Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai izslēgt saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiks attēlota bez stiliem un JavaScript.
Cilvēka zarnu morfoģenēze nosaka kriptas-bārkstiņas 3D epitēlija mikroarhitektūras un telpiskās organizācijas iezīmes. Šī unikālā struktūra ir nepieciešama, lai uzturētu zarnu homeostāzi, aizsargājot cilmes šūnu nišu bazālajā kriptā no eksogēniem mikrobu antigēniem un to metabolītiem. Turklāt zarnu bārkstiņas un sekrētās gļotas veido funkcionāli diferencētas epitēlija šūnas ar aizsargbarjeru uz zarnu gļotādas virsmas. Tāpēc 3D epitēlija struktūru atjaunošana ir ļoti svarīga in vitro zarnu modeļu veidošanai. Jāatzīmē, ka organiskā mimētiskā zarnu mikročipa tehnoloģija var izraisīt zarnu epitēlija spontānu 3D morfoģenēzi ar uzlabotām fizioloģiskajām funkcijām un biomehāniku. Šeit mēs piedāvājam reproducējamu protokolu, lai spēcīgi inducētu zarnu morfoģenēzi zarnās gan mikrofluidikas mikroshēmā, gan Transvela iegultā hibrīda mikroshēmā. Mēs aprakstām detalizētas metodes ierīču izgatavošanai, Caco-2 vai zarnu organoīdu epitēlija šūnu kultivēšanai gan parastos apstākļos, gan mikrofluidikas platformā, 3D morfoģenēzes indukcijai un izveidotā 3D epitēlija raksturošanai, izmantojot vairākas attēlveidošanas metodes. Šis protokols panāk funkcionālas zarnu mikrofibrilācijas atjaunošanos. mikroarhitektūru, kontrolējot bazolaterālo šķidruma plūsmu 5 dienas. Mūsu in vitro morfogenēzes metode izmanto fizioloģiski atbilstošu bīdes spriegumu un mehānisku kustību, un tai nav nepieciešama sarežģīta šūnu inženierija vai manipulācija, kas varētu pārspēt citas esošās metodes. Mēs paredzam, ka mūsu ierosinātajam protokolam varētu būt plaša ietekme uz biomedicīnas pētniecības kopienu, nodrošinot metodi 3D zarnu epitēlija slāņu reģenerācijai in vitro biomedicīnas, klīniskiem un farmaceitiskiem lietojumiem.
Eksperimenti liecina, ka zarnu epitēlija Caco-2 šūnas, kas kultivētas "gunt-on-a-chip"1,2,3,4,5 vai divslāņu mikrofluidikas ierīcēs6,7, var piedzīvot spontānu 3D morfoģenēzi in vitro bez skaidras izpratnes par pamatā esošo mehānismu. Mūsu nesenajā pētījumā mēs atklājām, ka bazolaterāli sekretēto morfogēnu antagonistu izņemšana no kultivēšanas ierīcēm ir nepieciešama un pietiekama, lai inducētu 3D epitēlija morfoģenēzi in vitro, ko ir pierādījuši Caco-2 un no pacientiem iegūti zarnu organoīdi. Epitēlija šūnas tika validētas. Šajā pētījumā mēs īpaši koncentrējāmies uz spēcīga Wnt antagonista Dickkopf-1 (DKK-1) šūnu ražošanu un koncentrācijas sadalījumu zarnās uz mikroshēmas un modificētās mikrofluidikas ierīcēs, kas satur Transvela ieliktņus, ko sauc par "hibrīdčipu". Mēs pierādām, ka eksogēnu Wnt antagonistu (piemēram, DKK-1, Wnt represora 1, sekretētā frizzled-related protein 1 vai Soggy-1) pievienošana zarnām uz mikroshēmas kavē morfoģenēzi vai izjauc iepriekš strukturēto 3D epitēlija slāni, kas liecina, ka antagonistiskais stress kultūras laikā ir atbildīgs par zarnu morfoģenēzi in vitro. Tāpēc praktiska pieeja, lai panāktu spēcīgu morfoģenēzi epitēlija saskarnē, ir Wnt antagonistu līmeņa noņemšana vai minimāla uzturēšana bazolaterālajā nodalījumā, izmantojot aktīvu skalošanu (piemēram, zarnās uz mikroshēmas vai hibrīdčipa platformās) vai difūziju. Bazolaterālā barotne (piemēram, no Transvela ieliktņiem lielos bazolaterālos rezervuāros urbumos).
Šajā protokolā mēs piedāvājam detalizētu metodi “zarnas uz mikroshēmas” mikroierīču un Transvela ievietojamu hibrīdmikroshēmu izgatavošanai (1.–5. solis), lai kultivētu zarnu epitēlija šūnas uz polidimetilsiloksāna (PDMS) bāzes porainām membrānām (6.A, 7.A, 8., 9. solis) vai Transvela ieliktņu poliestera membrānām (6.B, 7.B, 8., 9. solis) un inducētu 3D morfoģenēzi in vitro (10. solis). Mēs arī identificējām šūnu un molekulārās pazīmes, kas liecina par audu specifisku histoģenēzi un no līnijas atkarīgu šūnu diferenciāciju, izmantojot vairākas attēlveidošanas modalitātes (11.–24. solis). Mēs inducējam morfoģenēzi, izmantojot cilvēka zarnu epitēlija šūnas, piemēram, Caco-2 vai zarnu organoīdus, divos kultivēšanas formātos ar tehniskām detaļām, tostarp porainu membrānu virsmas modifikāciju, 2D monoslāņu izveidi un zarnu bioķīmisko un biomehāniskās mikrovides reprodukciju in vitro. Lai inducētu 3D morfoģenēzi no 2D epitēlija monoslāņiem, mēs noņēmām morfogēnu antagonistus abās kultivētajās formās, ieplūstot barotnē. kultūras bazolaterālais nodalījums. Visbeidzot, mēs sniedzam reģenerējama 3D epitēlija slāņa lietderības attēlojumu, ko var izmantot, lai modelētu no morfogēna atkarīgu epitēlija augšanu, gareniskās saimnieka un mikrobioma kopkultūras, patogēnu infekciju, iekaisuma bojājumus, epitēlija barjeras disfunkciju un uz probiotikām balstītas terapijas. Piemērs.ietekmes.
Mūsu protokols varētu būt noderīgs plašam zinātnieku lokam fundamentālajos (piemēram, zarnu gļotādas bioloģijā, cilmes šūnu bioloģijā un attīstības bioloģijā) un lietišķajos pētījumos (piemēram, preklīniskajā zāļu testēšanā, slimību modelēšanā, audu inženierijā un gastroenteroloģijā) ar plašu ietekmi. Tā kā mūsu protokols spēj reproducēt un noturīgi inducēt zarnu epitēlija 3D morfoģenēzi in vitro, mēs paredzam, ka mūsu tehnisko stratēģiju var izplatīt auditorijai, kas pēta šūnu signālu dinamiku zarnu attīstības, reģenerācijas vai homeostāzes laikā. Turklāt mūsu protokols ir noderīgs infekcijas izpētei ar dažādiem infekcijas izraisītājiem, piemēram, norovīrusu 8, smaga akūta respiratorā sindroma koronavīrusu 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 vai Vibrio cholerae. Noderīgas ir arī slimības patoloģijas un patogenēzes auditorijas. Izmantojot mikroshēmā iebūvētu zarnu mikrofizioloģijas sistēmu, var veikt garenisku kopkultūru 10 un pēc tam novērtēt saimnieka aizsardzību, imūnās atbildes reakcijas un ar patogēniem saistīto bojājumu atjaunošanos kuņģa-zarnu traktā (KZT) 11. Citas KZT slimības, kas saistītas ar caurs zarnu sindromu, celiakiju, Krona slimību, čūlaino kolītu, paučītu vai kairinātu zarnu sindromu, var simulēt, sagatavojot 3D zarnu epitēlija slāņus, izmantojot pacienta 3D zarnu epitēlija slāņus. Šīs slimības ietver bārkstiņu atrofiju, kriptu saīsināšanos, gļotādas bojājumus vai epitēlija barjeras traucējumus. Biopsijas vai cilmes šūnu iegūti zarnu organoīdi 12,13. Lai labāk modelētu slimības vides augstāku sarežģītību, lasītāji var apsvērt iespēju pievienot slimībai atbilstošus šūnu tipus, piemēram, pacienta perifēro asiņu mononukleārās šūnas (PBMC), modeļiem, kas satur 3D zarnu bārkstiņu-kriptu mikroarhitektūras. Audu specifiskās imūnās šūnas, 5.
Tā kā 3D epitēlija mikrostruktūru var fiksēt un vizualizēt bez griezuma procesa, skatītāji, kas strādā ar telpisko transkriptiku un augstas izšķirtspējas vai superizšķirtspējas attēlveidošanu, varētu būt ieinteresēti mūsu gēnu un olbaltumvielu telpiski dinamisko kartēšanu epitēlija nišās. Interesē tehnoloģijas. Reakcija uz mikrobiāliem vai imūniem stimuliem. Turklāt garenisko saimnieka un mikrobioma šķērssarunu 10, 14, kas koordinē zarnu homeostāzi, var izveidot 3D zarnu gļotādas slānī, kopīgi kultivējot dažādas mikrobu sugas, mikrobu kopienas vai fekāliju mikrobiotu, īpaši zarnās uz mikroshēmas. platformā. Šī pieeja ir īpaši pievilcīga auditorijai, kas studē gļotādas imunoloģiju, gastroenteroloģiju, cilvēka mikrobiomu, kulturomiku un klīnisko mikrobioloģiju, lai laboratorijā kultivētu iepriekš nekultivētu zarnu mikrobiotu. Ja mūsu in vitro morfogenēzes protokolu var pielāgot mērogojamiem kultūras formātiem, piemēram, daudzu iedobumu ieliktņiem 24, 96 vai 384 iedobju plāksnēs, kas nepārtraukti papildina bazolaterālos nodalījumus, protokolu var izplatīt arī tiem, kas izstrādā farmaceitiskās, biomedicīniskās vai augstas caurlaidības skrīninga vai validācijas platformas pārtikas rūpniecībai. Kā principa pierādījumu mēs nesen parādījām daudzkārtējas augstas caurlaidības morfogenēzes sistēmas, kas ir mērogojama līdz 24 iedobju plāksnīšu formātam, iespējamību. Turklāt ir komercializēti vairāki orgānu mikroshēmas produkti16,17,18. Tāpēc mūsu in vitro morfogenēzes metodes validāciju var paātrināt un potenciāli pieņemt daudzas pētniecības laboratorijas, nozares vai valdības un regulatīvās aģentūras, lai izprastu šūnu pārprogrammēšanu in vitro zarnu morfogenēzē transkriptomiskā līmenī, lai pārbaudītu zāles vai bioterapeitiskus līdzekļus. Zāļu kandidātu absorbcija un transportēšana tika novērtēta, izmantojot 3D zarnu surogātu izmantošana vai pielāgotu vai komerciālu orgānu uz mikroshēmas modeļu izmantošana, lai novērtētu zarnu morfogenēzes procesa reproducējamību.
Zarnu epitēlija morfoģenēzes izpētei ir izmantots ierobežots skaits ar cilvēkiem saistītu eksperimentālu modeļu, galvenokārt tāpēc, ka trūkst ieviešamu protokolu 3D morfoģenēzes inducēšanai in vitro. Patiesībā liela daļa pašreizējo zināšanu par zarnu morfoģenēzi ir balstītas uz pētījumiem ar dzīvniekiem (piemēram, zebrafish20, pelēm21 vai vistām22). Tomēr tie ir darbietilpīgi un dārgi, var būt ētiski apšaubāmi un, pats galvenais, precīzi nenosaka cilvēka attīstības procesus. Šiem modeļiem ir arī ļoti ierobežotas iespējas tos testēt daudzvirzienu mērogojamā veidā. Tāpēc mūsu protokols 3D audu struktūru reģenerācijai in vitro pārspēj in vivo dzīvnieku modeļus, kā arī citus tradicionālos statiskos 2D šūnu kultūru modeļus. Kā iepriekš aprakstīts, 3D epitēlija struktūru izmantošana ļāva mums pārbaudīt diferencētu šūnu telpisko lokalizāciju kriptas-bārkstiņas asī, reaģējot uz dažādiem gļotādas vai imūnsistēmas stimuliem. 3D epitēlija slāņi var nodrošināt telpu, lai pētītu, kā mikrobu šūnas konkurē, veidojot telpiskas nišas, un ekoloģisko evolūciju, reaģējot uz saimnieka faktoriem (piemēram, iekšējie pret ārējiem gļotu slāņiem, IgA un antimikrobiālo peptīdu sekrēciju). Turklāt, 3D epitēlija morfoloģija var ļaut mums saprast, kā zarnu mikrobiota strukturē savas kopienas un sinerģiski ražo mikrobu metabolītus (piemēram, īsās ķēdes taukskābes), kas veido šūnu organizāciju un cilmes šūnu nišas bazālajās kriptās. Šīs īpašības var pierādīt tikai tad, kad 3D epitēlija slāņi ir izveidoti in vitro.
Papildus mūsu 3D zarnu epitēlija struktūru veidošanas metodei ir vairākas in vitro metodes. Zarnu organoīdu kultūra ir moderna audu inženierijas metode, kuras pamatā ir zarnu cilmes šūnu kultivēšana īpašos morfogēnu apstākļos23,24,25. Tomēr 3D organoīdu modeļu izmantošana transporta analīzei vai saimnieka un mikrobioma kopkultūrām bieži vien ir sarežģīta, jo zarnu lūmens ir ietverts organoīdā, un tāpēc lūmena komponentu, piemēram, mikrobu šūnu vai eksogēnu antigēnu, ievadīšana ir ierobežota. Piekļuvi organoīdu lūmeniem var uzlabot, izmantojot mikroinjektoru26,27, taču šī metode ir invazīva un darbietilpīga, un tās veikšanai ir nepieciešamas specializētas zināšanas. Turklāt tradicionālās organoīdu kultūras, kas tiek uzturētas hidrogelu sastatnēs statiskos apstākļos, precīzi neatspoguļo aktīvo in vivo biomehāniku.
Citas pieejas, ko izmanto vairākas pētniecības grupas, izmanto iepriekš strukturētas 3D hidrogelu karkasus, lai atdarinātu zarnu epitēlija struktūru, kultivējot izolētas cilvēka zarnu šūnas uz gēla virsmas. Izgatavojiet hidrogelu karkasus, izmantojot 3D drukātas, mikrofrēzētas vai litogrāfiski izgatavotas veidnes. Šī metode parāda izolētu epitēlija šūnu pašorganizētu izvietojumu in vitro ar fizioloģiski nozīmīgiem morfogēnu gradientiem, izveidojot augstu epitēlija struktūras malu attiecību un stromas-epitēlija šķērssavienojumu, iekļaujot stromas šūnas karkasā. Tomēr iepriekš strukturētu karkasu raksturs var traucēt paša spontānā morfogēniskā procesa parādīšanos. Šie modeļi arī nenodrošina dinamisku lūmena vai intersticiālu plūsmu, jo tiem trūkst šķidruma bīdes sprieguma, kas zarnu šūnām nepieciešams, lai veiktu morfoģenēzi un iegūtu fizioloģisko funkciju. Citā nesenā pētījumā tika izmantotas hidrogelu karkasi mikrofluidikas platformā un veidotas zarnu epitēlija struktūras, izmantojot lāzera kodināšanas metodes. Peles zarnu organoīdi seko iegravētiem modeļiem, veidojot zarnu kanāliņu struktūras, un intraluminālo šķidruma plūsmu var atkārtot, izmantojot mikrofluidikas moduli. Tomēr šis modelis neuzrāda ne spontānus morfogēniskus procesus, ne arī ietver zarnu mehanbioloģiskās kustības. Tās pašas grupas 3D drukāšanas metodes spēja izveidot miniatūras zarnu caurules ar spontāniem morfogēniskiem procesiem. Neskatoties uz dažādu zarnu segmentu sarežģīto izgatavošanu caurulē, šim modelim trūkst arī lūmena šķidruma plūsmas un mehāniskās deformācijas. Turklāt modeļa darbspēja var būt ierobežota, īpaši pēc bioprintēšanas procesa pabeigšanas, traucējot eksperimentālos apstākļus vai šūnu savstarpējo mijiedarbību. Tā vietā mūsu piedāvātais protokols nodrošina spontānu zarnu morfoģenēzi, fizioloģiski atbilstošu bīdes spriegumu, biomehāniku, kas atdarina zarnu kustīgumu, neatkarīgu apikālo un bazolaterālo nodalījumu pieejamību un sarežģītu modulāru bioloģisko mikrovidi atjaunošanu. Tāpēc mūsu in vitro 3D morfoģenēzes protokols var nodrošināt papildinošu pieeju, lai pārvarētu esošo metožu izaicinājumus.
Mūsu protokols ir pilnībā vērsts uz 3D epitēlija morfoģenēzi, kultūrā iekļaujot tikai epitēlija šūnas un bez citiem apkārtējo šūnu veidiem, piemēram, mezenhimālās šūnas, endotēlija šūnas un imūnās šūnas. Kā iepriekš aprakstīts, mūsu protokola pamatā ir epitēlija morfoģenēzes indukcija, noņemot morfogēnu inhibitorus, kas izdalās ievadītās barotnes bazolaterālajā pusē. Lai gan mūsu "zarnas uz mikroshēmas" un "hibrīds uz mikroshēmas" spēcīgā modularitāte ļauj mums atjaunot viļņoto 3D epitēlija slāni, vēl jāapsver papildu bioloģiskās sarežģītības, piemēram, epitēlija-mezenhimālā mijiedarbība33,34, ekstracelulārās matricas (ECM) nogulsnēšanās35 un, mūsu modelī, kriptu-bārkstiņu iezīmes, kas nodod cilmes šūnu nišas bazālajās kriptās. Stromas šūnas (piemēram, fibroblasti) mezenhīmā spēlē galveno lomu ECM olbaltumvielu ražošanā un zarnu morfoģenēzes regulēšanā in vivo35,37,38. Mezenhimālo šūnu pievienošana mūsu modelim uzlaboja morfoģenēzes procesu un šūnu piesaistes efektivitāti. Endotēlija slānim (t.i., kapilāriem vai limfvadiem) ir svarīga loma molekulārais transports39 un imūnšūnu piesaiste40 zarnu mikrovidē. Turklāt asinsvadu komponenti, ko var savienot starp audu modeļiem, ir priekšnoteikums, izstrādājot audu modeļus, lai demonstrētu daudzorgānu mijiedarbību. Tādēļ, lai modelētu precīzākas fizioloģiskās pazīmes ar orgānu līmeņa izšķirtspēju, var būt nepieciešams iekļaut endotēlija šūnas. No pacienta iegūtas imūnšūnas ir būtiskas arī iedzimtu imūnreakciju, antigēnu prezentācijas, iedzimtu adaptīvu imūnsistēmas savstarpējo sarunu un audu specifiskās imunitātes attēlošanai zarnu slimību imitācijas kontekstā.
Hibrīda mikroshēmu izmantošana ir vienkāršāka nekā "zarna-on-a-chip" metode, jo ierīces iestatīšana ir vienkāršāka un Transvela ieliktņu izmantošana ļauj mērogot zarnu epitēlija kultūru. Tomēr komerciāli pieejamie Transvela ieliktņi ar poliestera membrānām nav elastīgi un nevar simulēt peristaltiskas kustības. Turklāt hibrīdmikroshēmā ievietotā Transvela ieliktņa apikālais nodalījums palika nekustīgs bez bīdes sprieguma apikālajā pusē. Ir skaidrs, ka statiskās īpašības apikālajā nodalījumā reti nodrošina ilgstošu baktēriju kopkultūru hibrīdmikroshēmās. Lai gan, izmantojot hibrīdmikroshēmas, mēs varam stabili inducēt 3D morfoģenēzi Transvela ieliktņos, fizioloģiski nozīmīgas biomehānikas un apikālā šķidruma plūsmas trūkums var ierobežot hibrīdmikroshēmu platformu iespējamību potenciālajiem pielietojumiem.
Cilvēka kriptas-bārkstiņas ass pilna mēroga rekonstrukcijas "zarnas uz mikroshēmas" un "hibrīdas uz mikroshēmas" kultūrās vēl nav pilnībā izveidotas. Tā kā morfoģenēze sākas no epitēlija monoslāņa, 3D mikroarhitektūras ne vienmēr nodrošina morfoloģisku līdzību ar kriptām in vivo. Lai gan mēs raksturojām proliferējošo šūnu populāciju pie bazālā kriptas domēna mikroinženierijas 3D epitēlijā, kriptas un bārkstiņas reģioni netika skaidri norobežoti. Lai gan augstāki augšējie kanāli uz mikroshēmas palielina mikroinženierijas epitēlija augstumu, maksimālais augstums joprojām ir ierobežots līdz ~300–400 µm. Cilvēka zarnu kriptu faktiskais dziļums tievajās un resnajās zarnās ir attiecīgi ~135 µm un ~400 µm, un tievās zarnas bārkstiņu augstums ir ~600 µm41.
No attēlveidošanas viedokļa 3D mikroarhitektūru in situ superizšķirtspējas attēlveidošana var būt ierobežota ar zarnām uz mikroshēmas, jo nepieciešamais darba attālums no objektīva lēcas līdz epitēlija slānim ir aptuveni daži milimetri. Lai pārvarētu šo problēmu, var būt nepieciešams tāls objektīvs. Turklāt plānu sekciju izgatavošana attēlveidošanas paraugu sagatavošanai ir sarežģīta PDMS augstās elastības dēļ. Turklāt, tā kā zarnu mikroizgatavošana slāni pa slānim uz mikroshēmas ietver pastāvīgu saķeri starp katru slāni, ir ārkārtīgi grūti atvērt vai noņemt augšējo slāni, lai pārbaudītu epitēlija slāņa virsmas struktūru. Piemēram, izmantojot skenējošo elektronu mikroskopu (SEM).
PDMS hidrofobitāte ir bijis ierobežojošs faktors mikrofluidikas pētījumos, kas saistīti ar hidrofobām mazām molekulām, jo ​​PDMS var nespecifiski adsorbēt šādas hidrofobas molekulas. Var apsvērt alternatīvas PDMS ar citiem polimēru materiāliem. Alternatīvi, var apsvērt PDMS virsmas modifikāciju (piemēram, pārklāšanu ar lipofīliem materiāliem 42 vai poli(etilēnglikolu) 43), lai samazinātu hidrofobo molekulu adsorbciju.
Visbeidzot, mūsu metode nav labi raksturota attiecībā uz augstas caurlaidības skrīninga vai lietotājam draudzīgas eksperimentālās platformas nodrošināšanu. Pašreizējam protokolam ir nepieciešams šļirces sūknis katrai mikroierīcei, kas aizņem vietu CO2 inkubatorā un neļauj veikt liela mēroga eksperimentus. Šo ierobežojumu var ievērojami uzlabot, pielāgojot inovatīvus kultūras formātus (piemēram, 24, 96 vai 384 iedobju porainus ieliktņus, kas ļauj nepārtraukti papildināt un noņemt bazolaterālo barotni).
Lai in vitro inducētu cilvēka zarnu epitēlija 3D morfoģenēzi, mēs izmantojām mikrofluidikas mikroshēmas zarnu ierīci, kas satur divus paralēlus mikrokanālus un elastīgu porainu membrānu starp tiem, lai izveidotu lūmena-kapilāra saskarni. Mēs arī demonstrējam viena kanāla mikrofluidikas ierīces (hibrīda mikroshēmas) izmantošanu, kas nodrošina nepārtrauktu bazolaterālu plūsmu zem polarizētiem epitēlija slāņiem, kas audzēti uz Transvela ieliktņiem. Abās platformās dažādu cilvēka zarnu epitēlija šūnu morfoģenēzi var demonstrēt, pielietojot plūsmas virziena manipulāciju, lai no bazolaterālā nodalījuma noņemtu morfogēnu antagonistus. Visa eksperimentālā procedūra (1. attēls) sastāv no piecām daļām: (i) zarnu mikroshēmas vai Transvela ievietojamās hibrīdmikroshēmas mikroizgatavošana (1.–5. darbība; 1. lodziņš), (ii) zarnu epitēlija šūnu (Caco-2 šūnas) vai cilvēka zarnu organoīdu sagatavošana; 2.–5. ieraksts), (iii) zarnu epitēlija šūnu kultivēšana uz zarnu mikroshēmām vai hibrīdčipiem (6.–9. solis), (iv) 3D morfoģenēzes indukcija in vitro (10. solis) un (v)), lai raksturotu 3D epitēlija mikrostruktūru (11.–24. solis). Visbeidzot, tika izveidota atbilstoša kontroles grupa (sīkāk aplūkota turpmāk), lai apstiprinātu in vitro morfoģenēzes efektivitāti, salīdzinot epitēlija morfoģenēzi ar telpiskām, laika, nosacītām vai procedurālām kontrolēm.
Mēs izmantojām divas dažādas kultivēšanas platformas: “gunt-on-a-chip” ar taisniem kanāliem vai nelineāriem, savītiem kanāliem, vai hibrīda mikroshēmas, kas satur Transvela (TW) ieliktņus mikrofluidikas ierīcē, kas izgatavotas, kā aprakstīts 1. lodziņā, un 1.–5. solī “Ierīces izgatavošana” parādīti galvenie soļi viena mikroshēmas vai hibrīda mikroshēmas izgatavošanā. “Cilvēka zarnu epitēlija šūnu kultivēšana” skaidro šūnu avotu (Caco-2 vai cilvēka zarnu organoīdi) un kultivēšanas procedūru, kas izmantota šajā protokolā. “In vitro morfoģenēze” parāda vispārējos soļus, kuros Caco-2 vai no organoīdiem iegūtas epitēlija šūnas tiek kultivētas uz zarnu mikroshēmas vai uz hibrīda mikroshēmas Transvela ieliktņiem, kam seko 3D morfoģenēzes indukcija un raksturotas epitēlija struktūras veidošanās. Programmas soļa numurs vai lodziņa numurs ir parādīts zem katras bultiņas. Lietojumprogramma sniedz piemērus tam, kā izveidotos zarnu epitēlija slāņus var izmantot, piemēram, šūnu diferenciācijas raksturošanā, zarnu fizioloģijas pētījumos, saimnieka-mikrobioma ekosistēmu izveidē un slimību modelēšanā. Imunofluorescences attēli sadaļā “Šūnu diferenciācija”, kas parāda kodolus, F-aktīnu un MUC2 ekspresējas 3D Caco-2 epitēlija slānī, kas ģenerēts uz zarnu mikroshēmas. MUC2 signalizācija ir klātesoša kausveida šūnās un gļotās, kas izdalās no gļotādas virsmām. Fluorescējoši attēli sadaļā “Gut Physiology” parāda gļotas, kas rodas, iekrāsojot siālskābes un N-acetilglikozamīna atlikumus, izmantojot fluorescējošu kviešu dīgļu aglutinīnu. Divi pārklājošie attēli sadaļā “Host-Microbe Co-Cultures” parāda reprezentatīvas saimnieka un mikrobioma kopkultūras zarnās uz mikroshēmas. Kreisajā panelī parādīta E. coli, kas ekspresē zaļo fluorescējošo proteīnu (GFP), kopkultūra ar mikroinženierijas 3D Caco-2 epitēlija šūnām. Labajā panelī parādīta GFP E. coli lokalizācija, kas kopkultivēta ar 3D Caco-2 epitēlija šūnām, kam seko imunofluorescences krāsošana ar F-aktīnu (sarkans) un kodoliem (zils). Slimību modelēšana ilustrē veselas zarnas salīdzinājumā ar caurs zarnu zarnu iekaisuma mikroshēmās, fizioloģiski ietekmējot ar baktēriju antigēniem (piemēram, lipopolisaharīdu, LPS) un imūnšūnām (piemēram, PBMC; zaļa). Caco-2 šūnas tika kultivētas, lai izveidotu 3D epitēlija slāni. Mērogs stabiņš, 50 µm. Attēli apakšējā rindā: “Šūnu diferenciācija”, pielāgota ar 2. atsauces atļauju. Oxford University Press; reproducēts ar 5. atsauces atļauju. NAS; “Saimnieka un mikroba kopkultūra”, pielāgota ar 3. atsauces atļauju. NAS; “Slimību modelēšana”, pielāgota ar 5. atsauces atļauju. NAS.
Gan “zarnas uz mikroshēmas”, gan hibrīda mikroshēmas tika izgatavotas, izmantojot PDMS kopijas, kas tika izņemtas no silīcija veidnēm, izmantojot mīksto litogrāfiju1,44, un veidotas ar SU-8. Katras mikroshēmas mikrokanālu dizains tiek noteikts, ņemot vērā hidrodinamiku, piemēram, bīdes spriegumu un hidrodinamisko spiedienu1,4,12. Sākotnējais “zarnas uz mikroshēmas” dizains (paplašinātie dati, 1.a att.), kas sastāvēja no diviem blakus novietotiem paralēliem taisniem mikrokanāliem, ir attīstījies par sarežģītu “zarnas uz mikroshēmas” dizainu (paplašinātie dati, 1.b att.), kas ietver izliektu mikrokanālu pāri, lai izraisītu palielinātu šķidruma uzturēšanās laiku, nelineārus plūsmas modeļus un kultivēto šūnu daudzaksiālo deformāciju (2.a–f att.)12. Kad ir jāatjauno sarežģītāka zarnu biomehānika, var izvēlēties sarežģītas “zarnas uz mikroshēmas”. Mēs esam pierādījuši, ka savītā “Gut-Chip” arī spēcīgi inducē 3D morfoģenēzi līdzīgā laika posmā ar līdzīgu epitēlija augšanas pakāpi salīdzinājumā ar sākotnējo “Gut-Chip”, neatkarīgi no… kultivētu šūnu tips.Tāpēc, lai inducētu 3D morfoģenēzi, lineāri un sarežģīti mikroshēmas zarnu dizaini ir savstarpēji aizvietojami. PDMS replikas, kas sacietētas uz silikona veidnēm ar SU-8 rakstiem, pēc izņemšanas no formas nodrošināja negatīvas īpašības (2.a att.).Lai izgatavotu zarnu uz mikroshēmas, sagatavotais augšējais PDMS slānis tika secīgi savienots ar porainu PDMS plēvi un pēc tam izlīdzināts ar apakšējo PDMS slāni, izmantojot neatgriezenisku savienošanu, izmantojot koronas apstrādātāju (2.b–f att.).Lai izgatavotu hibrīdmikroshēmas, sacietētas PDMS replikas tika savienotas ar stikla slaidiem, lai izveidotu vienkanāla mikrofluidikas ierīces, kurās varētu ievietot Transvela ieliktņus (2.h att. un paplašinātie dati 2. att.).Saistīšanas process tiek veikts, apstrādājot PDMS replikas un stikla virsmas ar skābekļa plazmu vai koronas apstrādi.Pēc mikroizgatavotās ierīces, kas piestiprināta pie silikona caurules, sterilizācijas ierīces iestatījums bija gatavs zarnu epitēlija 3D morfoģenēzes veikšanai (2.g att.).
a, PDMS detaļu sagatavošanas shematisks attēlojums no SU-8 rakstu silikona veidnēm. Nesacietējušo PDMS šķīdumu ielēja silikona veidnē (pa kreisi), sacietēja 60 °C temperatūrā (vidū) un izņēma no veidnes (pa labi). Izņemto PDMS sagrieza gabalos un iztīrīja turpmākai izmantošanai.b, Silīcija veidnes fotogrāfija, kas izmantota PDMS augšējā slāņa sagatavošanai.c, Silīcija veidnes fotogrāfija, kas izmantota PDMS porainās membrānas izgatavošanai.d, Augšējo un apakšējo PDMS komponentu un saliktās uz mikroshēmas esošās zarnu ierīces fotogrāfiju sērija.e, Augšējo, membrānas un apakšējo PDMS komponentu izlīdzināšanas shēma.Katrs slānis ir neatgriezeniski savienots ar plazmas vai koronas apstrādi.f, Izgatavotās “zarna uz mikroshēmas” ierīces shēma ar uzliktiem spirālveida mikrokanāliem un vakuuma kamerām.g, “zarna uz mikroshēmas” iestatīšana mikrofluidikas šūnu kultūrai. Izgatavotā “zarna uz mikroshēmas”, kas salikta ar silikona caurulīti un šļirci, tika novietota uz pārsega stikla. Čipa ierīce tika novietota uz 150 mm Petri trauciņa vāka. apstrāde. Saistviela tiek izmantota, lai aizvērtu silikona caurulīti.h, Hibrīda mikroshēmas izgatavošanas un 3D morfoģenēzes vizuāli momentuzņēmumi, izmantojot hibrīdmikroshēmas. Transvela ieliktņi, kas sagatavoti neatkarīgi zarnu epitēlija šūnu 2D monoslāņu kultivēšanai, tika ievietoti hibrīdmikroshēmā, lai inducētu zarnu 3D morfoģenēzi. Barotne tiek perfūzēta caur mikrokanāliem zem šūnu slāņa, kas izveidots uz Transvela ieliktņa.Mēroga josla, 1 cm.h Pārpublicēts ar atsauces atļauju.4. Elsevier.
Šajā protokolā Caco-2 šūnu līnija un zarnu organoīdi tika izmantoti kā epitēlija avoti (3.a att.). Abi šūnu veidi tika kultivēti neatkarīgi (2. un 5. lodziņš) un izmantoti, lai iesētu ECM pārklātos mikroshēmas zarnu vai Transvela ieliktņu mikrokanālus. Kad šūnas ir saplūdušas (>95% pārklājums kolbās), regulāri kultivētās Caco-2 šūnas (starp 10. un 50. pasāžu) T-kolbās tiek savāktas, lai sagatavotu disociētas šūnu suspensijas ar tripsīna šķidrumu (2. lodziņš). Cilvēka zarnu organoīdi no zarnu biopsijām vai ķirurģiskām rezekcijām tika kultivēti Matrigel sastatņu kupolos 24 iedobju plāksnēs, lai atbalstītu strukturālo mikrovidi. Barotne, kas satur būtiskus morfogēnus (piemēram, Wnt, R-spondīnu un Noggin) un augšanas faktorus, kas sagatavoti, kā aprakstīts 3. lodziņā, tika papildināta katru otro dienu, līdz organoīdi izauga līdz ~500 µm diametrā. Pilnībā izaugušie organoīdi tiek savākti un disociēti atsevišķās šūnās sēšanai uz zarnām vai Transvela ieliktņiem mikroshēmā (2. lodziņš). 5). Kā jau iepriekš ziņojām, to var diferencēt atkarībā no slimības veida12,13 (piemēram, čūlainais kolīts, Krona slimība, kolorektālais vēzis vai vesels donors), bojājuma vietas (piemēram, bojājums salīdzinājumā ar neskarto zonu) un kuņģa-zarnu trakta atrašanās vietas (piemēram, divpadsmitpirkstu zarnā, tukšajā zarnā, ileumā, aklajā zarnā, resnajā zarnā vai taisnajā zarnā). 5. lodziņā mēs piedāvājam optimizētu protokolu resnās zarnas organoīdu (koloīdu) kultivēšanai, kuriem parasti nepieciešama augstāka morfogēnu koncentrācija nekā tievās zarnas organoīdiem.
a, Darbplūsma zarnu morfogenēzes indukcijai zarnu mikroshēmā. Šajā protokolā tiek izmantots Caco-2 cilvēka zarnu epitēlijs un zarnu organoīdi, lai demonstrētu 3D morfogenēzi. Izolētās epitēlija šūnas tika iesētas sagatavotajā zarnu-uz-čipa ierīcē (mikroshēmas sagatavošana). Kad šūnas ir iesētas (iesētas) un piestiprinātas (piestiprinātas) pie PDMS porainās membrānas 0. dienā (D0), tiek uzsākta un pirmās 2 dienas tiek uzturēta apikālā (AP) plūsma (plūsma, AP, D0-D2). Tiek uzsākta arī bazolaterālā (BL) plūsma kopā ar cikliskām stiepšanās kustībām (stiepšanās, plūsma, AP un BL), kad veidojas pilnīgs 2D monoslānis. Zarnu 3D morfogenēze notika spontāni pēc 5 dienu mikrofluidikas kultūras (morfogenēze, D5). Fāžu kontrasta attēli parāda Caco-2 šūnu reprezentatīvu morfoloģiju katrā eksperimentālajā posmā vai laika punktā (stabiņu diagramma, 100 µm). Četras shematiskas diagrammas, kas ilustrē atbilstošās zarnu morfogenēzes kaskādes (augšējā labajā stūrī). Pārtrauktās bultiņas shēmā attēlo virzienu Šķidruma plūsma.b, SEM attēls, kurā redzama izveidotā 3D Caco-2 epitēlija virsmas topoloģija (pa kreisi). Ieliktnis, kas izceļ palielināto laukumu (balts punktēts lodziņš), parāda reģenerētās mikrobārkstiņas uz 3D Caco-2 slāņa (pa labi).c, Izveidotā Caco-2 3D horizontālais frontālais skats, klaudīns (ZO-1, sarkans) un nepārtrauktas otas robežas membrānas, kas marķētas ar F-aktīnu (zaļš) un kodoliem (zils). Epitēlija šūnu imunofluorescences konfokālā vizualizācija uz zarnu mikroshēmām. Bultiņas, kas norāda uz shēmas vidusdaļu, norāda katra konfokālā skata fokālās plaknes atrašanās vietu.d, Morfoloģisko izmaiņu laika gaita organoīdos, kas kultivēti uz mikroshēmas, iegūta ar fāzu kontrasta mikroskopiju 3., 7., 9., 11. un 13. dienā. Ieliktnis (augšējā labajā stūrī) parāda sniegtā attēla augsto palielinājumu.e, DIC fotomikrogrāfija ar zarnās izveidoto organoīdo 3D epitēliju šķēlē, kas uzņemta 7. dienā.f, Pārklāti imunofluorescences attēli, kuros redzami cilmes šūnu (LGR5; fuksīna), kausveida šūnu (MUC2; zaļa) marķieri. F-aktīns (pelēks) un kodoli (ciāna krāsā), kas audzēti uz zarnu mikroshēmām 3 dienas (pa kreisi), un 13 dienu (vidū) organoīdi uz epitēlija slāņa. Skatīt arī paplašināto datu 3. attēlu, kurā izcelta LGR5 signalizācija bez MUC2 signalizācijas. Fluorescences attēli, kuros redzama 3D organoīda epitēlija epitēlija mikrostruktūra (pa labi), kas izveidota zarnās uz mikroshēmas, iekrāsojot plazmas membrānu ar CellMask krāsvielu (pa labi) kultūras 13. dienā. Mēroga josla ir 50 μm, ja vien nav norādīts citādi. b Pārpublicēts ar atsauces atļauju. 2. Oxford University Press; c Pielāgots ar atsauces atļauju. 2. Oxford University Press; e un f pielāgoti ar atsauces atļauju. 12 Saskaņā ar Creative Commons licenci CC BY 4.0.
Čipa zarnās ir nepieciešams modificēt PDMS porainās membrānas hidrofobo virsmu, lai veiksmīgi veiktu ECM pārklājumu. Šajā protokolā mēs izmantojam divas dažādas metodes, lai modificētu PDMS membrānu hidrofobitāti. Caco-2 šūnu kultivēšanai virsmas aktivācija ar UV/ozona apstrādi vien bija pietiekama, lai samazinātu PDMS virsmas hidrofobitāti, pārklātu ECM un piestiprinātu Caco-2 šūnas PDMS membrānai. Tomēr organoīdā epitēlija mikrofluidiskajai kultūrai ir nepieciešama ķīmiska virsmas funkcionalizācija, lai panāktu efektīvu ECM proteīnu nogulsnēšanos, secīgi uzklājot polietilēnimīnu (PEI) un glutaraldehīdu uz PDMS mikrokanāliem. Pēc virsmas modifikācijas ECM proteīni tika nogulsnēti, lai pārklātu funkcionalizēto PDMS virsmu, un pēc tam ievadīti izolētajā organoīdā epitēlijā. Pēc šūnu piestiprināšanas mikrofluidiskā šūnu kultūra sākas ar tikai barotnes perfūziju augšējā mikrokanālā, līdz šūnas veido pilnīgu monoslāni, kamēr apakšējais mikrokanāls uztur statiskus apstākļus. Šī optimizētā virsmas aktivācijas un ECM pārklāšanas metode ļauj piestiprināt organoīdo epitēliju, lai inducētu 3D morfogenēzi uz PDMS virsmas.
Transvela kultūrām pirms šūnu iesēšanas ir nepieciešams arī ECM pārklājums; tomēr Transvela kultūrām nav nepieciešami sarežģīti pirmapstrādes soļi, lai aktivizētu porainu ieliktņu virsmu. Caco-2 šūnu audzēšanai uz Transvela ieliktņiem ECM pārklājums uz porainiem ieliktņiem paātrina disociēto Caco-2 šūnu piesaisti (<1 stunda) un ciešas savienojuma barjeras veidošanos (<1–2 dienas). Lai kultivētu organoīdus uz Transvela ieliktņiem, izolētus organoīdus iesēj uz ar ECM pārklātiem ieliktņiem, piestiprina pie membrānas virsmas (<3 h) un uztur, līdz organoīdi veido pilnīgu monoslāni ar barjeras integritāti. Transvela kultūras tiek veiktas 24 iedobumu plāksnēs, neizmantojot hibrīdmikroshēmas.
In vitro 3D morfoģenēzi var uzsākt, pielietojot šķidruma plūsmu izveidotā epitēlija slāņa bazolaterālajai pusei. Zarnās uz mikroshēmas epitēlija morfoģenēze sākās, kad barotne tika perfuzēta augšējā un apakšējā mikrokanālā (3.a att.). Kā iepriekš aprakstīts, ir svarīgi ieviest šķidruma plūsmu apakšējā (bazolaterālajā) nodalījumā, lai nepārtraukti noņemtu virzītus sekretētos morfogēnu inhibitorus. Lai nodrošinātu pietiekamu barības vielu un seruma daudzumu šūnām, kas saistītas ar porainām membrānām, un radītu lūmena bīdes spriegumu, mēs parasti pielietojam divkāršu plūsmu zarnās uz mikroshēmas. Hibrīda mikroshēmās Transvela ieliktņi, kas satur epitēlija monoslāņus, tika ievietoti hibrīda mikroshēmās. Pēc tam barotne tika uzklāta zem porainā Transvela ieliktņa bazolaterālās puses caur mikrokanālu. Zarnu morfoģenēze notika 3–5 dienas pēc bazolaterālās plūsmas uzsākšanas abās kultūras platformās.
Mikroinženierijas veidoto 3D epitēlija slāņu morfoloģiskās iezīmes var analizēt, izmantojot dažādas attēlveidošanas metodes, tostarp fāzu kontrasta mikroskopiju, diferenciālās interferences kontrasta (DIC) mikroskopiju, SEM vai imunofluorescences konfokālo mikroskopiju (3. un 4. attēls). Fāzu kontrasta vai DIC attēlveidošanu var viegli veikt jebkurā laikā kultivēšanas laikā, lai uzraudzītu 3D epitēlija slāņu formu un izvirzījumu. Pateicoties PDMS un poliestera plēvju optiskajai caurspīdībai, gan "gunt-on-a-chip", gan hibrīdmikroshēmu platformas var nodrošināt reāllaika in situ attēlveidošanu bez nepieciešamības sagriezt vai izjaukt ierīci. Veicot imunofluorescences attēlveidošanu (1., 3.c, f un 4.b, c attēls), šūnas parasti tiek fiksētas ar 4% (svars/tilp.) paraformaldehīdu (PFA), kam seko Triton X-100 un 2% (svars/tilp.) liellopu seruma albumīns (BSA), šādā secībā. Atkarībā no šūnu tipa var izmantot dažādus fiksatorus, permeabilizatorus un bloķējošos līdzekļus. Primārās antivielas, kas vērstas pret no ciltsraksta atkarīgām šūnu vai reģionu marķieriem, tiek izmantotas, lai izceltu imobilizētas šūnas. in situ uz mikroshēmas, kam seko sekundārās antivielas kopā ar kontrastkrāsvielu, kas vērsta vai nu uz kodolu (piemēram, 4',6-diamidino-2-fenilēn)indolu, DAPI), vai F-aktīnu (piemēram, fluorescenci iezīmētu falloidīnu). Fluorescences tiešraides attēlveidošanu var veikt arī in situ, lai noteiktu gļotu veidošanos (1. att., “Šūnu diferenciācija” un “Zarnu fizioloģija”), mikrobu šūnu nejaušu kolonizāciju (1. att., “Saimnieka un mikroba kopkultūra”), imūnšūnu piesaisti (1. att., “Slimību modelēšana”) vai 3D epitēlija morfoloģijas kontūras (3.c, f un 4.b, c attēls). Modificējot zarnas uz mikroshēmas, lai atdalītu augšējo slāni no apakšējā mikrokanālu slāņa, kā aprakstīts atsaucē. Kā parādīts 2. attēlā, 3D epitēlija morfoloģiju, kā arī mikrobārkstiņas uz apikālās otas robežas var vizualizēt ar SEM (3.b attēls). Diferenciācijas marķieru ekspresiju var novērtēt, veicot kvantitatīvu PCR5 vai vienas šūnas RNS sekvencēšanu. Šajā gadījumā zarnu mikroshēmās vai hibrīdmikroshēmās audzētu epitēlija šūnu 3D slāņus iegūst ar tripsinizāciju un pēc tam izmanto molekulārajai vai ģenētiskajai analīzei.
a, Darbplūsma zarnu morfogenēzes indukcijai hibrīdmikroshēmā. Šajā protokolā Caco-2 un zarnu organoīdi tiek izmantoti, lai demonstrētu 3D morfogenēzi hibrīdmikroshēmas platformā. Disociētās epitēlija šūnas tika iesētas sagatavotos Transvela ieliktņos (TW sagatavošana; skatīt attēlu zemāk). Kad šūnas bija iesētas (iesētas) un piestiprinātas pie poliestera membrānām Transvela ieliktņos, visas šūnas tika kultivētas statiskos apstākļos (TW kultūra). Pēc 7 dienām viens Transvela ieliktnis, kas saturēja 2D epitēlija šūnu monoslāni, tika integrēts hibrīdmikroshēmā, lai ieviestu bazolaterālu plūsmu (Flow, BL), kas galu galā noveda pie 3D epitēlija slāņa ģenerēšanas (morfogenēze). Fāžu kontrasta mikroattēli, kas parāda cilvēka orgānu epitēlija šūnu morfoloģiskās iezīmes, kas iegūtas no normāla donora (C103 līnija) augšupejošās resnās zarnas katrā eksperimentālajā solī vai laika punktā. Augšējo slāņu shēmas ilustrē katra soļa eksperimentālo konfigurāciju. b, Hibrīda mikroshēmas (kreisā shēma) var izraisīt organoīdu epitēlija šūnu 3D morfogenēzi ar augšas uz leju vērstiem konfokālās mikroskopijas skatiem, kas uzņemti dažādās Z pozīcijās (augšējā, vidējā un apakšējā; skatīt labo shēmu un atbilstošās punktētās līnijas). uzrādīja acīmredzamas morfoloģiskas īpašības. F-aktīns (ciāns), kodols (pelēks). c, Fluorescences konfokālās mikroattēli (3D leņķisks skats) no organoīdiem iegūtām epitēlija šūnām, kas kultivētas statiskā Transvela (TW; ieliktnis baltā punktētā lodziņā) salīdzinājumā ar hibrīda mikroshēmu (lielākais pilnais kadrs), salīdzinot attiecīgi 2D un 3D morfoloģiju. Divu 2D vertikālu šķērsgriezuma skatu pāris (ieliktnis augšējā labajā stūrī; “XZ”) parāda arī 2D un 3D iezīmes. Mēroga josla, 100 µm. c Pārpublicēts ar atsauces atļauju. 4. Elsevier.
Kontroles var sagatavot, kultivējot tās pašas šūnas (Caco-2 vai zarnu organoīdās epitēlija šūnas) divdimensiju monoslāņos parastos statiskās kultivēšanas apstākļos. Jāatzīmē, ka barības vielu noplicināšanās var rasties mikrokanālu ierobežotās tilpuma ietilpības dēļ (t. i., ~4 µl augšējā kanālā sākotnējā zarnu mikroshēmas dizainā). Tādēļ var salīdzināt arī epitēlija morfoloģiju pirms un pēc bazolaterālās plūsmas pielietošanas.
Mīkstās litogrāfijas process jāveic tīrā telpā. Katram mikroshēmas slānim (augšējam un apakšējam slānim un membrānām) un hibrīdmikroshēmām tika izmantotas dažādas fotomaskas, kas tika izgatavotas uz atsevišķām silīcija plāksnēm, jo ​​mikrokanālu augstumi bija atšķirīgi. Mikroshēmas iekšējās daļas augšējo un apakšējo mikrokanālu mērķa augstumi ir attiecīgi 500 µm un 200 µm. Hibrīda mikroshēmas kanāla mērķa augstums ir 200 µm.
Ievietojiet 3 collu silikona vafeli traukā ar acetonu. Viegli virpiniet plāksni 30 sekundes, pēc tam nosusiniet vafeli gaisā. Pārvietojiet vafeli uz plāksnes ar IPA un pēc tam centrifugējiet plāksni 30 sekundes, lai to notīrītu.
Lai maksimāli palielinātu organisko atlikumu noņemšanu no silīcija plāksnes virsmas, var izvēlēties izmantot piranjas šķīdumu (ūdeņraža peroksīda un koncentrētas sērskābes maisījumu, 1:3 (tilp./tilp.)).
Piranjas šķīdums ir ārkārtīgi kodīgs un rada siltumu. Ir nepieciešami papildu drošības pasākumi. Atkritumu utilizācijai ļaujiet šķīdumam atdzist un pārvietojiet to uz tīru, sausu atkritumu konteineru. Izmantojiet sekundāros konteinerus un pareizi marķējiet atkritumu konteinerus. Lūdzu, ievērojiet iestādes drošības vadlīnijas, lai iegūtu detalizētākas procedūras.
Dehidrējiet vafeles, novietojot tās uz 200 °C karstas plāksnes uz 10 minūtēm. Pēc dehidratācijas vafeles piecas reizes kratīja gaisā, lai tās atdzistu.
Uzlejiet ~10 g fotorezista SU-8 2100 uz notīrītās silīcija plāksnes centra. Izmantojiet pinceti, lai vienmērīgi izklātu fotorezistoru uz plāksnes. Ik pa laikam novietojiet plāksni uz 65°C karstas plāksnes, lai fotorezists kļūtu mazāk lipīgs un vieglāk uzklājams. Nenovietojiet plāksni tieši uz karstas plāksnes.
SU-8 tika vienmērīgi sadalīts uz vafeles, izmantojot griešanās pārklāšanu. Ieprogrammējiet SU-8 ienākošo rotāciju 5–10 sekundes, lai tā izplatītos ar ātrumu 500 apgr./min un paātrinājumu 100 apgr./min. Iestatiet galveno griešanos 200 µm biezuma rakstu veidošanai ar ātrumu 1500 apgr./min vai sasniedziet 250 µm biezumu (veidojot 500 µm augstumu mikroshēmas iekšējās daļas augšējam slānim; skatiet sadaļu “Kritiskie soļi” zemāk), iestatot paātrinājumu 300 apgr./min 30 sekundes pie 1200 apgr./min.
Galveno griešanās ātrumu var regulēt atbilstoši SU-8 raksta mērķa biezumam uz silīcija vafeles.
Lai izgatavotu 500 µm augstus SU-8 rakstus mikroshēmas iekšējās daļas augšējam slānim, šīs kastes centrifūgas pārklāšanas un mīkstās cepšanas soļi (7. un 8. solis) tika secīgi atkārtoti (sk. 9. soli), lai izveidotu divus 250 µm biezus SU-8 slāņus, kurus var slāņot un savienot ar UV starojumu šīs kastes 12. solī, izveidojot 500 µm augstu slāni.
Mīksti cepiet SU-8 pārklātās plāksnītes, uzmanīgi novietojot tās uz karstas plāksnes 65 °C temperatūrā 5 minūtes, pēc tam pārslēdziet temperatūru uz 95 °C un inkubējiet vēl 40 minūtes.
Lai augšējā mikrokanālā sasniegtu 500 μm augstumu SU-8 rakstu, atkārtojiet 7. un 8. darbību, lai izveidotu divus 250 μm biezus SU-8 slāņus.
Izmantojot UV maskas izlīdzinātāju, veiciet lampas testu saskaņā ar ražotāja norādījumiem, lai aprēķinātu plāksnītes ekspozīcijas laiku (ekspozīcijas laiks, ms) = (ekspozīcijas deva, mJ/cm2)/(lampas jauda, ​​mW/cm2).
Pēc ekspozīcijas laika noteikšanas novietojiet fotomasku uz UV maskas izlīdzinātāja maskas turētāja un novietojiet fotomasku uz SU-8 pārklātās plāksnes.
Lai samazinātu UV starojuma izkliedi, novietojiet fotomaskas apdrukāto virsmu tieši uz silīcija vafeles SU-8 pārklātās puses.
Apstaro SU-8 pārklāto plāksni un fotomasku vertikāli ar 260 mJ/cm2 UV gaismas iepriekš noteikto ekspozīcijas laiku (skatīt šīs rūtiņas 10. darbību).
Pēc UV starojuma iedarbības SU-8 pārklātās silīcija plāksnes tika ceptas 65 °C temperatūrā 5 minūtes un 95 °C temperatūrā 15 minūtes uz katras sildvirsmas, lai izveidotu rakstus ar 200 μm augstumu. Pēccepšanas laiku 95 °C temperatūrā pagarināja līdz 30 minūtēm, lai izveidotu rakstus ar 500 µm augstumu.
Attīstītāju ielej stikla traukā, un cepto plāksni ievieto traukā. SU-8 attīstītāja tilpums var atšķirties atkarībā no stikla plāksnes izmēra. Pārliecinieties, ka izmantojat pietiekami daudz SU-8 attīstītāja, lai pilnībā noņemtu neapstaroto SU-8. Piemēram, izmantojot 150 mm diametra stikla trauku ar 1 l tilpumu, izmantojiet ~300 ml SU-8 attīstītāja. Attīstiet veidni 25 minūtes, ik pa laikam viegli pagriežot.
Noskalojiet attīstīto veidni ar ~10 ml svaiga attīstītāja, kam seko IPA, izsmidzinot šķīdumu ar pipeti.
Ievietojiet plāksni plazmas tīrītājā un pakļaujiet to skābekļa plazmai (atmosfēras gāze, mērķa spiediens 1 × 10−5 Torr, jauda 125 W) 1,5 minūtes.
Ievietojiet plāksni vakuuma eksikatorā ar stikla priekšmetstikliņu iekšpusē. Plāksnes un priekšmetstikliņus var novietot blakus. Ja vakuuma eksikators ir sadalīts vairākos slāņos ar plāksni, ievietojiet priekšmetstikliņus apakšējā kamerā un plāksnītes augšējā kamerā. Piliniet 100 μL trihloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktil)silāna šķīduma uz stikla priekšmetstikliņa un pielietojiet vakuumu silanizācijai.
Atkausējiet flakonu ar saldētām Caco-2 šūnām 37°C ūdens vannā, pēc tam pārvietojiet atkausētās šūnas uz T75 kolbu, kas satur 15 ml 37°C iepriekš uzsildītas Caco-2 barotnes.
Lai Caco-2 šūnas cirkulētu ~90% konfluencē, vispirms 37°C ūdens vannā jāuzsilda Caco-2 barotne, PBS un 0,25% tripsīns/1 mM EDTA.
Aspirējiet barotni ar vakuuma aspirāciju. Šūnas divas reizes mazgājiet ar 5 ml silta PBS, atkārtojot vakuuma aspirāciju un pievienojot svaigu PBS.