ polyester nínú àwọn ìfikún Transwell, a gbin gbogbo àwọn sẹ́ẹ̀lì lábẹ́ àwọn ipò àìdúró (àṣà TW). Lẹ́yìn ọjọ́ méje, a fi ìfikún Transwell kan ṣoṣo tí ó ní 2D monolayer ti àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial sínú ìfúnpọ̀ ìfun láti ṣe àgbékalẹ̀ ìṣàn basolateral (Flow, BL), èyí tí ó yọrí sí ìṣẹ̀dá ìfọ́ epithelial 3D (morphogenesis). Àwọn micrograph contrast phase tí ó ń fi àwọn ànímọ́ ìfọwọ́sowọ́pọ̀ ti àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial ara ènìyàn tí a rí láti inú olùfúnni déédéé (ìlà C103) tí ó ń gòkè ní ìpele ìṣàyẹ̀wò kọ̀ọ̀kan tàbí àkókò. Àwọn ìpele nínú àwọn ìpele òkè ṣàfihàn ìṣètò ìṣàyẹ̀wò fún ìgbésẹ̀ kọ̀ọ̀kan.b, àwọn ìpele ìfọwọ́sowọ́pọ̀ (ìfọ́ òsì) lè yọrí sí ìfọwọ́sowọ́pọ̀ 3D ti àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial organoid pẹ̀lú confocal òkè-isalẹ̀ Àwọn ìwòran microscopy tí a yà ní àwọn ipò Z ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ (òkè, àárín, àti ìsàlẹ̀; wo àwọn ìlà onípele ọ̀tún àti àwọn ìlà oníwọ̀n tó báramu). fi àwọn ànímọ́ ìrísí hàn kedere. F-actin (cyan), nucleus (grey).c, Àwọn micrograph confocal fluorescence (ìwòye igun 3D) ti àwọn sẹ́ẹ̀lì epithelial tí a mú láti ara organoid tí a gbìn sínú Transwell static (TW; inset in in white dashes box) sí chípù hybrid (ìwòye pípé tó tóbi jùlọ) tí a fi wé morphology 2D àti 3D, lẹ́sẹẹsẹ. Àwọn ìwòran 2D tí a gé ní igun ọ̀tún òkè; “XZ”) tún fi àwọn ànímọ́ 2D àti 3D hàn. Pápá ìwọ̀n, 100 µm.c A tún tẹ̀ ẹ́ jáde pẹ̀lú àṣẹ láti ọ̀dọ̀ ìtọ́kasí.4. Elsevier.
A le pese awọn iṣakoso nipa dida awọn sẹẹli kanna (awọn sẹẹli Caco-2 tabi awọn sẹẹli epithelial inu) sinu awọn fẹlẹfẹlẹ onisẹpo meji labẹ awọn ipo asa ti aṣa. Ni pataki, idinku ounjẹ le waye nitori agbara iwọn didun ti awọn ikanni kekere (iyẹn ni ~ 4 µL ni ikanni oke lori apẹrẹ ikun-chip atilẹba). Nitorinaa, a le ṣe afiwe apẹrẹ epithelial ṣaaju ati lẹhin lilo ti sisan basolateral.
Ó yẹ kí a ṣe ìlànà ìwádìí onírọ̀rùn ní yàrá mímọ́. Fún ìpele kọ̀ọ̀kan lórí ìpele náà (àwọn ìpele òkè àti ìsàlẹ̀ àti àwọn ìpele àwọ̀) àti àwọn ìpele àwọ̀, a lo àwọn ìbòjú fọ́tò oríṣiríṣi tí a sì ṣe lórí àwọn wafers silicon lọtọ nítorí pé gíga àwọn microchannels yàtọ̀ síra. Gíga ibi tí a fojú sí ti àwọn microchannels òkè àti ìsàlẹ̀ ti ìfun lórí ìpele náà jẹ́ 500 µm àti 200 µm, lẹ́sẹẹsẹ. Gíga ibi tí a fojú sí ikanni ti ìpele àwọ̀ náà jẹ́ 200 µm.
Fi wafer silikoni 3-inch sinu awo kan pẹlu acetone. Yi awo naa pada pẹlu pẹlẹbẹ fun iṣẹju-aaya 30, lẹhinna gbẹ wafer naa ni afẹfẹ. Gbe wafer naa sinu awo kan pẹlu IPA, lẹhinna yi awo naa fun iṣẹju-aaya 30 lati nu.
Oògùn piranha (adalu hydrogen peroxide ati sulfuric acid ti a ṣopọ, 1:3 (vol/vol)) ni a le lo lati mu ki awọn ohun elo adayeba kuro ninu oju wafer silicon pọ si.
Omi Piranha jẹ́ ohun tí ó ń ba nǹkan jẹ́ gidigidi, ó sì ń mú kí ooru jáde. Àwọn ìṣọ́ra ààbò míràn ṣe pàtàkì. Fún ìdanù ìdọ̀tí, jẹ́ kí omi náà tutù kí ó sì gbé e sínú àpótí ìdọ̀tí tí ó mọ́, tí ó sì gbẹ. Lo àwọn àpótí kejì kí o sì fi àmì sí àwọn àpótí ìdọ̀tí dáadáa. Jọ̀wọ́ tẹ̀lé àwọn ìlànà ààbò ilé-iṣẹ́ náà fún àwọn ìlànà tí ó kún fún àlàyé.
Àwọn wáfáà náà gbẹ omi nípa gbígbé wọn sí orí àwo gbígbóná 200°C fún ìṣẹ́jú mẹ́wàá. Lẹ́yìn gbígbó omi, wọ́n mì wáfáà náà ní ìgbà márùn-ún nínú afẹ́fẹ́ kí ó lè tutù.
Tú ~10 g ti photoresist SU-8 2100 sí àárín wafer silicon tí a ti wẹ̀ mọ́. Lo àwọn tweezers láti tan photoresist náà déédé lórí wafer náà. Nígbà míì, gbé wafer náà sí orí awo gbígbóná 65°C kí photoresist náà má baà le mọ́, kí ó sì rọrùn láti tàn káàkiri. Má ṣe gbé wafer náà sí orí awo gbígbóná náà.
A pín SU-8 káàkiri lórí wafer náà nípa lílo ìbòrí yíyípo. Ṣètò ìyípo SU-8 tí ń bọ̀ fún 5–10 s láti tàn káàkiri ní 500 rpm ní ìyára 100 rpm/s. Ṣètò ìyípo pàtàkì fún ìṣàpẹẹrẹ ìyẹ̀fun 200 µm ní 1,500 rpm, tàbí kí o ṣe àṣeyọrí ìyẹ̀fun 250 µm (tí ó ṣe gíga 500 µm fún ìpele òkè ti ikùn lórí ìyẹ̀fun náà; wo “Àwọn ìgbésẹ̀ pàtàkì” ní ìsàlẹ̀) tí a ṣètò ní ìyára 300 rpm/s ní 30 s ní 1,200 rpm.
A le ṣatunṣe iyara iyipo akọkọ gẹgẹbi sisanra afojusun ti apẹrẹ SU-8 lori wafer silicon.
Láti ṣe àwọn àpẹẹrẹ SU-8 tí ó ga tó 500 µm fún ìpele òkè ikùn lórí ìkọ́ náà, a tún ṣe àtúnṣe sí ìbòrí yíyípo àti àwọn ìgbésẹ̀ yíyọ́ ti Àpótí yìí (àwọn ìgbésẹ̀ 7 àti 8) lẹ́sẹẹsẹ (wo ìgbésẹ̀ 9) láti ṣe ìpele méjì ti 250 µm A ti SU-8 tí ó nípọn, èyí tí a lè fi ìfarahàn UV sí orí rẹ̀ kí a sì so pọ̀ mọ́ ní ìgbésẹ̀ 12 ti àpótí yìí, èyí tí yóò mú kí ìpele náà ga tó 500 µm.
Yan awọn wafer ti a bo ni SU-8 ni rirọ nipa fifi awọn wafer naa si ori awo gbigbona ni 65 °C fun iṣẹju marun, lẹhinna yi eto naa pada si 95 °C ki o si fi sii fun iṣẹju 40 miiran.
Láti dé ibi gíga 500 μm ti àpẹẹrẹ SU-8 ní orí microchannel òkè, tún àwọn ìgbésẹ̀ 7 àti 8 ṣe láti ṣẹ̀dá àwọn fẹlẹfẹlẹ SU-8 méjì tí ó nípọn 250 μm.
Nípa lílo UV Mask Aligner, ṣe ìdánwò fìtílà gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè láti ṣírò àkókò ìfarahàn fìtílà náà. (àkókò ìfarahàn, ms) = (iwọn ìfarahàn, mJ/cm2)/(agbára fìtílà, mW/cm2).
Lẹ́yìn tí o bá ti pinnu àkókò tí a fi ń hàn, gbé àwòrán ojú náà sí orí ohun tí a fi ń bo ojú ìbora UV náà kí o sì gbé àwòrán ojú náà sí orí ìbora SU-8 tí a fi bo ojú ìbora náà.
Gbe oju ti a tẹ jade ti iboju iboju naa taara si apa ti a bo SU-8 ti wafer silikoni lati dinku itankale UV.
Fi ìbòjú ìbòjú ìbòjú SU-8 àti ìbòjú ìbòjú ìbòjú hàn ní ìta sí 260 mJ/cm2 ti ìmọ́lẹ̀ UV fún àkókò tí a ti pinnu tẹ́lẹ̀ (wo ìgbésẹ̀ 10 ti àpótí yìí).
Lẹ́yìn tí a bá ti fi UV hàn, a máa ń yan àwọn wafer silicon tí a fi SU-8 bo ní 65°C fún ìṣẹ́jú 5 àti 95°C fún ìṣẹ́jú 15 lórí àwo gbígbóná kọ̀ọ̀kan láti ṣe àwọn àpẹẹrẹ pẹ̀lú gíga 200 μm. Mú àkókò lẹ́yìn yíyan náà gùn sí ìṣẹ́jú 95°C sí ìṣẹ́jú 30 láti ṣe àwọn àpẹẹrẹ pẹ̀lú gíga 500 µm.
A da olùgbékalẹ̀ náà sínú àwo gilasi kan, a sì gbé wáfà tí a ti yan sínú àwo náà. Ìwọ̀n olùgbékalẹ̀ SU-8 lè yàtọ̀ síra ní ìbámu pẹ̀lú ìwọ̀n àwo gilasi náà. Rí i dájú pé o lo olùgbékalẹ̀ SU-8 tó láti yọ SU-8 tí kò tíì fara hàn pátápátá. Fún àpẹẹrẹ, nígbà tí o bá ń lo àwo gilasi oníwọ̀n 150 mm pẹ̀lú agbára L 1, lo ~300 mL ti olùgbékalẹ̀ SU-8. Ṣe àwo náà fún ìṣẹ́jú 25 pẹ̀lú ìyípo díẹ̀díẹ̀ lẹ́ẹ̀kọ̀ọ̀kan.
Fi ~10 mL ti ohun èlò tuntun fọ mọl ti a ti ṣe agbekalẹ naa, lẹ́yìn náà, fi IPA fọ omi naa nipa lilo pipette kan.
Fi wafer sinu ohun elo fifọ plasma ki o si fi si inu plasma atẹgun (gaasi afẹfẹ, titẹ afojusun 1 × 10−5 Torr, agbara 125 W) fun iṣẹju 1.5.
Fi wafer sinu ohun elo imukuro fifi omi sinu pẹlu gilasi fifa sinu. A le gbe wafer ati awọn slides lẹgbẹẹ ara wọn. Ti a ba pin ohun elo imukuro si awọn fẹlẹfẹlẹ pupọ nipasẹ awo kan, gbe awọn slides sinu yara isalẹ ati awọn wafers sinu yara oke. Fi omi trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane 100 μL silẹ lori gilasi fifa ki o si fi vacuum si fun silanization.
Tú ìgò kan ti àwọn sẹ́ẹ̀lì Caco-2 tí ó ti dìdì sínú omi ìwẹ̀ 37°C, lẹ́yìn náà gbé àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ó ti dìdì náà sínú ìgò T75 tí ó ní 15 mL ti 37°C tí a ti gbóná tẹ́lẹ̀ Caco-2.
Láti kọjá àwọn sẹ́ẹ̀lì Caco-2 ní ìwọ̀n ìdàpọ̀ tó tó 90%, kọ́kọ́ lo Caco-2 tó gbóná, PBS, àti 0.25% trypsin/1 mM EDTA nínú omi ìwẹ̀ 37°C.
Fi omi gbígbóná sí ara àwọn sẹ́ẹ̀lì náà nípa lílo omi gbígbóná 5 mL nípa fífọ omi gbígbóná lẹ́ẹ̀mejì nípa ṣíṣe àtúnṣe omi gbígbóná àti fífi PBS tuntun kún un.
Àkókò ìfìwéránṣẹ́: Oṣù Keje-16-2022
