Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu pro CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v prohlížeči Internet Explorer). Mezitím budeme web zobrazovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Morfogeneze lidského střeva zavádí rysy krypta-klků s 3D epiteliální mikroarchitekturou a prostorovou organizací. Tato jedinečná struktura je nezbytná pro udržení homeostázy střeva ochranou niky kmenových buněk v bazální kryptě před exogenními mikrobiálními antigeny a jejich metabolity. Kromě toho střevní klky a vylučující hlen představují funkčně diferencované epiteliální buňky s ochrannou bariérou na povrchu střevní sliznice. Proto je pro konstrukci in vitro modelů střeva klíčové znovuvytvořit 3D epiteliální struktury. Je pozoruhodné, že organická mimetická střeva na čipu mohou indukovat spontánní 3D morfogenezi střevního epitelu se zvýšenými fyziologickými funkcemi a biomechanikou. Zde poskytujeme reprodukovatelný protokol pro robustní indukci střevní morfogeneze ve střevě na mikrofluidním čipu i na hybridním čipu Transwell. Popisujeme podrobné metody pro výrobu zařízení, kultivaci Caco-2 nebo střevních organoidních epiteliálních buněk v konvenčním prostředí i na mikrofluidní platformě, indukci 3D morfogeneze a charakterizaci zavedeného 3D epitelu s využitím různých zobrazovacích modalit. Tento protokol dosahuje regenerace funkční střevní mikroarchitektury řízením bazolaterálního toku tekutiny po dobu 5 dnů. Naše metoda morfogeneze in vitro využívá fyziologicky relevantní smykové napětí a mechanický pohyb a nevyžaduje složité buněčné inženýrství ani manipulaci, což by mohlo překonat jiné stávající techniky. Předpokládáme, že náš navrhovaný protokol by mohl mít široké důsledky pro biomedicínskou výzkumnou komunitu a poskytnout metodu regenerace 3D vrstev střevního epitelu in vitro pro biomedicínské, klinické a farmaceutické aplikace.
Experimenty ukazují, že střevní epiteliální buňky Caco-2 kultivované v zařízeních typu „gut-on-a-chip“1,2,3,4,5 nebo v dvouvrstvých mikrofluidních zařízeních6,7 mohou podléhat spontánní 3D morfogenezi in vitro bez jasného pochopení základního mechanismu. V naší nedávné studii jsme zjistili, že odstranění bazolaterálně sekretovaných antagonistů morfogenů z kultivačních zařízení je nezbytné a dostatečné k indukci 3D epiteliální morfogeneze in vitro, což bylo prokázáno pomocí Caco-2 a střevních organoidů odvozených od pacienta. Epitelové buňky byly validovány. V této studii jsme se konkrétně zaměřili na buněčnou produkci a distribuci koncentrace silného Wnt antagonisty, Dickkopf-1 (DKK-1), v zařízeních typu gut-on-a-chip a modifikovaných mikrofluidních zařízeních obsahujících vložky Transwell, nazývaných „hybridní čip“. Prokazujeme, že přidání exogenních Wnt antagonistů (jako je DKK-1, Wnt represor 1, sekretovaný protein frizzled-related protein 1 nebo Soggy-1) do zařízení typu on-chip inhibuje morfogenezi nebo narušuje předstrukturovanou 3D epiteliální vrstvu, což naznačuje, že antagonistický stres během kultivace je zodpovědný za střevní morfogenezi in vitro. Praktickým přístupem k dosažení robustní morfogeneze na epiteliálním rozhraní je proto odstranění nebo minimální udržení hladin Wnt antagonistů v bazolaterálním kompartmentu aktivním proplachováním (např. v platformách gut-on-a-chip nebo hybrid-on-a-chip) nebo difúzí do bazolaterálních médií (např. z vložek Transwell do velkých bazolaterálních rezervoárů v jamkách).
V tomto protokolu poskytujeme podrobnou metodu pro výrobu mikrozařízení typu „střevo na čipu“ a hybridních čipů vložených do Transwell (kroky 1-5) pro kultivaci střevních epiteliálních buněk na porézních membránách na bázi polydimethylsiloxanu (PDMS) (kroky 6A, 7A, 8, 9) nebo polyesterových membránách vložek Transwell (kroky 6B, 7B, 8, 9) a indukovanou 3D morfogenezi in vitro (krok 10). Také jsme identifikovali buněčné a molekulární znaky svědčící o tkáňově specifické histogenezi a buněčné diferenciaci závislé na linii aplikací více zobrazovacích modalit (kroky 11-24). Indukujeme morfogenezi pomocí lidských střevních epiteliálních buněk, jako je Caco-2 nebo střevní organoidy, ve dvou kultivačních formátech s technickými detaily, včetně modifikace povrchu porézních membrán, tvorby 2D monovrstev a střevní biochemické a reprodukční aktivity biomechanického mikroprostředí in vitro. Pro indukci 3D morfogeneze z 2D epiteliálních monovrstev jsme odstranili antagonisty morfogenů v obou kultivovaných formách prouděním. médium do bazolaterálního kompartmentu kultury. Nakonec poskytujeme znázornění užitečnosti regenerovatelné 3D epiteliální vrstvy, kterou lze použít k modelování morfogen-dependentního epiteliálního růstu, longitudinálních kokultur hostitel-mikrobiom, patogenní infekce, zánětlivého poškození, dysfunkce epiteliální bariéry a terapií založených na probioticích. Příklad vlivů.
Náš protokol může být užitečný pro širokou škálu vědců v základním (např. biologie střevní sliznice, biologie kmenových buněk a vývojová biologie) a aplikovaném výzkumu (např. preklinická léčebná léčba, modelování nemocí, tkáňové inženýrství a gastroenterologie) s širokým dopadem. Vzhledem k reprodukovatelnosti a robustnosti našeho protokolu pro indukci 3D morfogeneze střevního epitelu in vitro si představujeme, že naši technickou strategii lze šířit mezi publikum studující dynamiku buněčné signalizace během vývoje, regenerace nebo homeostázy střeva. Kromě toho je náš protokol užitečný pro zkoumání infekce způsobené různými infekčními agens, jako je Norovirus 8, koronavirus 2 způsobený těžkým akutním respiračním syndromem (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 nebo Vibrio cholerae. Užitečné jsou také cílové skupiny v oblasti patologie a patogeneze onemocnění. Použití systému mikrofyziologie střeva na čipu může umožnit longitudinální kokultivaci 10 a následné posouzení obranyschopnosti hostitele, imunitních odpovědí a opravy poškození souvisejícího s patogeny v gastrointestinálním (GI) traktu 11. Další gastrointestinální poruchy spojené se syndromem propustného střeva, celiakií, Crohnovou chorobou, ulcerózní kolitidou, pouchitidou nebo syndromem dráždivého tračníku lze simulovat, když se 3D vrstvy střevního epitelu připraví s použitím 3D vrstev střevního epitelu pacienta. Mezi tato onemocnění patří atrofie klků, zkrácení krypt, poškození sliznice nebo zhoršená epiteliální bariéra. Biopsie nebo střevní organoidy odvozené z kmenových buněk 12,13. Pro lepší modelování vyšší složitosti prostředí onemocnění mohou čtenáři zvážit přidání typů buněk relevantních pro onemocnění, jako jsou mononukleární buňky periferní krve pacienta (PBMC), do modelů obsahujících 3D mikroarchitektury střevních klků a krypt. tkáňově specifické imunitní buňky, 5.
Vzhledem k tomu, že 3D epiteliální mikrostrukturu lze fixovat a vizualizovat bez procesu řezání, diváci pracující na prostorové transkriptomice a zobrazování s vysokým nebo superrozlišením by mohli mít zájem o naše mapování časoprostorové dynamiky genů a proteinů na epiteliálních výklencích. Zájem o technologie. Reakce na mikrobiální nebo imunitní podněty. Dále lze v 3D vrstvě střevní sliznice kokultivací různých mikrobiálních druhů, mikrobiálních společenstev nebo fekální mikrobioty, zejména ve střevě na čipu, vytvořit longitudinální přeslechy mezi hostitelem a mikrobiomem 10, 14, které koordinují střevní homeostázu. na platformě. Tento přístup je obzvláště atraktivní pro publikum studující slizniční imunologii, gastroenterologii, lidský mikrobiom, kulturomiku a klinickou mikrobiologii, které se snaží kultivovat dříve nekultivovanou střevní mikrobiotu v laboratoři. Pokud lze náš protokol morfogeneze in vitro přizpůsobit škálovatelným kultivačním formátům, jako jsou například vícejamkové vložky v 24, 96 nebo 384jamkových destičkách, které kontinuálně doplňují bazolaterální kompartmenty, lze protokol šířit i mezi ty, kteří vyvíjejí farmaceutické, biomedicínské nebo vysoce výkonné screeningové či validační platformy pro potravinářský průmysl. Jako důkaz principu jsme nedávno prokázali proveditelnost multiplexního vysoce výkonného systému morfogeneze škálovatelného na formát 24jamkové destičky. Kromě toho bylo komerčně uvedeno na trh několik produktů typu organ-on-a-chip16,17,18. Validaci naší metody morfogeneze in vitro proto může urychlit a potenciálně ji přijmout mnoho výzkumných laboratoří, průmyslu nebo vládních a regulačních agentur, aby pochopily buněčné přeprogramování střevní morfogeneze in vitro na transkriptomické úrovni za účelem testování léků nebo bioterapeutik. Absorpce a Transport kandidátních léčiv byl hodnocen pomocí 3D střevních náhražek nebo pomocí zakázkových či komerčních modelů orgánů na čipu k posouzení reprodukovatelnosti procesu morfogeneze střeva.
Pro studium morfogeneze střevního epitelu byl použit omezený počet experimentálních modelů relevantních pro člověka, a to zejména kvůli nedostatku implementovatelných protokolů pro indukci 3D morfogeneze in vitro. Ve skutečnosti je velká část současných znalostí o morfogenezi střeva založena na studiích na zvířatech (např. zebra rybky20, myši21 nebo kuřata22). Jsou však náročné na pracovní sílu a náklady, mohou být eticky sporné a co je nejdůležitější, přesně neurčují procesy lidského vývoje. Tyto modely jsou také velmi omezené ve své schopnosti být testovány vícenásobně škálovatelným způsobem. Náš protokol pro regeneraci 3D tkáňových struktur in vitro proto překonává zvířecí modely in vivo i jiné tradiční statické 2D modely buněčných kultur. Jak již bylo popsáno, využití 3D epiteliálních struktur nám umožnilo zkoumat prostorovou lokalizaci diferencovaných buněk v ose krypta-klky v reakci na různé slizniční nebo imunitní podněty. 3D epiteliální vrstvy mohou poskytnout prostor pro studium toho, jak mikrobiální buňky soutěží o vytváření prostorových niek a ekologického vývoje v reakci na faktory hostitele (např. vnitřní versus vnější vrstvy hlenu, sekreci IgA a antimikrobiální peptidy). Kromě toho nám 3D epiteliální morfologie umožňuje pochopit, jak střevní mikrobiota strukturuje svá společenstva a synergicky produkuje mikrobiální metabolity (např. mastné kyseliny s krátkým řetězcem), které formují buněčnou organizaci a výklenky kmenových buněk v bazálních kryptách. Tyto vlastnosti lze prokázat pouze tehdy, jsou-li in vitro vytvořeny 3D epiteliální vrstvy.
Kromě naší metody vytváření 3D struktur střevního epitelu existuje několik metod in vitro. Kultura střevních organoidů je moderní technika tkáňového inženýrství založená na kultivaci střevních kmenových buněk za specifických morfogenních podmínek23,24,25. Použití 3D modelů organoidů pro analýzu transportu nebo kokultury hostitele a mikrobiomu je však často náročné, protože střevní lumen je uzavřen v organoidu, a proto je zavedení luminálních složek, jako jsou mikrobiální buňky nebo exogenní antigeny, omezené. Přístup k organoidním lumenům lze zlepšit pomocí mikroinjektoru,26,27 ale tato metoda je invazivní a pracná a vyžaduje specializované znalosti. Navíc tradiční kultury organoidů udržované v hydrogelových nosičích za statických podmínek přesně neodrážejí aktivní biomechaniku in vivo.
Jiné přístupy používané několika výzkumnými skupinami využívají předstrukturované 3D hydrogelové lešení k napodobení struktury střevního epitelu kultivací izolovaných lidských střevních buněk na povrchu gelu. Hydrogelové lešení se vyrábějí pomocí 3D tištěných, mikrofrézovaných nebo litograficky vyrobených forem. Tato metoda ukazuje samoorganizované uspořádání izolovaných epiteliálních buněk in vitro s fyziologicky relevantními gradienty morfogenů, čímž se vytváří epiteliální struktura s vysokým poměrem stran a přeslech stromatu a epitelu zahrnutím stromálních buněk do lešení. Povaha předstrukturovaných lešení však může bránit zobrazení samotného spontánního morfogenetického procesu. Tyto modely také neposkytují dynamický luminální ani intersticiální tok, postrádají smykové napětí tekutiny, které střevní buňky potřebují k morfogenezi a získání fyziologické funkce. Další nedávná studie použila hydrogelové lešení v mikrofluidní platformě a vzorované střevní epiteliální struktury pomocí technik laserového leptání. Myší střevní organoidy sledují leptané vzory a tvoří střevní tubulární struktury a intraluminální tok tekutiny lze rekapitulovat pomocí mikrofluidního modulu. Tento model však nevykazuje ani spontánní... morfogenetické procesy ani nezahrnuje mechanobiologické pohyby střev. Techniky 3D tisku od stejné skupiny dokázaly vytvořit miniaturní střevní trubice se spontánními morfogenetickými procesy. Navzdory komplexní výrobě různých segmentů střeva uvnitř trubice tomuto modelu také chybí luminální tok tekutiny a mechanická deformace. Navíc může být omezená funkčnost modelu, zejména po dokončení procesu biotisku, což narušuje experimentální podmínky nebo interakce mezi buňkami. Místo toho náš navrhovaný protokol poskytuje spontánní morfogenezi střeva, fyziologicky relevantní smykové napětí, biomechaniku napodobující motilitu střeva, dostupnost nezávislých apikálních a bazolaterálních kompartmentů a rekonstrukci komplexních biologických mikroprostředí modularity. Náš protokol in vitro 3D morfogeneze proto může poskytnout doplňkový přístup k překonání problémů stávajících metod.
Náš protokol je zcela zaměřen na 3D epiteliální morfogenezi, přičemž v kultuře jsou pouze epiteliální buňky a žádné jiné typy okolních buněk, jako jsou mezenchymální buňky, endotelové buňky a imunitní buňky. Jak již bylo popsáno, jádrem našeho protokolu je indukce epiteliální morfogeneze odstraněním inhibitorů morfogenů vylučovaných na bazolaterální straně zavedeného média. Zatímco robustní modularita našich metod „střevo na čipu“ a „hybrid na čipu“ nám umožňuje znovu vytvořit zvlněnou 3D epiteliální vrstvu, je třeba dále zvážit další biologické složitosti, jako jsou epiteliálně-mezenchymální interakce33,34, ukládání extracelulární matrix (ECM)35 a v našem modelu i rysy krypty a klků, které zprostředkovávají výklenky kmenových buněk v bazálních kryptách. Stromální buňky (např. fibroblasty) v mezenchymu hrají klíčovou roli v produkci proteinů ECM a regulaci střevní morfogeneze in vivo35,37,38. Přidání mezenchymálních buněk do našeho modelu zlepšilo morfogenetický proces a buněčnou adhezi. účinnost. Endoteliální vrstva (tj. kapiláry nebo lymfatické cévy) hraje důležitou roli v regulaci molekulárního transportu39 a náboru imunitních buněk40 v mikroprostředí střeva. Kromě toho jsou vaskularní komponenty, které lze propojit mezi tkáňovými modely, nezbytným předpokladem, pokud jsou tkáňové modely navrženy tak, aby demonstrovaly interakce mezi více orgány. Proto může být nutné zahrnout endotelové buňky, aby bylo možné modelovat přesnější fyziologické znaky s rozlišením na úrovni orgánů. Imunitní buňky odvozené od pacienta jsou také nezbytné pro zobrazení vrozených imunitních odpovědí, prezentace antigenů, vrozeného adaptivního imunitního přeslechu a tkáňově specifické imunity v kontextu napodobování střevního onemocnění.
Použití hybridních čipů je jednodušší než metoda „střevo na čipu“, protože nastavení zařízení je jednodušší a použití vložek Transwell umožňuje škálovatelnou kultivaci střevního epitelu. Komerčně dostupné vložky Transwell s polyesterovými membránami však nejsou elastické a nemohou simulovat peristaltické pohyby. Apikální kompartment vložky Transwell umístěné v hybridním čipu navíc zůstal stacionární bez smykového napětí na apikální straně. Statické vlastnosti apikálního kompartmentu zřejmě jen zřídka umožňují dlouhodobou kokultivaci bakterií v hybridních čipech. I když při použití hybridních čipů můžeme v vložkách Transwell robustně indukovat 3D morfogenezi, nedostatek fyziologicky relevantní biomechaniky a apikálního proudění tekutiny může omezit proveditelnost hybridních čipových platforem pro potenciální aplikace.
Plnohodnotné rekonstrukce osy lidské krypta-klky v kulturách typu gut-on-a-chip a hybrid-on-a-chip nebyly dosud plně prokázány. Vzhledem k tomu, že morfogeneze začíná z epiteliální monovrstvy, 3D mikroarchitektury nemusí nutně poskytovat morfologickou podobnost s kryptami in vivo. Přestože jsme charakterizovali populaci proliferujících buněk v blízkosti bazální domény krypty v mikroinženýrském 3D epitelu, oblasti krypty a klků nebyly jasně ohraničeny. Ačkoli vyšší horní kanály na čipu vedou ke zvýšené výšce mikroinženýrského epitelu, maximální výška je stále omezena na ~300–400 µm. Skutečná hloubka lidských střevních krypt v tenkém a tlustém střevě je ~135 µm a ~400 µm a výška klků tenkého střeva je ~600 µm41.
Z hlediska zobrazování může být in situ zobrazování 3D mikroarchitektur s vysokým rozlišením omezeno na střevo na čipu, protože požadovaná pracovní vzdálenost od objektivu k epiteliální vrstvě je řádově několik milimetrů. K překonání tohoto problému může být zapotřebí vzdálený objektiv. Kromě toho je výroba tenkých řezů pro přípravu zobrazovacích vzorků náročná kvůli vysoké elasticitě PDMS. Vzhledem k tomu, že mikrofabrikace střeva na čipu po vrstvách zahrnuje trvalou adhezi mezi jednotlivými vrstvami, je extrémně náročné otevřít nebo odstranit horní vrstvu a prozkoumat povrchovou strukturu epiteliální vrstvy. Například pomocí rastrovacího elektronového mikroskopu (SEM).
Hydrofobicita PDMS byla limitujícím faktorem v mikrofluidních studiích zabývajících se hydrofobními malými molekulami, protože PDMS může nespecificky adsorbovat takové hydrofobní molekuly. Lze zvážit alternativy k PDMS s jinými polymerními materiály. Alternativně lze zvážit modifikaci povrchu PDMS (např. povlak lipofilními materiály 42 nebo poly(ethylenglykolem) 43), aby se minimalizovala adsorpce hydrofobních molekul.
Naše metoda nakonec nebyla dobře charakterizována z hlediska poskytování vysoce výkonného screeningu nebo univerzální a uživatelsky přívětivé experimentální platformy. Současný protokol vyžaduje injekční pumpu na mikrozařízení, což zabírá místo v CO2 inkubátoru a brání rozsáhlým experimentům. Toto omezení lze výrazně zlepšit škálovatelností inovativních kultivačních formátů (např. 24jamkové, 96jamkové nebo 384jamkové porézní vložky, které umožňují kontinuální doplňování a odstraňování bazolaterálních médií).
Pro indukci 3D morfogeneze lidského střevního epitelu in vitro jsme použili mikrofluidní čipové střevní zařízení obsahující dva paralelní mikrokanály a elastickou porézní membránu mezi nimi pro vytvoření rozhraní lumen-kapilára. Také demonstrujeme použití jednokanálového mikrofluidního zařízení (hybridního čipu), které zajišťuje kontinuální bazolaterální tok pod polarizovanými epiteliálními vrstvami pěstovanými na vložkách Transwell. Na obou platformách lze demonstrovat morfogenezi různých lidských střevních epiteliálních buněk aplikací směrové manipulace toku za účelem odstranění antagonistů morfogenů z bazolaterálního kompartmentu. Celý experimentální postup (obrázek 1) se skládá z pěti částí: (i) mikrofabrikace střevního čipu nebo vložitelného hybridního čipu Transwell (kroky 1-5; rámeček 1), (ii) příprava střevních epiteliálních buněk (buňky Caco-2) nebo lidských střevních organoidů; rámečky 2-5), (iii) kultivace střevních epiteliálních buněk na střevních čipech nebo hybridních čipech (kroky 6-9), (iv) indukce 3D morfogeneze in vitro (krok 10) a (v)) pro charakterizaci 3D epiteliální mikrostruktury (kroky 11-24). Nakonec byla navržena vhodná kontrolní skupina (podrobněji popsána níže) pro ověření účinnosti morfogeneze in vitro porovnáním epiteliální morfogeneze s prostorovými, časovými, podmíněnými nebo procedurálními kontrolami.
Použili jsme dvě různé kultivační platformy: střevo na čipu s přímými kanály nebo nelineárními zamotanými kanály, nebo hybridní čipy obsahující vložky Transwell (TW) v mikrofluidním zařízení, vyrobeném dle popisu v rámečku 1 a kroku 1-5. „Výroba zařízení“ ukazuje hlavní kroky při výrobě jednoho čipu nebo hybridního čipu. „Kultura lidských střevních epiteliálních buněk“ vysvětluje zdroj buněk (Caco-2 nebo lidské střevní organoidy) a kultivační postup použitý v tomto protokolu. „Morfogeneze in vitro“ ukazuje celkové kroky, ve kterých jsou epiteliální buňky odvozené z Caco-2 nebo organoidů kultivovány na střevním čipu nebo na vložkách Transwell hybridního čipu, následované indukcí 3D morfogeneze a tvorbou charakterizované epiteliální struktury. Číslo kroku programu nebo číslo pole je zobrazeno pod každou šipkou. Aplikace poskytuje příklady toho, jak lze použít zavedené střevní epiteliální vrstvy, například při charakterizaci buněčné diferenciace, studiích fyziologie střeva, vytváření ekosystémů hostitel-mikrobiom a modelování onemocnění. Imunofluorescenční snímky v „Diferenciaci buněk“ znázorňující jádra, F-aktin a MUC2 exprimované v 3D epiteliální vrstvě Caco-2 generované na střevním čipu. Signalizace MUC2 je přítomna v pohárkových buňkách a hlenu vylučovaném z povrchů sliznic. Fluorescenční snímky v Gut Physiology ukazují hlen produkovaný barvením na kyselinu sialovou a zbytky N-acetylglukosaminu pomocí fluorescenčního aglutininu pšeničných klíčků. Dva překrývající se snímky v „Host-Microbe Co-Cultures“ ukazují reprezentativní kokultury hostitele a mikrobiomu ve střevě na čipu. Levý panel ukazuje kokulturu E. coli exprimující zelený fluorescenční protein (GFP) s mikroinženýrskými 3D epiteliálními buňkami Caco-2. Pravý panel ukazuje lokalizaci GFP E. coli kokultivované s 3D epiteliálními buňkami Caco-2, následovanou imunofluorescenčním barvením F-aktinem (červená) a jádry (modrá). Modelování onemocnění ilustruje zdravé versus propustné střevo v chipech se zánětem střeva při fyziologickém vystavení bakteriálním antigenům (např. lipopolysacharid, LPS) a imunitním buňkám (např. PBMC; zelená). Buňky Caco-2 byly kultivovány za účelem vytvoření 3D epiteliální vrstvy. Měřítko, 50 µm. Obrázky ve spodním řádku: „Diferenciace buněk“ adaptováno s laskavým svolením z odkazu.2. Oxford University Press; Reprodukováno s laskavým svolením z odkazu.5. NAS; „Kokultura hostitele a mikroba“ adaptováno s laskavým svolením z odkazu.3. NAS; „Modelování onemocnění“ adaptováno s laskavým svolením z odkazu.5. NAS.
Čipy typu „střevo na čipu“ i hybridní čipy byly vyrobeny s použitím replik PDMS, které byly vyjmuty z křemíkových forem měkkou litografií1,44 a vzorovány pomocí SU-8. Design mikrokanálků v každém čipu je určen s ohledem na hydrodynamiku, jako je smykové napětí a hydrodynamický tlak1,4,12. Původní design „střevo na čipu“ (Extended Data Obr. 1a), který sestával ze dvou vedle sebe umístěných paralelních přímých mikrokanálků, se vyvinul do komplexního designu „střevo na čipu“ (Extended Data Obr. 1b), který zahrnuje dvojici zakřivených mikrokanálků pro indukci delší doby zdržení tekutiny, nelineárních vzorců proudění a multiaxiální deformace kultivovaných buněk (Obr. 2a–f)12. Pokud je třeba znovu vytvořit složitější biomechaniku střeva, lze zvolit komplexní „střevo na čipu“. Ukázali jsme, že spletitý „střevo na čipu“ také silně indukuje 3D morfogenezi v podobném časovém rámci s podobným stupněm růstu epitelu ve srovnání s původním „střevo na čipu“. bez ohledu na typ kultivovaných buněk. Proto jsou pro indukci 3D morfogeneze lineární a komplexní návrhy střev na čipu zaměnitelné. Repliky PDMS vytvrzené na silikonových formách se vzory SU-8 poskytly po vyjmutí z formy negativní vlastnosti (obr. 2a). Pro výrobu střeva na čipu byla připravená horní vrstva PDMS postupně spojena s porézní PDMS fólií a poté zarovnána se spodní PDMS vrstvou nevratným spojením pomocí koronového zpracování (obr. 2b–f). Pro výrobu hybridních čipů byly vytvrzené repliky PDMS spojeny se skleněnými podložními sklíčky, čímž vznikly jednokanálové mikrofluidní zařízení, která by mohla pojmout vložky Transwell (obr. 2h a rozšířená data obr. 2). Proces spojení se provádí ošetřením povrchů repliky PDMS a skla kyslíkovou plazmou nebo koronovým ošetřením. Po sterilizaci mikrofabrikovaného zařízení připojeného k silikonové trubici bylo zařízení připraveno k provedení 3D morfogeneze střevního epitelu (obrázek 2g).
a, Schematické znázornění přípravy dílů PDMS z křemíkových forem se vzorem SU-8. Nevytvrzený roztok PDMS byl nalit na křemíkovou formu (vlevo), vytvrzen při 60 °C (uprostřed) a vyjmut z formy (vpravo). Vyjmutý PDMS byl rozřezán na kusy a vyčištěn pro další použití.b, Fotografie křemíkové formy použité k přípravě horní vrstvy PDMS.c, Fotografie křemíkové formy použité k výrobě porézní membrány PDMS.d, Série fotografií horních a dolních komponent PDMS a sestaveného střevního zařízení na čipu.e, Schéma zarovnání horní, membránové a dolní komponenty PDMS. Každá vrstva je nevratně spojena plazmovým nebo koronovým ošetřením.f, Schéma vyrobeného zařízení „střevo na čipu“ s překrývajícími se zamotanými mikrokanály a vakuovými komorami.g, Nastavení „střeva na čipu“ pro mikrofluidní buněčnou kulturu. Vyrobené „střevo na čipu“ sestavené se silikonovou hadičkou a stříkačkou bylo umístěno na krycí sklíčko. Čipové zařízení bylo umístěno na víku 150mm Petriho kyvety. miska pro zpracování. Pojivo se používá k uzavření silikonové trubice.h, Vizuální snímky výroby hybridního čipu a 3D morfogeneze s použitím hybridních čipů. Vložky Transwell připravené nezávisle pro kultivaci 2D monovrstev střevních epiteliálních buněk byly vloženy do hybridního čipu za účelem indukce střevní 3D morfogeneze. Médium je promýváno mikrokanály pod buněčnou vrstvou vytvořenou na vložce Transwell. Měřítko, 1 cm.h Převzato s laskavým svolením z odkazu.4. Elsevier.
V tomto protokolu byly jako epiteliální zdroje použity buněčná linie Caco-2 a střevní organoidy (obr. 3a). Oba typy buněk byly kultivovány nezávisle (rámeček 2 a rámeček 5) a použity k naočkování mikrokanálků potažených ECM v čipových střevech nebo vložek Transwell. Když jsou buňky konfluentní (>95% pokrytí v baňkách), rutinně kultivované buňky Caco-2 (mezi pasážemi 10 a 50) v T-baňkách se sklidí za účelem přípravy disociovaných buněčných suspenzí trypsinizační tekutinou (rámeček 2). Lidské střevní organoidy ze střevních biopsií nebo chirurgických resekcí byly kultivovány v Matrigelových scaffoldových kopulích na 24jamkových destičkách pro podporu strukturálního mikroprostředí. Médium obsahující esenciální morfogeny (jako je Wnt, R-spondin a Noggin) a růstové faktory připravené dle popisu v rámečku 3 bylo doplňováno každý druhý den, dokud organoidy nedosáhly průměru ~500 µm. Plně vzrostlé organoidy se sklidí a disociují na jednotlivé buňky pro naočkování do střeva nebo Vložky Transwell na čipu (rámeček 5). Jak jsme již dříve uvedli, lze jej rozlišit podle typu onemocnění12,13 (např. ulcerózní kolitida, Crohnova choroba, kolorektální karcinom nebo normální dárce), místa léze (např. léze versus nepostižená oblast) a gastrointestinální lokalizace v traktu (např. dvanáctník, jejunum, ileum, slepé střevo, tlusté střevo nebo konečník). V rámečku 5 uvádíme optimalizovaný protokol pro kultivaci organoidů tlustého střeva (koloidů), které obvykle vyžadují vyšší koncentrace morfogenů než organoidy tenkého střeva.
a, Pracovní postup pro indukci morfogeneze střeva ve střevním čipu. V tomto protokolu se k demonstraci 3D morfogeneze používá lidský střevní epitel Caco-2 a střevní organoidy. Izolované epitelové buňky byly naočkovány do připraveného zařízení „střevo na čipu“ (příprava čipu). Jakmile jsou buňky naočkovány (naočkovány) a připojeny (připevněny) k porézní membráně PDMS v den 0 (D0), je zahájen apikální (AP) tok a udržován po dobu prvních 2 dnů (tok, AP, D0-D2). Je také zahájen bazolaterální (BL) tok spolu s cyklickými protahovacími pohyby (protažení, tok, AP a BL), kdy se vytvoří kompletní 2D monovrstva. Střevní 3D morfogeneze proběhla spontánně po 5 dnech mikrofluidní kultury (morfogeneze, D5). Fázově kontrastní snímky ukazují reprezentativní morfologii buněk Caco-2 v každém experimentálním kroku nebo časovém bodě (sloupcový graf, 100 µm). Čtyři schematické diagramy ilustrující odpovídající kaskády morfogeneze střeva (vpravo nahoře). Čárkované šipky. Ve schématu je znázorněn směr proudění tekutiny.b, SEM snímek znázorňující povrchovou topologii zavedeného 3D epitelu Caco-2 (vlevo). Vložený obrázek zvýrazňující zvětšenou oblast (bílý přerušovaný rámeček) ukazuje regenerované mikroklky na vrstvě 3D Caco-2 (vpravo).c, Horizontální čelní pohled na zavedený 3D Caco-2, klaudin (ZO-1, červená) a souvislé membrány s kartáčovým lemem označené F-aktinem (zelená) a jádra (modrá). Imunofluorescenční konfokální vizualizace epiteliálních buněk na střevních štěpcích. Šipky směřující do středního schématu označují umístění ohniskové roviny pro každý konfokální pohled.d, Časový průběh morfologických změn v organoidech kultivovaných na čipu získaný fázově kontrastní mikroskopií ve dnech 3, 7, 9, 11 a 13. Vložený obrázek (vpravo nahoře) ukazuje vysoké zvětšení poskytnutého obrázku.e, DIC mikrofotografie organoidního 3D epitelu zavedeného ve střevě na řezu pořízeném 7. den.f, Překryté imunofluorescenční snímky zobrazující markery pro kmenové buňky. (LGR5; purpurová), pohárkové buňky (MUC2; zelená), F-aktin (šedá) a jádra (azurová) pěstované na střevních štěpcích po dobu 3 dnů (vlevo) a 13denních (uprostřed) organoidů na epiteliální vrstvě. Viz také obrázek 3 z rozšířených dat, který zvýrazňuje signalizaci LGR5 bez signalizace MUC2. Fluorescenční snímky znázorňující epiteliální mikrostrukturu (vpravo) 3D organoidního epitelu vytvořeného ve střevě na čipu barvením plazmatické membrány barvivem CellMask (vpravo) 13. den kultivace. Měřítko je 50 μm, pokud není uvedeno jinak.b Převzato s laskavým svolením z reference.2. Oxford University Press; c Adaptováno s laskavým svolením z reference.2. Oxford University Press; e a f adaptováno s laskavým svolením odkazem.12 Pod licencí Creative Commons CC BY 4.0.
Ve střevě na čipu je nutné modifikovat hydrofobní povrch porézní membrány PDMS pro úspěšné potažení ECM. V tomto protokolu aplikujeme dvě různé metody pro modifikaci hydrofobnosti membrán PDMS. Pro kultivaci buněk Caco-2 byla aktivace povrchu pouze UV/ozonovou úpravou dostatečná ke snížení hydrofobnosti povrchu PDMS, potažení ECM a připojení buněk Caco-2 k membráně PDMS. Mikrofluidní kultura organoidního epitelu však vyžaduje chemickou povrchovou funkcionalizaci, aby se dosáhlo účinného ukládání proteinů ECM postupným nanášením polyethyleniminu (PEI) a glutaraldehydu na mikrokanály PDMS. Po modifikaci povrchu byly proteiny ECM naneseny tak, aby pokryly funkcionalizovaný povrch PDMS, a poté byly zavedeny do izolovaného organoidního epitelu. Po připojení buněk začíná mikrofluidní buněčná kultura perfuzí pouze média do horního mikrokanálu, dokud buňky nevytvoří kompletní monovrstvu, zatímco spodní mikrokanál udržuje statické podmínky. Tato optimalizovaná metoda pro aktivaci povrchu a potažení ECM umožňuje připojení organoidního epitelu k indukci 3D morfogeneze na povrchu PDMS.
Kultury Transwell také vyžadují povlak ECM před naočkováním buněk; kultury Transwell však nevyžadují složité kroky předúpravy k aktivaci povrchu porézních vložek. Pro pěstování buněk Caco-2 na vložkách Transwell urychluje povlak ECM na porézních vložkách přichycení disociovaných buněk Caco-2 (<1 hodina) a tvorbu těsné bariéry (<1-2 dny). Pro kultivaci organoidů na vložkách Transwell se izolované organoidy naočkují na vložky potažené ECM, připevní se k povrchu membrány (<3 hodiny) a udržují se, dokud organoidy nevytvoří kompletní monovrstvu s integritou bariéry. Kultivace Transwell se provádějí na 24jamkových destičkách bez použití hybridních čipů.
In vitro 3D morfogeneze může být zahájena aplikací toku tekutiny na bazolaterální stranu zavedené epiteliální vrstvy. Ve střevě na čipu začala epiteliální morfogeneze, když bylo médium perfuzováno do horního a dolního mikrokanálu (obr. 3a). Jak bylo popsáno dříve, je zásadní zavést tok tekutiny do dolního (bazolaterálního) kompartmentu pro kontinuální odstraňování směrově sekretovaných inhibitorů morfogenů. Abychom buňkám vázaným na porézní membrány poskytli dostatek živin a séra a generovali smykové napětí v luminu, obvykle aplikujeme ve střevě na čipu dvojí tok. V hybridních čipech byly do hybridních čipů vloženy vložky Transwell obsahující epiteliální monovrstvy. Poté bylo médium aplikováno pod bazolaterální stranu porézní vložky Transwell mikrokanálem. Střevní morfogeneze proběhla 3–5 dní po zahájení bazolaterálního toku v obou kultivačních platformách.
Morfologické znaky mikroinženýrských 3D epiteliálních vrstev lze analyzovat pomocí různých zobrazovacích modalit, včetně fázově kontrastní mikroskopie, mikroskopie s diferenciálním interferenčním kontrastem (DIC), SEM nebo imunofluorescenční konfokální mikroskopie (obrázky 3 a 4). Fázově kontrastní nebo DIC zobrazování lze snadno provést kdykoli během kultivace a monitorovat tvar a výčnělky 3D epiteliálních vrstev. Díky optické transparentnosti PDMS a polyesterových filmů mohou platformy gut-on-a-chip i hybridní čipy poskytovat zobrazování in situ v reálném čase bez nutnosti řezání nebo demontáže zařízení. Při provádění imunofluorescenčního zobrazování (obrázky 1, 3c, f a 4b, c) se buňky obvykle fixují 4% (hm./obj.) paraformaldehydem (PFA), poté Tritonem X-100 a 2% (hm./obj.) bovinním sérovým albuminem (BSA) v daném pořadí. V závislosti na typu buňky lze použít různé fixační látky, permeabilizační činidla a blokovací činidla. Primární protilátky cílící na buňku nebo oblast závislou na linii. Markery se používají k zvýraznění buněk imobilizovaných in situ na čipu, následované sekundárními protilátkami spolu s kontrastním barvivem cíleným buď na jádro (např. 4',6-diamidino-2-fenylen)indol, DAPI) nebo F-aktin (např. fluorescenčně značený faloidin). Fluorescenční živé zobrazování lze také provést in situ k detekci produkce hlenu (obr. 1, „Buněčná diferenciace“ a „Fyziologie střeva“), náhodné kolonizace mikrobiálních buněk (obr. 1, „Kokultura hostitele a mikroba“), náboru imunitních buněk (obr. 1, „Modelování onemocnění“) nebo kontur 3D epiteliální morfologie (obr. 3c, f a 4b, c). Při modifikaci střeva na čipu k oddělení horní vrstvy od spodní vrstvy mikrokanálu, jak je popsáno v ref. Jak je znázorněno na obr. 2, lze 3D epiteliální morfologii a také mikroklky na apikálním kartáčovém lemu vizualizovat pomocí SEM (obr. 3b). Exprese Diferenciační markery lze stanovit kvantitativní PCR5 nebo sekvenováním RNA jednotlivých buněk. V tomto případě se 3D vrstvy epiteliálních buněk pěstovaných ve střevních chipech nebo hybridních chipech sklízejí trypsinizací a poté se používají pro molekulární nebo genetickou analýzu.
a, Pracovní postup pro indukci střevní morfogeneze v hybridním čipu. Caco-2 a střevní organoidy se v tomto protokolu používají k demonstraci 3D morfogeneze v hybridní čipové platformě. Disociované epitelové buňky byly naočkovány do připravených vložek Transwell (TW prep; viz obrázek níže). Jakmile byly buňky naočkovány (seeded) a připojeny k polyesterovým membránám v vložkách Transwell, všechny buňky byly kultivovány za statických podmínek (TW culture). Po 7 dnech byla jedna vložka Transwell obsahující 2D monovrstvu epitelových buněk integrována do hybridního čipu za účelem zavedení bazolaterálního toku (Flow, BL), což nakonec vedlo ke vzniku 3D epitelové vrstvy (morfogeneze). Fázově kontrastní mikrofotografie zobrazující morfologické znaky lidských orgánových epiteliálních buněk odvozených od normálního dárce (linie C103) vzestupného tračníku v každém experimentálním kroku nebo časovém bodě. Schémata v horních vrstvách ilustrují experimentální konfiguraci pro každý krok. b, Hybridní čipy (levé schéma) mohou vést k 3D morfogenezi organoidních epiteliálních buněk s pohledy shora dolů z konfokální mikroskopie pořízenými v různých Pozice Z (horní, střední a dolní; viz schéma vpravo a odpovídající tečkované čáry). vykazovaly zřejmé morfologické charakteristiky. F-aktin (azurová), jádro (šedá).c, Fluorescenční konfokální mikrofotografie (3D úhlový pohled) epiteliálních buněk odvozených z organoidů kultivovaných ve statickém Transwell (TW; vložka v bílém přerušovaném rámečku) versus hybridní čip (největší celkový záběr) porovnávající 2D versus 3D morfologii. Dvojice 2D vertikálních příčných řezů (vložka v pravém horním rohu; „XZ“) také ukazuje 2D a 3D prvky. Měřítko, 100 µm.c Převzato s laskavým svolením z odkazu.4. Elsevier.
Kontroly lze připravit kultivací stejných buněk (Caco-2 nebo střevních organoidních epiteliálních buněk) do dvourozměrných monovrstev za konvenčních statických kultivačních podmínek. Je třeba poznamenat, že v důsledku omezené objemové kapacity mikrokanálků (tj. ~4 µl v horním kanálku u původního designu střevního čipu) může dojít k vyčerpání živin. Proto lze porovnat i morfologii epitelu před a po aplikaci bazolaterálního toku.
Proces měkké litografie by měl být prováděn v čisté místnosti. Pro každou vrstvu na čipu (horní a spodní vrstvu a membrány) a hybridních čipech byly použity různé fotomasky a vyrobeny na samostatných křemíkových destičkách, protože výšky mikrokanálků byly odlišné. Cílové výšky horních a spodních mikrokanálků střeva na čipu jsou 500 µm a 200 µm. Cílová výška kanálů hybridního čipu je 200 µm.
Umístěte 7,5 cm křemíkovou destičku do misky s acetonem. Destičkou jemně vířte po dobu 30 sekund a poté destičku osušte na vzduchu. Přeneste destičku na destičku s IPA a poté destičku 30 sekund odstředěte, aby se vyčistila.
Pro maximalizaci odstranění organických zbytků z povrchu křemíkového plátku lze volitelně použít roztok piraně (směs peroxidu vodíku a koncentrované kyseliny sírové v poměru 1:3 (obj./obj.)).
Roztok Piranha je extrémně korozivní a generuje teplo. Jsou nutná další bezpečnostní opatření. Pro likvidaci odpadu nechte roztok vychladnout a přelijte do čisté, suché nádoby na odpad. Používejte sekundární nádoby a nádoby na odpad řádně označte. Podrobnější postupy naleznete v bezpečnostních pokynech daného zařízení.
Oplatky dehydratujte umístěním na horkou plotnu o teplotě 200 °C na 10 minut. Po dehydrataci byly oplatky pětkrát protřepány na vzduchu, aby se ochladily.
Nalijte ~10 g fotorezistu SU-8 2100 do středu očištěného křemíkového waferu. Pomocí pinzety fotorezist rovnoměrně rozetřete na waferu. Občas wafer umístěte na horkou desku o teplotě 65 °C, aby fotorezist nebyl tak lepivý a snáze se roztíral. Neumisťujte wafer přímo na horkou desku.
SU-8 byl rovnoměrně rozložen na waferu spuštěním rotačního nanášení. Naprogramujte příchozí rotaci SU-8 po dobu 5–10 s tak, aby se šířil rychlostí 500 ot/min a zrychlením 100 ot/min/s. Nastavte hlavní rotaci pro vzorování o tloušťce 200 µm při 1 500 ot/min nebo dosáhněte tloušťky 250 µm (s výškou 500 µm pro horní vrstvu střeva na čipu; viz „Důležité kroky“ níže) nastavenou na zrychlení 300 ot/min/s po dobu 30 sekund při 1 200 ot/min.
Hlavní rychlost odstředění lze nastavit podle cílové tloušťky vzoru SU-8 na křemíkové destičce.
Pro výrobu vzorů SU-8 o výšce 500 µm pro horní vrstvu střeva na čipu byly postupně opakovány kroky odstředivého nanášení a měkkého vypalování v této krabici (kroky 7 a 8) (viz krok 9), čímž se vytvořily dvě vrstvy SU-8 o tloušťce 250 µm, které lze vrstvit a spojovat UV zářením v kroku 12 této krabice, čímž se vytvoří vrstva o výšce 500 µm.
Oplatky s povlakem SU-8 pečte do měkka tak, že je opatrně položíte na horkou plotnu vyhřátou na 65 °C po dobu 5 minut, poté přepnete nastavení na 95 °C a inkubujete dalších 40 minut.
Pro dosažení výšky vzoru SU-8 500 μm v horním mikrokanálu opakujte kroky 7 a 8 pro vytvoření dvou vrstev SU-8 o tloušťce 250 μm.
Pomocí UV masky Aligner proveďte test lampy podle pokynů výrobce a vypočítejte dobu expozice waferu. (doba expozice, ms) = (expoziční dávka, mJ/cm2) / (výkon lampy, mW/cm2).
Po určení doby expozice umístěte fotomasku na držák masky zarovnávače UV masky a umístěte fotomasku na wafer s povlakem SU-8.
Umístěte potištěnou plochu fotomasky přímo na stranu křemíkového waferu s povlakem SU-8, abyste minimalizovali rozptyl UV záření.
Vystavte destičku a fotomasku s povlakem SU-8 vertikálně UV světlu o intenzitě 260 mJ/cm2 po předem stanovenou dobu expozice (viz krok 10 v tomto rámečku).
Po vystavení UV záření byly křemíkové destičky potažené SU-8 vypalovány při teplotě 65 °C po dobu 5 minut a při teplotě 95 °C po dobu 15 minut na každé horké desce za účelem výroby vzorů o výšce 200 μm. Doba následného vypalování při 95 °C byla prodloužena na 30 minut pro výrobu vzorů o výšce 500 µm.
Vývojka se nalije do skleněné misky a upečená oplatka se umístí do misky. Objem vývojky SU-8 se může lišit v závislosti na velikosti skleněné destičky. Ujistěte se, že používáte dostatečné množství vývojky SU-8 k úplnému odstranění neexponované SU-8. Například při použití skleněné misky o průměru 150 mm s objemem 1 l použijte ~300 ml vývojky SU-8. Vyvíjejte formu po dobu 25 minut za občasného jemného otáčení.
Vyvolanou formu opláchněte přibližně 10 ml čerstvé vývojky a poté roztokem IPA postříkáním pipetou.
Umístěte destičku do plazmového čističe a vystavte ji kyslíkovému plazmatu (atmosférický plyn, cílový tlak 1 × 10−5 Torr, výkon 125 W) po dobu 1,5 minuty.
Umístěte destičku do vakuového exsikátoru s podložním sklíčkem uvnitř. Destičky a podložní sklíčka lze umístit vedle sebe. Pokud je vakuový exsikátor rozdělen destičkou na několik vrstev, umístěte podložní sklíčka do spodní komory a destičky do horní komory. Na podložní sklíčko nakapejte 100 μl roztoku trichlor(1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyl)silanu a pro silanizaci použijte vakuum.
Rozmrazte lahvičku s zmrazenými buňkami Caco-2 ve vodní lázni o teplotě 37 °C a poté rozmrazené buňky přeneste do baňky T75 obsahující 15 ml média Caco-2 předehřátého na 37 °C.
Pro průchod buněk Caco-2 při ~90% konfluenci nejprve zahřejte médium Caco-2, PBS a 0,25% trypsinu/1 mM EDTA ve vodní lázni o teplotě 37 °C.
Médium odsajte vakuovou aspirací. Buňky dvakrát promyjte 5 ml teplého PBS opakováním vakuové aspirace a přidáním čerstvého PBS.