Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Ayrıca, sürekli destek sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Aynı anda üç slayttan oluşan bir slayt gösterisi sunar. Önceki ve Sonraki düğmelerini kullanarak üç slayt arasında geçiş yapabilir veya sondaki kaydırma düğmelerini kullanarak üç slayt arasında geçiş yapabilirsiniz.
Geniş gözenekli partiküller elde etmek için bazı modifikasyonlarla sol-jel yöntemi kullanılarak gözenekli silika partikülleri hazırlandı. Bu partiküller, N-fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat (PMI) ve stiren ile ters zincir transferi-parçalanma (RAFT) polimerizasyonu yoluyla türevlendirilerek N-fenilmaleimid ara katmanlı poliamidler üretildi. Stiren (PMP) sabit fazı kullanıldı. Dar çaplı paslanmaz çelik kolonlar (100 × 1,8 mm iç çap) bir bulamaç dolgu maddesi ile dolduruldu. PMP kolonunun kromatografik performansı, beş peptitten (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amino asit enkefalin) oluşan sentetik peptit karışımını ve insan serum albüminin (HAS) triptik hidrolizatını ayırmak için değerlendirildi. Optimal elüsyon koşulları altında, peptit karışımı içeren teorik plaka sayısı 280.000 plaka/m²'ye ulaştı. Geliştirilen kolonun ayırma performansını ticari Ascentis Express RP-Amide kolonu ile karşılaştırdığımızda, PMP kolonunun ayırma verimliliği ve çözünürlük açısından ticari kolona göre daha üstün olduğu gözlemlendi.
Biyofarmasötik endüstrisi, son yıllarda pazar payında önemli bir artışla genişleyen küresel bir pazar haline gelmiştir. Biyofarmasötik endüstrisinin patlayıcı büyümesiyle birlikte1,2,3 peptit ve protein analizine büyük bir ihtiyaç doğmuştur. Hedef peptitin yanı sıra, peptit sentezi sırasında çeşitli safsızlıklar oluşur, bu nedenle istenen peptit saflığını elde etmek için kromatografik saflaştırma gereklidir. Vücut sıvılarında, dokularda ve hücrelerdeki proteinlerin analizi ve karakterizasyonu, tek bir örnekte bulunan çok sayıda potansiyel olarak tespit edilebilir tür nedeniyle son derece zorlu bir görevdir. Kütle spektrometresi peptit ve proteinlerin dizilenmesi için etkili bir araç olmasına rağmen, bu tür örnekler doğrudan kütle spektrometresine verilirse, ayırma tatmin edici olmayacaktır. Bu sorun, MS analizinden önce sıvı kromatografisi (LC) yapılarak çözülebilir; bu da belirli bir zamanda kütle spektrometresine giren analit miktarını azaltacaktır4,5,6. Ek olarak, analitler sıvı faz ayrımı sırasında dar bir bölgede yoğunlaşabilir, böylece bu analitler yoğunlaşarak MS tespitinin hassasiyetini artırır. Sıvı kromatografisi (LC) son on yılda önemli ölçüde ilerleme kaydetmiş ve proteomik analiz için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline gelmiştir7,8,9,10.
Ters fazlı sıvı kromatografisi (RP-LC), oktadesil modifiye silika (ODS) durağan faz olarak kullanılarak peptit karışımlarının saflaştırılması ve ayrılması için yaygın olarak kullanılmaktadır11,12,13. Bununla birlikte, karmaşık yapıları ve amfoterik doğaları nedeniyle14,15 RP durağan fazları, peptitlerin ve proteinlerin tatmin edici bir şekilde ayrılmasını sağlayamaz. Bu nedenle, polar ve polar olmayan parçalara sahip peptitlerin ve proteinlerin analizi, bu analitlerle etkileşime girmek ve onları tutmak için özel olarak tasarlanmış durağan fazlar gerektirir16. Çok modlu etkileşimler sunan karışık kromatografi, peptitleri, proteinleri ve diğer karmaşık karışımları ayırmak için RP-LC'ye bir alternatif olabilir. Birkaç karışık tip durağan faz hazırlanmış ve bu durağan fazlarla doldurulmuş kolonlar peptitleri ve proteinleri ayırmak için kullanılmıştır17,18,19,20,21. Polar ve polar olmayan grupların varlığı nedeniyle, karışık modlu sabit fazlar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar interkalasyon/RPLC) peptitlerin ve proteinlerin ayrılması için uygundur22,23,24,25,26,27,28. Kovalent olarak bağlanmış polar gruplara sahip polar interkalasyonlu sabit fazlar, ayırma işlemi analit ile sabit faz arasındaki etkileşime bağlı olduğundan, polar ve polar olmayan analitler için iyi ayırma yetenekleri ve benzersiz seçicilik gösterir. Çok modlu etkileşimler 29,30,31,32. Son zamanlarda Zhang ve ark. 30, poliaminlerin behenil uçlu sabit fazlarını elde etmiş ve hidrokarbonları, antidepresanları, flavonoidleri, nükleositleri, östrojenleri ve diğer bazı analitleri başarıyla ayırmıştır. Polar gömülü sabit malzeme hem polar hem de polar olmayan gruplara sahip olduğundan, peptitleri ve proteinleri hidrofobik ve hidrofilik kısımlara ayırmak için kullanılabilir. Polar sıralı kolonlar (örneğin, amid sıralı C18 kolonlar) Ascentis Express RP-Amide kolonları ticari adı altında mevcuttur, ancak bu kolonlar yalnızca amin 33'ün analizi için kullanılmıştır.
Bu çalışmada, polar bir gömme sabit faz (N-fenilmaleimid, gömme polistiren) hazırlanmış ve peptit ayrımı ve tripsinle HSA parçalanması için değerlendirilmiştir. Sabit fazın hazırlanmasında aşağıdaki strateji kullanılmıştır. Gözenekli silika parçacıkları, önceki yayınlarımızda açıklanan prosedürlere göre, hazırlama şemalarında bazı değişiklikler yapılarak hazırlanmıştır 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Üre, polietilen glikol (PEG), TMOS ve sulu asetik asit oranları, geniş gözenek boyutlarına sahip silika parçacıkları elde etmek için ayarlanmıştır. İkinci olarak, yeni bir fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat ligandı sentezlenmiş ve türevlendirilmiş silika parçacıkları polar gömme sabit fazların hazırlanmasında kullanılmıştır. Elde edilen sabit faz, optimize edilmiş bir paketleme şemasına göre paslanmaz çelik bir kolona (iç çap 100 × 1,8 mm) paketlenmiştir. Kolonun paketlenmesi, kolon içinde düzgün bir tabaka sağlamak için mekanik titreşimle desteklenmiştir. Doldurulmuş kolon, beş peptitten (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lösin-enkefalin peptidi) oluşan bir peptit karışımının ve insan serum albüminin (HSA) tripsin hidrolizatlarının ayrılması için değerlendirildi. Peptit karışımının ve HSA tripsin sindiriminin iyi bir çözünürlük ve verimlilikle ayrıldığı gözlemlendi. PMP kolonunun ayırma verimliliği, Ascentis Express RP-Amide kolonunun ayırma verimliliği ile karşılaştırıldı. Peptitlerin ve proteinlerin PMP kolonunda iyi bir çözünürlüğe ve yüksek ayırma verimliliğine sahip olduğu ve PMP kolonunun ayırma verimliliğinin Ascentis Express RP-Amide kolonundan daha yüksek olduğu gözlemlendi.
PEG (polietilen glikol), üre, asetik asit, trimetoksiortosilikat (TMOS), trimetilklorsilan (TMCS), tripsin, insan serum albümini (HSA), amonyum klorür, üre, heksametilmetakriloildisilazan (HMDS), metakriloil klorür (MC), stiren, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksit (BPO), HPLC için asetonitril (ACN), metanol, 2-propanol ve aseton. Sigma-Aldrich Şirketi (St. Louis, Missouri, ABD).
8 g üre, 8 g polietilen glikol ve 8 ml 0,01 N asetik asit karışımı 10 dakika karıştırıldı ve buz altında soğutularak 24 ml TMOS eklendi. Reaksiyon karışımı, paslanmaz çelik bir otoklavda 40°C'de 6 saat ve ardından 120°C'de 8 saat ısıtıldı. Su süzüldü ve kalıntı 70°C'de 12 saat kurutuldu. Kurutulmuş yumuşak bloklar düzgün bir şekilde öğütüldü ve fırında 550°C'de 12 saat kalsine edildi. Parçacık boyutlarının, gözenek boyutunun ve yüzey alanının tekrarlanabilirliğini test etmek için üç parti hazırlandı ve karakterize edildi.
Polistiren zincirleri için polar grup ve sabit faz. Hazırlama prosedürü aşağıda açıklanmıştır.
200 mg N-fenilmaleimid ve 100 mg metil vinil izosiyanat susuz toluende çözüldü ve ardından reaksiyon kabına 0,1 ml 2,2′-azoizobütironitril (AIBN) eklenerek fenilmaleimid ve metil vinil izosiyanat kopolimeri (PMCP) elde edildi. Karışım 60°C'de 3 saat ısıtıldı, süzüldü ve 40°C'de 3 saat fırında kurutuldu.
Kurutulmuş silika parçacıkları (2 g), 500 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişede kuru toluen (100 ml) içinde dağıtıldı, karıştırıldı ve 10 dakika boyunca ultrasonik işlemden geçirildi. PMCP (10 mg) toluen içinde çözüldü ve bir damlama hunisi vasıtasıyla reaksiyon şişesine damla damla eklendi. Karışım 100°C'de 8 saat boyunca geri akışa bırakıldı, süzüldü, asetonla yıkandı ve 60°C'de 3 saat kurutuldu. Daha sonra, PMCP ile ilişkili silika parçacıkları (100 g) toluen (200 ml) içinde çözüldü ve katalizör olarak 100 μl dibutiltin dilaurat varlığında 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) eklendi. Karışım 50°C'de 8 saat boyunca karıştırıldı, süzüldü ve 50°C'de 3 saat kurutuldu.
Stiren (1 ml), benzoil peroksit BPO (0,5 ml) ve TEMPO-PMCP'ye bağlı silika parçacıkları (1,5 g) toluen içinde dağıtıldı ve azotla arındırıldı. Stirenin polimerizasyonu 100°C'de 12 saat süreyle gerçekleştirildi. Elde edilen ürün metanol ile yıkandı ve 60°C'de bir gece boyunca kurutuldu. Reaksiyonun genel şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
Numuneler, 10–3 Torr'dan daha düşük bir artık basınç elde edilene kadar 393 K'de 1 saat süreyle gazdan arındırıldı. Toplam gözenek hacmini belirlemek için, bağıl basınç P/P0 = 0,99'da adsorbe edilen N2 miktarı kullanıldı. Saf ve ligand bağlı silika parçacıklarının morfolojisi, taramalı elektron mikroskobu (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japonya) kullanılarak incelendi. Kuru numuneler (saf silika ve ligand bağlı silika parçacıkları) karbon bant kullanılarak alüminyum çubuklar üzerine yerleştirildi. Numuneye Q150T püskürtme cihazı kullanılarak altın kaplandı ve numuneye 5 nm kalınlığında bir Au tabakası biriktirildi. Bu, düşük voltajlı işlemin verimliliğini artırır ve ince soğuk püskürtme sağlar. Elementel analiz, Thermo Electron (Waltham, MA, ABD) Flash EA1112 elementel bileşim analizörü kullanılarak gerçekleştirildi. Parçacık boyutu dağılımını elde etmek için Malvern parçacık boyutu analizörü (Worcestershire, İngiltere) Mastersizer 2000 kullanıldı. Kaplamasız silika parçacıkları ve ligand bağlı silika parçacıkları (her biri 5 mg) 5 ml izopropanol içinde dağıtıldı, 10 dakika ultrasonik işlemden geçirildi, 5 dakika çalkalandı ve Mastersizer optik tezgahına yerleştirildi. Termogravimetrik analiz, 30 ila 800 °C sıcaklık aralığında dakikada 5 °C hızla gerçekleştirildi.
Referans 31'dekiyle aynı prosedür izlenerek, cam elyafı kaplı dar çaplı paslanmaz çelik kolonlar (ID 100 × 1,8 mm) bulamaç doldurma yöntemiyle paketlendi. Paslanmaz çelik kolon (cam elyafı kaplı, ID 100 × 1,8 mm) ve 1 µm'lik bir filtre içeren çıkış, bir bulamaç paketleme makinesine (Alltech, Deerfield, IL, ABD) bağlandı. 150 mg sabit fazı 1,2 ml metanolde süspansiyon haline getirerek ve rezervuar kolona besleyerek sabit faz süspansiyonu hazırlandı. Bulamaç çözücüsü ve kontrol çözücüsü olarak metanol kullanıldı. Kolon, 10 dakika boyunca 100 MP, 15 dakika boyunca 80 MP ve 30 dakika boyunca 60 MP'lik bir basınç dizisi uygulanarak paketlendi. Paketleme işleminde, düzgün kolon paketlemesini sağlamak için mekanik titreşim için iki gaz kromatografisi kolon vibratörü (Alltech, Deerfield, IL, ABD) kullanıldı. Bulamaç paketleyicisini kapatın ve boru hattına zarar gelmemesi için basıncı yavaşça boşaltın. Kolon, bulamaç memesinden ayrıldı ve girişine başka bir bağlantı parçası takılarak LC sistemine bağlandı ve çalışması test edildi.
Özel bir MLC, bir LC pompası (10AD Shimadzu, Japonya), 50 nL enjeksiyon döngüsüne sahip bir örnekleyici (Valco (ABD) C14 W.05), bir membran gaz giderici (Shimadzu DGU-14A) ve bir UV-VIS kılcal pencere kullanılarak oluşturuldu. Dedektör cihazı (UV-2075) ve emaye mikrokolon kullanıldı. Ek kolon genişlemesinin etkisini en aza indirmek için çok dar ve kısa bağlantı tüpleri kullanıldı. Kolon doldurulduktan sonra, 1/16″ indirgeyici bağlantının çıkışına bir kılcal boru (50 µm iç çap 365) ve indirgeyici bağlantının içine bir kılcal boru (50 µm) takıldı. Veri toplama ve kromatogram işleme, Multichro 2000 yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. 254 nm'de, denek analitlerinin UV absorbansı 0'da izlendi. Kromatografik veriler OriginPro8 (Northampton, MA) kullanılarak analiz edildi.
İnsan serum albümini, liyofilize toz, ≥ %96 (agaroz jel elektroforezi) 3 mg, tripsin (1,5 mg), 4,0 M üre (1 ml) ve 0,2 M amonyum bikarbonat (1 ml) ile karıştırıldı. Çözelti 10 dakika karıştırıldı ve 37°C'de su banyosunda 6 saat bekletildi, ardından 1 ml %0,1 TFA ile söndürüldü. Çözelti süzüldü ve 4°C'nin altında saklandı.
Peptit ve tripsin sindirim ürünü HSA karışımının PMP kolonunda ayrılması ayrı ayrı değerlendirildi. PMP kolonu ile ayrılan peptit ve HSA karışımının tripsin hidrolizini kontrol edin ve sonuçları Ascentis Express RP-Amide kolonu ile karşılaştırın. Teorik plaka sayısı aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanır:
Şekil 2'de saf silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının SEM görüntüleri gösterilmektedir. Saf silika parçacıklarının SEM görüntüleri (A, B), önceki çalışmalarımıza kıyasla parçacıkların uzamış veya düzensiz simetriye sahip olduğu küresel bir şekil göstermektedir. Ligand bağlı silika parçacıklarının yüzeyi (C, D), saf silika parçacıklarının yüzeyinden daha pürüzsüzdür; bu durum, silika parçacıklarının yüzeyini kaplayan polistiren zincirlerinden kaynaklanıyor olabilir.
Saf silika parçacıklarının (A, B) ve ligand bağlı silika parçacıklarının (C, D) taramalı elektron mikroskobu görüntüleri.
Saf silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının parçacık boyutu dağılımı Şekil 2.3(A)'da gösterilmiştir. Hacimsel parçacık boyutu dağılım eğrileri, kimyasal modifikasyondan sonra silika parçacık boyutunun arttığını göstermiştir (Şekil 3A). Mevcut çalışma ve önceki çalışmadan elde edilen silika parçacık boyutu dağılım verileri Tablo 1(A)'da karşılaştırılmıştır. PMP'nin hacimsel parçacık boyutu d(0.5) 3,36 µm iken, önceki çalışmamızda (polistiren bağlı silika parçacıkları)34 ad(0.5) değeri 3,05 µm idi. Reaksiyon karışımındaki PEG, üre, TMOS ve asetik asit oranındaki değişiklik nedeniyle, bu partinin parçacık boyutu dağılımı önceki çalışmamıza göre daha dardır. PMP fazının parçacık boyutu, daha önce incelediğimiz polistiren bağlı silika parçacık fazınınkinden biraz daha büyüktür. Bu, silika parçacıklarının stiren ile yüzey fonksiyonelleştirilmesinin silika yüzeyine yalnızca bir polistiren tabakası (0,97 µm) bıraktığı, PMP aşamasında ise tabaka kalınlığının 1,38 µm olduğu anlamına gelir.
Saf silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının parçacık boyutu dağılımı (A) ve gözenek boyutu dağılımı (B).
Bu çalışmada kullanılan silika parçacıklarının gözenek boyutu, gözenek hacmi ve yüzey alanı Tablo 1(B)'de gösterilmiştir. Saf silika parçacıklarının ve ligand bağlı silika parçacıklarının PSD profilleri Şekil 3(B)'de gösterilmiştir. Sonuçlar önceki çalışmamızla karşılaştırılabilir niteliktedir34. Saf ve ligand bağlı silika parçacıklarının gözenek boyutları sırasıyla 310 Å ve 241 Å olup, kimyasal modifikasyondan sonra gözenek boyutunun 69 Å azaldığı Tablo 1(B)'de gösterilmiştir ve kayma eğrisi Şekil'de gösterilmiştir. Mevcut çalışmadaki silika parçacıklarının özgül yüzey alanı 116 m2/g olup, önceki çalışmamızla (124 m2/g) karşılaştırılabilir düzeydedir. Tablo 1(B)'de gösterildiği gibi, kimyasal modifikasyondan sonra silika parçacıklarının yüzey alanı (m2/g) da 116 m2/g'den 105 m2/g'ye düşmüştür.
Sabit fazın elementel analiz sonuçları Tablo 2'de sunulmuştur. Mevcut sabit fazın karbon içeriği %6,35 olup, önceki çalışmamızdaki değerlerden (polistirenle ilişkili silika parçacıkları, sırasıyla %7,9335 ve %10,21)42 daha düşüktür. Mevcut sabit fazın karbon içeriğinin düşük olmasının nedeni, SP'nin hazırlanmasında stirene ek olarak fenilmaleimid metil vinil izosiyanat (PCMP) ve 4-hidroksi-TEMPO gibi bazı polar ligandların kullanılmış olmasıdır. Mevcut sabit fazdaki azotun ağırlık yüzdesi, önceki çalışmalardaki %0,1735 ve %0,85'e42 kıyasla %2,21'dir. Bu, mevcut sabit fazın fenilmaleimid nedeniyle yüksek bir azot ağırlık yüzdesine sahip olduğu anlamına gelir. Benzer şekilde, Tablo 2'de gösterildiği gibi, ürünler (4) ve (5) sırasıyla %2,7 ve %2,9 karbon içeriğine sahipken, nihai ürün (6) %6,35 karbon içeriğine sahiptir. Ağırlık kaybını test etmek için PMP'nin sabit fazında termogravimetrik analiz (TGA) kullanıldı ve TGA eğrisi Şekil 4'te gösterilmiştir. TGA eğrisi %8,6'lık bir ağırlık kaybı göstermektedir ki bu, ligandların sadece C değil, aynı zamanda N, O ve H de içermesi nedeniyle karbon içeriği (%6,35) ile iyi bir uyum içindedir.
Silika parçacıklarının yüzeyini modifiye etmek için polar fenilmaleimid ve vinilizosiyanat grupları nedeniyle fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat ligandı seçilmiştir. Vinilizosiyanat grupları, canlı radikal polimerizasyon yoluyla stiren ile daha fazla reaksiyona girebilir. İkinci neden ise, fenilmaleimid kısmı normal pH'da sanal yüke sahip olmadığından, analit ile orta derecede etkileşime giren ve analit ile sabit faz arasında güçlü elektrostatik etkileşimler oluşturmayan bir grup eklemektir. Sabit fazın polaritesi, optimum stiren miktarı ve serbest radikal polimerizasyon reaksiyon süresi ile kontrol edilebilir. Reaksiyonun son adımı (serbest radikal polimerizasyon), sabit fazın polaritesini değiştirdiği için kritiktir. Bu sabit fazlardaki karbon içeriğini kontrol etmek için elementel analiz yapılmıştır. Stiren miktarının ve reaksiyon süresinin artmasının sabit fazın karbon içeriğini artırdığı ve bunun tersinin de geçerli olduğu gözlemlenmiştir. Farklı stiren konsantrasyonlarıyla hazırlanan sabit fazların farklı karbon yükleri vardır. Benzer şekilde, bu sabit fazlar paslanmaz çelik kolonlara yerleştirildi ve kromatografik özellikleri (seçicilik, çözünürlük, N değeri vb.) kontrol edildi. Bu deneylere dayanarak, kontrollü polarite ve analitin iyi tutulmasını sağlamak için PMP sabit fazının hazırlanması için optimize edilmiş bir bileşim seçildi.
PMP kolonu ayrıca, hareketli fazın kapasitesi kullanılarak beş peptit karışımının (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lösin-enkefalin) analizi için de değerlendirilmiştir. 60/40 (v/v) ACN/su (%0,1 TFA) akış hızı 80 µl/min'dir. Optimal elüsyon koşullarında (200.000 plaka/m), kolon başına (100 × 1,8 mm) teorik plaka sayısı (N) 20.000 ± 100'dür. Üç PMP kolonu için N değerleri Tablo 3'te, kromatogramlar ise Şekil 5A'da gösterilmiştir. PMP kolonunda yüksek akış hızında (700 µl/dak) hızlı analiz, bir dakika içinde beş peptidin elüsyonunu sağladı; kolon başına (100 x 1,8 mm çap) mükemmel bir N değeri olan 13.500 ± 330 elde edildi, bu da 135.000 plaka/m'ye eşdeğerdir (Şekil 5B). Tekrarlanabilirliği test etmek için aynı boyutta (iç çap 100 x 1,8 mm) üç farklı PMP sabit faz partisi ile üç kolon dolduruldu. Her kolon için analitler, optimum elüsyon koşulları, teorik plaka sayısı N ve tutma süresi kullanılarak her kolonda aynı test karışımının ayrılmasıyla kaydedildi. PMP kolonları için tekrarlanabilirlik verileri Tablo 4'te gösterilmiştir. PMP kolonunun tekrarlanabilirliği, Tablo 3'te gösterildiği gibi çok düşük %RSD değerleriyle iyi bir korelasyon göstermiştir.
Peptit karışımlarının PMP kolonunda (B) ve Ascentis Express RP-Amide kolonunda (A) ayrılması, hareketli faz 60/40 ACN/H2O (TFA %0,1), PMP kolon boyutları (100 x 1,8 mm iç çap), analiz. Bileşiklerin elüsyon sırası: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ve 5 (lösik asit enkefalin).
İnsan serum albüminin tripsin hidrolizatının HPLC ile ayrılması için bir PMP kolonu (iç çap 100 x 1,8 mm) değerlendirildi. Şekil 6'daki kromatogram, örneklerin çok iyi çözünürlükle iyi bir şekilde ayrıldığını göstermektedir. HSA çözeltileri, 100 μl/dakika akış hızı, %70 asetonitril/%30 su ve %0,1 TFA'dan oluşan bir mobil faz kullanılarak analiz edildi. HSA'nın parçalanması, kromatogramda (Şekil 6) gösterildiği gibi, 17 peptite karşılık gelen 17 pik halinde bölündü. HSA hidrolizatından elde edilen bireysel piklerin ayrılma verimlilikleri hesaplandı ve değerler Tablo 5'te gösterilmiştir.
HSA tripsin hidrolizatları, PMP kolonunda (iç çap 100 x 1,8 mm), akış hızı (100 μl/min), hareketli faz olarak 60/40 asetonitril/su ve %0,1 TFA kullanılarak ayrıştırıldı.
Burada L kolon uzunluğu, η hareketli fazın viskozitesi, ΔP kolonun geri basıncı ve u hareketli fazın doğrusal hızıdır. PMP kolonunun geçirgenliği 2,5 × 10–14 m2, akış hızı 25 µl/min, 60/40 v/v ACN/su karışımı kullanılmıştır. PMP kolonunun (ID 100 × 1,8 mm) geçirgenliği, önceki Ref.34 çalışmamızdakine benzerdi. Yüzeysel olarak gözenekli parçacıklarla doldurulmuş bir kolonun geçirgenliği 1,7×10,6 µm, 5 µm parçacıklar için 2,5×10-14 m2'dir43. Bu nedenle, PMP fazının geçirgenliği, 5 µm boyutundaki çekirdek-kabuk parçacıklarının geçirgenliğine benzerdir.
Burada Wx, kloroformla doldurulmuş kolonun kütlesi, Wy, metanolle doldurulmuş kolonun kütlesi ve ρ, çözücünün yoğunluğudur. Metanolün yoğunluğu (ρ = 0,7866) ve kloroformun yoğunluğu (ρ = 1,484)'tür. Silika-C18 partikül kolonunun (100 × 1,8 mm iç çap)34 ve daha önce incelediğimiz C18-üre31 kolonunun toplam gözenekliliği sırasıyla 0,63 ve 0,55'tir. Bu, üre ligandlarının varlığının durağan fazın geçirgenliğini azalttığı anlamına gelir. Öte yandan, PMP kolonunun (iç çap 100 × 1,8 mm) toplam gözenekliliği 0,60'tır. PMP kolonları, C18 bağlı silika parçacıklarıyla doldurulmuş kolonlardan daha az geçirgendir çünkü C18 tipi sabit fazlarda C18 ligandları silika parçacıklarına doğrusal zincirler halinde bağlanırken, polistiren tipi sabit fazlarda parçacıkların etrafında nispeten kalın bir polimer tabakası oluşur. Tipik bir deneyde, kolon gözenekliliği aşağıdaki gibi hesaplanır:
Şekil 7A ve 7B'de, aynı elüsyon koşulları altında (60/40 ACN/H2O ve %0,1 TFA, her iki kolonda da 20 µl/dak ila 800 µl/dak akış hızı) bir PMP kolonu (iç çap 100 x 1,8 mm) ve bir Ascentis Express RP-Amide kolonu (iç çap 100 x 1,8 mm) için Van Deemter grafikleri gösterilmektedir. Optimal akış hızında (80 µl/dak) minimum HETP değerleri, PMP kolonu için 2,6 µm ve Ascentis Express RP-Amide kolonu için 3,9 µm idi. HETP değerleri, PMP kolonunun (100 x 1,8 mm iç çap) ayırma verimliliğinin, piyasada bulunan Ascentis Express RP-Amide kolonuna (100 x 1,8 mm iç çap) göre çok daha yüksek olduğunu göstermektedir. Şekil 7(A)'daki van Deemter grafiği, N değerindeki azalmanın, önceki çalışmamıza kıyasla artan akışla önemli ölçüde daha yüksek olmadığını göstermektedir. PMP kolonunun (id 100 × 1,8 mm) Ascentis Express RP-Amide kolonuna kıyasla daha yüksek ayırma verimliliği, mevcut çalışmada kullanılan geliştirilmiş parçacık şekli ve boyutu ile gelişmiş kolon paketleme prosedürüne dayanmaktadır34.
(A) 0.1% TFA içeren 60/40 ACN/H2O çözeltisinde PMP kolonunda (iç çap 100 x 1.8 mm) elde edilen Van Deemter grafiği (HETP'ye karşı hareketli faz doğrusal hızı). (B) 0.1% TFA içeren 60/40 ACN/H2O çözeltisinde Ascentis Express RP-Amide kolonunda (iç çap 100 x 1.8 mm) elde edilen Van Deemter grafiği (HETP'ye karşı hareketli faz doğrusal hızı).
İnterkalasyonlu polistirenden oluşan polar bir sabit faz hazırlanmış ve yüksek performanslı sıvı kromatografisinde sentetik peptitlerin ve insan serum albüminin (HSA) tripsin hidrolizatının ayrılması için değerlendirilmiştir. Peptit karışımları için PMP kolonlarının kromatografik performansı, ayırma verimliliği ve çözünürlük açısından mükemmeldir. PMP kolonlarının iyileştirilmiş ayırma verimliliği, silika parçacık boyutu ve gözenek boyutu, sabit fazların kontrollü sentezi ve karmaşık kolon dolgu malzemeleri gibi çeşitli nedenlerden kaynaklanmaktadır. Yüksek ayırma verimliliğine ek olarak, bu sabit fazın bir diğer avantajı da yüksek akış hızlarında düşük kolon geri basıncıdır. PMP kolonları yüksek oranda tekrarlanabilir olup, peptit karışımlarını ve çeşitli proteinlerin tripsin sindirimini analiz etmek için kullanılabilir. Bu kolonu, sıvı kromatografisinde doğal ürünlerden, tıbbi bitki ve mantar özlerinden biyoaktif bileşiklerin ayrılması için kullanmayı planlıyoruz. Gelecekte, PMP kolonları proteinlerin ve monoklonal antikorların ayrılması için de değerlendirilecektir.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters faz kromatografisi peptit ayırma sistemleri üzerine araştırma, Bölüm I: Kolon karakterizasyonu için bir protokol geliştirilmesi. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters faz kromatografisi peptit ayırma sistemleri üzerine araştırma, Bölüm I: Kolon karakterizasyonu için bir protokol geliştirilmesi.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. ve Petersson, P. Ters Faz Kromatografisi ile Peptit Ayırma Sistemlerinin İncelenmesi, Bölüm I: Kolon Karakterizasyonu için Bir Protokol Geliştirme. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters faz kromatografisi peptit ayırma sistemleri üzerine araştırma, Bölüm I: Kolon özelliklerine yönelik bir protokol geliştirilmesi. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ters faz kromatografisi peptit ayırma sistemleri üzerine araştırma, Bölüm I: Kolon özelliklerine yönelik bir protokol geliştirilmesi.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. ve Petersson, P. Ters Faz Kromatografisi ile Peptit Ayırma Sistemlerinin İncelenmesi, Bölüm I: Kolon Karakterizasyonu için Bir Protokol Geliştirme.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. ve diğerleri. Bulaşıcı hastalıkların tedavisi için geliştirilmiş aktif peptitler oluşturma yöntemleri. Biyoteknoloji. Başarılar 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. ve Khrestchatisky, M. Sentetik terapötik peptitler: Bilim ve pazar. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. ve Khrestchatisky, M. Sentetik terapötik peptitler: Bilim ve pazar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ve Chreschatyski M. Sentetik terapötik peptitler: bilim ve pazar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ve Khreschatsky M. Sentetik terapötik peptitler: bilim ve pazar. İlaç keşfi. Bugün 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Gelişmiş proteomik sıvı kromatografisi. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Gelişmiş proteomik sıvı kromatografisi.Bkz. F., Smith RD ve Shen Yu. Gelişmiş proteomik sıvı kromatografisi. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Gelişmiş protein bileşimi.Bkz. F., Smith RD ve Shen Yu. Gelişmiş proteomik sıvı kromatografisi.J. Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. ve diğerleri. Gelişmiş sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi, geniş tabanlı metabolomik ve proteomikleri birleştirebilmektedir. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ İlaç geliştirmede UHPLC'nin rolü. Chesnut, SM & Salisbury, JJ İlaç geliştirmede UHPLC'nin rolü.Chesnut, SM ve Salisbury, JJ. İlaç geliştirmede UHPLC'nin rolü.Chesnut, SM ve Salisbury, JJ UHPLC'nin ilaç geliştirmedeki rolü. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Hızlı ayırma işlemleri için ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri. Wu, N. & Clausen, AM Hızlı ayırma işlemleri için ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri.Wu, N. ve Clausen, AM. Hızlı ayırma için yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri. Wu, N. & Clausen, AM Wu, N. & Clausen, AM. Hızlı ayırma için ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri.Wu, N. ve Clausen, AM. Hızlı ayırma için yüksek basınçlı sıvı kromatografisinin temel ve pratik yönleri.J. Eylül Bilimi. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. İlaç geliştirmede ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisinin kullanımı. Wren, SA & Tchelitcheff, P. İlaç geliştirmede ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisinin kullanımı.Ren, SA ve Chelischeff, P. İlaç geliştirmede ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisinin kullanımı. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA ve Tchelitcheff, P.Ren, SA ve Chelischeff, P. İlaç geliştirmede ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisinin uygulaması.J. Kromatografi. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. ve diğerleri. Enterovirüs 71'in verimli bir şekilde saflaştırılması için yüksek iç fazlı, yağ-su emülsiyonundan türetilmiş monolitik makrogözenekli bir hidrojel. Kimyasal. proje. Dergi 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Proteomikte sıvı kromatografisinin rolü. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Proteomikte sıvı kromatografisinin rolü.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. ve Wilkins, JA Proteomikte sıvı kromatografisinin rolü. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. ve Wilkins, JA Proteomikte sıvı kromatografisinin rolü.J. Kromatografi. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Terapötik peptitlerin ve proteinlerin ters fazlı sıvı kromatografik ayrımında yeni trendler: Teori ve uygulamalar. & Guillarme, D. Terapötik peptitlerin ve proteinlerin ters fazlı sıvı kromatografik ayrımında yeni trendler: Teori ve uygulamalar. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: teori ve uygulama. & Guillarme, D. Ters fazlı sıvı kromatografisi ile terapötik peptitlerin ve proteinlerin ayrılmasında yeni trendler: teori ve uygulamalar. & Guillarme, D. & Guillarme, D.ve Guillarmé, D. Ters fazlı sıvı kromatografisi ile terapötik peptitlerin ve proteinlerin ayrılmasında yeni trendler: teori ve uygulamalar.J. Pharm. Biyomedikal Bilim. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC. Birinci ve ikinci ayırma boyutlarında farklı pH değerleri kullanılarak RP-RP-HPLC sistemi ile peptitlerin iki boyutlu ayrılması. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC. Birinci ve ikinci ayırma boyutlarında farklı pH değerleri kullanılarak RP-RP-HPLC sistemi ile peptitlerin iki boyutlu ayrılması.Gilar M., Olivova P., Dali AE ve Gebler JK, Birinci ve ikinci ayırma boyutlarında farklı pH değerleri kullanılarak RP-RP-HPLC sistemi ile peptitlerin iki boyutlu ayrılması.Gilar M., Olivova P., Dali AE ve Gebler JK, RP-RP-HPLC sistemi kullanılarak birinci ve ikinci ayırma boyutlarında farklı pH değerleri kullanılarak peptitlerin iki boyutlu ayrılması. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. ve diğerleri. 2 µm'den küçük, tamamen gözenekli ve yüzeysel olarak gözenekli C18 parçacıklarıyla doldurulmuş yüksek performanslı kromatografi kolonlarının kütle transferi ve kinetik özelliklerinin incelenmesi. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. ve diğerleri. Bitkisel biyoaktif peptitlerin izolasyonu, tanımlanması ve doğrulanmasında son trendler ve analitik zorluklar. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB ve diğerleri. Yaşam krallığının proteomik manzarası. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. ve diğerleri. Terapötik peptitlerin hazırlayıcı sıvı kromatografisi ile son işlemden geçirilmesi. Moleküller (Basel, İsviçre) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. ve Geng, X. Karma modlu kromatografi ve biyopolimerlere uygulamaları. Yang, Y. ve Geng, X. Karma modlu kromatografi ve biyopolimerlere uygulamaları.Yang, Yu. ve Geng, X. Karma modlu kromatografi ve biyopolimerlere uygulanması. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Yang, Y. ve Geng, X. Karma modlu kromatografi ve biyopolimerlerdeki uygulaması.Yang, Yu. ve Gene, X. Karma modlu kromatografi ve biyopolimerlere uygulanması.J. Kromatografi. A 1218(49), 8813–8825 (2011).