Хвала вам што сте посетили Nature.com. Верзија прегледача коју користите има ограничену подршку за CSS. За најбоље искуство, препоручујемо вам да користите ажурирани прегледач (или да искључите режим компатибилности у Internet Explorer-у). У међувремену, како бисмо осигурали континуирану подршку, приказиваћемо сајт без стилова и JavaScript-а.
Морфогенеза људског црева успоставља карактеристике крипто-вилуса 3Д епителне микроархитектуре и просторне организације. Ова јединствена структура је неопходна за одржавање хомеостазе црева заштитом нише матичних ћелија у базалној крипти од егзогених микробних антигена и њихових метаболита. Поред тога, цревне ресице и лучење слузи представљају функционално диференциране епителне ћелије са заштитном баријером на површини цревне слузокоже. Стога је рекреирање 3Д епителних структура кључно за изградњу ин витро модела црева. Приметно је да органско миметско црево на чипу може индуковати спонтану 3Д морфогенезу цревног епитела са побољшаним физиолошким функцијама и биомехаником. Овде пружамо репродуктивни протокол за робусно индуковање цревне морфогенезе у цревима на микрофлуидном чипу, као и у Трансвел уграђеном хибридном чипу. Описујемо детаљне методе за израду уређаја, култивацију Caco-2 или цревних органоидних епителних ћелија у конвенционалним условима, као и на микрофлуидној платформи, индукцију 3Д морфогенезе и карактеризацију успостављеног 3Д епитела коришћењем вишеструких модалитета снимања. Овим протоколом се постиже регенерација функционалне микроархитектуре црева контролом базолатералног протока течности током 5 дана. Наша метода морфогенезе in vitro користи физиолошки релевантно смицајно напрезање и механичко кретање и не захтева сложено ћелијско инжењерство или манипулацију, што може надмашити друге постојеће технике. Замишљамо да би наш предложени протокол могао имати широке импликације за биомедицинску истраживачку заједницу, пружајући метод за регенерацију 3Д слојева цревног епитела in vitro за биомедицинске, клиничке и фармацеутске примене.
Експерименти показују да ћелије цревног епитела Caco-2 култивисане у уређајима типа „црево на чипу“1,2,3,4,5 или двослојним микрофлуидним уређајима6,7 могу проћи кроз спонтану 3Д морфогенезу in vitro без јасног разумевања основног механизма. У нашој недавној студији, открили смо да је уклањање базолатерално секретованих антагониста морфогена из уређаја за култивацију неопходно и довољно да индукује 3Д епителну морфогенезу in vitro, што је показано помоћу Caco-2 и цревних органоида изведених од пацијената. Епителне ћелије су валидиране. У овој студији, посебно смо се фокусирали на ћелијску производњу и дистрибуцију концентрације снажног Wnt антагониста, Dickkopf-1 (DKK-1), у цревима на чипу и модификованим микрофлуидним уређајима који садрже Transwell инсерте, назване „Хибридни чип“. Показали смо да додавање егзогених Wnt антагониста (као што су DKK-1, Wnt репресор 1, секретовани frizzled-related protein 1 или Soggy-1) у црева на чипу инхибира морфогенезу или ремети преструктурирани 3D епителни слој, што сугерише да је антагонистички стрес током културе одговоран за цревну морфогенезу in vitro. Стога, практичан приступ за постизање робусне морфогенезе на епителном интерфејсу је уклањање или минимално одржавање нивоа Wnt антагониста у базолатералном одељку активним испирањем (нпр. у платформама црева на чипу или хибрида на чипу) или дифузијом. Базолатерални медијум (нпр. из Transwell инсерта у велике базолатералне резервоаре у бунарима).
У овом протоколу, пружамо детаљан метод за израду микроуређаја типа „црево на чипу“ и хибридних чипова који се могу уметнути у Трансвел (кораци 1-5) за култивацију ћелија цревног епитела на порозним мембранама на бази полидиметилсилоксана (PDMS) (кораци 6А, 7А, 8, 9) или полиестерским мембранама Трансвел уметака (кораци 6Б, 7Б, 8, 9) и индуковану 3Д морфогенезу in vitro (корак 10). Такође смо идентификовали ћелијске и молекуларне карактеристике које указују на ткивно специфичну хистогенезу и ћелијску диференцијацију зависну од лозе применом вишеструких модалитета снимања (кораци 11-24). Индукујемо морфогенезу користећи ћелије људског цревног епитела, као што су Caco-2 или цревни органоиди, у два формата културе са техничким детаљима који укључују модификацију површине порозних мембрана, стварање 2Д монослојева и цревну биохемију и репродукцију биомеханичког микроокружења in vitro. Да бисмо индуковали 3Д морфогенезу из 2Д епителних монослојева, уклонили смо антагонисте морфогена у оба култивисана облика протоком... медијум у базолатерални одељак културе. Коначно, пружамо приказ корисности регенерабилног 3Д епителног слоја који се може користити за моделирање раста епитела зависног од морфогена, уздужних кокултура домаћина и микробиома, инфекције патогенима, инфламаторних повреда, дисфункције епителне баријере и терапија заснованих на пробиотицима. Пример утицаја.
Наш протокол може бити користан широком спектру научника у основним (нпр. биологија цревне слузокоже, биологија матичних ћелија и развојна биологија) и примењеним истраживањима (нпр. преклиничко тестирање лекова, моделирање болести, ткивно инжењерство и гастроентерологија) са широким утицајем. Због репродуктивности и робусности нашег протокола за индуковање 3Д морфогенезе цревног епитела in vitro, предвиђамо да се наша техничка стратегија може дисеминирати публици која проучава динамику ћелијске сигнализације током развоја црева, регенерације или хомеостазе. Поред тога, наш протокол је користан за испитивање инфекције под различитим инфективним агенсима као што су норовирус 8, тешки акутни респираторни синдром коронавирус 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 или Vibrio cholerae. Такође су корисне публике патологије и патогенезе болести. Употреба система за микрофизиологију црева на чипу може омогућити лонгитудиналну ко-културу 10 и накнадну процену одбране домаћина, имуних одговора и поправке повреда повезаних са патогенима у гастроинтестиналном (ГИ) тракту 11. Други ГИ поремећаји повезани са синдромом пропустљивог црева, целијакијом, Кроновом болешћу, улцерозним колитисом, поухитисом или синдромом иритабилног црева могу се симулирати када се 3Д слојеви цревног епитела припреме коришћењем пацијентових 3Д слојева цревног епитела, а ове болести укључују атрофију ресица, скраћивање крипти, оштећење слузокоже или оштећену епителну баријеру. Биопсија или цревни органоиди изведени из матичних ћелија 12,13. Да би се боље моделирала већа сложеност окружења болести, читаоци могу размотрити додавање типова ћелија релевантних за болест, као што су мононуклеарне ћелије периферне крви пацијента (PBMC), моделима који садрже 3Д микроархитектуре цревних ресица и крипти, ткивно специфичне имуне ћелије, 5.
Пошто се 3Д епителна микроструктура може фиксирати и визуализовати без процеса сечења, посматрачи који раде на просторној транскриптомици и снимању високе или супер резолуције могу бити заинтересовани за наше мапирање просторно-временске динамике гена и протеина на епителним нишама. Заинтересовани за технологију. Одговор на микробне или имунолошке стимулусе. Штавише, уздужно преслушкивање домаћина и микробиома 10, 14 које координира хомеостазу црева може се успоставити у 3Д слоју цревне слузокоже кокултивацијом различитих микробних врста, микробних заједница или фекалне микробиоте, посебно у цревима на чипу. на платформи. Овај приступ је посебно атрактиван за публику која проучава имунологију слузокоже, гастроентерологију, људски микробиом, културомику и клиничку микробиологију, а која жели да култивише претходно некултивисану цревну микробиоту у лабораторији. Ако се наш протокол морфогенезе in vitro може прилагодити скалабилним форматима културе, као што су уметци са више бунара у плочама са 24, 96 или 384 бунара који континуирано обнављају базолатералне одељке, протокол се такође може дистрибуирати онима који развијају фармацеутске, биомедицинске или платформе за скрининг или валидацију високог протока за прехрамбену индустрију. Као доказ принципа, недавно смо показали изводљивост мултиплекс система морфогенезе високог протока који се може скалирати на формат плоче са 24 бунара. Поред тога, комерцијализовани су производи са више органа на чипу16,17,18. Стога, валидација наше методе морфогенезе in vitro може се убрзати и потенцијално усвојити од стране многих истраживачких лабораторија, индустрије или владиних и регулаторних агенција како би се разумело ћелијско репрограмирање морфогенезе црева in vitro на транскриптомском нивоу за тестирање лекова или биотерапеутика. Апсорпција и Транспорт кандидата за лекове процењен је коришћењем 3Д сурогата црева или коришћењем прилагођених или комерцијалних модела органа на чипу како би се проценила репродуктивност процеса морфогенезе црева.
Ограничен број експерименталних модела релевантних за људе коришћен је за проучавање морфогенезе цревног епитела, углавном због недостатка имплементираних протокола за индуковање 3Д морфогенезе in vitro. У ствари, велики део тренутног знања о морфогенези црева заснива се на студијама на животињама (нпр. зебрице20, мишеви21 или пилићи22). Међутим, оне су радно и скупо интензивне, могу бити етички упитне и, што је најважније, не одређују прецизно процесе људског развоја. Ови модели су такође веома ограничени у својој могућности да се тестирају на вишеструко скалабилан начин. Стога, наш протокол за регенерацију 3Д структура ткива in vitro надмашује in vivo животињске моделе, као и друге традиционалне статичке 2Д моделе ћелијске културе. Као што је претходно описано, коришћење 3Д епителних структура нам је омогућило да испитамо просторну локализацију диференцираних ћелија у оси крипта-вилус као одговор на различите мукозне или имунолошке стимулусе. 3Д епителни слојеви могу пружити простор за проучавање како се микробне ћелије такмиче да формирају просторне нише и еколошку еволуцију као одговор на факторе домаћина (нпр. унутрашњи наспрам спољашњих слојева слузи, секрецију IgA и антимикробни пептиди). Штавише, 3Д епителна морфологија нам може омогућити да разумемо како цревна микробиота структурира своје заједнице и синергистички производи микробне метаболите (нпр. масне киселине кратког ланца) који обликују ћелијску организацију и нише матичних ћелија у базалним криптама. Ове карактеристике се могу показати само када се 3Д епителни слојеви успоставе in vitro.
Поред наше методе креирања 3Д структура цревног епитела, постоји неколико ин витро метода. Култура цревних органоида је најсавременија техника ткивног инжењерства заснована на култивацији цревних матичних ћелија под специфичним условима морфогена23,24,25. Међутим, употреба 3Д органоидних модела за анализу транспорта или ко-културе домаћина и микробиома је често изазовна јер је цревни лумен затворен унутар органоида и стога је уношење луминалних компоненти као што су микробне ћелије или егзогени антигени ограничено. Приступ органоидним луменима може се побољшати коришћењем микроињектора26,27, али ова метода је инвазивна и радно интензивна и захтева специјализовано знање за извођење. Штавише, традиционалне органоидне културе одржаване у хидрогелним скелама под статичким условима не одражавају тачно активну ин виво биомеханику.
Други приступи које користе неколико истраживачких група користе претходно структуриране 3Д хидрогелне скеле како би имитирале структуру цревног епитела култивисањем изолованих људских цревних ћелија на површини гела. Направите хидрогелне скеле користећи 3Д штампане, микроглодане или литографски израђене калупе. Ова метода показује самоорганизовани распоред изолованих епителних ћелија in vitro са физиолошки релевантним градијентима морфогена, успостављајући епителну структуру високог односа ширине и висине и преслушкивање строме и епитела укључивањем стромалних ћелија у скелу. Међутим, природа претходно структурираних скела може спречити приказивање самог спонтаног морфогенетског процеса. Ови модели такође не пружају динамичан луминални или интерстицијални ток, недостаје им напон смицања течности који је цревним ћелијама потребан да би прошле кроз морфогенезу и стекле физиолошку функцију. Још једна недавна студија користила је хидрогелне скеле у микрофлуидној платформи и обликовала структуре цревног епитела користећи технике ласерског нагризања. Мишји цревни органоиди прате нагризане обрасце да би формирали цревне цевасте структуре, а интралуминални ток течности може се рекапитулирати помоћу микрофлуидног модула. Међутим, овај модел не показује ни спонтани... морфогенетски процеси нити укључује механобиолошке покрете црева. Технике 3Д штампања из исте групе биле су у стању да створе минијатурне цревне цеви са спонтаним морфогенетским процесима. Упркос сложеној изради различитих сегмената црева унутар цеви, овом моделу такође недостаје проток луминалне течности и механичка деформација. Поред тога, оперативност модела може бити ограничена, посебно након што је процес биоштампања завршен, што нарушава експерименталне услове или интеракције ћелија-ћелија. Уместо тога, наш предложени протокол пружа спонтану морфогенезу црева, физиолошки релевантан напон смицања, биомеханику која опонаша покретљивост црева, доступност независних апикалних и базолатералних одељака и рекреацију сложених биолошких микроокружења модуларности. Стога, наш in vitro 3Д протокол морфогенезе може пружити комплементарни приступ за превазилажење изазова постојећих метода.
Наш протокол је у потпуности фокусиран на 3Д епителну морфогенезу, са само епителним ћелијама у култури и без других врста околних ћелија као што су мезенхималне ћелије, ендотелне ћелије и имуне ћелије. Као што је претходно описано, суштина нашег протокола је индукција епителне морфогенезе уклањањем инхибитора морфогена који се луче на базолатералној страни уведеног медијума. Иако нам робусна модуларност нашег црева на чипу и хибрида на чипу омогућава да рекреирамо таласасти 3Д епителни слој, додатне биолошке сложености као што су епително-мезенхималне интеракције33,34, таложење екстрацелуларног матрикса (ECM)35 и, у нашем моделу, карактеристике крипте и ресица које преносе нише матичних ћелија у базалним криптама, остаје да се даље разматрају. Стромалне ћелије (нпр. фибробласти) у мезенхиму играју кључну улогу у производњи ECM протеина и регулацији цревне морфогенезе in vivo35,37,38. Додавање мезенхималних ћелија нашем моделу побољшало је морфогенетски процес и везивање ћелија. ефикасност. Ендотелни слој (тј. капилари или лимфни чворови) игра важну улогу у регулисању молекуларног транспорта39 и регрутовању имуних ћелија40 у цревном микроокружењу. Штавише, компоненте васкулатуре које се могу повезати између модела ткива су предуслов када су модели ткива дизајнирани да демонстрирају интеракције између више органа. Стога, ендотелне ћелије могу бити потребне да би се моделирале прецизније физиолошке карактеристике са резолуцијом на нивоу органа. Имунске ћелије изведене од пацијента су такође неопходне за приказивање урођених имуних одговора, презентације антигена, урођеног адаптивног имуног преслушкивања и ткивно специфичног имунитета у контексту имитирања цревних болести.
Употреба хибридних чипова је једноставнија од црева на чипу јер је подешавање уређаја једноставније, а употреба Трансвел уметака омогућава скалабилну културу цревног епитела. Међутим, комерцијално доступни Трансвел уметци са полиестерским мембранама нису еластични и не могу симулирати перисталтичке покрете. Штавише, апикални одељак Трансвел уметка постављеног у хибридни чип остао је непокретан без смицајног напрезања на апикалној страни. Јасно је да статичка својства у апикалном одељку ретко омогућавају дугорочну бактеријску ко-културу у хибридним чиповима. Иако можемо снажно индуковати 3Д морфогенезу у Трансвел уметцима када користимо хибридне чипове, недостатак физиолошки релевантне биомеханике и апикалног протока течности може ограничити изводљивост хибридних чип платформи за потенцијалне примене.
Потпуне реконструкције људске осе крипта-вилус у културама црева на чипу и хибрида на чипу нису у потпуности утврђене. Пошто морфогенеза почиње од епителног монослоја, 3Д микроархитектуре не пружају нужно морфолошку сличност са криптама in vivo. Иако смо окарактерисали популацију пролиферирајућих ћелија близу базалног домена крипте у микроинжењерисаном 3Д епителу, региони крипте и вилуса нису били јасно разграничени. Иако виши горњи канали на чипу доводе до повећане висине микроинжењерисаног епитела, максимална висина је и даље ограничена на ~300–400 µm. Стварна дубина људских цревних крипти у танком и дебелом цреву је ~135 µm и ~400 µm, респективно, а висина ресица танког црева је ~600 µm41.
Са становишта снимања, снимање 3Д микроархитектура у супер резолуцији in situ може бити ограничено на црева на чипу, пошто је потребна радна удаљеност од објектива до епителног слоја реда величине неколико милиметара. Да би се превазишао овај проблем, може бити потребан удаљени објектив. Штавише, прављење танких пресека за припрему узорака за снимање је изазовно због високе еластичности PDMS-а. Штавише, пошто микрофабрикација црева слој по слој на чипу укључује трајно пријањање између сваког слоја, изузетно је изазовно отворити или уклонити горњи слој да би се испитала површинска структура епителног слоја. На пример, коришћењем скенирајућег електронског микроскопа (SEM).
Хидрофобност ПДМС-а је била ограничавајући фактор у микрофлуидним студијама које се баве хидрофобним малим молекулима, јер ПДМС може неспецифично да адсорбује такве хидрофобне молекуле. Алтернативе ПДМС-у могу се размотрити са другим полимерним материјалима. Алтернативно, модификација површине ПДМС-а (нпр. премазивање липофилним материјалима 42 или поли(етилен гликолом) 43) може се размотрити како би се минимизирала адсорпција хидрофобних молекула.
Коначно, наша метода није добро окарактерисана у смислу пружања високопропусног скрининга или „универзалне“ експерименталне платформе која је једноставна за коришћење. Тренутни протокол захтева шприц пумпу по микроуређају, што заузима простор у CO2 инкубатору и спречава експерименте великих размера. Ово ограничење се може значајно побољшати скалабилношћу иновативних формата културе (нпр. порозни уметци са 24, 96 или 384 бунара који омогућавају континуирано допуњавање и уклањање базолатералних медија).
Да бисмо индуковали 3Д морфогенезу људског цревног епитела in vitro, користили смо микрофлуидни чип цревни уређај који садржи два паралелна микроканала и еластичну порозну мембрану између њих како бисмо створили лумен-капиларни интерфејс. Такође демонстрирамо употребу једноканалног микрофлуидног уређаја (хибридног чипа) који обезбеђује континуирани базолатерални проток испод поларизованих епителних слојева узгајаних на Трансвел инсертима. На обе платформе, морфогенеза различитих ћелија људског цревног епитела може се демонстрирати применом усмерене манипулације протоком како би се уклонили антагонисти морфогена из базолатералног одељка. Читав експериментални поступак (Слика 1) састоји се од пет делова: (i) микрофабрикација цревног чипа или Трансвел инсербилног хибридног чипа (кораци 1-5; Оквир 1), (ii) припрема ћелија цревног епитела (Caco-2 ћелије) или органоида људског црева; оквири 2-5), (iii) култура ћелија цревног епитела на цревним чиповима или хибридним чиповима (кораци 6-9), (iv) индукција 3Д морфогенезе in vitro (корак 10) и (v)) за карактеризацију 3Д епителне микроструктуре (кораци 11-24). Коначно, одговарајућа контролна група (о којој ће бити детаљније речи у наставку) је дизајнирана да потврди ефикасност in vitro морфогенезе упоређивањем епителне морфогенезе са просторним, временским, условним или процедуралним контролама.
Користили смо две различите платформе за култивацију: црева на чипу са правим каналима или нелинеарним завојитим каналима, или хибридне чипове који садрже Трансвел (ТВ) уметке у микрофлуидном уређају, направљеном као што је описано у Оквиру 1, и корак 1-5. „Израда уређаја“ приказује главне кораке у изради једног чипа или хибридног чипа. „Култура ћелија људског цревног епитела“ објашњава извор ћелија (Caco-2 или људски цревни органоиди) и поступак културе који се користи у овом протоколу. „Ин витро морфогенеза“ приказује укупне кораке у којима се ћелије епитела изведене из Caco-2 или органоида култивишу на цревном чипу или на Трансвел уметцима хибридног чипа, након чега следи индукција 3Д морфогенезе и формирање окарактерисане епителне структуре. Број корака програма или број оквира приказан је испод сваке стрелице. Апликација пружа примере како се успостављени слојеви цревног епитела могу користити, на пример, у карактеризацији ћелијске диференцијације, студијама физиологије црева, успостављању екосистема домаћин-микробиом и моделирању болести. Слике имунофлуоресценције у „Диференцијацији ћелија“ приказују се језгра, Ф-актин и MUC2 експримирани у 3Д Caco-2 епителном слоју генерисаном на цревном чипу. MUC2 сигнализација је присутна у пехарастим ћелијама и слузи која се излучује са површина слузокоже. Флуоресцентне слике у Gut Physiology приказују слуз произведену бојењем за сијаличну киселину и остатке N-ацетилглукозамина коришћењем флуоресцентног аглутинина пшеничних клица. Две преклапајуће слике у „Host-Microbe Co-Cultures“ приказују репрезентативне ко-културе домаћина и микробиома у цревима на чипу. Леви панел приказује ко-културу E. coli која експримира зелени флуоресцентни протеин (GFP) са микроинжењерским 3Д Caco-2 епителним ћелијама. Десни панел приказује локализацију GFP E. coli ко-култивисане са 3Д Caco-2 епителним ћелијама, након чега следи имунофлуоресцентно бојење са F-актином (црвено) и језгрима (плаво). Моделирање болести илуструје здраво наспрам синдрома пропустљивог црева у чиповима за упалу црева под физиолошким изазовом са бактеријским антигенима (нпр. липополисахаридом, LPS) и имуним ћелијама (нпр. PBMC; зелена). Caco-2 ћелије су култивисане да би се успоставио 3Д епителни слој. Скала, 50 µm. Слике у доњем реду: „Диференцијација ћелија“ адаптирана уз дозволу из референце.2. Oxford University Press; Репродуковано уз дозволу из референце.5. NAS; „Кокултура домаћина и микроба“ адаптирана уз дозволу из референце.3. NAS; „Моделирање болести“ адаптирано уз дозволу из референце.5. NAS.
И чипови типа „црево на чипу“ и хибридни чипови су направљени коришћењем PDMS реплика које су извађене из силицијумских калупа меком литографијом1,44 и обликоване помоћу SU-8. Дизајн микроканала у сваком чипу је одређен узимањем у обзир хидродинамике као што су смицајни напон и хидродинамички притисак1,4,12. Оригинални дизајн „црево на чипу“ (Проширени подаци, слика 1а), који се састојао од два паралелна равна микроканала један поред другог, еволуирао је у сложени дизајн „црево на чипу“ (Проширени подаци, слика 1б) који укључује пар закривљених микроканала како би се изазвало повећано време задржавања течности, нелинеарни обрасци протока и вишеосна деформација култивисаних ћелија (слика 2а–ф)12. Када је потребно рекреирати сложенију биомеханику црева, могу се изабрати сложени „црево на чипу“. Показали смо да увијени „цревни чип“ такође снажно индукује 3Д морфогенезу у сличном временском оквиру са сличним степеном раста епитела у поређењу са оригиналним „цревним чипом“. без обзира на тип култивисаних ћелија. Стога, да би се индуковала 3Д морфогенеза, линеарни и комплексни дизајни црева на чипу су заменљиви. ПДМС реплике очврснуте на силицијумским калупима са СУ-8 обрасцима пружиле су негативне карактеристике након вађења из калупа (Слика 2а). Да би се направила црева на чипу, припремљени горњи ПДМС слој је секвенцијално везан за порозни ПДМС филм, а затим поравнат са доњим ПДМС слојем неповратним везивањем помоћу коронског третмана (Слика 2б–ф). Да би се направили хибридни чипови, очврснуте ПДМС реплике су везане за стаклене плочице да би се створили једноканални микрофлуидни уређаји који би могли да приме Трансвел уметке (Слика 2х и Проширени подаци Слика 2). Процес везивања се изводи третирањем површина ПДМС реплике и стакла кисеоничком плазмом или коронским третманом. Након стерилизације микрофабрикованог уређаја причвршћеног за силиконску цев, подешавање уређаја је било спремно за извођење 3Д морфогенезе цревног епитела (Слика 2г).
а, Шематски приказ припреме ПДМС делова из силиконских калупа са узорком СУ-8. Неочвршћени ПДМС раствор је сипан на силиконски калуп (лево), очврснут на 60 °C (средина) и извађен из калупа (десно). Извађени ПДМС је исечен на комаде и очишћен за даљу употребу.б, Фотографија силиконског калупа који се користи за припрему горњег слоја ПДМС-а.ц, Фотографија силиконског калупа који се користи за израду порозне ПДМС мембране.д, Серија фотографија горњих и доњих ПДМС компоненти и склопљеног цревног уређаја на чипу.е, Шематски приказ поравнања горњих, мембранских и доњих ПДМС компоненти. Сваки слој је неповратно повезан плазма или коронском обрадом.ф, Шематски приказ направљеног уређаја „црево на чипу“ са суперпонираним завојитим микроканалима и вакуумским коморама.г, Постављање „црева на чипу“ за микрофлуидну ћелијску културу. Направљено црево на чипу склопљено силиконском цеви и шприцем је постављено на покровно стакло. Уређај са чипом је постављен на поклопац Петријеве посуде од 150 мм. посуда за обраду. Везиво се користи за затварање силиконске цеви.х, Визуелни снимци израде хибридног чипа и 3Д морфогенезе коришћењем хибридних чипова. Трансвел инсерти припремљени независно за култивацију 2Д монослојева ћелија цревног епитела уметнути су у хибридни чип да би се индуковала 3Д морфогенеза црева. Медијум се перфузује кроз микроканале испод ћелијског слоја успостављеног на Трансвел инсерту. Скала, 1 цм.х Прештампано уз дозволу референце.4. Елсевиер.
У овом протоколу, ћелијска линија Caco-2 и цревни органоиди коришћени су као епителни извори (Сл. 3а). Обе врсте ћелија су култивисане независно (Оквир 2 и Оквир 5) и коришћене за засејавање ECM-ом обложених микроканала црева на чипу или Transwell уметака. Када су ћелије конфлуентне (>95% покривености у бочицама), рутински култивисане Caco-2 ћелије (између пасажа 10 и 50) у Т-бочицама се сакупљају да би се припремиле дисоциране ћелијске суспензије помоћу течности за трипсинизацију (оквир 2). Људски цревни органоиди из цревних биопсија или хируршких ресекција култивисани су у Matrigel скелетним куполама у плочама са 24 бунарића како би се подржало структурно микроокружење. Медијум који садржи есенцијалне морфогене (као што су Wnt, R-спондин и Noggin) и факторе раста припремљене као што је описано у Оквиру 3 допуњаван је сваког другог дана док органоиди нису нарасли до ~500 µм у пречнику. Потпуно узгајани органоиди се сакупљају и дисоцирају у појединачне ћелије за засејавање на црева или Трансвел уметци на чипу (Оквир 5). Као што смо раније известили, може се разликовати према типу болести12,13 (нпр. улцерозни колитис, Кронова болест, колоректални карцином или нормални донор), месту лезије (нпр. лезија у односу на неоштећено подручје) и гастроинтестиналној локацији у тракту (нпр. дуоденум, јејунум, илеум, цекум, дебело црево или ректум). У Оквиру 5 пружамо оптимизован протокол за култивацију органоида дебелог црева (колоида) који обично захтевају веће концентрације морфогена него органоиди танког црева.
а, Радни ток за индукцију морфогенезе црева у цревном чипу. У овом протоколу се користе Caco-2 људски цревни епител и цревни органоиди за демонстрацију 3Д морфогенезе. Изоловане епителне ћелије су посејане у припремљени уређај „црево на чипу“ (припрема чипа). Када се ћелије посеју (засеју) и причврсте (причврсте) за порозну мембрану PDMS 0. дана (D0), покреће се апикални (AP) ток и одржава се прва 2 дана (проток, AP, D0-D2). Базолатерални (BL) ток се такође покреће заједно са цикличним покретима истезања (истезање, проток, AP и BL) када се формира комплетан 2D монослој. Интестинална 3D морфогенеза се спонтано догодила након 5 дана микрофлуидне културе (морфогенеза, D5). Слике фазног контраста приказују репрезентативну морфологију Caco-2 ћелија у сваком експерименталном кораку или временској тачки (стубичасти графикон, 100 µm). Четири шематска дијаграма који илуструју одговарајуће каскаде морфогенезе црева (горе десно). Испрекидане стрелице. На шеми је приказан смер протока течности.б, СЕМ слика која приказује површинску топологију успостављеног 3Д Caco-2 епитела (лево). Уметнути део који истиче увећану област (бели испрекидани оквир) приказује регенерисане микровиле на 3Д Caco-2 слоју (десно).ц, Хоризонтални фронтални приказ успостављеног Caco-2 3Д, клаудина (ZO-1, црвена) и континуираних мембрана четкастог руба означених као F-актин (зелена) и језгра (плава). Имунофлуоресцентна конфокална визуелизација епителних ћелија на цревним чиповима. Стрелице које усмеравају ка средњем шематском приказу означавају локацију фокалне равни за сваки конфокални приказ.д, Временски ток морфолошких промена у органоидима култивисаним на чипу добијеним фазно контрастном микроскопијом 3., 7., 9., 11. и 13. дана. Уметнути део (горе десно) приказује велико увећање дате слике.е, DIC фотомикрографија органоидног 3Д епитела успостављеног у цревима на пресеку снимљеном 7. дана.ф, Преклопљене имунофлуоресцентне слике које приказују маркере за матичне ћелије. (LGR5; магента), пехарасте ћелије (MUC2; зелена), F-актин (сива) и језгра (цијан) узгајане на цревним чиповима 3 дана, респективно (лево) и 13-дневни (средњи) органоиди на епителном слоју. Видети такође слику 3 са проширеним подацима, која истиче LGR5 сигнализацију без MUC2 сигнализације. Флуоресцентне слике које приказују епителну микроструктуру (десно) 3Д органоидног епитела успостављеног у цревима на чипу бојењем плазма мембране бојом CellMask (десно) 13. дана културе. Скала је 50 μм осим ако није другачије назначено.б Прештампано уз дозволу из референце.2. Oxford University Press;ц Адаптирано уз дозволу из референце.2. Oxford University Press; е и ф адаптирано уз дозволу референцом.12 Под Creative Commons лиценцом CC BY 4.0.
У цревима на чипу, неопходно је модификовати хидрофобну површину порозне ПДМС мембране за успешно премазивање ЕЦМ-ом. У овом протоколу, примењујемо две различите методе за модификацију хидрофобности ПДМС мембрана. За култивацију Цацо-2 ћелија, површинска активација само УВ/озонским третманом била је довољна да смањи хидрофобност ПДМС површине, премаже ЕЦМ и причврсти Цацо-2 ћелије за ПДМС мембрану. Међутим, микрофлуидна култура органоидног епитела захтева хемијску површинску функционализацију како би се постигло ефикасно таложење ЕЦМ протеина секвенцијалним наношењем полиетиленимина (ПЕИ) и глутаралдехида на ПДМС микроканале. Након модификације површине, ЕЦМ протеини су депоновани да би покрили функционализовану ПДМС површину, а затим су унети у изоловани органоидни епител. Након што су ћелије причвршћене, микрофлуидна ћелијска култура почиње перфузијом само медијума у ​​горњи микроканал док ћелије не формирају комплетан монослој, док доњи микроканал одржава статичке услове. Ова оптимизована метода за површинску активацију и премазивање ЕЦМ-ом омогућава причвршћивање органоидног епитела да би се индуковала 3Д морфогенеза на ПДМС површини.
Трансвел културе такође захтевају премаз ECM-ом пре сетве ћелија; међутим, Трансвел културе не захтевају сложене кораке претходне обраде да би се активирала површина порозних уметака. За узгој Caco-2 ћелија на Трансвел уметцима, премаз ECM-ом на порозним уметцима убрзава везивање дисоцираних Caco-2 ћелија (<1 сат) и формирање чврсте спојне баријере (<1-2 дана). Да би се култивисали органоиди на Трансвел уметцима, изоловани органоиди се сеју на уметке обложене ECM-ом, причвршћују се за површину мембране (<3 сата) и одржавају док органоиди не формирају комплетан монослој са интегритетом баријере. Трансвел културе се изводе на плочама са 24 бунара без употребе хибридних чипова.
Ин витро 3Д морфогенеза може се иницирати применом протока течности на базолатерални аспект успостављеног епителног слоја. У цревима на чипу, епителна морфогенеза је почела када је медијум перфузиран у горњи и доњи микроканал (Сл. 3а). Као што је претходно описано, кључно је увести проток течности у доњи (базолатерални) одељак ради континуираног уклањања усмерено секретованих инхибитора морфогена. Да бисмо обезбедили довољно хранљивих материја и серума ћелијама везаним за порозне мембране и генерисали луминални смицајни напон, обично примењујемо двоструки проток у цревима на чипу. Код хибридних чипова, Трансвел уметци који садрже епителне монослојеве су уметнути у хибридне чипове. Затим је медијум примењен испод базолатералне стране порозног Трансвел уметка кроз микроканал. Интестинална морфогенеза се догодила 3-5 дана након почетка базолатералног протока у обе платформе за културу.
Морфолошке карактеристике микроинжењерских 3Д епителних слојева могу се анализирати применом различитих модалитета снимања, укључујући фазно-контрастну микроскопију, диференцијално-интерферентну контрастну (DIC) микроскопију, SEM или имунофлуоресцентну конфокалну микроскопију (слике 3 и 4). Фазно-контрастно или DIC снимање може се лако извршити у било ком тренутку током културе како би се пратио облик и избочина 3Д епителних слојева. Због оптичке транспарентности PDMS и полиестерских филмова, и платформе „црево на чипу“ и хибридне чипове могу пружити снимање in situ у реалном времену без потребе за сечењем или растављањем уређаја. Приликом извођења имунофлуоресцентног снимања (слике 1, 3ц, ф и 4б, ц), ћелије се обично фиксирају са 4% (теж./вол.) параформалдехидом (PFA), затим Triton X-100 и 2% (теж./вол.) говеђим серумским албумином (BSA), редом. У зависности од типа ћелије, могу се користити различити фиксативи, пермеабилизатори и блокирајући агенси. Примарна антитела усмерена на ћелију или регион зависан од лозе. Маркери се користе за истицање ћелија имобилисаних in situ на чипу, након чега следе секундарна антитела заједно са контрастном бојом која циља или једро (нпр. 4′,6-диамидино-2-фенилен) индол, DAPI) или F-актин (нпр. флуоресцентно обележени фалоидин). Снимање уживо засновано на флуоресценцији такође се може извести in situ за детекцију производње слузи (Сл. 1, „Диференцијација ћелија“ и „Физиологија црева“), насумичне колонизације микробних ћелија (Сл. 1, „Кокултура домаћина и микроба“), регрутовања имуних ћелија (Сл. 1, „Моделирање болести“) или контура 3Д епителне морфологије (Сл. 3ц, ф и 4б, ц). Када се модификује црево на чипу да би се одвојио горњи слој од доњег слоја микроканала, као што је описано у реф. Као што је приказано на Сл. 2, 3Д епителна морфологија, као и микровили на апикалној четкастој ивици, могу се визуализовати помоћу SEM (Сл. 3б). Експресија Маркери диференцијације могу се проценити извођењем квантитативне PCR5 или секвенцирањем РНК појединачних ћелија. У овом случају, 3Д слојеви епителних ћелија узгајаних у цревним чиповима или хибридним чиповима се сакупљају трипсинизацијом, а затим користе за молекуларну или генетску анализу.
а, Радни ток за индукцију цревне морфогенезе у хибридном чипу. Caco-2 и цревни органоиди се користе у овом протоколу за демонстрацију 3Д морфогенезе на хибридној чип платформи. Дисоциране епителне ћелије су посејане у припремљене Трансвел уметке (TW преп; видети слику испод). Након што су ћелије посејане (засејане) и причвршћене за полиестерске мембране у Трансвел уметцима, све ћелије су култивисане у статичким условима (TW култура). Након 7 дана, један Трансвел уметак који садржи 2Д монослој епителних ћелија је интегрисан у хибридни чип да би се увео базолатерални ток (Flow, BL), што је на крају довело до стварања 3Д епителног слоја (морфогенеза). Фазно контрастне микрографије које приказују морфолошке карактеристике ћелија епитела људских органа изведених из нормалног донора (линија C103) узлазног колона у сваком експерименталном кораку или временској тачки. Шеме у горњим слојевима илуструју експерименталну конфигурацију за сваки корак.б, Хибридни чипови (леви шематски приказ) могу довести до 3Д морфогенезе ћелија органоидног епитела са приказима конфокалне микроскопије одозго надоле снимљеним у различитим Z позиције (горња, средња и доња; видети десну шему и одговарајуће испрекидане линије). показале су очигледне морфолошке карактеристике. F-актин (цијан), једро (сива).c, Флуоресцентне конфокалне микрографије (3D угаони поглед) епителних ћелија изведених из органоида култивисаних у статичком Transwell-у (TW; уметак унутар беле испрекидане кутије) у односу на хибридни чип (највећи снимак у целини) упоређујући 2D и 3D морфологију, респективно. Пар 2D вертикалних попречних пресека (уметак у горњем десном углу; „XZ“) такође приказује 2D и 3D карактеристике. Размера, 100 µm.c Прештампано уз дозволу референце.4. Elsevier.
Контроле се могу припремити култивисањем истих ћелија (Caco-2 или цревних органоидних епителних ћелија) у дводимензионалне монослојеве под конвенционалним статичким условима културе. Приметно је да исцрпљивање хранљивих материја може настати због ограниченог запреминског капацитета микроканала (тј. ~4 µL у горњем каналу на оригиналном дизајну цревног чипа). Стога се може упоредити и епителна морфологија пре и после примене базолатералног протока.
Процес меке литографије треба изводити у чистој просторији. За сваки слој на чипу (горњи и доњи слој и мембране) и хибридним чиповима, коришћене су различите фотомаске и направљене на одвојеним силицијумским плочицама јер су висине микроканала биле различите. Циљне висине горњег и доњег микроканала црева на чипу су 500 µm и 200 µm, респективно. Циљна висина канала хибридног чипа је 200 µm.
Ставите силицијумску плочицу од 7,5 цм у посуду са ацетоном. Лагано окрећите плочу 30 секунди, а затим је осушите на ваздуху. Пребаците плочицу на плочу са IPA, а затим је окрећите 30 секунди да бисте је очистили.
Раствор пиране (смеша водоник-пероксида и концентроване сумпорне киселине, 1:3 (вол/вол)) може се опционо користити за максимизирање уклањања органских остатака са површине силицијумске плочице.
Раствор пиране је изузетно корозиван и ствара топлоту. Неопходне су додатне мере предострожности. За одлагање отпада, оставите раствор да се охлади и пребаците га у чисту, суву посуду за отпад. Користите секундарне контејнере и правилно обележите контејнере за отпад. Молимо вас да пратите безбедносне смернице објекта за детаљније процедуре.
Дехидрирајте вафле тако што ћете их ставити на плочу загрејану на 200 °C током 10 минута. Након дехидрације, вафла је пет пута протресена на ваздуху да се охлади.
Сипајте ~10 г фоторезиста SU-8 2100 на средину очишћене силицијумске плочице. Користите пинцету да равномерно распоредите фоторезист по плочици. Повремено ставите плочицу на грејну плочу загрејану на 65°C како би фоторезист био мање лепљив и лакши за мазање. Не стављајте плочицу директно на грејну плочу.
SU-8 је равномерно распоређен по плочици покретањем центрифугирања. Програмирајте долазну ротацију SU-8 током 5–10 секунди да се шири брзином од 500 о/мин и убрзањем од 100 о/мин/с. Подесите главно окретање за обликовање дебљине 200 µм на 1.500 о/мин или постигнете дебљину од 250 µм (чинећи висину од 500 µм за горњи слој црева на чипу; видети „Критични кораци“ испод) подешено на убрзање од 300 о/мин/с током 30 секунди при 1.200 о/мин.
Главна брзина центрифуге може се подесити у складу са циљном дебљином СУ-8 узорка на силицијумској плочици.
Да би се направили SU-8 обрасци висине 500 µм за горњи слој црева на чипу, кораци центрифугирања и меког печења ове кутије (кораци 7 и 8) су секвенцијално поновљени (видети корак 9) да би се произвела два слоја SU-8 дебљине 250 µм, који се могу слојевито наносити и спојити УВ зрачењем у кораку 12 ове кутије, чинећи слој висине 500 µм.
Меко пеците вафле обложене SU-8 тако што ћете их пажљиво ставити на врућу плочу на 65 °C током 5 минута, затим пребаците подешавање на 95 °C и инкубирајте додатних 40 минута.
Да бисте постигли висину СУ-8 узорка од 500 μм у горњем микроканалу, поновите кораке 7 и 8 да бисте генерисали два слоја СУ-8 дебљине 250 μм.
Користећи УВ маску за поравнавање, извршите тест лампе према упутствима произвођача да бисте израчунали време експозиције плочице. (време експозиције, ms) = (доза експозиције, mJ/cm2) / (снага лампе, mW/cm2).
Након одређивања времена експозиције, поставите фотомаску на држач маске поравнавача УВ маске и поставите фотомаску на плочицу обложену SU-8.
Поставите одштампану површину фотомаске директно на страну силицијумске плочице обложену SU-8 како бисте смањили УВ дисперзију.
Изложите SU-8 премазану плочицу и фотомаску вертикално УВ светлости од 260 mJ/cm2 током унапред одређеног времена експозиције (видети корак 10 овог оквира).
Након излагања УВ зрачењу, силицијумске плочице обложене SU-8 су печене на 65°C током 5 минута и 95°C током 15 минута на свакој врућој плочи да би се направили обрасци висине 200 μm. Време након печења на 95°C продужено је на 30 минута да би се направили обрасци висине 500 μm.
Развијач се сипа у стаклену посуду, а печена вафла се ставља у посуду. Запремина развијача SU-8 може да варира у зависности од величине стаклене плоче. Уверите се да користите довољно развијача SU-8 да бисте потпуно уклонили неосветљени SU-8. На пример, када користите стаклену посуду пречника 150 mm са капацитетом од 1 l, користите ~300 ml развијача SU-8. Развијајте калуп 25 минута уз повремено нежно окретање.
Исперите развијени калуп са ~10 мл свежег развијача, а затим IPA прскањем раствора пипетом.
Ставите плочицу у плазма чистач и изложите је кисеоничкој плазми (атмосферски гас, циљни притисак 1 × 10−5 Torr, снага 125 W) током 1,5 мин.
Ставите плочицу у вакуумски ексикатор са стакленом плочицом унутра. Плочице и плочице могу се поставити једна поред друге. Ако је вакуумски ексикатор подељен на неколико слојева плочом, поставите плочице у доњу комору, а плочице у горњу комору. На стаклену плочицу сипајте 100 μL раствора трихлоро(1H, 1H, 2H, 2H-перфлуорооктил)силана и примените вакуум за силанизацију.
Отопите бочицу замрзнутих Caco-2 ћелија у воденом купатилу на 37°C, а затим пребаците одмрзнуте ћелије у Т75 боцу која садржи 15 мл претходно загрејане Caco-2 подлоге на 37°C.
Да би се Caco-2 ћелије преносиле на ~90% конфлуентности, прво загрејте Caco-2 медијум, PBS и 0,25% трипсина/1 mM EDTA у воденом купатилу на 37°C.
Аспирирајте медијум вакуумском аспирацијом. Исперите ћелије два пута са 5 мл топлог PBS-а понављањем вакуумске аспирације и додавањем свежег PBS-а.