Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Limitado ang suporta para sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipapakita namin ang site nang walang mga estilo at JavaScript.
Ang morphogenesis ng bituka ng tao ay nagtatatag ng mga katangian ng crypt-villus ng 3D epithelial microarchitecture at spatial organization. Ang natatanging istrukturang ito ay kinakailangan upang mapanatili ang gut homeostasis sa pamamagitan ng pagprotekta sa stem cell niche sa basal crypt mula sa exogenous microbial antigens at kanilang mga metabolite. Bilang karagdagan, ang intestinal villi at secreting mucus ay nagpapakita ng mga functionally differentiated epithelial cells na may protective barrier sa intestinal mucosal surface. Samakatuwid, ang muling paglikha ng 3D epithelial structures ay mahalaga para sa pagbuo ng in vitro gut models. Kapansin-pansin, ang organic mimetic gut-on-a-chip ay maaaring mag-induce ng spontaneous 3D morphogenesis ng intestinal epithelium na may pinahusay na physiological functions at biomechanics. Dito, nagbibigay kami ng isang reproducible protocol upang matibay na mag-induce ng intestinal morphogenesis sa bituka sa isang microfluidic chip pati na rin sa isang Transwell embedded hybrid chip. Inilalarawan namin ang mga detalyadong pamamaraan para sa paggawa ng device, pag-culturing ng Caco-2 o intestinal organoid epithelial cells sa mga conventional setting pati na rin sa isang microfluidic platform, induction ng 3D morphogenesis, at characterization ng itinatag na 3D epithelia gamit ang multiple imaging modalities. Ang protocol na ito Nakakamit ang pagbabagong-buhay ng functional gut microarchitecture sa pamamagitan ng pagkontrol sa daloy ng basolateral fluid sa loob ng 5 araw. Ang aming in vitro morphogenesis method ay gumagamit ng physiologically relevant shear stress at mechanical motion at hindi nangangailangan ng kumplikadong cell engineering o manipulation, na maaaring mas mahusay kaysa sa iba pang mga umiiral na pamamaraan. Nakikita namin na ang aming iminungkahing protocol ay maaaring magkaroon ng malawak na implikasyon para sa biomedical research community, na nagbibigay ng isang paraan upang muling buuin ang 3D intestinal epithelial layers in vitro para sa biomedical, clinical, at pharmaceutical applications.
Ipinapakita ng mga eksperimento na ang mga intestinal epithelial Caco-2 cells na kinultura sa gut-on-a-chip1,2,3,4,5 o bilayer microfluidic devices6,7 ay maaaring sumailalim sa kusang 3D morphogenesis in vitro nang walang malinaw na pag-unawa sa pinagbabatayang mekanismo. Sa aming kamakailang pag-aaral, natuklasan namin na ang pag-alis ng mga basolaterally secreted morphogen antagonists mula sa mga culture device ay kinakailangan at sapat upang mag-induce ng 3D epithelial morphogenesis in vitro, na naipakita na ng Caco-2 at mga organoid sa bituka na nagmula sa pasyente. Napatunayan ang mga epithelial cell. Sa pag-aaral na ito, partikular naming pinagtuunan ng pansin ang produksyon ng cell at distribusyon ng konsentrasyon ng isang malakas na Wnt antagonist, ang Dickkopf-1 (DKK-1), sa gut-on-a-chip at modified microfluidic devices na naglalaman ng mga Transwell insert, na tinatawag na "Hybrid Chip". Ipinakita namin na ang pagdaragdag ng mga exogenous Wnt antagonist (tulad ng DKK-1, Wnt repressor 1, secreted frizzled-related protein 1, o Soggy-1) sa on-chip gut ay pumipigil sa morphogenesis o nakakagambala sa prestructured 3D epithelial layer, na nagmumungkahi na ang antagonistic stress habang isinasagawa ang culture ay responsable para sa intestinal morphogenesis in vitro. Samakatuwid, ang isang praktikal na paraan upang makamit ang matatag na morphogenesis sa epithelial interface ay ang pag-alis o minimally na pagpapanatili ng mga antas ng Wnt antagonist sa basolateral compartment sa pamamagitan ng aktibong flushing (hal., sa gut-on-a-chip o hybrid-on-a-chip platforms) o diffusion. Basolateral media (hal., mula sa mga Transwell insert papunta sa malalaking basolateral reservoir sa mga balon).
Sa protocol na ito, nagbibigay kami ng detalyadong pamamaraan para sa paggawa ng mga gut-on-a-chip microdevice at Transwell-insertable hybrid chips (mga hakbang 1-5) upang i-culture ang mga intestinal epithelial cell sa mga polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membranes (mga hakbang 6A, 7A, 8, 9) o polyester membranes ng mga Transwell insert (mga hakbang 6B, 7B, 8, 9) at nag-induce ng 3D morphogenesis in vitro (hakbang 10). Natukoy din namin ang mga cellular at molecular feature na nagpapahiwatig ng tissue-specific histogenesis at lineage-dependent cellular differentiation sa pamamagitan ng paglalapat ng multiple imaging modalities (mga hakbang 11-24). Nag-induce kami ng morphogenesis gamit ang mga human intestinal epithelial cells, tulad ng Caco-2 o intestinal organoids, sa dalawang culture format na may mga teknikal na detalye kabilang ang surface modification ng mga porous membrane, paglikha ng 2D monolayers, at intestinal biochemical at Reproduction ng biomechanical microenvironment. in vitro. Upang mag-induce ng 3D morphogenesis mula sa 2D epithelial monolayers, inalis namin ang mga morphogen antagonist sa parehong cultured forms sa pamamagitan ng flow... ang medium patungo sa basolateral compartment ng kultura. Panghuli, nagbibigay kami ng representasyon ng gamit ng isang regenerable 3D epithelial layer na maaaring gamitin upang imodelo ang morphogen-dependent epithelial growth, longitudinal host-microbiome co-cultures, pathogen infection, inflammatory injury, epithelial barrier dysfunction, at mga probiotic-based therapies Halimbawa.
Ang aming protocol ay maaaring maging kapaki-pakinabang sa malawak na hanay ng mga siyentipiko sa malawak na epekto ng basic (hal., intestinal mucosal biology, stem cell biology, at developmental biology) at applied research (hal., preclinical drug testing, disease modeling, tissue engineering, at gastroenterology). Dahil sa reproducibility at katatagan ng aming protocol upang mag-induce ng 3D morphogenesis ng intestinal epithelium in vitro, nakikita namin na ang aming teknikal na diskarte ay maaaring maipamahagi sa mga mambabasang nag-aaral ng dynamics ng cell signaling sa panahon ng pag-unlad, regeneration o homeostasis ng bituka. Bilang karagdagan, ang aming protocol ay kapaki-pakinabang para sa pag-imbestiga sa impeksyon sa ilalim ng iba't ibang mga nakakahawang ahente tulad ng Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella Typhimurium 9 o Vibrio cholerae. Kapaki-pakinabang din ang mga mambabasa ng patolohiya at pathogenesis ng sakit. Ang paggamit ng isang on-chip gut microphysiology system ay maaaring magpahintulot sa longitudinal co-culture 10 at kasunod na pagtatasa ng host defense, immune responses at pathogen-related injury repair sa gastrointestinal (GI) tract 11. Ang iba pang mga GI disorder na nauugnay sa leaky gut syndrome, celiac disease, Crohn's disease, ulcerative colitis, pouchitis, o irritable bowel syndrome ay maaaring gayahin kapag ang 3D intestinal epithelial layers ay inihanda gamit ang 3D intestinal epithelial layers ng pasyente, kabilang sa mga sakit na ito ang villous atrophy, crypt shortening, mucosal damage, o impaired epithelial barrier. Biopsy o stem cell-derived intestinal organoids 12,13. Upang mas mahusay na imodelo ang mas mataas na complexity ng kapaligiran ng sakit, maaaring isaalang-alang ng mga mambabasa ang pagdaragdag ng mga uri ng cell na may kaugnayan sa sakit, tulad ng mga peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) ng pasyente, sa mga modelong naglalaman ng 3D intestinal villus-crypt microarchitectures. tissue-specific immune cells, 5.
Dahil ang 3D epithelial microstructure ay maaaring maayos at mailarawan nang walang proseso ng sectioning, ang mga manonood na nagtatrabaho sa spatial transcriptomics at high-resolution o super-resolution imaging ay maaaring maging interesado sa aming pagmamapa ng spatiotemporal dynamics ng mga gene at protina sa mga epithelial niches. Interesado sa teknolohiya. Tugon sa microbial o immune stimuli. Bukod pa rito, ang longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 na nagko-coordinate ng gut homeostasis ay maaaring maitatag sa 3D intestinal mucosal layer sa pamamagitan ng co-culturing ng iba't ibang microbial species, microbial community o fecal microbiota, lalo na sa gut-on-a-chip. sa plataporma. Ang pamamaraang ito ay partikular na kaakit-akit sa mga mambabasang nag-aaral ng mucosal immunology, gastroenterology, human microbiome, culturomics at clinical microbiology na naghahangad na linangin ang dating hindi nakulturang gut microbiota sa laboratoryo. Kung ang aming in vitro morphogenesis protocol ay maaaring iakma sa mga scalable culture format, tulad ng mga multiwell insert sa 24, 96 o 384 well plate na patuloy na nagpapalit ng mga basolateral compartment, ang protocol ay maaari ring ipamahagi sa mga bumubuo ng mga pharmaceutical, biomedical o high-throughput screening o validation platform para sa industriya ng pagkain. Bilang isang patunay ng prinsipyo, kamakailan naming ipinakita ang pagiging posible ng isang multiplex high-throughput morphogenesis system na scalable sa isang 24-well plate format. Bilang karagdagan, ang mga produktong multiple organ-on-a-chip ay nai-komersyalisado16,17,18. Samakatuwid, ang pagpapatunay ng aming in vitro morphogenesis method ay maaaring mapabilis at potensyal na gamitin ng maraming research laboratory, industriya o gobyerno at mga regulatory agency upang maunawaan ang cellular reprogramming ng in vitro gut morphogenesis sa transcriptomic level upang subukan ang mga gamot o biotherapeutics. Ang pagsipsip at transportasyon ng mga kandidatong gamot ay tinasa gamit ang mga 3D gut surrogates o gamit ang mga custom o komersyal na organ-on-a-chip na modelo upang masuri ang reproducibility ng proseso ng gut morphogenesis.
Isang limitadong bilang ng mga modelong pang-eksperimento na may kaugnayan sa tao ang ginamit upang pag-aralan ang intestinal epithelial morphogenesis, pangunahin dahil sa kakulangan ng mga maipapatupad na protocol upang mag-udyok ng 3D morphogenesis in vitro. Sa katunayan, karamihan sa kasalukuyang kaalaman tungkol sa gut morphogenesis ay batay sa mga pag-aaral sa hayop (hal., zebrafish20, mice21 o manok22). Gayunpaman, ang mga ito ay matrabaho at magastos, maaaring maging kaduda-duda sa etika, at higit sa lahat, hindi tumpak na tumutukoy sa mga proseso ng pag-unlad ng tao. Ang mga modelong ito ay limitado rin sa kanilang kakayahang masubukan sa isang multi-way scalable na paraan. Samakatuwid, ang aming protocol para sa pagbabagong-buhay ng mga istruktura ng 3D tissue in vitro ay mas mahusay kaysa sa mga modelo ng hayop in vivo pati na rin ang iba pang tradisyonal na static na 2D cell culture model. Tulad ng naunang inilarawan, ang paggamit ng mga istrukturang 3D epithelial ay nagbigay-daan sa amin upang suriin ang spatial localization ng mga differentiated cell sa crypt-villus axis bilang tugon sa iba't ibang mucosal o immune stimuli. Ang mga 3D epithelial layer ay maaaring magbigay ng espasyo upang pag-aralan kung paano nakikipagkumpitensya ang mga microbial cell upang bumuo ng mga spatial niches at ecological evolution bilang tugon sa mga host factor (hal., panloob laban sa panlabas na mucus layer, pagtatago ng IgA at antimicrobial peptides). Bukod pa rito, ang 3D epithelial morphology ay makakatulong sa atin na maunawaan kung paano binubuo ng gut microbiota ang mga komunidad nito at synergistically na gumagawa ng mga microbial metabolite (hal., short-chain fatty acids) na humuhubog sa organisasyon ng cellular at mga stem cell niches sa basal crypts. Ang mga katangiang ito ay maipapakita lamang kapag ang mga 3D epithelial layer ay naitatag in vitro.
Bukod sa aming pamamaraan ng paglikha ng 3D na istruktura ng epithelial sa bituka, mayroong ilang mga pamamaraan na in vitro. Ang kultura ng organoid sa bituka ay isang makabagong pamamaraan sa tissue engineering batay sa paglilinang ng mga stem cell sa bituka sa ilalim ng mga partikular na kondisyon ng morphogen23,24,25. Gayunpaman, ang paggamit ng mga 3D na modelo ng organoid para sa pagsusuri ng transportasyon o mga co-culture ng host-microbiome ay kadalasang mahirap dahil ang lumen ng bituka ay nakapaloob sa loob ng organoid at, samakatuwid, ang pagpapakilala ng mga luminal na bahagi tulad ng mga microbial cell o exogenous antigen ay limitado. Ang pag-access sa mga organoid lumen ay maaaring mapabuti gamit ang isang microinjector,26,27 ngunit ang pamamaraang ito ay invasive at matrabaho at nangangailangan ng espesyal na kaalaman upang maisagawa. Bukod pa rito, ang mga tradisyonal na kultura ng organoid na pinapanatili sa mga hydrogel scaffold sa ilalim ng mga static na kondisyon ay hindi tumpak na sumasalamin sa aktibo na in vivo biomechanics.
Ang iba pang mga pamamaraang ginagamit ng ilang grupo ng pananaliksik ay gumagamit ng mga prestructured 3D hydrogel scaffold upang gayahin ang istruktura ng epithelial ng bituka sa pamamagitan ng pag-cultivate ng mga nakahiwalay na selula ng bituka ng tao sa ibabaw ng gel. Gumawa ng mga hydrogel scaffold gamit ang 3D-printed, micro-milled, o lithographically fabricated molds. Ipinapakita ng pamamaraang ito ang self-organized na pagkakaayos ng mga nakahiwalay na epithelial cell in vitro na may physiologically relevant morphogen gradients, na nagtatatag ng isang mataas na aspect ratio epithelial structure at stroma-epithelial crosstalk sa pamamagitan ng pagsasama ng mga stromal cell sa scaffold. Gayunpaman, ang katangian ng mga prestructured scaffold ay maaaring pumigil sa pagpapakita ng kusang proseso ng morphogenetic mismo. Ang mga modelong ito ay hindi rin nagbibigay ng dynamic na luminal o interstitial flow, kulang sa fluid shear stress na kailangan ng mga selula ng bituka upang sumailalim sa morphogenesis at makakuha ng physiological function. Ang isa pang kamakailang pag-aaral ay gumamit ng mga hydrogel scaffold sa isang microfluidic platform at patterned intestinal epithelial structure gamit ang mga laser-etching techniques. Ang mga organoid ng bituka ng daga ay sumusunod sa mga nakaukit na pattern upang bumuo ng mga istruktura ng tubular ng bituka, at ang intraluminal fluid flow ay maaaring muling isulat gamit ang isang microfluidics module. Gayunpaman, ang modelong ito ay hindi nagpapakita ng kusang proseso. Hindi kasama sa mga prosesong morpohenetiko ang mga galaw na mekanobiolohikal ng bituka. Ang mga pamamaraan ng 3D printing mula sa parehong grupo ay nakalikha ng maliliit na tubo ng bituka na may kusang prosesong morpohenetiko. Sa kabila ng masalimuot na paggawa ng iba't ibang segment ng bituka sa loob ng tubo, ang modelong ito ay kulang din sa daloy ng luminal fluid at mekanikal na deformasyon. Bukod pa rito, maaaring limitado ang kakayahang magamit ng modelo, lalo na pagkatapos makumpleto ang proseso ng bioprinting, na nakakasagabal sa mga kondisyon ng eksperimento o mga interaksyon ng cell-to-cell. Sa halip, ang aming iminungkahing protocol ay nagbibigay ng kusang morpogenesis ng bituka, shear stress na may kaugnayan sa pisyolohikal, biomechanics na ginagaya ang motility ng bituka, pag-access ng mga independiyenteng apical at basolateral compartment, at muling paglikha ng mga kumplikadong biological microenvironment na may modularity. Samakatuwid, ang aming in vitro 3D morphogenesis protocol ay maaaring magbigay ng isang komplementaryong diskarte upang malampasan ang mga hamon ng mga umiiral na pamamaraan.
Ang aming protocol ay ganap na nakatuon sa 3D epithelial morphogenesis, na may mga epithelial cell lamang sa kultura at walang iba pang uri ng mga nakapalibot na cell tulad ng mesenchymal cells, endothelial cells, at immune cells. Gaya ng naunang inilarawan, ang core ng aming protocol ay ang induction ng epithelial morphogenesis sa pamamagitan ng pag-alis ng mga morphogen inhibitor na inilalabas sa basolateral na bahagi ng ipinakilalang medium. Bagama't ang matatag na modularity ng aming gut-on-a-chip at hybrid-on-a-chip ay nagbibigay-daan sa amin na muling likhain ang undulating 3D epithelial layer, ang mga karagdagang biological complexities tulad ng epithelial-mesenchymal interactions33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition35 at, sa aming modelo, ang mga tampok ng crypt-villus na nagdadala ng mga stem cell niches sa basal crypts ay nananatiling dapat pang isaalang-alang. Ang mga stromal cells (hal., fibroblasts) sa mesenchyme ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa paggawa ng mga protina ng ECM at regulasyon ng intestinal morphogenesis in vivo35,37,38. Ang pagdaragdag ng mga mesenchymal cells sa aming modelo ay nagpahusay sa proseso ng morphogenetic at kahusayan ng pagkabit ng cell. Ang endothelial layer (ibig sabihin, mga capillary o lymphatics) ay may mahalagang papel sa pag-regulate ng molecular transport39 at immune cell recruitment40 sa gut microenvironment. Bukod pa rito, ang mga bahagi ng vasculature na maaaring konektado sa pagitan ng mga modelo ng tissue ay isang kinakailangan kapag ang mga modelo ng tissue ay idinisenyo upang ipakita ang mga interaksyon sa maraming organ. Samakatuwid, maaaring kailanganing isama ang mga endothelial cell upang maimodelo ang mas tumpak na mga katangiang pisyolohikal na may resolusyon sa antas ng organ. Ang mga immune cell na nagmula sa pasyente ay mahalaga rin para sa pagpapakita ng mga likas na tugon ng immune system, presentasyon ng antigen, likas na adaptive immune crosstalk, at tissue-specific immunity sa konteksto ng paggaya sa sakit sa bituka.
Ang paggamit ng mga hybrid chips ay mas diretso kaysa sa gut-on-a-chip dahil mas simple ang pag-setup ng device at ang paggamit ng mga Transwell insert ay nagbibigay-daan para sa scalable culture ng gut epithelium. Gayunpaman, ang mga komersyal na makukuhang Transwell insert na may polyester membranes ay hindi elastic at hindi kayang gayahin ang mga peristaltic-like na paggalaw. Bukod pa rito, ang apical compartment ng Transwell insert na inilagay sa hybrid chip ay nanatiling nakatigil nang walang shear stress sa apical side. Maliwanag, ang mga static properties sa apical compartment ay bihirang magbigay-daan sa pangmatagalang bacterial co-culture sa mga hybrid chips. Bagama't maaari nating mabisang mag-induce ng 3D morphogenesis sa mga Transwell insert kapag gumagamit ng hybrid chips, ang kakulangan ng physiologically relevant biomechanics at apical fluid flow ay maaaring limitahan ang posibilidad ng mga hybrid chip platform para sa mga potensyal na aplikasyon.
Ang mga ganap na rekonstruksyon ng axis ng crypt-villus ng tao sa mga kultura ng gut-on-a-chip at hybrid-on-a-chip ay hindi pa ganap na naitatatag. Dahil ang morphogenesis ay nagsisimula sa isang epithelial monolayer, ang mga 3D microarchitecture ay hindi kinakailangang magbigay ng pagkakatulad sa morpolohiya sa mga crypt in vivo. Bagama't nailalarawan namin ang pagdami ng populasyon ng selula malapit sa basal crypt domain sa microengineered 3D epithelium, ang mga rehiyon ng crypt at villous ay hindi malinaw na natukoy. Bagama't ang mas matataas na itaas na channel sa chip ay humahantong sa pagtaas ng taas ng microengineered epithelium, ang pinakamataas na taas ay limitado pa rin sa ~300–400 µm. Ang aktwal na lalim ng mga crypt ng bituka ng tao sa maliit at malaking bituka ay ~135 µm at ~400 µm, ayon sa pagkakabanggit, at ang taas ng maliit na villi ng bituka ay ~600 µm41.
Mula sa pananaw ng imaging, ang in situ super-resolution imaging ng 3D microarchitectures ay maaaring limitado sa gut sa isang chip, dahil ang kinakailangang working distance mula sa objective lens hanggang sa epithelial layer ay nasa order ng ilang milimetro. Upang malampasan ang problemang ito, maaaring kailanganin ang isang malayong objective. Bukod pa rito, ang paggawa ng manipis na mga seksyon para sa paghahanda ng imaging specimen ay mahirap dahil sa mataas na elasticity ng PDMS. Bukod pa rito, dahil ang layer-by-layer microfabrication ng gut sa isang chip ay nagsasangkot ng permanenteng pagdikit sa pagitan ng bawat layer, lubhang mahirap buksan o tanggalin ang itaas na layer upang suriin ang istruktura ng ibabaw ng epithelial layer. Halimbawa, sa pamamagitan ng paggamit ng scanning electron microscope (SEM).
Ang hydrophobicity ng PDMS ay isang naglilimitang salik sa mga pag-aaral na nakabatay sa microfluidic na tumatalakay sa hydrophobic small molecules, dahil ang PDMS ay maaaring hindi espesipikong sumipsip ng mga naturang hydrophobic molecules. Ang mga alternatibo sa PDMS ay maaaring isaalang-alang kasama ng iba pang polymeric materials. Bilang kahalili, ang surface modification ng PDMS (hal., pagpapatong gamit ang mga lipophilic materials 42 o poly(ethylene glycol) 43) ay maaaring isaalang-alang upang mabawasan ang adsorption ng mga hydrophobic molecules.
Panghuli, ang aming pamamaraan ay hindi pa mahusay na nailalarawan sa mga tuntunin ng pagbibigay ng isang high-throughput screening o "one-size-fits-all" na user-friendly na experimental platform. Ang kasalukuyang protocol ay nangangailangan ng isang syringe pump bawat microdevice, na kumukuha ng espasyo sa isang CO2 incubator at pumipigil sa malawakang mga eksperimento. Ang limitasyong ito ay maaaring mapabuti nang malaki sa pamamagitan ng scalability ng mga makabagong format ng culture (hal., 24-well, 96-well, o 384-well porous inserts na nagbibigay-daan sa patuloy na muling pagdadagdag at pag-alis ng basolateral media).
Upang ma-induce ang 3D morphogenesis ng human intestinal epithelium in vitro, gumamit kami ng isang microfluidic chip intestinal device na naglalaman ng dalawang parallel microchannels at isang elastic porous membrane sa pagitan upang lumikha ng lumen-capillary interface. Ipinakita rin namin ang paggamit ng isang single-channel microfluidic device (isang hybrid chip) na nagbibigay ng patuloy na basolateral flow sa ilalim ng polarized epithelial layers na lumaki sa mga Transwell insert. Sa parehong platform, ang morphogenesis ng iba't ibang human intestinal epithelial cells ay maaaring maipakita sa pamamagitan ng paglalapat ng directional manipulation ng flow upang alisin ang mga morphogen antagonist mula sa basolateral compartment. Ang buong experimental procedure (Figure 1) ay binubuo ng limang bahagi: (i) microfabrication ng gut chip o Transwell insertable hybrid chip (mga hakbang 1-5; Box 1), (ii) paghahanda ng intestinal epithelial cells (Caco-2 cells) o human intestinal organoids; mga kahon 2-5), (iii) kultura ng mga selula ng epithelial sa bituka sa mga intestinal chips o hybrid chips (mga hakbang 6-9), (iv) induction ng 3D morphogenesis in vitro (hakbang 10) at (v)) upang makilala ang 3D epithelial microstructure (mga hakbang 11-24). Panghuli, isang naaangkop na control group (tatalakayin pa sa ibaba) ang idinisenyo upang patunayan ang bisa ng in vitro morphogenesis sa pamamagitan ng paghahambing ng epithelial morphogenesis sa spatial, temporal, conditional, o procedural na mga kontrol.
Gumamit kami ng dalawang magkaibang plataporma ng kultura: gut-on-a-chip na may mga tuwid na channel o nonlinear convoluted channel, o hybrid chips na naglalaman ng mga Transwell (TW) insert sa isang microfluidic device, na ginawa gaya ng inilarawan sa Box 1, at hakbang 1-5. "Ipinapakita ng Device Fabrication" ang mga pangunahing hakbang sa paggawa ng isang chip o hybrid chip. "Ipinapaliwanag ng Culture of Human Intestinal Epithelial Cells" ang pinagmulan ng cell (Caco-2 o human intestinal organoids) at pamamaraan ng kultura na ginamit sa protocol na ito. "Ipinapakita ng In vitro morphogenesis" ang mga pangkalahatang hakbang kung saan ang Caco-2 o mga organoid-derived epithelial cells ay kinultura sa isang intestinal chip o sa mga Transwell insert ng isang hybrid chip, na sinusundan ng induction ng 3D morphogenesis at ang pagbuo ng isang characterized epithelial structure. Ang program step number o box number ay ipinapakita sa ibaba ng bawat arrow. Ang application ay nagbibigay ng mga halimbawa kung paano magagamit ang mga naitatag na intestinal epithelial layer, halimbawa, sa cell differentiation characterization, gut physiology studies, pagtatatag ng host-microbiome ecosystems, at disease modeling. Mga imahe ng immunofluorescence sa "Cell "Differentiation" na nagpapakita ng nuclei, F-actin at MUC2 na ipinahayag sa 3D Caco-2 epithelial layer na nabuo sa gut chip. Ang MUC2 signaling ay naroroon sa mga goblet cell at mucus na inilalabas mula sa mga mucosal surface. Ang mga fluorescent na imahe sa Gut Physiology ay nagpapakita ng mucus na ginawa sa pamamagitan ng paglamlam para sa sialic acid at N-acetylglucosamine residues gamit ang fluorescent wheat germ agglutinin. Ang dalawang magkakapatong na imahe sa "Host-Microbe Co-Cultures" ay nagpapakita ng mga kinatawan na host-microbiome co-culture sa gut sa isang chip. Ang kaliwang panel ay nagpapakita ng co-culture ng E. coli na nagpapahayag ng berdeng fluorescent protein (GFP) na may microengineered 3D Caco-2 epithelial cells. Ang kanang panel ay nagpapakita ng lokalisasyon ng GFP E. coli na co-cultured sa 3D Caco-2 epithelial cells, na sinusundan ng immunofluorescence staining na may F-actin (pula) at nuclei (asul). Ang disease modeling ay naglalarawan ng malusog laban sa leaky gut sa mga gut inflammation chips sa ilalim ng physiological challenge na may bacterial antigens (hal., lipopolysaccharide, LPS) at immune cells (hal., PBMC; berde). Ang mga selula ng Caco-2 ay kinultura upang magtatag ng isang 3D epithelial layer. Scale bar, 50 µm. Mga imahe sa ibabang hanay: “Differentiation of cells” na inangkop nang may pahintulot mula sa sanggunian. 2. Oxford University Press; Nilikha nang may pahintulot mula sa Ref.5. NAS; “Host-Microbe Co-Culture” na inangkop nang may pahintulot mula sa ref.3. NAS; “Disease Modeling” na inangkop nang may pahintulot mula sa sanggunian. 5. NAS.
Ang parehong gut-on-chip at hybrid chips ay ginawa gamit ang mga replika ng PDMS na hinulma mula sa mga silicon mold sa pamamagitan ng malambot na lithography1,44 at nilagyan ng pattern na SU-8. Ang disenyo ng mga microchannel sa bawat chip ay natutukoy sa pamamagitan ng pagsasaalang-alang sa hydrodynamics tulad ng shear stress at hydrodynamic pressure1,4,12. Ang orihinal na disenyo ng gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1a), na binubuo ng dalawang magkadugtong na parallel straight microchannels, ay umunlad sa isang kumplikadong gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b) na kinabibilangan ng isang pares ng mga kurbadong microchannel upang magdulot ng pagtaas ng oras ng paninirahan ng fluid, mga nonlinear flow pattern, at multiaxial deformation ng mga cultured cell (Fig. 2a–f). Kapag kailangang muling likhain ang mas kumplikadong gut biomechanics, maaaring mapili ang mga kumplikadong gut-on-a-chip. Naipakita namin na ang masalimuot na Gut-Chip ay malakas ding nag-i-induce ng 3D morphogenesis sa isang katulad na time frame na may katulad na antas ng epithelial growth kumpara sa orihinal. Gut-Chip, anuman ang uri ng cultured cell. Samakatuwid, upang ma-induce ang 3D morphogenesis, ang linear at complex on-chip gut designs ay maaaring palitan. Ang mga PDMS replica na pinagaling sa mga silicon mold na may mga SU-8 pattern ay nagbigay ng mga negatibong katangian pagkatapos ng demolding (Fig. 2a). Upang mabuo ang gut sa isang chip, ang inihandang upper PDMS layer ay sunud-sunod na idinikit sa isang porous PDMS film at pagkatapos ay inihanay sa lower PDMS layer sa pamamagitan ng irreversible bonding gamit ang isang corona treater (Fig. 2b–f). Upang mabuo ang mga hybrid chips, ang mga pinagaling na PDMS replica ay idinikit sa mga glass slide upang lumikha ng mga single-channel microfluidic device na maaaring mag-accommodate ng mga Transwell insert (Fig. 2h at Extended Data Fig. 2). Ang proseso ng bonding ay isinasagawa sa pamamagitan ng paggamot sa mga ibabaw ng PDMS replica at salamin gamit ang oxygen plasma o corona treatment. Pagkatapos isterilisasyon ang microfabricated device na nakakabit sa silicone tube, handa na ang setup ng device upang magsagawa ng 3D morphogenesis ng intestinal epithelium (Fig. 2g).
a, Eskematikong ilustrasyon ng paghahanda ng mga bahagi ng PDMS mula sa mga molde na may pattern na SU-8 na silicon. Ang hindi pa natutuyong solusyon ng PDMS ay ibinuhos sa isang molde na silicon (kaliwa), pinatuyo sa 60 °C (gitna) at tinanggalan ng molde (kanan). Ang tinanggalan ng molde na PDMS ay hiniwa-hiwalay at nilinis para sa karagdagang paggamit. b, Larawan ng molde na silicon na ginamit upang ihanda ang pang-itaas na layer ng PDMS. c, Larawan ng molde na silicon na ginamit upang gawin ang porous membrane ng PDMS. d, Isang serye ng mga larawan ng pang-itaas at pang-ibabang bahagi ng PDMS at ang naka-assemble na on-chip intestinal device. e, Eskematikong pagkakahanay ng pang-itaas, lamad, at pang-ibabang bahagi ng PDMS. Ang bawat layer ay hindi na mababawi na pinagdurugtong ng plasma o corona treatment. f, Eskematikong ginawang gut-on-a-chip device na may nakapatong na mga convoluted microchannel at vacuum chamber. g, Pag-setup ng gut-on-a-chip para sa microfluidic cell culture. Ang ginawang gut sa isang chip na naka-assemble gamit ang silicone tube at syringe ay inilagay sa isang coverslip. Ang chip device ay inilagay sa takip ng isang 150 mm Petri pinggan para sa pagproseso. Ang binder ay ginagamit upang isara ang silicone tube. h, Mga visual na snapshot ng hybrid chip fabrication at 3D morphogenesis gamit ang hybrid chips. Ang mga Transwell insert na inihanda nang hiwalay upang ikultura ang 2D monolayers ng intestinal epithelial cells ay ipinasok sa hybrid chip upang mag-induce ng intestinal 3D morphogenesis. Ang medium ay pinapasok sa pamamagitan ng mga microchannel sa ilalim ng cell layer na itinatag sa Transwell insert. Scale bar, 1 cm. h Muling inilimbag nang may pahintulot mula sa sanggunian. 4. Elsevier.
Sa protocol na ito, ang Caco-2 cell line at mga intestinal organoid ay ginamit bilang mga epithelial source (Fig. 3a). Ang parehong uri ng mga selula ay kinultura nang hiwalay (Box 2 at Box 5) at ginamit upang itanim ang mga ECM-coated microchannels ng on-chip gut o Transwell inserts. Kapag ang mga selula ay nagtatagpo (>95% na sakop sa mga flasks), ang mga regular na kinultura na Caco-2 cells (sa pagitan ng mga passage 10 at 50) sa mga T-flask ay kinukuha upang ihanda ang mga dissociated cell suspensions sa pamamagitan ng trypsinization fluid (box 2). Ang mga human intestinal organoid mula sa mga intestinal biopsies o surgical resection ay kinultura sa Matrigel scaffold domes sa 24-well plates upang suportahan ang structural microenvironment. Ang medium na naglalaman ng mga mahahalagang morphogen (tulad ng Wnt, R-spondin, at Noggin) at mga growth factor na inihanda gaya ng inilarawan sa Box 3 ay dinagdagan tuwing ibang araw hanggang sa lumaki ang mga organoid sa ~500 µm ang diyametro. Ang mga ganap na lumaking organoid ay kinukuha at pinaghihiwalay sa mga single cell para itanim sa gut. o mga insert ng Transwell sa isang chip (Kahon 5). Gaya ng naiulat na namin dati, maaari itong pag-iba-ibahin ayon sa uri ng sakit12,13 (hal. ulcerative colitis, Crohn's disease, colorectal cancer, o normal donor), lugar ng lesyon (hal., lesyon laban sa lugar na walang lesyon) at lokasyon ng gastrointestinal sa tract (hal., duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, o tumbong). Nagbibigay kami ng isang na-optimize na protocol sa Kahon 5 para sa pag-cultivate ng mga colonic organoid (coloid) na karaniwang nangangailangan ng mas mataas na konsentrasyon ng mga morphogen kaysa sa mga small intestinal organoid.
a, Daloy ng trabaho para sa induction ng gut morphogenesis sa gut chip. Ang Caco-2 human intestinal epithelium at intestinal organoids ay ginagamit sa protocol na ito upang ipakita ang 3D morphogenesis. Ang mga nakahiwalay na epithelial cells ay itinanim sa inihandang gut-on-a-chip device (paghahanda ng chip). Kapag ang mga cell ay na-seed (na-seed) at nakakabit (nakakabit) sa PDMS porous membrane sa araw 0 (D0), ang apical (AP) flow ay sinisimulan at pinapanatili sa unang 2 araw (daloy, AP, D0-D2). Ang basolateral (BL) flow ay sinisimulan din kasama ng cyclic stretching motions (stretch, flow, AP at BL) kapag nabuo ang isang kumpletong 2D monolayer. Ang intestinal 3D morphogenesis ay kusang naganap pagkatapos ng 5 araw ng microfluidic culture (morphogenesis, D5). Ang mga phase contrast image ay nagpapakita ng representatibong morpolohiya ng mga Caco-2 cells sa bawat experimental step o time point (bar graph, 100 µm). Apat na eskematiko na diagram na naglalarawan ng kaukulang mga cascades ng gut morphogenesis (kanang itaas). Ang gitling Ang mga palaso sa eskematiko ay kumakatawan sa direksyon ng daloy ng likido. b, imahe ng SEM na nagpapakita ng topolohiya sa ibabaw ng naitatag na 3D Caco-2 epithelium (kaliwa). Ang inset na nagtatampok sa pinalaking lugar (puting gitling na kahon) ay nagpapakita ng muling nabuo na microvilli sa 3D Caco-2 layer (kanan). c, Pahalang na frontal view ng naitatag na Caco-2 3D, claudin (ZO-1, pula) at mga continuous brush border membrane na may label na F-actin (berde) at nuclei (asul). Immunofluorescence confocal visualization ng mga epithelial cell sa mga intestinal chips. Ang mga palaso na nakaturo sa gitnang eskematiko ay nagpapahiwatig ng lokasyon ng focal plane para sa bawat confocal view. d, Kurso ng oras ng mga pagbabago sa morpolohiya sa mga organoid na kinultura sa isang chip na nakuha sa pamamagitan ng phase contrast microscopy sa mga araw 3, 7, 9, 11, at 13. Ang inset (kanang itaas) ay nagpapakita ng mataas na magnification ng ibinigay na imahe. e, DIC photomicrograph ng organoid 3D epithelium na naitatag sa bituka sa hiwa na kinuha sa araw 7. f, Nakapatong na mga imahe ng immunofluorescence na nagpapakita ng mga marker para sa mga stem cell (LGR5; magenta), mga goblet cell (MUC2; berde), F-actin (kulay abo) at nuclei (cyan) na lumaki sa mga gut chip sa loob ng 3 araw, ayon sa pagkakabanggit (Kaliwa) at 13-araw (gitna) na mga organoid sa epithelial layer.Tingnan din ang Extended Data Figure 3, na nagtatampok ng LGR5 signaling nang walang MUC2 signaling.Mga larawan ng fluorescence na nagpapakita ng epithelial microstructure (kanan) ng 3D organoid epithelium na itinatag sa gut sa isang chip sa pamamagitan ng paglamlam sa plasma membrane gamit ang CellMask dye (kanan) sa ika-13 araw ng kultura.Ang scale bar ay 50 μm maliban kung iba ang nakasaad.b Muling inilimbag nang may pahintulot mula sa sanggunian.2. Oxford University Press; c Inangkop nang may pahintulot mula sa Sanggunian.2. Oxford University Press; e at f inangkop nang may pahintulot sa pamamagitan ng sanggunian.12 Sa ilalim ng Creative Commons License CC BY 4.0.
Sa bituka sa isang chip, kinakailangang baguhin ang hydrophobic surface ng PDMS porous membrane para sa matagumpay na ECM coating. Sa protocol na ito, naglalapat kami ng dalawang magkaibang pamamaraan upang baguhin ang hydrophobicity ng mga PDMS membrane. Para sa pag-cultivate ng mga Caco-2 cell, ang surface activation sa pamamagitan ng UV/ozone treatment lamang ay sapat na upang mabawasan ang hydrophobicity ng PDMS surface, pahiran ang ECM at ikabit ang mga Caco-2 cell sa PDMS membrane. Gayunpaman, ang microfluidic culture ng organoid epithelium ay nangangailangan ng chemical-based surface functionalization upang makamit ang mahusay na deposition ng mga ECM protein sa pamamagitan ng sunud-sunod na paglalapat ng polyethyleneimine (PEI) at glutaraldehyde sa mga PDMS microchannel. Pagkatapos ng surface modification, ang mga ECM protein ay idineposito upang matakpan ang functionalized PDMS surface at pagkatapos ay ipinakilala sa isolated organoid epithelium. Matapos ikabit ang mga cell, ang microfluidic cell culture ay nagsisimula sa pamamagitan ng perfusion lamang ng medium sa upper microchannel hanggang sa ang mga cell ay bumuo ng isang kumpletong monolayer, habang ang lower microchannel ay nagpapanatili ng mga static na kondisyon. Ang na-optimize na pamamaraan na ito para sa surface activation at ECM coating ay nagbibigay-daan sa pagkabit ng organoid epithelium upang mag-induce ng 3D morphogenesis sa PDMS. ibabaw.
Ang mga kultura ng Transwell ay nangangailangan din ng ECM coating bago ang cell seeding; gayunpaman, ang mga kultura ng Transwell ay hindi nangangailangan ng mga kumplikadong hakbang sa pretreatment upang ma-activate ang ibabaw ng mga porous insert. Para sa pagpapatubo ng mga Caco-2 cell sa mga Transwell insert, ang ECM coating sa mga porous insert ay nagpapabilis sa pagkabit ng mga dissociated Caco-2 cell (<1 oras) at pagbuo ng tight junction barrier (<1-2 araw). Para sa pag-culture ng mga organoid sa mga Transwell insert, ang mga nakahiwalay na organoid ay inihahain sa mga ECM-coated insert, ikinakabit sa ibabaw ng membrane (<3 oras) at pinapanatili hanggang sa ang mga organoid ay bumuo ng isang kumpletong monolayer na may integridad ng barrier. Ang mga kultura ng Transwell ay isinasagawa sa 24-well plates nang hindi gumagamit ng hybrid chips.
Ang in vitro 3D morphogenesis ay maaaring simulan sa pamamagitan ng paglalapat ng daloy ng likido sa basolateral na aspeto ng isang naitatag na epithelial layer. Sa bituka sa isang chip, nagsimula ang epithelial morphogenesis nang ang medium ay pinapasok sa upper at lower microchannels (Fig. 3a). Gaya ng naunang inilarawan, mahalaga na magpasok ng daloy ng likido sa inferior (basolateral) compartment para sa patuloy na pag-alis ng mga directional secreted morphogen inhibitors. Upang makapagbigay ng sapat na sustansya at serum sa mga selulang nakagapos sa porous membranes at makabuo ng luminal shear stress, karaniwan naming inilalapat ang dual flow sa bituka sa isang chip. Sa mga hybrid chips, ang mga Transwell insert na naglalaman ng epithelial monolayers ay ipinasok sa mga hybrid chips. Pagkatapos, ang medium ay inilapat sa ilalim ng basolateral na bahagi ng porous Transwell insert sa pamamagitan ng microchannel. Ang intestinal morphogenesis ay naganap 3-5 araw pagkatapos ng pagsisimula ng basolateral flow sa parehong culture platform.
Ang mga katangiang morpolohikal ng mga microengineered 3D epithelial layer ay maaaring suriin sa pamamagitan ng paglalapat ng iba't ibang modalidad ng imaging, kabilang ang phase contrast microscopy, differential interference contrast (DIC) microscopy, SEM, o immunofluorescence confocal microscopy (Mga Larawan 3 at 4). Ang phase contrast o DIC imaging ay madaling maisagawa anumang oras habang isinasagawa ang kultura upang masubaybayan ang hugis at pag-usli ng mga 3D epithelial layer. Dahil sa optical transparency ng PDMS at polyester films, ang parehong gut-on-a-chip at hybrid chip platform ay maaaring magbigay ng real-time in situ imaging nang hindi nangangailangan ng sectioning o disassembly ng device. Kapag nagsasagawa ng immunofluorescence imaging (Mga Larawan 1, 3c, f at 4b, c), ang mga cell ay karaniwang inaayos gamit ang 4% (wt/vol) paraformaldehyde (PFA), na sinusundan ng Triton X-100 at 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA), nang sunod-sunod. Depende sa uri ng cell, maaaring gamitin ang iba't ibang fixative, permeabilizer, at blocking agents. Mga pangunahing antibody na nagta-target sa lineage-dependent cell o Ginagamit ang mga region marker upang i-highlight ang mga selulang naka-immobilize in situ sa chip, na sinusundan ng mga secondary antibodies kasama ang counterstain dye na nagta-target sa alinman sa nucleus (hal., 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) o F-actin (hal., fluorescently labeled phalloidin). Maaari ring isagawa ang fluorescence-based live imaging in situ upang matukoy ang produksyon ng mucus (Fig. 1, “Cell differentiation” at “Gut physiology”), random colonization ng mga microbial cell (Fig. 1, “Host-microbe co-culture”), ang recruitment ng mga immune cell (Fig. 1, 'Disease Modeling') o ang mga contour ng 3D epithelial morphology (Fig. 3c,f at 4b,c). Kapag binabago ang gut sa chip upang paghiwalayin ang upper layer mula sa lower microchannel layer, gaya ng inilarawan sa ref. Gaya ng ipinapakita sa Fig. 2, ang 3D epithelial morphology pati na rin ang microvilli sa apical brush border ay maaaring makita sa pamamagitan ng SEM (Fig. 3b). Ang ekspresyon ng differentiation Maaaring masuri ang mga marker sa pamamagitan ng pagsasagawa ng quantitative PCR5 o single-cell RNA sequencing. Sa kasong ito, ang mga 3D layer ng mga epithelial cell na lumaki sa mga gut chip o hybrid chip ay kinukuha sa pamamagitan ng trypsinization at pagkatapos ay ginagamit para sa molecular o genetic analysis.
a, Daloy ng trabaho para sa induction ng intestinal morphogenesis sa isang hybrid chip. Ang Caco-2 at mga intestinal organoid ay ginagamit sa protocol na ito upang ipakita ang 3D morphogenesis sa isang hybrid chip platform. Ang mga dissociated epithelial cell ay itinanim sa mga inihandang Transwell insert (TW prep; tingnan ang figure sa ibaba). Nang ang mga cell ay itinanim (itinanim) at ikinabit sa mga polyester membrane sa mga Transwell insert, lahat ng cell ay kinultura sa ilalim ng mga static na kondisyon (TW culture). Pagkatapos ng 7 araw, isang Transwell insert na naglalaman ng 2D monolayer ng mga epithelial cell ay isinama sa isang hybrid chip upang magpakilala ng isang basolateral flow (Flow, BL), na sa huli ay humantong sa pagbuo ng isang 3D epithelial layer (morphogenesis). Ang mga phase contrast micrograph na nagpapakita ng mga morphological feature ng mga human organ epithelial cell na nagmula sa normal donor (C103 line) ascending colon sa bawat experimental step o time point. Ang mga schematic sa itaas na mga layer ay naglalarawan ng experimental configuration para sa bawat hakbang. b, Ang Hybrid chips (kaliwang schematic) ay maaaring humantong sa 3D morphogenesis ng mga organoid epithelial cell na may mga top-down confocal microscopy view na kinuha sa iba't ibang Z position (itaas, gitna, at ibaba; tingnan ang kanang eskematiko at kaukulang tuldok-tuldok na linya). ay nagpakita ng mga halatang katangiang morpolohikal.F-actin (cyan), nucleus (kulay abo).c, Mga fluorescence confocal micrograph (3D angled view) ng mga organoid-derived epithelial cell na kinultura sa static Transwell (TW; inset sa loob ng puting gitling na kahon) laban sa hybrid chip (pinakamalaking buong shot) na naghahambing sa 2D laban sa 3D na morpolohiya, ayon sa pagkakabanggit.Ang isang pares ng 2D vertical cross-cut views (inset sa kanang sulok sa itaas; “XZ”) ay nagpapakita rin ng 2D at 3D na mga tampok.Scale bar, 100 µm.c Muling inilimbag nang may pahintulot mula sa sanggunian.4. Elsevier.
Maaaring ihanda ang mga kontrol sa pamamagitan ng pagkultura ng parehong mga selula (Caco-2 o mga intestinal organoid epithelial cell) sa mga two-dimensional monolayer sa ilalim ng mga kumbensyonal na static culture condition. Kapansin-pansin, ang pagkaubos ng sustansya ay maaaring magresulta dahil sa limitadong kapasidad ng volume ng mga microchannel (ibig sabihin, ~4 µL sa itaas na channel sa orihinal na disenyo ng gut-chip). Samakatuwid, ang morpolohiya ng epithelial bago at pagkatapos ng paglalapat ng basolateral flow ay maaari ring ihambing.
Ang proseso ng malambot na lithography ay dapat isagawa sa isang malinis na silid. Para sa bawat layer sa chip (itaas at ibabang layer at membrane) at hybrid chips, iba't ibang photomask ang ginamit at ginawa sa magkakahiwalay na silicon wafers dahil magkakaiba ang taas ng mga microchannel. Ang target na taas ng itaas at ibabang microchannels ng bituka sa chip ay 500 µm at 200 µm, ayon sa pagkakabanggit. Ang target na taas ng channel ng hybrid chip ay 200 µm.
Maglagay ng 3-pulgadang silicon wafer sa isang lalagyan na may acetone. Dahan-dahang paikutin ang plato sa loob ng 30 segundo, pagkatapos ay patuyuin ito sa hangin. Ilipat ang wafer sa isang plato na may IPA, pagkatapos ay iikot ang plato sa loob ng 30 segundo upang linisin.
Maaari ring gamitin ang solusyon ng piranha (pinaghalong hydrogen peroxide at concentrated sulfuric acid, 1:3 (vol/vol)) upang mapakinabangan nang husto ang pag-aalis ng mga organikong residue mula sa ibabaw ng silicon wafer.
Ang solusyon ng Piranha ay lubhang kinakaing unti-unti at lumilikha ng init. Kinakailangan ang mga karagdagang pag-iingat sa kaligtasan. Para sa pagtatapon ng basura, hayaang lumamig ang solusyon at ilipat sa isang malinis at tuyong lalagyan ng basura. Gumamit ng mga pangalawang lalagyan at lagyan ng wastong label ang mga lalagyan ng basura. Mangyaring sundin ang mga alituntunin sa kaligtasan ng pasilidad para sa mas detalyadong mga pamamaraan.
Patuyuin ang mga wafer sa pamamagitan ng paglalagay sa mga ito sa isang 200 °C na hot plate sa loob ng 10 minuto. Pagkatapos ng dehydration, ang wafer ay inalog nang limang beses sa hangin upang lumamig.
Ibuhos ang humigit-kumulang 10 g ng photoresist SU-8 2100 sa gitna ng nilinis na silicon wafer. Gumamit ng sipit upang pantay na ikalat ang photoresist sa wafer. Paminsan-minsan, ilagay ang wafer sa isang 65°C na hot plate upang hindi gaanong malagkit at mas madaling ikalat ang photoresist. Huwag ilagay ang wafer nang direkta sa hot plate.
Ang SU-8 ay pantay na ipinamahagi sa wafer sa pamamagitan ng pagpapatakbo ng spin coating. I-program ang papasok na pag-ikot ng SU-8 sa loob ng 5-10 segundo upang lumaganap sa 500 rpm sa bilis na 100 rpm/s. Itakda ang pangunahing spin para sa 200 µm na kapal ng patterning sa 1,500 rpm, o makamit ang kapal na 250 µm (na gagawa ng taas na 500 µm para sa itaas na layer ng gut sa chip; tingnan ang "Mga kritikal na hakbang" sa ibaba) na nakatakda sa bilis na 300 rpm/s sa loob ng 30 segundo sa 1,200 rpm.
Maaaring isaayos ang pangunahing bilis ng pag-ikot ayon sa target na kapal ng pattern ng SU-8 sa silicon wafer.
Upang makagawa ng mga pattern ng SU-8 na may taas na 500 µm para sa itaas na patong ng gut sa chip, ang mga hakbang sa spin coating at soft bake ng Kahong ito (mga hakbang 7 at 8) ay sunod-sunod na inulit (tingnan ang hakbang 9) upang makagawa ng dalawang patong ng 250 µm na kapal ng patong ng SU-8, na maaaring patung-patong at pagdugtungin sa pamamagitan ng pagkakalantad sa UV sa hakbang 12 ng kahong ito, na gagawa ng isang patong na may taas na 500 µm.
I-soft bake ang mga SU-8 coated wafer sa pamamagitan ng maingat na paglalagay ng mga wafer sa isang hot plate sa temperaturang 65 °C sa loob ng 5 minuto, pagkatapos ay ilipat ang setting sa 95 °C at i-incubate sa loob ng karagdagang 40 minuto.
Para makamit ang 500 μm na taas ng SU-8 pattern sa itaas na microchannel, ulitin ang mga hakbang 7 at 8 para makabuo ng dalawang 250 μm na kapal na SU-8 layer.
Gamit ang UV Mask Aligner, magsagawa ng pagsubok sa lampara ayon sa mga tagubilin ng tagagawa upang kalkulahin ang oras ng pagkakalantad ng wafer. (oras ng pagkakalantad, ms) = (dosis ng pagkakalantad, mJ/cm2)/(lakas ng lampara, mW/cm2).
Matapos matukoy ang oras ng pagkakalantad, ilagay ang photomask sa lalagyan ng maskara ng UV mask aligner at ilagay din ang photomask sa SU-8 coated wafer.
Ilagay ang naka-print na ibabaw ng photomask nang direkta sa gilid ng silicon wafer na may patong na SU-8 upang mabawasan ang UV dispersion.
Ilantad nang patayo ang SU-8 coated wafer at photomask sa 260 mJ/cm2 ng UV light sa loob ng itinakdang oras ng pagkakalantad (tingnan ang hakbang 10 ng kahong ito).
Pagkatapos ng pagkakalantad sa UV, ang mga SU-8-coated silicon wafer ay inihurno sa 65°C sa loob ng 5 minuto at 95°C sa loob ng 15 minuto sa bawat hot plate upang makagawa ng mga pattern na may taas na 200 μm. Palawigin ang oras pagkatapos i-bake sa 95 °C hanggang 30 minuto upang makagawa ng mga pattern na may taas na 500 µm.
Ang developer ay ibinubuhos sa isang lalagyang salamin, at ang inihurnong wafer ay inilalagay sa lalagyan. Ang dami ng SU-8 developer ay maaaring mag-iba depende sa laki ng platong salamin. Siguraduhing gumamit ng sapat na SU-8 developer upang tuluyang matanggal ang hindi nakalantad na SU-8. Halimbawa, kapag gumagamit ng 150 mm na diyametrong lalagyang salamin na may 1 L na kapasidad, gumamit ng ~300 mL ng SU-8 developer. Ihanda ang hulmahan sa loob ng 25 minuto na may paminsan-minsang marahang pag-ikot.
Banlawan ang nabuo na amag gamit ang humigit-kumulang 10 mL ng sariwang developer na sinusundan ng IPA sa pamamagitan ng pag-ispray ng solusyon gamit ang isang pipette.
Ilagay ang wafer sa isang plasma cleaner at ilantad sa oxygen plasma (atmospheric gas, target pressure 1 × 10−5 Torr, power 125 W) sa loob ng 1.5 minuto.
Ilagay ang wafer sa isang vacuum desiccator na may glass slide sa loob. Maaaring magkatabi ang mga wafer at slide. Kung ang vacuum desiccator ay hinati sa ilang patong sa pamamagitan ng isang plato, ilagay ang mga slide sa ibabang silid at ang mga wafer sa itaas na silid. Magpatak ng 100 μL ng trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl)silane solution sa isang glass slide at maglagay ng vacuum para sa silanization.
Lasawin ang isang vial ng mga nagyelong Caco-2 cells sa isang 37°C water bath, pagkatapos ay ilipat ang mga natunaw na cells sa isang T75 flask na naglalaman ng 15 mL ng 37°C prewarmed Caco-2 medium.
Para maipasa ang mga selula ng Caco-2 sa ~90% na confluency, painitin muna ang Caco-2 medium, PBS, at 0.25% trypsin/1 mM EDTA sa isang 37°C na paliguan ng tubig.
Sipsipin ang medium sa pamamagitan ng vacuum aspiration. Hugasan ang mga selula nang dalawang beses gamit ang 5 mL ng maligamgam na PBS sa pamamagitan ng pag-uulit ng vacuum aspiration at pagdaragdag ng bagong PBS.