Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta para sa CSS. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o i-off ang compatibility mode sa Internet Explorer). Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipapakita namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
Ang human gut morphogenesis ay nagtatatag ng mga tampok na crypt-villus ng 3D epithelial microarchitecture at spatial na organisasyon. Ang natatanging istrukturang ito ay kinakailangan upang mapanatili ang gut homeostasis sa pamamagitan ng pagprotekta sa stem cell niche sa basal crypt mula sa mga exogenous microbial antigens at ang kanilang mga metabolite. mucosal surface.Samakatuwid, ang muling paglikha ng 3D epithelial structures ay napakahalaga para sa pagbuo ng in vitro gut models. Kapansin-pansin, ang organic mimetic gut-on-a-chip ay maaaring mag-udyok ng kusang 3D morphogenesis ng intestinal epithelium na may pinahusay na physiological function at biomechanics. gut sa isang microfluidic chip pati na rin sa isang Transwell embedded hybrid chip. Inilalarawan namin ang mga detalyadong pamamaraan para sa paggawa ng device, pag-culture ng Caco-2 o intestinal organoid epithelial cells sa mga conventional na setting pati na rin sa isang microfluidic platform, induction ng 3D morphogenesis, at characterization ng mga naitatag na 3D epithelia gamit ang multifunctional na pag-imbento ng mga microgeneration gamit ang multiple imaging protocol na ito. pagkontrol sa basolateral fluid flow para sa 5 d. Ang aming in vitro morphogenesis na paraan ay gumagamit ng physiologically relevant na shear stress at mechanical motion at hindi nangangailangan ng kumplikadong cell engineering o manipulation, na maaaring makalampas sa pagganap ng iba pang umiiral na mga diskarte. Naiisip namin na ang aming iminungkahing protocol ay maaaring magkaroon ng malawak na implikasyon para sa biomedical research community, na nagbibigay ng isang paraan upang muling buuin ang 3D intestinal epithelial, at biomedical layer na epithelial para sa biomedical layer. mga aplikasyon.
Ipinakikita ng mga eksperimento na ang mga intestinal epithelial Caco-2 cells na naka-culture sa gut-on-a-chip1,2,3,4,5 o bilayer microfluidic device6,7 ay maaaring sumailalim sa spontaneous 3D morphogenesis in vitro nang walang malinaw na pag-unawa sa pinagbabatayan na mekanismo. epithelial morphogenesis in vitro, na ipinakita ng Caco-2 at mga organoids ng bituka na nagmula sa pasyente. Na-validate ang mga epithelial cell. Sa pag-aaral na ito, partikular kaming nakatuon sa paggawa ng cell at pamamahagi ng konsentrasyon ng isang makapangyarihang Wnt antagonist, Dickkopf-1 (DKK-1), sa gut-on-a-chip at binagong microfluidic device na naglalaman ng mga Transwell insert, na tinatawag na " Hybrid Chip". frizzled-related protein 1, o Soggy-1) sa on-chip gut inhibits morphogenesis o disrupts the prestructured 3D epithelial layer , na nagmumungkahi na ang antagonistic na stress sa panahon ng kultura ay responsable para sa intestinal morphogenesis in vitro. Samakatuwid, ang isang praktikal na diskarte upang makamit ang matatag na morphogenesis sa mga antas ng epithelial antagonist ay upang mapanatili ang minimal na mga antas ng epithelial antagonistic na epithelial interface. sa pamamagitan ng aktibong pag-flush (hal., sa gut-on-a-chip o hybrid-on-a-chip platform) o diffusion .Basolateral media (hal., mula sa Transwell inserts sa malalaking basolateral reservoir sa mga balon).
Sa protocol na ito, nagbibigay kami ng detalyadong paraan para sa paggawa ng mga gut-on-a-chip microdevice at Transwell-insertable hybrid chips (mga hakbang 1-5) upang ikultura ang mga bituka na epithelial cells sa polydimethylsiloxane (PDMS) na nakabatay sa porous membranes (mga hakbang 6A, 7A, 8, 9) o polyesterBs, 7, 9) o polyesterBs, 8, 9 na polyesterBs (8, 9) o polyesterB na mga lamad ng Transwell. 9) at nag-udyok ng 3D morphogenesis sa vitro (hakbang 10). Natukoy din namin ang mga tampok na cellular at molekular na nagpapahiwatig ng histogenesis na tukoy sa tisyu at pagkita ng cellular na umaasa sa linya sa pamamagitan ng paglalapat ng maramihang mga modalidad ng imaging (hakbang 11-24). Nai-induce namin ang morphogenesis gamit ang mga human intestinal epithelial cells, o sa mga teknikal na detalye ng epithelial na mga cell ng bituka ng tao, tulad ng mga detalye ng Catinol na ibabaw ng organ. pagbabago ng mga buhaghag na lamad, paglikha ng 2D monolayer, at bituka na biochemical at Reproduction ng biomechanical microenvironment.in vitro.Upang mahikayat ang 3D morphogenesis mula sa 2D epithelial monolayer, inalis namin ang mga morphogen antagonist sa parehong kulturang anyo sa pamamagitan ng pagdaloy ng medium sa basolateral na kompartimento ng 3D regener ng culture. epithelial layer na maaaring gamitin upang imodelo ang morphogen-dependent epithelial growth, longitudinal host-microbiome co-cultures, pathogen infection, inflammatory injury, epithelial barrier dysfunction, at probiotic-based na mga therapies Example.influences.
Ang aming protocol ay maaaring maging kapaki-pakinabang sa isang malawak na hanay ng mga siyentipiko sa pangunahing (hal., intestinal mucosal biology, stem cell biology, at developmental biology) at inilapat na pananaliksik (hal., preclinical drug testing, disease modelling, tissue engineering, at gastroenterology) malawak na epekto. Dahil sa reproducibility at katatagan ng aming protocol na mag-udyok sa 3D morphinal evision ng aming diskarte sa enthelium na vipitroogenesis ng aming diskarte. maaaring ipalaganap sa mga madlang nag-aaral ng dynamics ng cell signaling sa panahon ng pag-unlad ng bituka, pagbabagong-buhay o homeostasis . Bilang karagdagan, ang aming protocol ay kapaki-pakinabang para sa pagtatanong ng impeksyon sa ilalim ng iba't ibang nakakahawang ahente tulad ng Norovirus 8, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Clostridium difficile, Salmonella choae, o Clostridium difficile. Kapaki-pakinabang din ang mga audience ng pathology at pathogenesis ng sakit. Ang paggamit ng on-chip gut microphysiology system ay maaaring magbigay-daan sa longitudinal co-culture 10 at kasunod na pagtatasa ng host defense, immune responses at pathogen-related injury repair sa gastrointestinal (GI) tract. Inihahanda ang 3D intestinal epithelial layers gamit ang 3D intestinal epithelial layers ng pasyente , ang mga sakit na ito ay kinabibilangan ng villous atrophy, crypt shortening, mucosal damage, o impaired epithelial barrier.Biopsy o stem cell-derived intestinal organoids12,13. Upang mas mahusay na isaalang-alang ang sakit bilang isang mas mataas na kumplikadong mga uri ng cell, tulad ng mga mambabasa ng sakit. pasyente peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), sa mga modelong naglalaman ng 3D intestinal villus-crypt microarchitectures. immune cells na partikular sa tissue, 5.
Dahil ang 3D epithelial microstructure ay maaaring maayos at mailarawan nang walang proseso ng sectioning, ang mga manonood na nagtatrabaho sa spatial transcriptomics at high-resolution o super-resolution na imaging ay maaaring maging interesado sa aming pagmamapa ng spatiotemporal dynamics ng mga gene at protina sa mga epithelial niches. Interesado sa teknolohiya.Tugon sa microbial o immune stimuli.Higit pa rito, ang longitudinal host-microbiome crosstalk 10, 14 na nagko-coordinate ng gut homeostasis ay maaaring maitatag sa 3D intestinal mucosal layer sa pamamagitan ng co-culturing ng iba't ibang microbial species, microbial community o fecal microbiota-on-a-chip-, lalo na sa gut. sa platform.Ang diskarte na ito ay partikular na kaakit-akit sa mga madlang nag-aaral ng mucosal immunology, gastroenterology, microbiome ng tao, culturomics at clinical microbiology na naglalayong linangin ang dati nang hindi na-culture na gut microbiota sa laboratoryo. Kung ang aming in vitro morphogenesis protocol ay maaaring iakma sa mga scalable na format ng kultura, tulad ng multiwell inserts sa 24, 496 na tuluy-tuloy na baso, 496 na pinagsama-samang mga plato, 496 ang protocol ay maaari ding ipakalat sa mga bumubuo ng pharmaceutical, biomedical O high-throughput na screening o validation platform para sa industriya ng pagkain. Bilang patunay ng prinsipyo, ipinakita namin kamakailan ang pagiging posible ng isang multiplex na high-throughput na morphogenesis system na nasusukat sa isang 24-well plate na format. Bilang karagdagan, maraming organ-on-a-a-chip18 na mga produkto ang na-komersyal na18. ang aming in vitro morphogenesis na pamamaraan ay maaaring mapabilis at posibleng gamitin ng maraming research laboratories, industriya o gobyerno at mga ahensya ng regulasyon upang maunawaan ang cellular reprogramming ng in vitro gut morphogenesis sa antas ng transcriptomic upang subukan ang mga gamot o biotherapeutics Ang pagsipsip at transportasyon ng mga kandidato sa droga ay tinasa gamit ang 3D gut surrogates o paggamit ng custom o commercial na reprogutibility model. proseso ng morphogenesis.
Ang isang limitadong bilang ng mga modelong pang-eksperimentong nauugnay sa tao ay ginamit upang pag-aralan ang intestinal epithelial morphogenesis, pangunahin dahil sa kakulangan ng mga maipapatupad na protocol upang mahikayat ang 3D morphogenesis sa vitro. Sa katunayan, karamihan sa kasalukuyang kaalaman tungkol sa gut morphogenesis ay batay sa mga pag-aaral ng hayop (hal., zebrafish20, mice21 o mga manok22). kaduda-duda, at higit sa lahat, hindi tiyak na tinutukoy ang mga proseso ng pag-unlad ng tao. Ang mga modelong ito ay napakalimitado din sa kanilang kakayahang masuri sa isang multi-way na scalable na paraan. Samakatuwid, ang aming protocol para sa pagbabagong-buhay ng 3D tissue structures in vitro ay higit na gumaganap sa mga vivo animal models pati na rin ang iba pang tradisyonal na static na 2D cell culture na mga modelo. lokalisasyon ng mga magkakaibang selula sa axis ng crypt-villus bilang tugon sa iba't ibang mucosal o immune stimuli. Ang 3D epithelial layer ay maaaring magbigay ng puwang upang pag-aralan kung paano nakikipagkumpitensya ang mga microbial cell upang bumuo ng mga spatial na niches at ecological evolution bilang tugon sa mga host factor (hal., panloob laban sa panlabas na mucus layer, pagtatago ng IgA at antimicrobial na mga peptide na nagbibigay-daan sa pag-unawa sa mga antimicrobial epithelial, us). kung paano binubuo ng gut microbiota ang mga komunidad nito at synergistically gumagawa ng mga microbial metabolites (hal., short-chain fatty acids) na humuhubog sa cellular organization at stem cell niches sa basal crypts. Ang mga feature na ito ay maipapakita lamang kapag ang 3D epithelial layers ay naitatag sa vitro.
Bilang karagdagan sa aming paraan ng paglikha ng 3D intestinal epithelial structures, mayroong ilang mga in vitro na pamamaraan.Ang bituka organoid culture ay isang state-of-the-art na tissue engineering technique batay sa paglilinang ng mga bituka stem cell sa ilalim ng mga partikular na kondisyon ng morphogen23,24,25.Gayunpaman, ang paggamit ng 3D organoid na mga modelo-microbging analysis ay kadalasang ang host-culture analysis o host-microbging analysis. Ang bituka lumen ay nakapaloob sa loob ng organoid at, samakatuwid, ang pagpapakilala ng mga luminal na bahagi tulad ng mga microbial cell o exogenous antigens ay limitado. Ang pag-access sa mga organoid lumen ay maaaring mapabuti gamit ang isang microinjector,26,27 ngunit ang pamamaraang ito ay invasive at labor-intensive at nangangailangan ng espesyal na kaalaman upang maisagawa. Higit pa rito, ang mga tradisyonal na organoid na kultura na pinananatili sa hydrogel scaffolds sa ilalim ng mga static na kondisyon ay hindi tumpak na nagpapakita ng aktibo sa vivo biomechanics.
Ang iba pang mga diskarte na ginagamit ng ilang grupo ng pananaliksik ay gumagamit ng prestructured na 3D hydrogel scaffolds para gayahin ang gut epithelial structure sa pamamagitan ng pag-culture ng mga nakahiwalay na bituka ng tao na mga cell sa ibabaw ng gel. Fabricate hydrogel scaffolds gamit ang 3D-printed, micro-milled, o lithographically fabricated molds. Ipinapakita ng paraang ito ang self-physiological na intestinal na mga cell sa ibabaw ng gel. morphogen gradients, na nagtatatag ng mataas na aspect ratio na epithelial structure at stroma-epithelial crosstalk sa pamamagitan ng pagsasama ng stromal cells sa scaffold.Gayunpaman, ang likas na katangian ng prestructured scaffolds ay maaaring pumigil sa pagpapakita ng kusang morphogenetic na proseso mismo. at makakuha ng physiological function.Ang isa pang kamakailang pag-aaral ay gumamit ng hydrogel scaffolds sa isang microfluidic platform at patterned intestinal epithelial structures gamit ang laser-etching techniques. Ang mga organoid ng bituka ng mouse ay sumusunod sa mga nakaukit na pattern upang bumuo ng mga intestinal tubular na istruktura, at ang intraluminal fluid flow ay maaaring i-recapitalated gamit ang microfluidics na mga prosesong ito. mechanobiological movements. Ang mga diskarte sa pagpi-print ng 3D mula sa parehong grupo ay nakagawa ng mga miniature na gut tube na may kusang morphogenetic na proseso. Sa kabila ng kumplikadong paggawa ng iba't ibang gut segment sa loob ng tube, ang modelong ito ay kulang din sa luminal fluid flow at mechanical deformation. Bukod pa rito, ang operability ng modelo ay maaaring limitado, lalo na pagkatapos makumpleto ang proseso ng bioprinting o ang proseso ng bioprinting ay kumpleto, ang mga kondisyon ng cell-steady na pang-eksperimentong cell. gut morphogenesis, physiologically related shear stress, biomechanics na gumagaya sa gut motility, accessibility ng independent apical at basolateral compartments, at muling paglikha ng mga kumplikadong biological microenvironment ng modularity. Samakatuwid, ang aming in vitro 3D morphogenesis protocol ay maaaring magbigay ng pantulong na diskarte upang mapagtagumpayan ang mga hamon ng mga umiiral na pamamaraan.
Ang aming protocol ay ganap na nakatuon sa 3D epithelial morphogenesis, na may mga epithelial cell lamang sa kultura at walang iba pang mga uri ng nakapalibot na mga cell tulad ng mga mesenchymal cells, endothelial cells, at immune cells. Gaya ng naunang inilarawan, ang core ng aming protocol ay ang induction ng epithelial morphogenesis sa pamamagitan ng pag-aalis ng mga morphogen inhibitors na nakatago sa basolateral na bahagi ng aming medium na bahagi ng robust. Binibigyang-daan tayo ng gut-on-a-chip at hybrid-on-a-chip na muling likhain ang umaalon na 3D epithelial layer, ang mga karagdagang biological complexities tulad ng epithelial-mesenchymal interactions33,34, extracellular Matrix (ECM) deposition 35 at, sa aming modelo, ang mga feature ng crypt-villus na naghahatid ng mga stem cell niches ay nananatili sa mga basal blasts. ang mesenchyme ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa paggawa ng mga protina ng ECM at regulasyon ng bituka morphogenesis sa vivo35,37,38. Ang pagdaragdag ng mga mesenchymal cells sa aming modelo ay nagpahusay sa morphogenetic na proseso at kahusayan ng cell attachment. Ang endothelial layer (ibig sabihin, mga capillary o lymphatics) ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa pagsasaayos ng immune recruitment4 at recruitment ng cell gut30 microenvironment.Higit pa rito, ang mga bahagi ng vasculature na maaaring konektado sa pagitan ng mga modelo ng tissue ay isang paunang kinakailangan kapag ang mga modelo ng tissue ay idinisenyo upang magpakita ng mga multi-organ na pakikipag-ugnayan. Samakatuwid, ang mga endothelial cell ay maaaring kailangang isama upang mag-modelo ng mas tumpak na mga tampok na physiological na may resolusyon sa antas ng organ. Ang mga selulang nagmula sa pasyente ay mahalaga din para sa pagpapakita ng mga likas, cross-immune na pagtatanghal, at mga antigen tissue presentation kaligtasan sa sakit sa konteksto ng paggaya sa sakit sa bituka.
Ang paggamit ng hybrid chips ay mas prangka kaysa sa gut-on-a-chip dahil mas simple ang pag-setup ng device at ang paggamit ng Transwell inserts ay nagbibigay-daan para sa scalable culture ng gut epithelium. Gayunpaman, ang mga transwell insert na may polyester membrane na may polyester membrane ay hindi nababanat at hindi maaaring gayahin ang mga paggalaw na parang peristaltic. Higit pa rito, sa hybrid na bahagi ng chipar na inilagay na walang stress na istasyon ng Transwell na inilagay na may mga polyester membranes ay hindi nananatiling elastic. sa apikal na bahagi. Malinaw, ang mga static na katangian sa apical compartment ay bihirang nagbibigay-daan sa pangmatagalang bacterial co-culture sa hybrid chips. Bagama't maaari nating mabuo ang 3D morphogenesis sa mga pagsingit ng Transwell kapag gumagamit ng hybrid chips, ang kakulangan ng biomechanics na may kaugnayan sa physiologically at daloy ng apical fluid ay maaaring limitahan ang pagiging posible ng mga hybrid chip platform.
Hindi pa ganap na naitatag ang mga full-scale na reconstruction ng human crypt-villus axis sa gut-on-a-chip at hybrid-on-a-chip culture. Dahil ang morphogenesis ay nagsisimula sa isang epithelial monolayer, ang 3D microarchitectures ay hindi kinakailangang magbigay ng morphological similarity sa crypts sa vivo. Ang 3D epithelium, ang crypt at villous na mga rehiyon ay hindi malinaw na na-demarcated. Bagama't ang mas mataas na upper channel sa chip ay humantong sa pagtaas ng taas ng microengineered epithelium, ang maximum na taas ay limitado pa rin sa ~300–400 µm. ang taas ng small intestinal villi ay ~600 µm41.
Mula sa pananaw ng imaging, ang in situ super-resolution na imaging ng 3D microarchitectures ay maaaring limitado sa bituka sa isang chip, dahil ang kinakailangang working distance mula sa objective lens hanggang sa epithelial layer ay nasa pagkakasunud-sunod ng ilang millimeters. Upang malampasan ang problemang ito, maaaring kailanganin ang isang malayong layunin. PDMS.Higit pa rito, dahil ang layer-by-layer na microfabrication ng bituka sa isang chip ay nagsasangkot ng permanenteng pagdirikit sa pagitan ng bawat layer, napakahirap na buksan o alisin ang itaas na layer upang suriin ang istraktura sa ibabaw ng epithelial layer. Halimbawa, sa pamamagitan ng paggamit ng scanning electron microscope (SEM).
Ang hydrophobicity ng PDMS ay naging isang limiting factor sa microfluidic-based na pag-aaral na tumatalakay sa hydrophobic small molecules, dahil ang PDMS ay maaaring hindi partikular na i-adsorb ang naturang hydrophobic molecules. Ang mga alternatibo sa PDMS ay maaaring isaalang-alang kasama ng iba pang polymeric na materyales. Bilang kahalili, ang pagbabago sa ibabaw ng PDMS (hal. bawasan ang adsorption ng hydrophobic molecules.
Sa wakas, ang aming pamamaraan ay hindi mahusay na nailalarawan sa mga tuntunin ng pagbibigay ng high-throughput na screening o "one-size-fits-all" na user-friendly na pang-eksperimentong platform. Ang kasalukuyang protocol ay nangangailangan ng isang syringe pump bawat microdevice, na kumukuha ng espasyo sa isang CO2 incubator at pumipigil sa mga malalaking eksperimento. Ang limitasyong ito ay maaaring makabuluhang mapabuti sa pamamagitan ng scalability ng-well, 92 na mga format (well, 92, 92) 384-well porous insert na nagbibigay-daan sa tuluy-tuloy na muling pagdadagdag at pag-alis ng basolateral media).
Para ma-induce ang 3D morphogenesis ng human intestinal epithelium in vitro, gumamit kami ng microfluidic chip intestinal device na naglalaman ng dalawang parallel microchannels at isang elastic porous membrane sa pagitan upang lumikha ng lumen-capillary interface. Ipinapakita rin namin ang paggamit ng single-channel microfluidic device (isang hybrid chip) na nagbibigay ng tuluy-tuloy na basolarized na epithel na daloy sa ilalim ng powell layer sa ilalim ng powell layer. platform, morphogenesis ng iba't ibang mga bituka ng tao na epithelial cell ay maaaring maipakita sa pamamagitan ng paglalapat ng direksyon na pagmamanipula ng daloy upang alisin ang mga morphogen antagonist mula sa basolateral compartment. Ang buong eksperimentong pamamaraan (Figure 1) ay binubuo ng limang bahagi: (i) microfabrication ng gut chip o Transwell insertable hybrid chip (mga hakbang 1-5; (Caco-2 cells) o mga organo ng bituka ng tao; mga kahon 2-5), (iii) kultura ng mga bituka na epithelial cell sa bituka chips o hybrid chips (hakbang 6-9), (iv) induction ng 3D morphogenesis sa vitro (hakbang 10) at (v) ) upang makilala ang 3D epithelial microstructure (hakbang 11-24). vitro morphogenesis sa pamamagitan ng paghahambing ng epithelial morphogenesis sa spatial, temporal, conditional, o procedural na mga kontrol.
Gumamit kami ng dalawang magkaibang platform ng kultura: gut-on-a-chip na may mga straight channel o nonlinear convoluted channels, o hybrid chips na naglalaman ng Transwell (TW) inserts sa isang microfluidic device, na gawa tulad ng inilalarawan sa Box 1, at hakbang 1 -5."Device Fabrication" ay nagpapakita ng mga pangunahing hakbang sa paggawa ng isang chip o hybrid chip."Culture of Human Intestina Cello" Culture of Human Intestina Cello. organoids ng bituka ng tao) at pamamaraan ng kultura na ginamit sa protocol na ito."In vitro morphogenesis" ay nagpapakita ng mga pangkalahatang hakbang kung saan ang Caco-2 o organoid-derived epithelial cells ay nilinang sa bituka chip o sa Transwell inserts ng hybrid chip, na sinusundan ng induction ng 3D morphogenesis at ang pagbuo ng isang characterized na epithelial na istraktura ng bawat isa. Maaaring gamitin ang mga intestinal epithelial layer, halimbawa, sa cell differentiation characterization, gut physiology studies, pagtatatag ng host-microbiome ecosystem, at pagmomodelo ng sakit. Immunofluorescence images sa "Cell Differentiation" na nagpapakita ng nuclei, F-actin at MUC2 na ipinahayag sa 3D na gut na layer ng chip-2 na nabuo sa gat ng gut signal na nabuo sa CMUC2 na layer ng chip. goblet cells at mucus na itinago mula sa mucosal surface. Ang mga fluorescent na larawan sa Gut Physiology ay nagpapakita ng mucus na ginawa sa pamamagitan ng paglamlam para sa sialic acid at N-acetylglucosamine residues gamit ang fluorescent wheat germ agglutinin. Ang dalawang magkasanib na larawan sa "Host-Microbe Co-Cultures" ay nagpapakita ng kinatawan ng host-microbiome na co-culture sa isang co-culture ng E. coli expressing green fluorescent protein (GFP) na may microengineered 3D Caco-2 epithelial cells. Ang kanang panel ay nagpapakita ng localization ng GFP E. coli co-cultured na may 3D Caco-2 epithelial cells, na sinusundan ng immunofluorescence staining na may F-actin (pula) at nuclei (asul). na may mga bacterial antigens (hal., lipopolysaccharide, LPS) at immune cells (hal., PBMC; berde). Ang mga selulang Caco-2 ay na-culture para magtatag ng 3D epithelial layer. Scale bar, 50 µm. Mga larawan sa ibabang hilera: "Differentiation of cells" na inangkop nang may pahintulot mula sa sanggunian.2. Oxford University Press; Na-reproduce nang may pahintulot mula sa Ref.5. NAS; “Host-Microbe Co-Culture” na inangkop nang may pahintulot mula sa ref.3. NAS; "Pagmomodelo ng Sakit" na iniangkop nang may pahintulot mula sa sanggunian.5. NAS.
Ang parehong gut-on-chip at hybrid chips ay ginawa gamit ang PDMS replicas na na-demold mula sa silicon molds sa pamamagitan ng soft lithography1,44 at naka-pattern sa SU-8. Ang disenyo ng microchannels sa bawat chip ay tinutukoy sa pamamagitan ng pagsasaalang-alang sa hydrodynamics tulad ng shear stress at hydrodynamic pressure1,4,12. Ang orihinal na gut-on-a-chip na binubuo ng dalawang Fig. pinagsama-samang parallel straight microchannels, ay nag-evolve sa isang kumplikadong gut-on-a-chip (Extended Data Fig. 1b) na kinabibilangan ng isang pares ng curved microchannels para mahikayat ang Tumaas na fluid residence time, nonlinear flow patterns, at multiaxial deformation ng mga cultured cells (Fig. 2a–fhenchanics) 12. . Maaaring mapili ang gut-on-a-chips. Ipinakita namin na ang convoluted Gut-Chip ay malakas ding nag-uudyok ng 3D morphogenesis sa isang katulad na time frame na may katulad na antas ng paglaki ng epithelial kumpara sa orihinal na Gut-Chip, anuman ang kulturang uri ng cell. Samakatuwid, para ma-induce ang 3D morphogenesis, linear at design na mga on-chip mold ng interchangeable na on-chip mold na may mga silicon na gut na may mga interchangeable na molPD. Ang mga pattern ng SU-8 ay nagbigay ng mga negatibong tampok pagkatapos ng demolding (Larawan 2a). Upang mabuo ang bituka sa isang chip, ang inihandang itaas na layer ng PDMS ay sunud-sunod na pinagsama sa isang porous na PDMS film at pagkatapos ay nakahanay sa mas mababang layer ng PDMS sa pamamagitan ng hindi maibabalik na pagbubuklod gamit ang isang corona treater (Fig. 2b–f). na maaaring tumanggap ng mga pagsingit ng Transwell (Fig. 2h at Extended Data Fig. 2). Ang proseso ng pagbubuklod ay isinasagawa sa pamamagitan ng paggamot sa mga ibabaw ng PDMS replica at salamin na may oxygen plasma o paggamot sa corona. Pagkatapos ng isterilisasyon ng microfabricated na device na nakakabit sa silicone tube, handa na ang pag-setup ng device upang maisagawa ang 3D morphogenesis epithelium2glogenesis ng intestinag.
a, Ilustrasyon ng eskematiko ng paghahanda ng mga bahagi ng PDMS mula sa SU-8 na may pattern na silicon molds. Ang uncured PDMS solution ay ibinuhos sa isang silicon mold (kaliwa), cured sa 60 °C (gitna) at demolded (kanan). gawa-gawa ang PDMS porous membrane.d, Isang serye ng mga larawan ng upper at lower PDMS component at ang naka-assemble na on-chip intestinal device.e, Schematic ng alignment ng upper, membrane, at lower PDMS na bahagi. Ang bawat layer ay irreversibly bonded sa pamamagitan ng plasma o corona treatment.f, Schematic of the fabricated gut-on-a-channel na device na may superimposed na gut-on-a-channel chambers.g, Setup ng gut-on-a-chip para sa microfluidic cell culture. Ang gawa-gawang gut sa isang chip na binuo gamit ang silicone tube at syringe ay inilagay sa isang coverslip. Ang chip device ay inilagay sa takip ng isang 150 mm Petri dish para sa pagproseso. Ginagamit ang binder upang isara ang silicone tube.h, Visual na inihanda na mga snapshot ng 3D hybrids chipmorph na independiyenteng tela at mga chipogenesis na inihanda ng 3D hybrids chipmorph. sa kultura 2D monolayers ng bituka epithelial cell ay ipinasok sa hybrid chip upang magbuod ng bituka 3D morphogenesis. Ang medium ay perfused sa pamamagitan ng microchannels sa ilalim ng cell layer na itinatag sa Transwell insert. Scale bar, 1 cm.h Reprinted na may pahintulot mula sa reference.4. Elsevier.
Sa protocol na ito, ginamit ang Caco-2 cell line at intestinal organoids bilang mga epithelial sources (Fig. 3a). Ang parehong uri ng mga cell ay independiyenteng nilinang (Kahon 2 at Box 5) at ginamit upang i-seed ang ECM-coated microchannels ng on-chip gut o Transwell inserts. Kapag ang mga cell ay nagsasama-sama (>95% na mga cell na nagsasama-sama), regular na pumasa sa mga cell na na-flatage (> 95% na mga cell na naka-floated na mga cell. 10 at 50) sa T-flasks ay inaani upang maghanda ng mga dissociated cell suspension sa pamamagitan ng trypsinization fluid (kahon 2). Ang mga organoid ng bituka ng tao mula sa mga biopsies ng bituka o surgical resection ay nilinang sa Matrigel scaffold domes sa 24-well plates upang suportahan ang structural microenviring. R-spondin, at Noggin) at ang mga growth factor na inihanda gaya ng inilarawan sa Kahon 3 ay dinagdagan bawat ibang araw hanggang ang mga organoid ay lumaki hanggang ~500 µm ang diyametro. Ang mga ganap na lumaki na organoid ay inaani at hinihiwa-hiwalay sa mga solong selula para sa pagtatanim sa gat o Transwell inserts sa isang chip (Kahon 5). Gaya ng nauulat natin noon na may sakit12, ayon sa pagkaka-uri ng ulser, 12. colitis, Crohn's disease, colorectal cancer, o normal na donor), lesion site (hal., lesion versus non-lesioned area) at gastrointestinal na lokasyon sa tract (hal, duodenum, jejunum, ileum, cecum, colon, o rectum). Nagbibigay kami ng naka-optimize na protocol sa Box 5 para sa pag-culture ng colonic organoids (coloids na mas mataas na konsentrasyon ng mga morphtest) organoids.
a, Workflow para sa induction ng gut morphogenesis sa gut chip. Ginagamit ang Caco-2 human intestinal epithelium at intestinal organoids sa protocol na ito upang ipakita ang 3D morphogenesis. Ang mga nakahiwalay na epithelial cells ay ibinila sa inihandang gut-on-a-chip device (paghahanda ng chip). (D0), apical (AP) flow ay sinisimulan at pinananatili sa unang 2 araw (flow, AP, D0-D2). Basolateral (BL) flow ay sinisimulan din kasama ng cyclic stretching motions (stretch, flow, AP at BL) kapag nabuo ang isang kumpletong 2D monolayer. Intestinal 3D morphhaogenesis na mga larawan ay kusang naganap pagkatapos ng 5 araw na pagpapakita ng micromorphidic na kultura ng mga contraidic na 5 araw. kinatawan ng morphology ng Caco-2 cells sa bawat experimental step o time point (bar graph, 100 µm). Apat na schematic diagram na naglalarawan ng kaukulang cascades ng gut morphogenesis (kanang tuktok). (white dashed box) ay nagpapakita ng regenerated microvilli sa 3D Caco-2 layer (kanan).c, Horizontal frontal view ng itinatag na Caco-2 3D, claudin (ZO-1, red) at tuloy-tuloy na brush border membrane na may label na F-actin (berde) at nuclei (asul) Immunofluorescence confocal na mga cell visualization sa gitnang Arrowhelrial na mga cell visualization ipahiwatig ang lokasyon ng focal plane para sa bawat confocal view.d, Time course ng mga pagbabago sa morphological sa mga organoid na na-culture sa isang chip na nakuha sa pamamagitan ng phase contrast microscopy sa mga araw na 3, 7, 9, 11, at 13. Ang inset (kanan sa itaas) ay nagpapakita ng mataas na pag-magnify ng ibinigay na imahe.e, DIC photomicrograph ng organoid sa slice 3D epithelium na kinunan sa araw na gutthelium. immunofluorescence na mga imahe na nagpapakita ng mga marker para sa mga stem cell (LGR5; magenta), goblet cells (MUC2; green), F-actin (grey) at nuclei (cyan) na lumaki sa gut chips sa loob ng 3 araw, ayon sa pagkakabanggit (Kaliwa) at 13-araw (gitna) na mga organoid sa epithelial layer.Tingnan din ang highlight ng LG3R5 na walang signal ng LGR5. pagbibigay ng senyas.Mga larawang fluorescence na nagpapakita ng epithelial microstructure (kanan) ng 3D organoid epithelium na itinatag sa gut sa isang chip sa pamamagitan ng paglamlam sa plasma membrane ng CellMask dye (kanan) sa ika-13 araw ng kultura. Ang scale bar ay 50 μm maliban kung iba ang nakasaad.b Muling na-print nang may pahintulot mula sa sanggunian.2. Oxford University Press; c Iniangkop nang may pahintulot mula sa Sanggunian.2. Oxford University Press; inangkop ang e at f nang may pahintulot sa pamamagitan ng sanggunian.12 Sa ilalim ng Lisensya ng Creative Commons CC BY 4.0.
Sa gut sa isang chip, kinakailangang baguhin ang hydrophobic surface ng PDMS porous membrane para sa matagumpay na ECM coating. Sa protocol na ito, nag-aaplay kami ng dalawang magkaibang pamamaraan para baguhin ang hydrophobicity ng PDMS membranes. Para sa pag-culture ng Caco-2 cells, ang surface activation sa pamamagitan ng UV/ozone treatment lamang ay sapat na upang mabawasan ang hydrophobicity ng PDMS-attach na mga cell at surface, membrane.Gayunpaman, ang microfluidic culture ng organoid epithelium ay nangangailangan ng chemical-based surface functionalization upang makamit ang mahusay na deposition ng ECM proteins sa pamamagitan ng sunud-sunod na paglalapat ng polyethyleneimine (PEI) at glutaraldehyde sa PDMS microchannels.Pagkatapos ng pagbabago sa ibabaw, ang mga ECM proteins ay idineposito upang masakop ang functionalized na PDMS na isolated na mga cell at pagkatapos ay inilalagay ang organo sa ibabaw ng epiter. kalakip, ang microfluidic cell culture ay nagsisimula sa pamamagitan ng paglalagay lamang ng medium sa itaas na microchannel hanggang sa ang mga cell ay bumuo ng isang kumpletong monolayer, habang ang mas mababang microchannel ay nagpapanatili ng mga static na kondisyon. Ang na-optimize na paraan para sa pag-activate ng ibabaw at ECM coating ay nagbibigay-daan sa attachment ng organoid epithelium upang mahikayat ang 3D morphogenesis sa ibabaw ng PDMS.
Ang mga kultura ng Transwell ay nangangailangan din ng ECM coating bago ang cell seeding; gayunpaman, ang mga kultura ng Transwell ay hindi nangangailangan ng mga kumplikadong hakbang sa pretreatment upang i-activate ang ibabaw ng mga porous na pagsingit. Para sa lumalaking Caco-2 na mga cell sa mga Transwell insert, ang ECM coating sa mga porous na insert ay nagpapabilis sa pagkakadikit ng mga dissociated na Caco-2 na mga cell (<1 oras) at tight junction barrier formation (<1-2 araw). Ang mga pagsingit na pinahiran ng ECM, na nakakabit sa ibabaw ng lamad (<3 h) at pinananatili hanggang ang mga organoid ay bumuo ng isang kumpletong monolayer na may integridad ng barrier . Ang mga kultura ng Transwell ay ginagawa sa 24-well plate nang hindi gumagamit ng hybrid chips.
Ang in vitro 3D morphogenesis ay maaaring simulan sa pamamagitan ng paglalapat ng daloy ng likido sa basolateral na aspeto ng isang itinatag na epithelial layer. Sa gut sa isang chip, nagsimula ang epithelial morphogenesis kapag ang medium ay pinabango sa upper at lower microchannels (Fig. 3a). Gaya ng naunang inilarawan, kritikal na ipakilala ang tuluy-tuloy na daloy ng fluid sa inferior (basolateral na direksyon ng lihim na direksyon) inhibitors. Para makapagbigay ng sapat na nutrients at serum sa mga cell na nakagapos sa porous membranes at makabuo ng luminal shear stress, karaniwan naming inilalapat ang dual flow sa gut sa isang chip. Sa hybrid chips, ang mga Transwell insert na naglalaman ng mga epithelial monolayer ay ipinasok sa hybrid chips. Pagkatapos, ang medium ay inilapat sa ilalim ng basolateral side ng basolateral na Transwell insert na insert sa pamamagitan ng microchannel3 na pagpasok ng Transwell na araw sa pamamagitan ng microchannel3tivation na araw. basolateral na daloy sa parehong mga platform ng kultura.
Ang mga morphological feature ng microengineered 3D epithelial layers ay maaaring masuri sa pamamagitan ng paglalapat ng iba't ibang imaging modalities, kabilang ang phase contrast microscopy, differential interference contrast (DIC) microscopy, SEM, o immunofluorescence confocal microscopy (Figures 3 at 4). Ang phase contrast o DIC na pag-imaging ay madaling maisagawa sa anumang oras ng pag-monitor ng epithelial na kultura at protrusion ng DIC. mga layer.Dahil sa optical transparency ng PDMS at polyester films, ang parehong gut-on-a-chip at hybrid chip platform ay makakapagbigay ng real-time in situ imaging nang hindi nangangailangan ng sectioning o disassembly ng device. Kapag nagsasagawa ng immunofluorescence imaging (Figures 1, 3c, f at 4b, c), ang mga cell ay paratypically fixed na may paratypically fixed. (PFA), na sinusundan ng Triton X-100 at 2% (wt/vol) ) bovine serum albumin (BSA), ayon sa pagkakasunud-sunod. Depende sa uri ng cell, maaaring gumamit ng iba't ibang fixative, permeabilizer, at blocking agent. Ang mga pangunahing antibodies na nagta-target sa lineage-dependent na cell o mga marker ng rehiyon ay ginagamit upang i-highlight ang mga cell na hindi kumikilos sa lugar na sinusundan ng panlaban na antibodies sa chip, na sinusundan ng pangalawang stain antibodies sa chip, (hal., 4′,6-diamidino-2-phenylene) indole, DAPI) o F-actin (hal., fluorescently na may label na phalloidin). Ang fluorescence-based na live imaging ay maaari ding isagawa sa situ para makita ang produksyon ng mucus (Fig. 1, "Cell differentiation" at "Gut physiology"), random na kolonisasyon ng microbe. co-culture") , ang recruitment ng immune cells (Fig. 1, 'Disease Modeling') o ang mga contour ng 3D epithelial morphology (Fig. 3c,f at 4b,c). Kapag binago ang bituka sa chip upang paghiwalayin ang itaas na layer mula sa lower microchannel layer, tulad ng inilarawan sa ref. Gaya ng ipinapakita sa Fig3D emorphology. ang apical brush border ay maaaring makita ng SEM (Fig. 3b). Ang pagpapahayag ng mga differentiation marker ay maaaring masuri sa pamamagitan ng pagsasagawa ng quantitative PCR5 o single-cell RNA sequencing. Sa kasong ito, ang mga 3D na layer ng epithelial cells na lumago sa gut chips o hybrid chips ay inaani ng trypsinization at pagkatapos ay ginagamit para sa molecular o genetic analysis.
a, Workflow para sa induction ng intestinal morphogenesis sa isang hybrid chip. Ang Caco-2 at mga bituka na organoid ay ginagamit sa protocol na ito upang ipakita ang 3D morphogenesis sa isang hybrid chip platform. Ang mga di-dissociated na epithelial cell ay ibinuhos sa inihandang mga Transwell insert (TW prep; tingnan ang figure sa ibaba). Kapag ang mga cell ay na-seeded (seeded well) at naka-attach sa lahat ng mga cell na transstatic sa ilalim ng mga cell ng Transwell. kundisyon (kultura ng TW).Pagkalipas ng 7 araw, ang nag-iisang Transwell insert na naglalaman ng 2D monolayer ng mga epithelial cells ay isinama sa isang hybrid na chip upang ipakilala ang isang basolateral na daloy (Daloy, BL), na sa huli ay humantong sa pagbuo ng isang 3D na epithelial layer (morphogenesis).Phase contrast micrographs na nagpapakita ng mga morphological features ng human organ epithelial don line de cell30 derived. pang-eksperimentong hakbang o punto ng oras. Ang mga schematic sa itaas na mga layer ay naglalarawan ng pang-eksperimentong configuration para sa bawat hakbang.b, Hybrid chips (kaliwang schematic) ay maaaring humantong sa 3D morphogenesis ng organoid epithelial cells na may top-down confocal microscopy view na kinunan sa iba't ibang Z na posisyon (itaas, gitna, at ibaba; tingnan ang kanang schematic at katumbas na mga tuldok na linya). nagpakita ng mga halatang morphological na katangian.F-actin (cyan), nucleus (grey).c, Fluorescence confocal micrographs (3D angled view) ng organoid-derived epithelial cells na naka-culture sa static na Transwell (TW; inset sa loob ng puting dashed box) kumpara sa hybrid chip (pinakamalaking full shot) na naghahambing ng 2D versus 3D na vertical na morphology, ayon sa pagkakasunod-sunod ng mga cut2 na morphology. kanang sulok; "XZ") ay nagpapakita rin ng 2D at 3D na mga feature.Scale bar, 100 µm.c Reprinted na may pahintulot mula sa reference.4. Elsevier.
Ang mga kontrol ay maaaring ihanda sa pamamagitan ng pag-culture ng parehong mga cell (Caco-2 o intestinal organoid epithelial cells) sa dalawang-dimensional na monolayer sa ilalim ng conventional static na kondisyon ng kultura. maikumpara.
Ang proseso ng malambot na lithography ay dapat isagawa sa isang malinis na silid. Para sa bawat layer sa chip (itaas at ibabang mga layer at lamad) at hybrid chips, iba't ibang photomask ang ginamit at ginawa sa magkahiwalay na mga wafer ng silicon dahil magkaiba ang taas ng microchannels. Ang mga target na taas ng upper at lower microchannels ng gut sa chip ay 500 µm at 2. 200 µm.
Maglagay ng 3-pulgadang silicon na wafer sa isang dish na may acetone. Dahan-dahang paikutin ang plato sa loob ng 30 segundo, pagkatapos ay tuyo sa hangin ang wafer. Ilipat ang wafer sa isang plato na may IPA, pagkatapos ay paikutin ang plato nang 30 s upang linisin.
Ang solusyon ng piranha (pinaghalong hydrogen peroxide at concentrated sulfuric acid, 1:3 (vol/vol)) ay maaaring opsyonal na gamitin upang i-maximize ang pag-alis ng mga organikong residue mula sa ibabaw ng silicon wafer.
Ang solusyon ng Piranha ay lubhang kinakaing unti-unti at nagdudulot ng init. Kinakailangan ang mga karagdagang pag-iingat sa kaligtasan. Para sa pagtatapon ng basura, hayaang lumamig ang solusyon at ilipat sa isang malinis at tuyo na lalagyan ng basura. Gumamit ng mga pangalawang lalagyan at wastong lagyan ng label ang mga lalagyan ng basura. Mangyaring sundin ang mga alituntunin sa kaligtasan ng pasilidad para sa mas detalyadong mga pamamaraan.
I-dehydrate ang mga wafer sa pamamagitan ng paglalagay sa kanila sa isang 200 °C na mainit na plato sa loob ng 10 min. Pagkatapos ma-dehydrate, ang wafer ay inalog ng limang beses sa hangin upang lumamig.
Ibuhos ang ~10 g ng photoresist SU-8 2100 sa gitna ng nilinis na silicon na wafer.Gumamit ng mga sipit para pantay-pantay na ikalat ang photoresist sa wafer. Paminsan-minsan ay ilagay ang wafer sa isang 65°C na hot plate upang hindi gaanong malagkit at madaling kumalat ang photoresist. Huwag ilagay ang wafer nang direkta sa hot plate.
Ang SU-8 ay pantay na ipinamahagi sa wafer sa pamamagitan ng pagpapatakbo ng spin coating. I-program ang isang papasok na pag-ikot ng SU-8 sa loob ng 5–10 s upang magpalaganap sa 500 rpm sa isang acceleration na 100 rpm/s. Itakda ang main spin para sa 200 µm thickness patterning sa 1,500 rpm 50 (makamit ang kapal ng 1,500 rpm, o 500 rpm, o mak50). µm na taas para sa itaas na layer ng bituka sa chip; tingnan ang "Mga kritikal na hakbang" sa ibaba) na nakatakda sa isang acceleration na 300 rpm/s 30 segundo sa 1,200 rpm.
Ang pangunahing bilis ng pag-ikot ay maaaring iakma ayon sa target na kapal ng SU-8 pattern sa silicon wafer.
Upang gumawa ng mga pattern ng SU-8 na may taas na 500 µm para sa itaas na layer ng bituka sa chip, ang spin coating at soft bake steps ng Kahong ito (mga hakbang 7 at 8) ay sunud-sunod na inulit (tingnan ang hakbang 9) upang makabuo ng dalawang layer na 250 µm Isang makapal na layer ng SU-8, na maaaring i-layer sa 10 na hakbang ng exposure box na ito, na maaaring isama sa 10 na hakbang na ito ng UV µm. mataas.
Soft bake ang SU-8 coated wafers sa pamamagitan ng maingat na paglalagay ng mga wafer sa isang hot plate sa 65 °C sa loob ng 5 min, pagkatapos ay ilipat ang setting sa 95 °C at i-incubate para sa karagdagang 40 min.
Upang makamit ang 500 μm na taas ng SU-8 pattern sa itaas na microchannel, ulitin ang mga hakbang 7 at 8 upang makabuo ng dalawang 250 μm na kapal ng SU-8 na layer.
Gamit ang UV Mask Aligner, magsagawa ng lamp test ayon sa mga tagubilin ng tagagawa para kalkulahin ang oras ng pagkakalantad ng wafer.(tagal ng pagkakalantad, ms) = (dosis ng pagkakalantad, mJ/cm2)/(lakas ng lampara, mW/cm2).
Pagkatapos matukoy ang oras ng pagkakalantad, ilagay ang photomask sa mask holder ng UV mask aligner at ilagay ang photomask sa SU-8 coated wafer.
Ilagay ang naka-print na ibabaw ng photomask nang direkta sa SU-8 na pinahiran na gilid ng silicon wafer upang mabawasan ang UV ​​dispersion.
Ilantad ang SU-8 coated wafer at photomask nang patayo sa 260 mJ/cm2 ng UV light para sa paunang natukoy na oras ng pagkakalantad (tingnan ang hakbang 10 ng kahon na ito).
Pagkatapos ng UV exposure, ang SU-8-coated na silicon wafers ay inihurnong sa 65°C sa loob ng 5 min at 95°C sa loob ng 15 min sa bawat hot plate upang makagawa ng mga pattern na may taas na 200 μm. Patagalin ang post-bake time sa 95 °C hanggang 30 min upang makagawa ng mga pattern na may taas na 500 μm.
Ang developer ay ibinubuhos sa isang glass dish, at ang baked wafer ay inilalagay sa dish.Ang volume ng SU-8 developer ay maaaring mag-iba depende sa laki ng glass plate.Siguraduhing gumamit ng sapat na SU-8 developer upang ganap na maalis ang hindi nalantad na SU-8.Halimbawa, kapag gumagamit ng 150 mm diameter na glass dish na may kapasidad na 1 L, gumamit ng ~300 mL ng 5 minutong rotation na may pag-develop.
Banlawan ang nabuong amag na may ~10 mL ng sariwang developer na sinusundan ng IPA sa pamamagitan ng pag-spray ng solusyon gamit ang pipette.
Ilagay ang wafer sa isang plasma cleaner at ilantad sa oxygen plasma (atmospheric gas, target pressure 1 × 10−5 Torr, power 125 W) sa loob ng 1.5 min.
Ilagay ang wafer sa isang vacuum desiccator na may glass slide sa loob. Ang mga wafer at slide ay maaaring ilagay nang magkatabi. Kung ang vacuum desiccator ay nahahati sa ilang layer sa pamamagitan ng isang plato, ilagay ang mga slide sa lower chamber at ang mga wafer sa upper chamber. Maghulog ng 100 μL ng trichloro(1H, 1H, 2H, 2H) at slide solution. vacuum para sa silanisasyon.
I-thaw ang vial ng frozen Caco-2 cells sa 37°C water bath, pagkatapos ay ilipat ang mga natunaw na cell sa T75 flask na naglalaman ng 15 mL ng 37°C na prewarmed Caco-2 medium.
Upang maipasa ang Caco-2 na mga cell sa ~90% na pagkakatagpo, unang mainit na Caco-2 medium, PBS, at 0.25% trypsin/1 mM EDTA sa isang 37°C na paliguan ng tubig.
I-aspirate ang medium sa pamamagitan ng vacuum aspiration. Hugasan ang mga cell nang dalawang beses gamit ang 5 mL ng mainit na PBS sa pamamagitan ng pag-uulit ng vacuum aspiration at pagdaragdag ng sariwang PBS.