Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau mematikan mod keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Morfogenesis usus manusia mewujudkan ciri-ciri kript-villus bagi mikroarkitektur epitelium 3D dan organisasi ruang. Struktur unik ini diperlukan untuk mengekalkan homeostasis usus dengan melindungi niche sel stem dalam kript basal daripada antigen mikrob eksogen dan metabolitnya. Di samping itu, vili usus dan mukus yang merembeskan mempersembahkan sel epitelium yang dibezakan secara berfungsi dengan penghalang pelindung pada permukaan mukosa usus. Oleh itu, mencipta semula struktur epitelium 3D adalah penting untuk pembinaan model usus in vitro. Terutamanya, usus-pada-cip mimetik organik boleh mendorong morfogenesis 3D spontan epitelium usus dengan fungsi fisiologi dan biomekanik yang dipertingkatkan. Di sini, kami menyediakan protokol yang boleh dihasilkan semula untuk mendorong morfogenesis usus secara kukuh dalam usus pada cip mikrofluidik serta dalam cip hibrid terbenam Transwell. Kami menerangkan kaedah terperinci untuk fabrikasi peranti, pengkulturan Caco-2 atau sel epitelium organoid usus dalam tetapan konvensional serta pada platform mikrofluidik, induksi morfogenesis 3D, dan pencirian epitel 3D yang telah ditetapkan menggunakan pelbagai modaliti pengimejan. Protokol ini mencapai pertumbuhan semula mikroarkitektur usus berfungsi dengan mengawal aliran bendalir basolateral selama 5 hari. Kaedah morfogenesis in vitro kami menggunakan tegasan ricih dan gerakan mekanikal yang berkaitan secara fisiologi dan tidak memerlukan kejuruteraan atau manipulasi sel yang kompleks, yang mungkin mengatasi teknik sedia ada yang lain. Kami membayangkan bahawa protokol yang dicadangkan boleh mempunyai implikasi yang luas untuk komuniti penyelidikan bioperubatan, menyediakan kaedah untuk menjana semula lapisan epitelium usus 3D secara in vitro untuk aplikasi bioperubatan, klinikal dan farmaseutikal.
Eksperimen menunjukkan bahawa sel Caco-2 epitelium usus yang dikultur dalam peranti mikrofluidik usus-pada-cip1,2,3,4,5 atau dwilapisan6,7 boleh menjalani morfogenesis 3D spontan secara in vitro tanpa pemahaman yang jelas tentang mekanisme yang mendasarinya. Dalam kajian terbaru kami, kami mendapati bahawa penyingkiran antagonis morfogen yang dirembeskan secara basolateral daripada peranti kultur adalah perlu dan mencukupi untuk mendorong morfogenesis epitelium 3D secara in vitro, yang telah ditunjukkan oleh Caco-2 dan organoid usus yang diperoleh pesakit. Sel-sel epitelium telah disahkan. Dalam kajian ini, kami secara khusus menumpukan pada penghasilan sel dan taburan kepekatan antagonis Wnt yang kuat, Dickkopf-1 (DKK-1), dalam peranti mikrofluidik usus-pada-cip dan yang diubah suai yang mengandungi sisipan Transwell, yang dipanggil "Cip Hibrid". Kami menunjukkan bahawa penambahan antagonis Wnt eksogen (seperti DKK-1, penindas Wnt 1, protein berkaitan frizzled 1 yang dirembeskan, atau Soggy-1) pada usus atas cip menghalang morfogenesis atau mengganggu lapisan epitelium 3D yang telah distrukturkan, menunjukkan bahawa tekanan antagonistik semasa kultur bertanggungjawab untuk morfogenesis usus secara in vitro. Oleh itu, pendekatan praktikal untuk mencapai morfogenesis yang teguh pada antara muka epitelium adalah dengan membuang atau mengekalkan tahap antagonis Wnt secara minimum dalam petak basolateral melalui pembilasan aktif (contohnya, dalam platform usus-pada-cip atau hibrid-pada-cip) atau resapan. Media basolateral (contohnya, daripada sisipan Transwell ke dalam takungan basolateral yang besar dalam telaga).
Dalam protokol ini, kami menyediakan kaedah terperinci untuk menghasilkan mikroperanti usus-atas-cip dan cip hibrid yang boleh dimasukkan Transwell (langkah 1-5) untuk mengkultur sel epitelium usus pada membran berliang berasaskan polidimetilsiloksana (PDMS) (langkah 6A, 7A, 8, 9) atau membran poliester sisipan Transwell (langkah 6B, 7B, 8, 9) dan mendorong morfogenesis 3D secara in vitro (langkah 10). Kami juga mengenal pasti ciri-ciri selular dan molekul yang menunjukkan histogenesis khusus tisu dan pembezaan selular yang bergantung kepada keturunan dengan menggunakan pelbagai modaliti pengimejan (langkah 11-24). Kami mendorong morfogenesis menggunakan sel epitelium usus manusia, seperti Caco-2 atau organoid usus, dalam dua format kultur dengan butiran teknikal termasuk pengubahsuaian permukaan membran berliang, penciptaan lapisan tunggal 2D, dan biokimia usus dan Pembiakan persekitaran mikro biomekanikal. in vitro. Untuk mendorong morfogenesis 3D daripada lapisan tunggal epitelium 2D, kami membuang antagonis morfogen dalam kedua-dua bentuk kultur dengan mengalir medium ke dalam petak basolateral kultur. Akhir sekali, kami memberikan gambaran tentang kegunaan lapisan epitelium 3D yang boleh dijana semula yang boleh digunakan untuk memodelkan pertumbuhan epitelium yang bergantung kepada morfogen, kultur bersama hos-mikrobiom membujur, jangkitan patogen, kecederaan keradangan, disfungsi penghalang epitelium dan terapi berasaskan probiotik Contoh.
Protokol kami mungkin berguna kepada pelbagai saintis dalam impak luas penyelidikan asas (contohnya, biologi mukosa usus, biologi sel stem dan biologi perkembangan) dan gunaan (contohnya, ujian ubat praklinikal, pemodelan penyakit, kejuruteraan tisu dan gastroenterologi). Disebabkan kebolehulangan dan keteguhan protokol kami untuk mendorong morfogenesis 3D epitelium usus secara in vitro, kami membayangkan bahawa strategi teknikal kami dapat disebarkan kepada khalayak yang mengkaji dinamik isyarat sel semasa perkembangan usus, regenerasi atau homeostasis. Di samping itu, protokol kami berguna untuk menyoal siasat jangkitan di bawah pelbagai agen berjangkit seperti Norovirus 8, Sindrom Pernafasan Akut Teruk Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 atau Vibrio cholerae. Khalayak patologi dan patogenesis penyakit juga berguna. Penggunaan sistem mikrofisiologi usus atas cip mungkin membolehkan kultur bersama membujur 10 dan penilaian seterusnya terhadap pertahanan perumah, tindak balas imun dan pembaikan kecederaan berkaitan patogen dalam saluran gastrousus (GI) 11. Gangguan GI lain yang berkaitan dengan sindrom usus bocor, penyakit seliak, penyakit Crohn, kolitis ulseratif, pouchitis, atau sindrom usus rengsa boleh disimulasikan apabila lapisan epitelium usus 3D disediakan menggunakan lapisan epitelium usus 3D pesakit, penyakit ini termasuk atrofi vilus, pemendekan kript, kerosakan mukosa, atau penghalang epitelium terjejas. Biopsi atau organoid usus yang berasal dari sel stem 12,13. Untuk memodelkan persekitaran penyakit yang lebih kompleks dan lebih baik, pembaca boleh mempertimbangkan untuk menambah jenis sel yang berkaitan dengan penyakit, seperti sel mononuklear darah periferal pesakit (PBMC), kepada model yang mengandungi mikroarkitektur vilus-kript usus 3D. sel imun khusus tisu, 5.
Oleh kerana mikrostruktur epitelium 3D boleh ditetapkan dan divisualisasikan tanpa proses pengekstrakan, penonton yang mengusahakan transkriptomik spatial dan pengimejan resolusi tinggi atau super-resolusi mungkin berminat dengan pemetaan dinamik spatiotemporal gen dan protein pada niche epitelium. Berminat dengan teknologi. Tindak balas terhadap rangsangan mikrob atau imun. Tambahan pula, crosstalk hos-mikrobiom membujur 10, 14 yang menyelaras homeostasis usus boleh diwujudkan dalam lapisan mukosa usus 3D dengan mengkultur bersama pelbagai spesies mikrob, komuniti mikrob atau mikrobiota najis, terutamanya dalam usus-pada-cip. dalam platform. Pendekatan ini amat menarik bagi khalayak yang mempelajari imunologi mukosa, gastroenterologi, mikrobiom manusia, kulturomik dan mikrobiologi klinikal yang ingin memupuk mikrobiota usus yang sebelum ini tidak dikultur di makmal. Jika protokol morfogenesis in vitro kami boleh disesuaikan dengan format kultur yang boleh diskalakan, seperti sisipan berbilang telaga dalam plat 24, 96 atau 384 telaga yang sentiasa mengisi semula petak basolateral, protokol ini juga boleh disebarkan kepada mereka yang membangunkan platform saringan atau pengesahan farmaseutikal, bioperubatan atau daya pemprosesan tinggi untuk industri makanan. Sebagai bukti prinsip, kami baru-baru ini menunjukkan kebolehlaksanaan sistem morfogenesis berdaya pemprosesan tinggi multipleks yang boleh diskalakan kepada format plat 24 telaga. Di samping itu, produk berbilang organ-pada-cip telah dikomersialkan16,17,18. Oleh itu, pengesahan kaedah morfogenesis in vitro kami boleh dipercepatkan dan berpotensi diguna pakai oleh banyak makmal penyelidikan, industri atau kerajaan dan agensi kawal selia untuk memahami pengaturcaraan semula selular morfogenesis usus in vitro pada peringkat transkriptomik untuk menguji ubat atau bioterapeutik. Penyerapan dan pengangkutan calon ubat telah dinilai menggunakan pengganti usus 3D atau menggunakan model organ-pada-cip tersuai atau komersial untuk menilai kebolehulangan proses morfogenesis usus.
Sebilangan kecil model eksperimen yang berkaitan dengan manusia telah digunakan untuk mengkaji morfogenesis epitelium usus, terutamanya disebabkan oleh kekurangan protokol yang boleh dilaksanakan untuk mendorong morfogenesis 3D secara in vitro. Malah, kebanyakan pengetahuan semasa tentang morfogenesis usus adalah berdasarkan kajian haiwan (contohnya, zebrafish20, tikus21 atau ayam22). Walau bagaimanapun, ia memerlukan tenaga kerja dan kos yang tinggi, boleh dipersoalkan secara etika, dan yang paling penting, tidak menentukan proses perkembangan manusia dengan tepat. Model-model ini juga sangat terhad dalam keupayaannya untuk diuji dengan cara yang boleh diskalakan pelbagai cara. Oleh itu, protokol kami untuk menjana semula struktur tisu 3D secara in vitro mengatasi model haiwan in vivo serta model kultur sel 2D statik tradisional yang lain. Seperti yang diterangkan sebelum ini, penggunaan struktur epitelium 3D membolehkan kami memeriksa penyetempatan ruang sel yang dibezakan dalam paksi crypt-villus sebagai tindak balas kepada pelbagai rangsangan mukosa atau imun. Lapisan epitelium 3D boleh menyediakan ruang untuk mengkaji bagaimana sel mikrob bersaing untuk membentuk niche ruang dan evolusi ekologi sebagai tindak balas kepada faktor perumah (contohnya, lapisan mukus dalam lawan luar, rembesan IgA dan antimikrob peptida). Tambahan pula, morfologi epitelium 3D membolehkan kita memahami bagaimana mikrobiota usus menstrukturkan komunitinya dan secara sinergi menghasilkan metabolit mikrob (contohnya, asid lemak rantai pendek) yang membentuk organisasi selular dan niche sel stem dalam krip basal. Ciri-ciri ini hanya boleh ditunjukkan apabila lapisan epitelium 3D dibentuk secara in vitro.
Selain kaedah kami untuk mencipta struktur epitelium usus 3D, terdapat beberapa kaedah in vitro. Kultur organoid usus ialah teknik kejuruteraan tisu canggih berdasarkan penanaman sel stem usus di bawah keadaan morfogen tertentu23,24,25. Walau bagaimanapun, penggunaan model organoid 3D untuk analisis pengangkutan atau kokultur hos-mikrobiom selalunya mencabar kerana lumen usus tertutup di dalam organoid dan, oleh itu, pengenalan komponen luminal seperti sel mikrob atau antigen eksogen adalah terhad. Akses kepada lumen organoid boleh diperbaiki menggunakan mikroinjektor,26,27 tetapi kaedah ini invasif dan intensif buruh serta memerlukan pengetahuan khusus untuk dilaksanakan. Tambahan pula, kultur organoid tradisional yang dikekalkan dalam perancah hidrogel di bawah keadaan statik tidak mencerminkan biomekanik aktif in vivo dengan tepat.
Pendekatan lain yang digunakan oleh beberapa kumpulan penyelidikan menggunakan perancah hidrogel 3D prastruktur untuk meniru struktur epitelium usus dengan mengkultur sel usus manusia terpencil pada permukaan gel. Fabrikasi perancah hidrogel menggunakan acuan bercetak 3D, mikro-giling atau fabrikasi litografi. Kaedah ini menunjukkan susunan sel epitelium terpencil yang tersusun secara in vitro dengan kecerunan morfogen yang berkaitan secara fisiologi, mewujudkan struktur epitelium nisbah aspek yang tinggi dan crosstalk stroma-epitelium dengan memasukkan sel stroma dalam perancah. Walau bagaimanapun, sifat perancah prastruktur mungkin menghalang paparan proses morfogenetik spontan itu sendiri. Model ini juga tidak menyediakan aliran luminal atau interstisial yang dinamik, kekurangan tegasan ricih bendalir yang diperlukan oleh sel usus untuk menjalani morfogenesis dan mendapatkan fungsi fisiologi. Satu lagi kajian baru-baru ini menggunakan perancah hidrogel dalam platform mikrofluidik dan struktur epitelium usus bercorak menggunakan teknik etsa laser. Organoid usus tikus mengikuti corak terukir untuk membentuk struktur tiub usus, dan aliran bendalir intraluminal boleh direkapitulasi menggunakan modul mikrofluidik. Walau bagaimanapun, model ini tidak mempamerkan spontan. proses morfogenetik dan juga tidak termasuk pergerakan mekanobiologi usus. Teknik pencetakan 3D daripada kumpulan yang sama dapat mencipta tiub usus kecil dengan proses morfogenetik spontan. Walaupun fabrikasi segmen usus yang berbeza di dalam tiub adalah kompleks, model ini juga kekurangan aliran bendalir luminal dan ubah bentuk mekanikal. Selain itu, kebolehkendalian model mungkin terhad, terutamanya selepas proses biocetak selesai, mengganggu keadaan eksperimen atau interaksi sel-ke-sel. Sebaliknya, protokol yang kami cadangkan menyediakan morfogenesis usus spontan, tegasan ricih yang berkaitan secara fisiologi, biomekanik yang meniru motiliti usus, kebolehcapaian petak apikal dan basolateral bebas, dan penciptaan semula persekitaran mikro biologi yang kompleks dengan modulariti. Oleh itu, protokol morfogenesis 3D in vitro kami boleh menyediakan pendekatan pelengkap untuk mengatasi cabaran kaedah sedia ada.
Protokol kami sepenuhnya tertumpu pada morfogenesis epitelium 3D, dengan hanya sel epitelium dalam kultur dan tiada jenis sel sekeliling lain seperti sel mesenchymal, sel endothelial dan sel imun. Seperti yang diterangkan sebelum ini, teras protokol kami ialah induksi morfogenesis epitelium dengan membuang perencat morfogen yang dirembeskan di bahagian basolateral medium yang diperkenalkan. Walaupun modulariti teguh usus-pada-cip dan hibrid-pada-cip kami membolehkan kami mencipta semula lapisan epitelium 3D yang beralun, kerumitan biologi tambahan seperti interaksi epitelium-mesenchymal33,34, pemendapan Matriks ekstraselular (ECM) 35 dan, dalam model kami, ciri kript-villus yang menyampaikan niche sel stem dalam kript basal masih perlu dipertimbangkan lebih lanjut. Sel stromal (contohnya, fibroblas) dalam mesenchyme memainkan peranan penting dalam penghasilan protein ECM dan pengawalaturan morfogenesis usus in vivo35,37,38. Penambahan sel mesenchymal kepada model kami meningkatkan proses morfogenetik dan kecekapan pelekatan sel. Lapisan endothelial (iaitu, kapilari atau limfa) memainkan peranan penting dalam mengawal selia pengangkutan molekul39 dan perekrutan sel imun40 dalam persekitaran mikro usus. Tambahan pula, komponen vaskular yang boleh dihubungkan antara model tisu adalah prasyarat apabila model tisu direka bentuk untuk menunjukkan interaksi berbilang organ. Oleh itu, sel endotel mungkin perlu dimasukkan untuk memodelkan ciri fisiologi yang lebih tepat dengan resolusi peringkat organ. Sel imun yang diperoleh daripada pesakit juga penting untuk memaparkan tindak balas imun semula jadi, pembentangan antigen, crosstalk imun adaptif semula jadi dan imuniti khusus tisu dalam konteks meniru penyakit usus.
Penggunaan cip hibrid adalah lebih mudah berbanding gut-on-a-cip kerana persediaan peranti adalah lebih mudah dan penggunaan sisipan Transwell membolehkan kultur epitelium usus yang boleh diskala. Walau bagaimanapun, sisipan Transwell yang tersedia secara komersial dengan membran poliester tidak elastik dan tidak dapat mensimulasikan pergerakan seperti peristaltik. Tambahan pula, petak apikal sisipan Transwell yang diletakkan di dalam cip hibrid kekal pegun tanpa tegasan ricih pada bahagian apikal. Jelas sekali, sifat statik dalam petak apikal jarang membolehkan kultur bersama bakteria jangka panjang dalam cip hibrid. Walaupun kita boleh mendorong morfogenesis 3D secara kukuh dalam sisipan Transwell apabila menggunakan cip hibrid, kekurangan biomekanik yang berkaitan secara fisiologi dan aliran bendalir apikal mungkin mengehadkan kebolehlaksanaan platform cip hibrid untuk aplikasi yang berpotensi.
Pembinaan semula skala penuh paksi kript-villus manusia dalam kultur usus-atas-cip dan hibrid-atas-cip belum sepenuhnya dipastikan. Oleh kerana morfogenesis bermula daripada lapisan tunggal epitelium, mikroarkitektur 3D tidak semestinya memberikan persamaan morfologi kepada kript secara in vivo. Walaupun kami mencirikan populasi sel yang membiak berhampiran domain kript basal dalam epitelium 3D yang direkayasa mikro, kawasan kript dan vilus tidak ditandakan dengan jelas. Walaupun saluran atas yang lebih tinggi pada cip menyebabkan peningkatan ketinggian epitelium yang direkayasa mikro, ketinggian maksimum masih terhad kepada ~300–400 µm. Kedalaman sebenar kript usus manusia dalam usus kecil dan besar masing-masing ialah ~135 µm dan ~400 µm, dan ketinggian vilus usus kecil ialah ~600 µm41.
Dari sudut pengimejan, pengimejan resolusi super in situ bagi mikroarkitektur 3D mungkin terhad kepada usus pada cip, memandangkan jarak kerja yang diperlukan dari kanta objektif ke lapisan epitelium adalah sekitar beberapa milimeter. Untuk mengatasi masalah ini, objektif yang jauh mungkin diperlukan. Tambahan pula, membuat bahagian nipis untuk penyediaan spesimen pengimejan adalah mencabar kerana keanjalan PDMS yang tinggi. Tambahan pula, memandangkan mikrofabrikasi usus lapisan demi lapisan pada cip melibatkan lekatan kekal antara setiap lapisan, adalah sangat mencabar untuk membuka atau menanggalkan lapisan atas untuk memeriksa struktur permukaan lapisan epitelium. Contohnya, dengan menggunakan mikroskop elektron imbasan (SEM).
Hidrofobisiti PDMS telah menjadi faktor pengehad dalam kajian berasaskan mikrofluidik yang berkaitan dengan molekul kecil hidrofobik, kerana PDMS boleh menyerap molekul hidrofobik tersebut secara tidak spesifik. Alternatif kepada PDMS boleh dipertimbangkan dengan bahan polimer lain. Sebagai alternatif, pengubahsuaian permukaan PDMS (contohnya, salutan dengan bahan lipofilik 42 atau poli(etilena glikol) 43) boleh dipertimbangkan untuk meminimumkan penjerapan molekul hidrofobik.
Akhir sekali, kaedah kami belum dicirikan dengan baik dari segi menyediakan penyaringan daya pemprosesan tinggi atau platform eksperimen mesra pengguna "satu saiz untuk semua". Protokol semasa memerlukan pam picagari bagi setiap mikroperanti, yang mengambil ruang dalam inkubator CO2 dan menghalang eksperimen berskala besar. Had ini boleh diperbaiki dengan ketara melalui kebolehskalaan format kultur inovatif (contohnya, sisipan berliang 24-telaga, 96-telaga atau 384-telaga yang membolehkan pengisian semula dan penyingkiran media basolateral secara berterusan).
Untuk mendorong morfogenesis 3D epitelium usus manusia secara in vitro, kami menggunakan peranti usus cip mikrofluidik yang mengandungi dua saluran mikro selari dan membran berliang elastik di antaranya untuk mencipta antara muka lumen-kapilari. Kami juga menunjukkan penggunaan peranti mikrofluidik saluran tunggal (cip hibrid) yang menyediakan aliran basolateral berterusan di bawah lapisan epitelium terpolarisasi yang ditumbuhkan pada sisipan Transwell. Dalam kedua-dua platform, morfogenesis pelbagai sel epitelium usus manusia boleh ditunjukkan dengan menggunakan manipulasi aliran berarah untuk membuang antagonis morfogen daripada petak basolateral. Keseluruhan prosedur eksperimen (Rajah 1) terdiri daripada lima bahagian: (i) mikrofabrikasi cip usus atau cip hibrid yang boleh dimasukkan Transwell (langkah 1-5; Kotak 1), (ii) penyediaan sel epitelium usus (sel Caco-2) atau organoid usus manusia; kotak 2-5), (iii) kultur sel epitelium usus pada cip usus atau cip hibrid (langkah 6-9), (iv) induksi morfogenesis 3D secara in vitro (langkah 10) dan (v)) untuk mencirikan mikrostruktur epitelium 3D (langkah 11-24). Akhir sekali, kumpulan kawalan yang sesuai (dibincangkan lebih lanjut di bawah) direka bentuk untuk mengesahkan keberkesanan morfogenesis in vitro dengan membandingkan morfogenesis epitelium dengan kawalan ruang, temporal, bersyarat atau prosedur.
Kami menggunakan dua platform kultur yang berbeza: gut-on-a-cip dengan saluran lurus atau saluran berbelit tak linear, atau cip hibrid yang mengandungi sisipan Transwell (TW) dalam peranti mikrofluidik, yang dibuat seperti yang diterangkan dalam Kotak 1, dan langkah 1-5. "Fabrikasi Peranti" menunjukkan langkah utama dalam membuat cip tunggal atau cip hibrid. "Kultur Sel Epitel Usus Manusia" menerangkan sumber sel (Caco-2 atau organoid usus manusia) dan prosedur kultur yang digunakan dalam protokol ini. "Morfogenesis in vitro" menunjukkan langkah keseluruhan di mana Caco-2 atau sel epitelium yang berasal dari organoid dikultur pada cip usus atau pada sisipan Transwell cip hibrid, diikuti dengan induksi morfogenesis 3D dan pembentukan struktur epitelium yang dicirikan. Nombor langkah program atau nombor kotak dipaparkan di bawah setiap anak panah. Aplikasi ini menyediakan contoh bagaimana lapisan epitelium usus yang terbentuk boleh digunakan, contohnya, dalam pencirian pembezaan sel, kajian fisiologi usus, penubuhan ekosistem hos-mikrobiom, dan pemodelan penyakit. Imej imunofluoresens dalam "Sel "Pembezaan" menunjukkan nukleus, F-aktin dan MUC2 yang diekspresikan dalam lapisan epitelium 3D Caco-2 yang dihasilkan pada cip usus. Isyarat MUC2 terdapat dalam sel goblet dan mukus yang dirembeskan dari permukaan mukosa. Imej pendarfluor dalam Fisiologi Usus menunjukkan mukus yang dihasilkan melalui pewarnaan untuk asid sialik dan residu N-asetilglukosamin menggunakan aglutinin kuman gandum pendarfluor. Dua imej yang bertindih dalam "Kultur Mikrob Hos" menunjukkan kultur bersama mikrobiom hos yang mewakili dalam usus pada cip. Panel kiri menunjukkan kultur bersama protein pendarfluor hijau (GFP) yang mengekspresikan E. coli dengan sel epitelium Caco-2 3D yang direkayasa secara mikro. Panel kanan menunjukkan penyetempatan GFP E. coli yang dikultur bersama dengan sel epitelium Caco-2 3D, diikuti dengan pewarnaan imunofluoresen dengan F-aktin (merah) dan nukleus (biru). Pemodelan penyakit menggambarkan usus yang sihat berbanding usus bocor dalam cip keradangan usus di bawah cabaran fisiologi dengan antigen bakteria (cth., lipopolisakarida, LPS) dan sel imun (cth., PBMC; hijau). Sel Caco-2 telah dikultur untuk membentuk lapisan epitelium 3D. Bar skala, 50 µm. Imej di baris bawah: “Pembezaan sel” diadaptasi dengan kebenaran daripada rujukan. 2. Oxford University Press; Diterbitkan semula dengan kebenaran daripada Ruj.5. NAS; “Kultur Bersama Mikrob Hos” diadaptasi dengan kebenaran daripada ruj.3. NAS; “Pemodelan Penyakit” diadaptasi dengan kebenaran daripada rujukan. 5. NAS.
Kedua-dua cip gut-on-chip dan hibrid telah difabrikasi menggunakan replika PDMS yang telah didedahkan daripada acuan silikon melalui litografi lembut1,44 dan dicorak dengan SU-8. Reka bentuk saluran mikro dalam setiap cip ditentukan dengan mempertimbangkan hidrodinamik seperti tegasan ricih dan tekanan hidrodinamik1,4,12. Reka bentuk gut-on-a-cip asal (Data Lanjutan Rajah 1a), yang terdiri daripada dua saluran mikro lurus selari yang disandingkan, telah berkembang menjadi gut-on-a-cip kompleks (Data Lanjutan Rajah 1b) yang merangkumi sepasang saluran mikro melengkung untuk mendorong peningkatan masa kediaman bendalir, corak aliran tak linear dan ubah bentuk berbilang paksi sel yang dikultur (Rajah 2a–f).12.Apabila biomekanik usus yang lebih kompleks perlu dicipta semula, gut-on-a-cip kompleks boleh dipilih.Kami telah menunjukkan bahawa Gut-Chip yang berbelit-belit juga mendorong morfogenesis 3D dengan kuat dalam jangka masa yang sama dengan tahap pertumbuhan epitelium yang serupa berbanding dengan yang asal. Cip Gut, tanpa mengira jenis sel yang dikultur. Oleh itu, untuk mendorong morfogenesis 3D, reka bentuk usus pada cip linear dan kompleks boleh ditukar ganti. Replika PDMS yang diawet pada acuan silikon dengan corak SU-8 memberikan ciri-ciri negatif selepas penyahcetakan (Rajah 2a). Untuk menghasilkan usus pada cip, lapisan PDMS atas yang disediakan telah diikat secara berurutan pada filem PDMS berliang dan kemudian diselaraskan dengan lapisan PDMS bawah melalui ikatan tak boleh balik menggunakan rawatan korona (Rajah 2b–f). Untuk menghasilkan cip hibrid, replika PDMS yang diawet telah diikat pada slaid kaca untuk mencipta peranti mikrofluidik saluran tunggal yang boleh menampung sisipan Transwell (Rajah 2h dan Data Lanjutan Rajah 2). Proses ikatan dilakukan dengan merawat permukaan replika PDMS dan kaca dengan plasma oksigen atau rawatan korona. Selepas pensterilan peranti mikrofabrikasi yang dilekatkan pada tiub silikon, persediaan peranti sedia untuk melakukan morfogenesis 3D epitelium usus (Rajah 2g).
a, Ilustrasi skematik penyediaan bahagian PDMS daripada acuan silikon bercorak SU-8. Larutan PDMS yang tidak diawet dituang ke atas acuan silikon (kiri), diawet pada suhu 60 °C (tengah) dan dinyahlengkungkan (kanan). PDMS yang dinyahlengkungkan dipotong menjadi kepingan dan dibersihkan untuk kegunaan selanjutnya. b, Gambar acuan silikon yang digunakan untuk menyediakan lapisan atas PDMS. c, Gambar acuan silikon yang digunakan untuk membuat membran berliang PDMS. d, Satu siri gambar komponen PDMS atas dan bawah dan peranti usus pada cip yang dipasang. e, Skematik penjajaran komponen PDMS atas, membran dan bawah. Setiap lapisan terikat secara tidak boleh dipulihkan oleh rawatan plasma atau korona. f, Skematik peranti usus-pada-cip yang dibuat dengan saluran mikro berbelit bertindih dan ruang vakum. g, Persediaan usus-pada-cip untuk kultur sel mikrofluidik. Usus yang dibuat pada cip yang dipasang dengan tiub silikon dan picagari diletakkan pada penutup. Peranti cip diletakkan pada penutup Petri 150 mm hidangan untuk pemprosesan. Pengikat digunakan untuk menutup tiub silikon.h, Gambaran visual fabrikasi cip hibrid dan morfogenesis 3D menggunakan cip hibrid. Sisipan Transwell yang disediakan secara bebas untuk mengkultur lapisan tunggal 2D sel epitelium usus dimasukkan ke dalam cip hibrid untuk mendorong morfogenesis 3D usus. Medium direfusikan melalui saluran mikro di bawah lapisan sel yang ditetapkan pada sisipan Transwell. Bar skala, 1 cm.h Dicetak semula dengan kebenaran daripada rujukan.4. Elsevier.
Dalam protokol ini, barisan sel Caco-2 dan organoid usus digunakan sebagai sumber epitelium (Rajah 3a). Kedua-dua jenis sel dikultur secara bebas (Kotak 2 dan Kotak 5) dan digunakan untuk menyemai saluran mikro bersalut ECM bagi usus atas cip atau sisipan Transwell. Apabila sel-sel berkumpul (liputan >95% dalam kelalang), sel Caco-2 yang dikultur secara rutin (antara laluan 10 dan 50) dalam kelalang-T dituai untuk menyediakan suspensi sel yang dipisahkan oleh cecair tripsinisasi (kotak 2). Organoid usus manusia daripada biopsi usus atau reseksi pembedahan dikultur dalam kubah perancah Matrigel dalam plat 24-telaga untuk menyokong persekitaran mikro struktur. Medium yang mengandungi morfogen penting (seperti Wnt, R-spondin dan Noggin) dan faktor pertumbuhan yang disediakan seperti yang diterangkan dalam Kotak 3 telah ditambah setiap selang hari sehingga organoid tumbuh hingga diameter ~500 µm. Organoid yang tumbuh sepenuhnya dituai dan dipisahkan menjadi sel tunggal untuk disemai ke dalam usus. atau sisipan Transwell pada cip (Kotak 5). Seperti yang telah kami laporkan sebelum ini, ia boleh dibezakan mengikut jenis penyakit12,13 (cth. kolitis ulseratif, penyakit Crohn, kanser kolorektal atau penderma normal), tapak lesi (cth., lesi berbanding kawasan tanpa lesi) dan lokasi gastrousus dalam saluran (cth., duodenum, jejunum, ileum, sekum, kolon atau rektum). Kami menyediakan protokol yang dioptimumkan dalam Kotak 5 untuk mengkultur organoid kolon (koloid) yang biasanya memerlukan kepekatan morfogen yang lebih tinggi daripada organoid usus kecil.
a, Aliran kerja untuk induksi morfogenesis usus dalam cip usus. Epitelium usus manusia Caco-2 dan organoid usus digunakan dalam protokol ini untuk menunjukkan morfogenesis 3D. Sel epitelium terpencil telah disemai dalam peranti usus-atas-cip yang disediakan (penyediaan cip). Setelah sel disemai (disemai) dan dilekatkan (dilampirkan) pada membran berliang PDMS pada hari ke-0 (D0), aliran apikal (AP) dimulakan dan dikekalkan selama 2 hari pertama (aliran, AP, D0-D2). Aliran basolateral (BL) juga dimulakan bersama-sama dengan gerakan regangan kitaran (regangan, aliran, AP dan BL) apabila lapisan tunggal 2D lengkap terbentuk. Morfogenesis 3D usus berlaku secara spontan selepas 5 hari kultur mikrofluidik (morfogenesis, D5). Imej kontras fasa menunjukkan morfologi perwakilan sel Caco-2 pada setiap langkah eksperimen atau titik masa (graf bar, 100 µm). Empat gambar rajah skematik yang menggambarkan lata morfogenesis usus yang sepadan (kanan atas). Garis putus-putus Anak panah dalam skematik mewakili arah aliran bendalir. b, Imej SEM menunjukkan topologi permukaan epitelium Caco-2 3D yang terbentuk (kiri). Sisipan yang menonjolkan kawasan yang diperbesarkan (kotak putus-putus putih) menunjukkan mikrovili yang dihasilkan semula pada lapisan Caco-2 3D (kanan). c, Pandangan hadapan mendatar bagi membran Caco-2 3D, claudin (ZO-1, merah) dan sempadan berus berterusan yang terbentuk berlabel F-aktin (hijau) dan nukleus (biru). Visualisasi konfokal imunofluoresens sel epitelium pada cip usus. Anak panah yang menunjuk ke skematik tengah menunjukkan lokasi satah fokus untuk setiap pandangan konfokal. d, Perjalanan masa perubahan morfologi dalam organoid yang dikultur pada cip yang diperoleh melalui mikroskopi kontras fasa pada hari ke-3, 7, 9, 11, dan 13. Sisipan (kanan atas) menunjukkan pembesaran tinggi imej yang disediakan. e, Fotomikrograf DIC epitelium 3D organoid yang terbentuk dalam usus pada hirisan yang diambil pada hari ke-7. f, Imej imunofluoresens bertindih menunjukkan penanda untuk sel stem (LGR5; magenta), sel goblet (MUC2; hijau), F-aktin (kelabu) dan nukleus (sia) yang ditanam pada cip usus selama 3 hari, masing-masing (Kiri) dan organoid 13 hari (tengah) pada lapisan epitelium. Lihat juga Data Lanjutan Rajah 3, yang menonjolkan isyarat LGR5 tanpa isyarat MUC2. Imej pendarfluor menunjukkan mikrostruktur epitelium (kanan) epitelium organoid 3D yang terbentuk dalam usus pada cip dengan mewarnakan membran plasma dengan pewarna CellMask (kanan) pada hari ke-13 kultur. Bar skala ialah 50 μm melainkan dinyatakan sebaliknya. b Dicetak semula dengan kebenaran daripada rujukan. 2. Oxford University Press; c Diadaptasi dengan kebenaran daripada Rujukan. 2. Oxford University Press; e dan f diadaptasi dengan kebenaran melalui rujukan. 12 Di bawah Lesen Creative Commons CC BY 4.0.
Dalam usus pada cip, adalah perlu untuk mengubah suai permukaan hidrofobik membran berliang PDMS untuk salutan ECM yang berjaya. Dalam protokol ini, kami menggunakan dua kaedah berbeza untuk mengubah suai hidrofobisiti membran PDMS. Untuk mengkultur sel Caco-2, pengaktifan permukaan melalui rawatan UV/ozon sahaja sudah mencukupi untuk mengurangkan hidrofobisiti permukaan PDMS, menyaluti ECM dan melekatkan sel Caco-2 pada membran PDMS. Walau bagaimanapun, kultur mikrofluidik epitelium organoid memerlukan fungsian permukaan berasaskan kimia untuk mencapai pemendapan protein ECM yang cekap dengan menggunakan polietilenimina (PEI) dan glutaraldehida secara berurutan pada saluran mikro PDMS. Selepas pengubahsuaian permukaan, protein ECM dimendapkan untuk menutup permukaan PDMS yang berfungsi dan kemudian dimasukkan ke dalam epitelium organoid yang terasing. Selepas sel dilekatkan, kultur sel mikrofluidik bermula dengan hanya meresapkan medium ke dalam saluran mikro atas sehingga sel membentuk lapisan tunggal yang lengkap, manakala saluran mikro bawah mengekalkan keadaan statik. Kaedah yang dioptimumkan untuk pengaktifan permukaan dan salutan ECM ini membolehkan pelekatan epitelium organoid untuk mendorong morfogenesis 3D pada PDMS. permukaan.
Kultur Transwell juga memerlukan salutan ECM sebelum pembenihan sel; walau bagaimanapun, kultur Transwell tidak memerlukan langkah prarawatan yang kompleks untuk mengaktifkan permukaan sisipan berliang. Bagi pertumbuhan sel Caco-2 pada sisipan Transwell, salutan ECM pada sisipan berliang mempercepatkan pelekatan sel Caco-2 yang terpisah (<1 jam) dan pembentukan penghalang simpang ketat (<1-2 hari). Bagi mengkultur organoid pada sisipan Transwell, organoid terasing dibenih pada sisipan bersalut ECM, dilekatkan pada permukaan membran (<3 jam) dan dikekalkan sehingga organoid membentuk lapisan tunggal lengkap dengan integriti penghalang. Kultur Transwell dilakukan dalam plat 24-telaga tanpa menggunakan cip hibrid.
Morfogenesis 3D in vitro boleh dimulakan dengan menggunakan aliran bendalir pada aspek basolateral lapisan epitelium yang telah terbentuk. Dalam usus pada cip, morfogenesis epitelium bermula apabila medium diperfusikan ke dalam mikrosaluran atas dan bawah (Rajah 3a). Seperti yang diterangkan sebelum ini, adalah penting untuk memperkenalkan aliran bendalir dalam petak inferior (basolateral) untuk penyingkiran berterusan perencat morfogen yang dirembeskan secara berarah. Untuk menyediakan nutrien dan serum yang mencukupi kepada sel yang terikat pada membran berliang dan menghasilkan tegasan ricih luminal, kami biasanya menggunakan aliran berganda dalam usus pada cip. Dalam cip hibrid, sisipan Transwell yang mengandungi monolayer epitelium dimasukkan ke dalam cip hibrid. Kemudian, medium digunakan di bawah bahagian basolateral sisipan Transwell berliang melalui mikrosaluran. Morfogenesis usus berlaku 3-5 hari selepas permulaan aliran basolateral dalam kedua-dua platform kultur.
Ciri-ciri morfologi lapisan epitelium 3D yang direkayasa mikro boleh dianalisis dengan menggunakan pelbagai modaliti pengimejan, termasuk mikroskopi kontras fasa, mikroskopi kontras gangguan pembezaan (DIC), SEM atau mikroskopi konfokal imunofluoresen (Rajah 3 dan 4). Pengimejan kontras fasa atau DIC boleh dilakukan dengan mudah pada bila-bila masa semasa kultur untuk memantau bentuk dan penonjolan lapisan epitelium 3D. Disebabkan oleh ketelusan optik PDMS dan filem poliester, kedua-dua platform cip usus-pada-cip dan hibrid boleh menyediakan pengimejan in situ masa nyata tanpa perlu memotong atau membuka peranti. Semasa melakukan pengimejan imunofluoresen (Rajah 1, 3c, f dan 4b, c), sel biasanya difiksasi dengan 4% (wt/vol) paraformaldehid (PFA), diikuti oleh Triton X-100 dan 2% (wt/vol) albumin serum lembu (BSA), mengikut urutan. Bergantung pada jenis sel, fiksatif, permeabiliser dan agen penyekat yang berbeza boleh digunakan. Antibodi primer yang menyasarkan sel yang bergantung kepada keturunan atau Penanda rantau digunakan untuk menonjolkan sel yang terbiolik in situ pada cip, diikuti oleh antibodi sekunder bersama-sama dengan pewarna counterstain yang menyasarkan sama ada nukleus (contohnya, 4′,6-diamidino-2-phenylene) indol, DAPI) atau F-actin (contohnya, phalloidin berlabel fluoresen). Pengimejan langsung berasaskan pendarfluor juga boleh dilakukan in situ untuk mengesan penghasilan mukus (Rajah 1, “Pembezaan sel” dan “Fisiologi usus”), penjajahan rawak sel mikrob (Rajah 1, “Kokultur hos-mikrob”), pengambilan sel imun (Rajah 1, 'Pemodelan Penyakit') atau kontur morfologi epitelium 3D (Rajah 3c,f dan 4b,c). Apabila mengubah suai usus pada cip untuk memisahkan lapisan atas daripada lapisan mikrosaluran bawah, seperti yang diterangkan dalam rujukan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2, morfologi epitelium 3D serta mikrovili pada sempadan berus apikal boleh divisualisasikan oleh SEM (Rajah 3b). Ekspresi pembezaan Penanda boleh dinilai dengan menjalankan penjujukan PCR5 kuantitatif atau RNA sel tunggal. Dalam kes ini, lapisan 3D sel epitelium yang ditumbuhkan dalam cip usus atau cip hibrid dituai melalui tripsinisasi dan kemudian digunakan untuk analisis molekul atau genetik.
a, Aliran kerja untuk induksi morfogenesis usus dalam cip hibrid. Caco-2 dan organoid usus digunakan dalam protokol ini untuk menunjukkan morfogenesis 3D dalam platform cip hibrid. Sel epitelium yang dipisahkan telah disemai dalam sisipan Transwell yang disediakan (persediaan TW; lihat rajah di bawah). Setelah sel disemai (disemai) dan dilekatkan pada membran poliester dalam sisipan Transwell, semua sel dikultur di bawah keadaan statik (kultur TW). Selepas 7 hari, satu sisipan Transwell yang mengandungi monolayer 2D sel epitelium telah disepadukan ke dalam cip hibrid untuk memperkenalkan aliran basolateral (Flow, BL), yang akhirnya membawa kepada penjanaan lapisan epitelium 3D (morfogenesis). Mikrograf kontras fasa menunjukkan ciri morfologi sel epitelium organ manusia yang berasal daripada kolon menaik penderma normal (garis C103) pada setiap langkah eksperimen atau titik masa. Skema dalam lapisan atas menggambarkan konfigurasi eksperimen untuk setiap langkah. b, Cip hibrid (skema kiri) boleh membawa kepada morfogenesis 3D sel epitelium organoid dengan pandangan mikroskopi confocal atas ke bawah yang diambil pada kedudukan Z yang berbeza (atas, tengah, dan bawah; lihat skematik kanan dan garis putus-putus yang sepadan). menunjukkan ciri-ciri morfologi yang jelas.F-aktin (sia), nukleus (kelabu).c, Mikrograf konfokal pendarfluor (pandangan bersudut 3D) sel epitelium yang berasal dari organoid yang dikultur dalam Transwell statik (TW; sisipan dalam kotak putus-putus putih) berbanding cip hibrid (tangkapan penuh terbesar) masing-masing membandingkan morfologi 2D berbanding 3D.Sepasang pandangan potongan silang menegak 2D (sisipan di sudut kanan atas; “XZ”) juga menunjukkan ciri 2D dan 3D.Bar skala, 100 µm.c Dicetak semula dengan kebenaran daripada rujukan.4. Elsevier.
Kawalan boleh disediakan dengan mengkultur sel yang sama (Caco-2 atau sel epitelium organoid usus) ke dalam lapisan tunggal dua dimensi di bawah keadaan kultur statik konvensional. Terutamanya, kekurangan nutrien mungkin berlaku disebabkan oleh kapasiti isipadu saluran mikro yang terhad (iaitu ~4 µL dalam saluran atas pada reka bentuk cip usus asal). Oleh itu, morfologi epitelium sebelum dan selepas aplikasi aliran basolateral juga boleh dibandingkan.
Proses litografi lembut perlu dilakukan di dalam bilik yang bersih. Bagi setiap lapisan pada cip (lapisan atas dan bawah serta membran) dan cip hibrid, topeng foto yang berbeza telah digunakan dan dibuat pada wafer silikon berasingan kerana ketinggian saluran mikro adalah berbeza. Ketinggian sasaran saluran mikro atas dan bawah usus pada cip masing-masing ialah 500 µm dan 200 µm. Ketinggian sasaran saluran cip hibrid ialah 200 µm.
Letakkan wafer silikon 3 inci di dalam pinggan berisi aseton. Putar pinggan perlahan-lahan selama 30 saat, kemudian keringkan wafer dengan udara. Pindahkan wafer ke pinggan berisi IPA, kemudian putar pinggan selama 30 saat untuk membersihkan.
Larutan piranha (campuran hidrogen peroksida dan asid sulfurik pekat, 1:3 (vol/vol)) secara pilihan boleh digunakan untuk memaksimumkan penyingkiran sisa organik daripada permukaan wafer silikon.
Larutan piranha sangat menghakis dan menghasilkan haba. Langkah berjaga-jaga keselamatan tambahan adalah perlu. Untuk pelupusan sisa, biarkan larutan sejuk dan pindahkan ke bekas sisa yang bersih dan kering. Gunakan bekas sekunder dan labelkan bekas sisa dengan betul. Sila ikuti garis panduan keselamatan kemudahan untuk prosedur yang lebih terperinci.
Dehidrasi wafer dengan meletakkannya di atas plat panas 200 °C selama 10 minit. Selepas dehidrasi, wafer digoncang lima kali di udara untuk menyejukkan.
Tuangkan ~10 g photoresist SU-8 2100 ke tengah wafer silikon yang telah dibersihkan. Gunakan pinset untuk menyebarkan photoresist secara merata pada wafer. Sekali-sekala letakkan wafer di atas plat panas 65°C untuk menjadikan photoresist kurang melekit dan lebih mudah disebarkan. Jangan letakkan wafer terus di atas plat panas.
SU-8 diagihkan secara sekata pada wafer dengan menjalankan salutan spin. Programkan putaran masuk SU-8 selama 5–10 saat untuk merambat pada 500 rpm pada pecutan 100 rpm/s. Tetapkan putaran utama untuk pencorakan ketebalan 200 µm pada 1,500 rpm, atau capai ketebalan 250 µm (menjadikan ketinggian 500 µm untuk lapisan atas usus pada cip; lihat "Langkah kritikal" di bawah) tetapkan pada pecutan 300 rpm/s 30 saat pada 1,200 rpm.
Kelajuan putaran utama boleh dilaraskan mengikut ketebalan sasaran corak SU-8 pada wafer silikon.
Untuk menghasilkan corak SU-8 setinggi 500 µm untuk lapisan atas usus pada cip, langkah salutan putaran dan pembakaran lembut Kotak ini (langkah 7 dan 8) telah diulang secara berurutan (lihat langkah 9) untuk menghasilkan dua lapisan SU-8 setebal 250 µm, yang boleh dilapis dan disambungkan melalui pendedahan UV dalam langkah 12 kotak ini, menjadikan lapisan setinggi 500 µm.
Bakar wafer bersalut SU-8 dengan api perlahan dengan meletakkan wafer tersebut dengan berhati-hati di atas plat panas pada suhu 65 °C selama 5 minit, kemudian tukar tetapan kepada 95 °C dan inkubasi selama 40 minit lagi.
Untuk mencapai ketinggian 500 μm bagi corak SU-8 di saluran mikro atas, ulangi langkah 7 dan 8 untuk menghasilkan dua lapisan SU-8 setebal 250 μm.
Menggunakan Penjajar Topeng UV, lakukan ujian lampu mengikut arahan pengilang untuk mengira masa pendedahan wafer. (masa pendedahan, ms) = (dos pendedahan, mJ/cm2)/(kuasa lampu, mW/cm2).
Selepas menentukan masa pendedahan, letakkan topeng foto pada pemegang topeng penjajar topeng UV dan letakkan topeng foto pada wafer bersalut SU-8.
Letakkan permukaan bercetak topeng foto terus pada bahagian wafer silikon yang bersalut SU-8 untuk meminimumkan penyebaran UV.
Dedahkan wafer dan fotomask bersalut SU-8 secara menegak kepada 260 mJ/cm2 cahaya UV untuk masa pendedahan yang telah ditetapkan (lihat langkah 10 pada kotak ini).
Selepas pendedahan UV, wafer silikon bersalut SU-8 dibakar pada suhu 65°C selama 5 minit dan 95°C selama 15 minit pada setiap plat panas untuk menghasilkan corak dengan ketinggian 200 μm. Panjangkan masa selepas pembakaran pada suhu 95 °C hingga 30 minit untuk menghasilkan corak dengan ketinggian 500 µm.
Pembangun dituang ke dalam piring kaca, dan wafer yang telah dibakar diletakkan di dalam piring. Isipadu pembangun SU-8 mungkin berbeza-beza bergantung pada saiz plat kaca. Pastikan anda menggunakan pembangun SU-8 yang mencukupi untuk menanggalkan sepenuhnya SU-8 yang tidak terdedah. Contohnya, apabila menggunakan piring kaca berdiameter 150 mm dengan kapasiti 1 L, gunakan ~300 mL pembangun SU-8. Kembangkan acuan selama 25 minit dengan putaran lembut sekali-sekala.
Bilas acuan yang telah terbentuk dengan ~10 mL pembangun segar diikuti dengan IPA dengan menyembur larutan menggunakan pipet.
Letakkan wafer dalam pembersih plasma dan dedahkan kepada plasma oksigen (gas atmosfera, tekanan sasaran 1 × 10−5 Torr, kuasa 125 W) selama 1.5 minit.
Letakkan wafer di dalam desikator vakum dengan slaid kaca di dalamnya. Wafer dan slaid boleh diletakkan bersebelahan. Jika desikator vakum dibahagikan kepada beberapa lapisan oleh plat, letakkan slaid di ruang bawah dan wafer di ruang atas. Titiskan 100 μL larutan trikloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktil)silana pada slaid kaca dan gunakan vakum untuk silanisasi.
Cairkan sebotol sel Caco-2 beku dalam mandian air 37°C, kemudian pindahkan sel yang telah dicairkan ke dalam kelalang T75 yang mengandungi 15 mL medium Caco-2 yang telah dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 37°C.
Untuk menyalurkan sel Caco-2 pada pertemuan ~90%, panaskan dahulu medium Caco-2, PBS dan 0.25% tripsin/1 mM EDTA dalam mandian air 37°C.
Sedut medium melalui aspirasi vakum. Basuh sel dua kali dengan 5 mL PBS suam dengan mengulangi aspirasi vakum dan menambah PBS segar.