Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com. Шумо версияи браузерро бо дастгирии маҳдуди CSS истифода мебаред. Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед). Илова бар ин, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript нишон медиҳем.
Якбора карусели се слайдро намоиш медиҳад. Тугмаҳои Пешина ва Ояндаро истифода баред, то дар як вақт дар се слайд гузаред ё тугмаҳои слайдерро дар охир истифода баред, то дар як вақт аз се слайд гузаред.
Заррачаҳои кремнийи ковокӣ бо усули сол-гел бо баъзе тағйиротҳо барои ба даст овардани зарраҳои сӯрохи васеъ омода карда шуданд. Ин зарраҳо бо N-фенилмалеймид-метилвинил изоцианат (PMI) ва стирол тавассути полимеризатсияи занҷири баръакси интиқол-фрагментация (RAFT) ҳосил карда шуданд, то полиамидҳои интеркалатсияшудаи N-фенилмалеймид ҳосил шаванд. Марҳилаи статсионарии стирол (PMP). Сутунҳои танги аз пӯлоди зангногир (диаметри дарунӣ 100 × 1,8 мм) бо бастаи slurry печонида шудаанд. Фаъолияти хроматографии сутуни PMP барои ҷудо кардани омехтаи пептидҳои синтетикӣ, ки аз панҷ пептидҳо иборатанд (Гли-Тир, Гли-Лю-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, Энкефалин кислотаи лей аминокислотаҳо) ва албоми триптии серумин гидролизи инсон арзёбӣ карда шуданд. Дар шароити оптималии элюцион микдори назариявии плитахои омехтаи пептидхо ба 280.000 пластина/м2 расид. Ҳангоми муқоисаи нишондиҳандаҳои ҷудокунии сутуни таҳияшуда бо сутуни тиҷоратии Ascentis Express RP-Amide, мушоҳида шуд, ки самаранокии ҷудокунии сутуни PMP аз сутуни тиҷоратӣ аз ҷиҳати самаранокии ҷудокунӣ ва ҳалкунанда бартарӣ дорад.
Саноати биофармасевтӣ ба бозори афзояндаи ҷаҳонӣ бо афзоиши назарраси ҳиссаи бозор дар солҳои охир табдил ёфтааст. Бо афзоиши босуръати саноати биофармасевтӣ1,2,3 ба таҳлили пептидҳо ва протеинҳо эҳтиёҷоти калон вуҷуд дорад. Илова ба пептиди мақсаднок, ҳангоми синтези пептидҳо наҷосатҳои гуногун ба вуҷуд меоянд, бинобар ин, барои ба даст овардани тозагии дилхоҳи пептид тозакунии хроматографӣ лозим аст. Таҳлил ва тавсифи сафедаҳо дар моеъҳои бадан, бофтаҳо ва ҳуҷайраҳо аз сабаби шумораи зиёди намудҳои эҳтимолан ошкоршаванда дар як намуна як вазифаи хеле душвор аст. Гарчанде ки масс-спектрометрия воситаи муассир барои пайдарпайии пептидҳо ва сафедаҳо аст, агар чунин намунаҳо бевосита ба спектрометри масса ворид карда шаванд, ҷудокунӣ ғайриқаноатбахш хоҳад буд. Ин масъаларо тавассути гузаронидани хроматографияи моеъ (ХК) пеш аз тахлили MS хал кардан мумкин аст, ки ин боиси кам шудани микдори тахлилхое, ки ба масс-спектрометр дар вакти муайян ворид мешавад4,5,6. Илова бар ин, таҳлилҳо метавонанд дар минтақаи танг ҳангоми ҷудокунии фазаи моеъ мутамарказ шаванд ва ба ин васила ин таҳлилҳоро тамаркуз кунанд ва ҳассосияти ошкоркунии MS-ро зиёд кунанд. Хроматографияи моеъ (LC) дар тӯли даҳсолаи охир ба таври назаррас пешрафт кард ва ба усули васеъ истифодашавандаи таҳлили протеоми табдил ёфт7,8,9,10.
Хроматографияи моеъи баръакс (RP-LC) барои тоза кардан ва ҷудо кардани омехтаҳои пептидҳо бо истифода аз кремнийи октадесил тағирёфта (ODS) ҳамчун марҳилаи статсионарӣ васеъ истифода мешавад11,12,13. Аммо, аз сабаби сохтори мураккаб ва табиати амфотерии худ, 14,15 фазаҳои стационарии РП наметавонанд ҷудошавии қаноатбахши пептидҳо ва сафедаҳоро таъмин кунанд. Аз ин рӯ, таҳлили пептидҳо ва сафедаҳо бо порчаҳои қутбӣ ва ғайриқутбӣ фазаҳои статсионарии махсус тарҳрезишударо барои мутақобила ва нигоҳ доштани ин таҳлилҳо талаб мекунад16. Хроматографияи омехта, ки таъсири мутақобилаи мултиподалӣ пешниҳод мекунад, метавонад алтернатива ба RP-LC барои ҷудо кардани пептидҳо, сафедаҳо ва дигар омехтаҳои мураккаб бошад. Якчанд фазаҳои стационарии омехта омода карда шуданд ва сутунҳои пур аз ин фазаҳои статсионарӣ барои ҷудо кардани пептидҳо ва сафедаҳо истифода шуданд17,18,19,20,21. Аз сабаби мавҷудияти гурӯҳҳои қутбӣ ва ғайриқутбӣ, фазаҳои стационарии ҳолати омехта (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalation қутбӣ/RPLC) барои ҷудо кардани пептидҳо ва сафедаҳо мувофиқанд22,23,24,25,26,27,28. , фазаҳои стационарии байни қутбӣ бо гурӯҳҳои қутбӣ бо ковалентӣ қобилиятҳои хуби ҷудокунӣ ва интихоби беҳамторо барои таҳлили қутбӣ ва ғайриқутбӣ нишон медиҳанд, зеро ҷудокунӣ аз таъсири мутақобилаи байни таҳлилшаванда ва марҳилаи статсионерӣ вобаста аст. Чанде пеш Чжан ва дигарон. 30 фазахои стационарии бо беенил хотимаёфтаи полиаминхо ба даст оварда шуданд ва карбогидридхо, антидепрессантхо, флавоноидхо, нуклеозидхо, эстрогенхо ва баъзе дигар аналитикхо бомуваффакият чудо карда шуданд. Маводи статсионарии қутбӣ ҳам гурӯҳҳои қутбӣ ва ҳам ғайриқутбӣ дорад, аз ин рӯ онро метавон барои ҷудо кардани пептидҳо ва сафедаҳо ба қисмҳои гидрофобӣ ва гидрофиликӣ истифода бурд. Сутунҳои дохилии қутбӣ (масалан, сутунҳои C18 бо амидҳои дохилӣ) зери номи тиҷоратии Ascentis Express сутунҳои RP-Amide дастрасанд, аммо ин сутунҳо танҳо барои таҳлили амини 33 истифода шудаанд.
Дар тадқиқоти ҷорӣ, як марҳилаи стационарии қутбӣ (N-фенилмалеймид, полистирол дохилшаванда) барои ҷудокунии пептидҳо ва тақсимоти триптии HSA омода ва арзёбӣ карда шуд. Барои омода кардани марҳилаи статсионарӣ стратегияи зерин истифода шудааст. Зарраҳои кремнийи рахнашуда мувофиқи расмиёти дар нашрияҳои қаблии мо тавсифшуда бо баъзе тағирот дар схемаҳои омодагӣ 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 омода карда шуданд. Таносуби мочевина, полиэтиленгликоли (PEG), TMOS ва кислотаи обии сирко барои ба даст овардани қисмҳои силикати калон танзим карда шуданд. Дуюм, лигандҳои нави изоцианати фенилмалеймид-метилвинил синтез карда шуданд ва зарраҳои ҳосилшудаи кремнийи он барои тайёр кардани фазаҳои стационарии қутбӣ истифода шуданд. Марҳилаи статсионарии ба даст овардашуда ба сутуни аз пӯлоди зангногир (диаметри дарунӣ 100 × 1,8 мм) мувофиқи нақшаи бастабандии оптимизатсияшуда баста карда шуд. Ба бастабандии сутун тавассути ларзиши механикӣ кӯмак мекунад, то қабати якхела дар дохили сутун таъмин карда шавад. Сутуни печонидашуда барои ҷудо кардани омехтаи пептидҳо, ки аз панҷ пептид иборатанд (Гли-Тир, Гли-Леу-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, пептидҳои лейцин-энкефалин) арзёбӣ карда шуданд. ва гидролизатҳои триптикии альбумини хунобаи инсон (HSA). Мушоҳида карда шуд, ки омехтаи пептид ва ҳазми триптии HSA бо ҳалли хуб ва самаранокӣ ҷудо карда шуданд. Самаранокии ҷудокунии сутуни PMP бо сутуни Ascentis Express RP-Amide муқоиса карда шуд. Мушоҳида шуд, ки пептидҳо ва сафедаҳо дар сутуни PMP ҳалли хуб ва самаранокии баланди ҷудокунӣ доранд ва самаранокии ҷудокунии сутуни PMP аз сутуни Ascentis Express RP-Amide баландтар аст.
PEG (полиэтиленгликол), мочевина, кислотаи уксусӣ, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлоросилан (TMCS), трипсин, альбумини хунобаи инсон (HSA), хлориди аммоний, мочевина, гексаметилметакрилоилдисилазан (HMDS, метхлор), метхлор 4-гидрокси-ТЕМПО, бензоил пероксиди (BPO), ацетонитрил (ACN) барои HPLC, метанол, 2-пропанол ва ацетон. Ширкати Sigma-Oldrich (Сент-Луис, Миссури, ИМА).
Омехтаи мочевина (8 г), полиэтиленгликол (8 г) ва 8 мл кислотаи 0,01 Н. сирко 10 дакика омехта карда, дар зери ях хунук кардан ба он 24 мл TMOS илова карда шуд. Омехтаи реаксия дар автоклави аз пӯлоди зангногир дар 40°С 6 соат ва баъд дар 120°С 8 соат гарм карда шуд. Об холӣ карда шуд ва боқимонда дар 70 ° C барои 12 соат хушк карда шуд. Блокҳои хушкшудаи мулоим ҳамвор хок карда шуданд ва дар танӯр дар 550 ° C барои 12 соат калсий карда шуданд. Барои санҷидани такрорпазирии андозаи зарраҳо, андозаи сӯрохҳо ва майдони рӯизаминӣ се партия омода ва тавсиф карда шуданд.
Гурӯҳи қутбӣ ва марҳилаи статсионарӣ барои занҷирҳои полистирол. Раванди омодагӣ дар поён тавсиф карда мешавад.
N-фенилмалеймид (200 мг) ва изоцианати метилвинил (100 мг) дар толуолҳои беоб гудохта шуда, сипас ба колба реаксия 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) илова карда, сополимери фенилмалеймид ва метиланат (CPPM) гирифта мешавад. )Омехтаро дар 60°С 3 соат гарм карда, филтр карда, дар танӯр дар 40°С 3 соат хушк карданд.
Зарраҳои кремнийи хушк (2 г) дар толуолҳои хушк (100 мл) пароканда карда шуданд ва дар зарфи 10 дақиқа дар колбачаи мудаввари поёни 500 мл омехта карда шуданд. PMCP (10 мг) дар толуол гудохта шуд ва ба колба реаксия ба воситаи як воҳиди иловагӣ илова карда шуд. Омехта дар ҳарорати 100°С 8 соат рефлюкс карда, филтр карда, бо ацетон шуста ва дар ҳарорати 60°С 3 соат хушк карда шуд. Сипас, зарраҳои кремнийи алоқаманд бо PMCP (100 г) дар толуол (200 мл) гудохта шуданд ва ба он 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) дар ҳузури 100 мкл дибутилтин дилаурат ҳамчун катализатор илова карда шуд. Омехта дар 50°С 8 соат омехта, филтр карда, дар 50°С 3 соат хушк карда шуд.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиди BPO (0,5 мл) ва заррачаҳои кремнийи ба TEMPO-PMCP (1,5 г) пайвастшуда дар толуол пароканда карда шуданд ва бо нитроген тоза карда шуданд. Полимеризатсияи стирол дар 100°С дар давоми 12 соат гузаронида шуд. Маҳсулоти ҳосилшуда бо метанол шуста шуд ва шабона дар 60 ° C хушк карда шуд. Схемаи умумии реаксия дар расм нишон дода шудааст. як .
Намунаҳо дар 393 К барои 1 соат то ба даст овардани фишори боқимондаи камтар аз 10-3 Торр дегаз карда шуданд. Миқдори N2, ки дар фишори нисбии P/P0 = 0,99 адсорб карда шудааст, барои муайян кардани ҳаҷми умумии сӯрохиҳо истифода шудааст. Морфологияи заррачаҳои кремнийи соф ва бо лиганд алоқаманд бо истифода аз микроскопи электронии сканерӣ (Hitachi High Technologies, Токио, Ҷопон) тафтиш карда шуд. Намунаҳои хушк (заррачаҳои кремнийи соф ва лиганд пайваст) дар чӯбҳои алюминий бо истифода аз лентаи карбон ҷойгир карда шуданд. Тилло дар рӯи намуна бо истифода аз дастгоҳи пошидани Q150T гузошта шуд ва дар намуна қабати ғафсии Au 5 нм гузошта шуд. Ин самаранокии раванди пастшиддатро беҳтар мекунад ва пошидани хунукро хуб таъмин мекунад. Таҳлили элементҳо бо истифода аз таҳлилгари таркиби элементҳои Thermo Electron (Waltham, MA, ИМА) Flash EA1112 анҷом дода шуд. Барои ба даст овардани тақсимоти андозаи зарраҳо як анализатори андозаи зарраҳои Малверн (Вустершир, Британияи Кабир) Mastersizer 2000 истифода шудааст. Заррачаҳои кремнийи пӯшониданашуда ва заррачаҳои кремнийи бо лиганд пайвастшуда (ҳар кадомаш 5 мг) дар 5 мл изопропанол пароканда карда, дар тӯли 10 дақиқа садо дода, 5 дақиқа такон дода, дар курсии оптикии Mastersizer ҷойгир карда шуданд. Таҳлили термогравиметрӣ бо суръати 5 °С дар як дақиқа дар диапазони ҳарорат аз 30 то 800 ° C гузаронида мешавад.
Сутунҳои аз пӯлоди зангногир бо андозаҳои (ID 100 × 1,8 мм) бо усули пуркунии slurry бастабандишуда бо ҳамон тартибе, ки дар истинод 31 ҷойгир карда шудаанд. Сутуни аз пӯлоди зангногир (шиша пӯшонидашуда, ID 100 × 1,8 мм) ва васлаки дорои 1 мкм frit, apackfields ILA (Delurry ILA, apackfields). ИМА). суспензияи фазаи стационариро бо боздоштани 150 мг фазаи стационарӣ дар 1,2 мл метанол ва додани он ба сутуни обанбор омода кунед. Метанол ҳамчун ҳалкунанда ва ҳалкунандаи назорат истифода мешуд. Сутунро бо истифодаи пайдарпаии фишори 100 МП барои 10 дақиқа, 80 МП барои 15 дақиқа ва 60 МП барои 30 дақиқа баста кунед. Раванди бастабандӣ ду вибратори сутуни хроматографияи газро (Alltech, Deerfield, IL, ИМА) барои ларзиши механикӣ истифода бурд, то бастабандии якхелаи сутунро таъмин кунад. Пакери slurry-ро пӯшед ва фишорро оҳиста раҳо кунед, то осеб надиҳад. Барои санҷидани кори он сутун аз сопло slurry ҷудо карда шуд ва як арматураи дигар ба даромадгоҳ васл карда шуд ва ба системаи LC пайваст карда шуд.
MLC фармоишӣ бо истифода аз насоси LC (10AD Shimadzu, Ҷопон), намунагир бо ҳалқаи тазриқӣ 50 nL (Valco (ИМА) C14 W.05), дегазатори мембрана (Shimadzu DGU-14A) ва равзанаи капиллярии UV-VIS сохта шудааст. Дастгоҳи детектор (UV-2075) ва микроколонна сирдор. Барои кам кардани таъсири васеъшавии сутунҳои иловагӣ қубурҳои хеле танг ва кӯтоҳро истифода баред. Пас аз пур кардани сутун, капиллярро (50 μm id 365) дар баромади 1/16 ″ редуксионалӣ насб кунед ва капиллярро (50 мкм) пайванди коҳишдиҳандаро насб кунед. Ҷамъоварии маълумот ва коркарди хроматограмма бо истифода аз нармафзори Multichro 2000 анҷом дода мешавад. Дар 254 нм, ҷаббиши ултрабунафш аз таҳлили субъектҳо дар 0 назорат карда шуд. Маълумоти хроматографӣ бо истифода аз OriginPro8 (Нортгемптон, MA) таҳлил карда шуд.
Альбумини хунобаи инсон, хокаи лиофилизатсияшуда, ≥ 96% (электрофорези агароз гели) 3 мг омехта бо трипсин (1,5 мг), 4,0 М мочевина (1 мл) ва 0,2 М бикарбонати аммоний (1 мл). Маҳлул барои 10 дақиқа омехта карда шуд ва дар ванна об дар 37 ° C барои 6 соат нигоҳ дошта шуд, сипас бо 1 мл 0,1% TFA хомӯш карда шуд. Маҳлулро филтр кунед ва дар ҳарорати на камтар аз 4 ° C нигоҳ доред.
Ҷудокунии омехтаи пептидҳо ва ҳазми триптии HSA дар сутуни PMP алоҳида арзёбӣ карда шуд. Гидролизи триптикии омехтаи пептидҳо ва HSA-ро, ки бо сутуни PMP ҷудо карда шудаанд, тафтиш кунед ва натиҷаҳоро бо сутуни Ascentis Express RP-Amide муқоиса кунед. Шумораи лавҳаҳои назариявӣ бо муодилаи зерин ҳисоб карда мешавад:
Тасвирҳои SEM аз зарраҳои кремнийи холис ва заррачаҳои кремнийи бо лиганд алоқаманд дар расми 2 нишон дода шудаанд. Тасвирҳои SEM заррачаҳои кремнийи холис (A, B) шакли курашаклро нишон медиҳанд, ки дар он зарраҳо дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблии мо дароз карда шудаанд ё симметрияи номунтазам доранд. Сатҳи заррачаҳои кремнийи бо лиганд (C, D) пайвастшуда нисбат ба заррачаҳои кремнийи соф ҳамвортар аст, ки шояд аз занҷирҳои полистирол рӯи заррачаҳои кремнийро мепӯшонанд.
Сканкунии микрографҳои электронии зарраҳои кремнийи холис (A, B) ва зарраҳои кремнийи бо лиганд алоқаманд (C, D).
Тақсимоти андозаи зарраҳои зарраҳои кремнийи соф ва зарраҳои кремнийи бо лиганд алоқаманд дар расми 2 нишон дода шудааст. 3(А). Каҷҳои тақсимоти андозаи зарраҳои ҳаҷмӣ нишон доданд, ки андозаи зарраҳои кремний пас аз тағир додани кимиёвӣ зиёд шудааст (расми 3А). Маълумоти тақсимоти андозаи зарраҳои кремний аз омӯзиши ҷорӣ ва таҳқиқоти қаблӣ дар ҷадвали 1(А) муқоиса карда шудаанд. Андозаи зарраҳои ҳаҷмии d(0,5) PMP 3,36 мкм буд, дар муқоиса бо арзиши ад(0,5) 3,05 мкм дар таҳқиқоти қаблии мо (заррачаҳои кремний бо полистирол)34. Аз сабаби тағир ёфтани таносуби PEG, мочевина, TMOS ва кислотаи сирко дар омехтаи реаксия, тақсимоти андозаи зарраҳои ин партия нисбат ба омӯзиши қаблии мо тангтар буд. Андозаи зарраҳои марҳилаи PMP нисбат ба фазаи зарраҳои силикии полистирол, ки мо қаблан омӯхта будем, каме калонтар аст. Ин маънои онро дорад, ки функсионализатсияи сатҳи зарраҳои кремний бо стирол танҳо як қабати полистиролро (0,97 мкм) дар сатҳи кремний гузоштааст, дар ҳоле ки дар марҳилаи PMP ғафсии қабат 1,38 мкм буд.
Тақсимоти андозаи зарраҳо (A) ва тақсимоти андозаи сӯрохиҳо (B) зарраҳои кремнийи холис ва зарраҳои кремнийи бо лиганд алоқаманд.
Андозаи сӯрохҳо, ҳаҷми сӯрохҳо ва майдони сатҳи зарраҳои кремний, ки дар ин таҳқиқот истифода мешаванд, дар ҷадвали 1 (B) нишон дода шудаанд. Профилҳои PSD аз зарраҳои кремнийи холис ва зарраҳои кремнийи бо лиганд алоқаманд дар расм нишон дода шудаанд. 3(Б). Натиҷаҳо бо тадқиқоти қаблии мо муқоисашаванда буданд34. Андозаи сӯрохиҳои заррачаҳои кремнийи соф ва лигандӣ мутаносибан 310 Å ва 241 Å буд, ки нишон медиҳад, ки пас аз тағир додани кимиёвӣ андозаи сӯрохҳо 69 Å кам шудааст, тавре ки дар ҷадвали 1 (B) нишон дода шудааст ва каҷи гузариш дар расм нишон дода шудааст. бо тадкикоти пештараи мо (124 м2/г) мукоиса кардан мумкин аст. Чи хеле ки дар чадвали 1(Б) нишон дода шудааст, масохати сатхи (м2/г) заррачахои кремний пас аз тагйир додани кимиёви низ аз 116 м2/г то 105 м2/г кам шуд.
Натичахои тахлили элементарии фазаи стационарй дар чадвал оварда шудаанд. 2. Микдори карбонии фазаи стационарии хозира 6,35% мебошад, ки ин нисбат ба тадкикоти пештараи мо камтар аст (заррачахои кремнийи бо полистирол алокаманд 7,93%35 ва 10,21%) 42. Микдори карбон дар фазаи стационарии хозира дар поён, зеро баъзе лигандхои кутб ба монанди фенилмалеимид (метилмалеимид) ва метилмалеимиди МП) мебошанд. Дар тайёр кардани СП ба гайр аз стирол 4-гидрокси-ТЕМПО истифода шудааст. Фоизи вазни нитроген дар марҳилаи ҳозираи стационарӣ нисбат ба 0,1735 ва 0,85% дар таҳқиқоти қаблӣ 2,21% мебошад42. Ин маънои онро дорад, ки марҳилаи ҳозираи статсионарӣ аз ҳисоби фенилмалеймид фоизи баланди нитроген дорад. Ба ҳамин монанд, маҳсулот (4) ва (5) дорои мазмуни карбон мебошанд, мутаносибан 2,7% ва 2,9%, дар ҳоле ки маҳсулоти ниҳоӣ (6) дорои мазмуни карбон 6,35% аст, тавре ки дар ҷадвали 2 нишон дода шудааст. Таҳлили термогравиметрӣ (TGA) дар марҳилаи статсионарии PMP барои санҷиши талафоти вазн истифода шудааст ва каҷи TGA дар расми TGA талафоти вазнро нишон медиҳад. 8,6%, ки бо таркиби карбон мувофиқат мекунад (6,35%), зеро лигандҳо на танҳо C, балки N, O ва H доранд.
Лиганди фенилмалеймид-метилвинил изоцианати барои тағир додани сатҳи зарраҳои кремний аз сабаби гурӯҳҳои қутбӣ фенилмалеймид ва винилисоцианат интихоб карда шуд. Гурӯҳҳои изоцианати винил метавонанд минбаъд бо стирол тавассути полимеризатсияи радикалии зинда реаксия кунанд. Сабаби дуюм ин дохил кардани гурӯҳе мебошад, ки бо моддаи таҳлилшаванда таъсири мӯътадил дорад ва дар байни моддаи таҳлилшаванда ва фазаи статсионарӣ таъсири сахти электростатикӣ надорад, зеро қисми фенилмалеймид дар рН муқаррарӣ заряди виртуалӣ надорад. Қутбнокии фазаи статсионариро тавассути миқдори оптималии стирол ва вақти реаксияи полимеризатсияи радикалҳои озод идора кардан мумкин аст. Марҳилаи ниҳоии реаксия (полимеризатсияи радикалҳои озод) муҳим аст, зеро он қутбияти фазаи статсионариро тағир медиҳад. Барои санҷидани миқдори карбон дар ин марҳилаҳои статсионарӣ таҳлили элементӣ гузаронида шуд. Мушоҳида шудааст, ки зиёд кардани миқдори стирол ва вақти реаксия миқдори карбонии фазаи стационариро зиёд мекунад ва баръакс. SP-ҳои бо консентратсияи гуногуни стирол омодашуда борҳои гуногуни карбон доранд. Ба ҳамин монанд, ин фазаҳои статсионарӣ дар сутунҳои аз пӯлоди зангногир ҷойгир карда шуданд ва хусусиятҳои хроматографии онҳо (интихобӣ, ҳалли, арзиши N ва ғайра) тафтиш карда шуданд. Дар асоси ин таҷрибаҳо, таркиби оптимизатсияшуда барои омода кардани марҳилаи стационарии PMP интихоб карда шуд, то қутбияти назоратшаванда ва нигоҳдории хуби таҳлилшавандаро таъмин кунад.
Сутуни PMP инчунин барои таҳлили панҷ омехтаи пептидҳо (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) бо истифода аз иқтидори марҳилаи мобилӣ арзёбӣ карда шуд. 60/40 (в/в) ACN/об (0,1% TFA) бо суръати ҷараёни 80 мкл/дақ. Дар шароити оптималии элюсия (200,000 плита/м), шумораи плитаҳои назариявӣ (N) дар як сутун (100 × 1,8 мм) 20,000 ± 100 аст. Қиматҳои N барои се сутуни PMP дар ҷадвали 3 ва хроматограммаҳо дар расми 5А нишон дода шудаанд. Таҳлили зуд бо суръати баланд (700 мкл/дақ) дар сутуни PMP, панҷ пептид дар давоми як дақиқа элюта мешавад, арзиши аълои N 13,500 ± 330 дар як сутун (диаметри 100 x 1,8 мм), баробар ба 135,000 плита/м (расми 5Б). Се сутуни андозаи якхела (диаметри дарунӣ 100 x 1,8 мм) бо се гурӯҳи гуногуни марҳилаи стационарии PMP барои санҷиши такрорӣ пур карда шуданд. Таҳлилҳо барои ҳар як сутун тавассути ҷудо кардани як омехтаи санҷишӣ дар ҳар як сутун бо истифода аз шароити оптималии элюсия, шумораи плитаҳои назариявӣ N ва вақти нигоҳдорӣ сабт карда шуданд. Маълумоти такрорӣ барои сутунҳои PMP дар ҷадвали 4 нишон дода шудааст. Таҷдидпазирии сутуни PMP бо арзишҳои хеле пасти %RSD, тавре ки дар ҷадвали 3 нишон дода шудааст, хуб алоқаманд аст.
Ҷудокунии омехтаҳои пептидӣ дар сутуни PMP (B) ва сутуни Ascentis Express RP-Amide (A), марҳилаи мобилӣ 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), андозаҳои сутуни PMP (100 x 1,8 мм id), таҳлил Тартиби ҷудошавии пайвастагиҳо: 1 (Gly-Tyrly-Leu), 2- (Гли-Гли-Тир-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) ва 5 (энкефалин кислотаи лейкин).
Сутуни PMP (диаметри дарунӣ 100 x 1,8 мм) барои ҷудо кардани гидролизати триптикии альбумини хунобаи инсон тавассути HPLC арзёбӣ карда шуд. Хроматограмма дар расми 6 нишон медиҳад, ки намунаҳо бо ҳалли хеле хуб ҷудо карда шудаанд. Маҳлулҳои HSA бо истифода аз суръати ҷараёни 100 мкл/дақ, марҳилаи мобилии 70/30 ацетонитрил/об ва 0,1% TFA таҳлил карда шуданд. Ҷудошавии HSA ба 17 қулла тақсим карда шуд, тавре ки дар хроматограмма нишон дода шудааст (расми 6), ки ба 17 пептид мувофиқ аст. Самаранокии ҷудокунии қуллаҳои инфиродӣ аз гидролизати HSA ҳисоб карда шуданд ва арзишҳо дар ҷадвали 5 нишон дода шудаанд.
Гидролизатҳои триптии HSA дар сутуни PMP (диаметри дарунӣ 100 x 1,8 мм), суръати ҷараён (100 мкл/дақ), фазаи мобилӣ 60/40 ацетонитрил/об ва 0,1% TFA ҷудо карда шуданд.
ки L дарозии сутун, η часпакии фазаи сайёр, ΔP фишори бозгашти сутун ва u суръати хаттии фазаи сайёр мебошад. Гузариши сутуни PMP 2,5 × 10-14 м2, суръати ҷараёни он 25 мкл/дақ, 60/40 в/в истифода шудааст. ACN/об. Гузариши сутуни PMP (ID 100 × 1,8 мм) ба тадқиқоти қаблии Ref.34 монанд буд. Кобилияти гузариши сутуни пур аз заррачахои сатхи ковок 1,7×10,6 мкм, барои заррачахои 5 мкм 2,5×10-14 м2 мебошад43. Аз ин рӯ, гузариши марҳилаи PMP ба гузариши заррачаҳои ядроӣ бо андозаи 5 мкм монанд аст.
ки Wx массаи сутуни пур аз хлороформ, Wy массаи сутуни пур аз метанол ва ρ зичии халкунанда мебошад. Зичии метанол (ρ = 0,7866) ва хлороформ (ρ = 1,484). Порозияи умумии сутуни заррачаҳои кремний-C18 (100 × 1,8 мм ID)34 ва сутуни қаблан омӯхташудаи мо C18-urea31 мутаносибан 0,63 ва 0,55 буд. Ин маънои онро дорад, ки мавҷудияти лигандҳои мочевина гузариши фазаи статсионариро коҳиш медиҳад. Аз тарафи дигар, порозияи умумии сутуни PMP (диаметри дарунӣ 100 × 1,8 мм) 0,60 аст. Сутунҳои PMP нисбат ба сутунҳое, ки бо зарраҳои силикии C18 баста шудаанд, камтар гузарандаанд, зеро дар фазаҳои стационарии навъи C18 лигандҳои C18 ба зарраҳои кремний дар занҷирҳои хатӣ пайваст мешаванд, дар ҳоле ки дар фазаҳои статсионарии навъи полистирол дар атрофи зарраҳо як полимери нисбатан ғафс ба вуҷуд меояд. қабати A. Дар озмоиши маъмулӣ қаъри сутун чунин ҳисоб карда мешавад:
Дар расм. 7A, B қитъаҳои Ван Димтерро барои сутуни PMP (id 100 x 1,8 мм) ва сутуни Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 мм) дар шароити якхела, 60/40 ACN/H2O ва 0,1% TFA 20 мкл/дақ дар ҳарду сутуни 80 мкл/дақ нишон медиҳанд. Қиматҳои ҳадди ақали HETP бо суръати оптималии ҷараён (80 мкл/дақ) мутаносибан 2,6 мкм ва 3,9 мкм барои сутуни PMP ва сутуни Ascentis Express RP-Amide буданд. Арзишҳои HETP нишон медиҳанд, ки самаранокии ҷудокунии сутуни PMP (100 x 1,8 мм id) нисбат ба сутуни Ascentis Express RP-Amide (100 x 1,8 мм id) хеле баландтар аст. Графикаи ван Димтер дар расми 7(А) нишон медиҳад, ки коҳиши арзиши N бо афзоиши ҷараён дар муқоиса бо омӯзиши қаблии мо ба таври назаррас баландтар нест. Самаранокии баландтари ҷудокунии сутуни PMP (id 100 × 1,8 мм) дар муқоиса бо сутуни Ascentis Express RP-Amide ба шакл ва андозаи беҳтаршудаи зарраҳо ва тартиби мукаммали бастабандии сутун, ки дар кори ҷорӣ истифода мешавад34 асос ёфтааст.
(A) Қитъаи Ван Димтер (HETP против суръати хатти фазаи мобилӣ), ки дар сутуни PMP (id 100 x 1,8 мм) дар 60/40 ACN/H2O бо 0,1% TFA гирифта шудааст. (B) Қитъаи Ван Димтер (HETP нисбат ба суръати хатти фазаи мобилӣ), ки дар сутуни Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 мм) дар 60/40 ACN/H2O бо 0,1% TFA гирифта шудааст.
Фазаи полярии статсионарии полистироли интеркализатсияшуда барои ҷудо кардани омехтаи пептидҳои синтетикӣ ва гидролизати триптии альбумин хунобаи инсон (HSA) дар хроматографияи моеъи баландсифат омода ва арзёбӣ карда шуд. Фаъолияти хроматографии сутунҳои PMP барои омехтаҳои пептидӣ аз ҷиҳати самаранокӣ ва ҳалли ҷудошавӣ аъло аст. Самаранокии беҳтари ҷудокунии сутунҳои PMP бо якчанд сабабҳо ба монанди андозаи зарраҳои кремний ва андозаи сӯрохиҳо, синтези назоратшавандаи фазаҳои статсионарӣ ва маводи бастабандии мураккаби сутунҳо вобаста аст. Илова ба самаранокии баланди ҷудокунӣ, бартарии дигари ин марҳилаи статсионарӣ фишори пасти бозгашти сутун бо суръати баланди ҷараён мебошад. Сутунҳои PMP хеле такроршавандаанд ва метавонанд барои таҳлили омехтаҳои пептидҳо ва ҳазми триптии сафедаҳои гуногун истифода шаванд. Мо ният дорем, ки ин сутунро барои ҷудо кардани пайвастагиҳои биологӣ аз маҳсулоти табиӣ, экстрактҳои гиёҳҳои шифобахш ва занбӯруғҳо дар хроматографияи моеъ истифода барем. Дар оянда сутунҳои PMP инчунин барои ҷудо кардани сафедаҳо ва антителоҳои моноклоналӣ арзёбӣ карда мешаванд.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Тадқиқот ба системаҳои ҷудошавии пептидҳои фазавии баръакс хроматография қисми I: Таҳияи протокол барои тавсифи сутун. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Тадқиқот ба системаҳои ҷудошавии пептидҳои фазавии баръакс хроматография қисми I: Таҳияи протокол барои тавсифи сутун.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Тадқиқоти системаҳои ҷудокунии пептидҳо тавассути хроматографияи баръакс, Қисми I: Таҳияи протокол барои тавсифи сутунҳо. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Тадқиқот ба системаҳои ҷудошавии пептидҳои марҳилаи баръакс хроматография қисми I: Таҳияи протокол барои хусусиятҳои сутун. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Тадқиқот ба системаҳои ҷудошавии пептидҳои марҳилаи баръакс хроматография қисми I: Таҳияи протокол барои хусусиятҳои сутун.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Тадқиқоти системаҳои ҷудокунии пептидҳо тавассути хроматографияи баръакс, Қисми I: Таҳияи протокол барои тавсифи сутунҳо.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Гомес, Б. Усулҳои эҷоди пептидҳои фаъоли такмилёфта барои табобати бемориҳои сироятӣ. Биотехнология. Дастовардҳо 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Пептидҳои терапевтии синтетикӣ: Илм ва бозор. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Пептидҳои терапевтии синтетикӣ: Илм ва бозор.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ва Chreschatyski M. Пептидҳои терапевтии синтетикӣ: илм ва бозор.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ва Khreschatsky M. Пептидҳои терапевтии синтетикӣ: илм ва бозор. кашфи маводи мухаддир. Имруз 15 (1—2), 40—56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced proteomic chromatography моеъ. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced proteomic chromatography моеъ.Нигаред Ф., Смит РД ва Шен Ю. Хроматографияи пешрафтаи протеомии моеъ. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Таркиби пешрафтаи протеин 液相色谱。Нигаред Ф., Смит РД ва Шен Ю. Хроматографияи пешрафтаи протеомии моеъ.J. Хроматография. А 1261, 78–90 (2012).
Лю, В. Хроматографияи пешрафтаи моеъ-спектрометрия қодир аст метаболомика ва протеомикаи васеъро муттаҳид созад. анус. Чим. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Нақши UHPLC дар рушди фармасевтӣ. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Нақши UHPLC дар рушди фармасевтӣ.Чеснут, СМ ва Солсбери, ҶҶ Нақши UHPLC дар рушди фармасевтӣ.Чеснут, СМ ва Солсбери, JJ Нақши UHPLC дар рушди маводи мухаддир. J. Сентябри илм. 30 (8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Ҷанбаҳои бунёдӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори баланд барои ҷудошавии зуд. Wu, N. & Clausen, AM Ҷанбаҳои бунёдӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори баланд барои ҷудошавии зуд.Ву, Н. ва Клаузен, AM Ҷанбаҳои асосӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори баланд барои ҷудокунии зуд. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Ҷанбаҳои асосӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори ултра баланд барои ҷудокунии зуд.Ву, Н. ва Клаузен, AM Ҷанбаҳои асосӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори баланд барои ҷудокунии зуд.J. Сентябри илм. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Истифодаи хроматографияи ултра-иҷрои моеъ дар рушди фармасевтӣ. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Истифодаи хроматографияи ултра-иҷрои моеъ дар рушди фармасевтӣ.Рен, SA ва Chelischeff, P. Истифодаи хроматографияи баландсифати моеъ дар рушди фармасевтӣ. Wren, SA & Tchelicheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelicheff, P.Рен, SA ва Chelischeff, P. Татбиқи хроматографияи моеъи ултра иҷро дар рушди маводи мухаддир.J. Хроматография. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, H. ва дигарон. Гидрогели монолитии макропорус, ки аз эмульсияи нафт дар об бо марҳилаи баланди дохилӣ барои тозакунии самараноки энтеровирусҳо 71. Химиявӣ. лоиҳа. Маҷалла 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С ва Вилкинс, Ҷ.А. Нақши хроматографияи моеъ дар протеомика. Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С ва Вилкинс, Ҷ.А. Нақши хроматографияи моеъ дар протеомика.Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С ва Вилкинс, Ҷ.А. Нақши хроматографияи моеъ дар протеомика. Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. & Уилкинс, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С ва Вилкинс, Ҷ.АШи, Ю., Сян, Р., Хорват, С ва Вилкинс, Ҷ.А. Нақши хроматографияи моеъ дар протеомика.J. Хроматография. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вутей, Ҷ.-Л. & Guillarme, D. Тамоюлҳои нав дар ҷудошавии хроматографии моеъи баръакси пептидҳо ва сафедаҳои терапевтӣ: назария ва татбиқ. & Guillarme, D. Тамоюлҳои нав дар ҷудошавии хроматографии моеъи баръакси пептидҳо ва сафедаҳои терапевтӣ: назария ва татбиқ. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов ва белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория ва приложения. & Guillarme, D. Тамоюлҳои нав дар ҷудо кардани пептидҳои табобатӣ ва сафедаҳо бо хроматографияи моеъи фазаи баръакс: назария ва татбиқ. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Гиларм, Д.ва Гиларме, Д. Тамоюлҳои нав дар ҷудо кардани пептидҳои табобатӣ ва сафедаҳо тавассути хроматографияи моеъи баръакс: назария ва татбиқ.J. Фарм. Илми биотиббӣ. анус. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Ҷудокунии ду-ченакаи пептидҳо бо истифода аз системаи RP-RP-HPLC бо pH гуногун дар андозаҳои ҷудокунии якум ва дуюм. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Ҷудокунии ду-ченакаи пептидҳо бо истифода аз системаи RP-RP-HPLC бо pH гуногун дар андозаҳои ҷудокунии якум ва дуюм.Гилар М., Оливова П., Дали АЕ ва Геблер ҶК Ҷудокунии дученакаи пептидҳо бо истифода аз системаи RP-RP-HPLC бо рН-и гуногун дар андозаҳои ҷудокунии якум ва дуюм.Гилар М., Оливова П., Дали АЕ ва Геблер ҶК Ҷудокунии дученакаи пептидҳо бо истифода аз арзишҳои гуногуни рН дар андозаҳои ҷудокунии якум ва дуюм бо истифода аз системаи RP-RP-HPLC. J. Сентябри илм. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Феллитти, С ва дигарон. Тадқиқоти интиқоли масса ва хусусиятҳои кинетикии сутунҳои хроматографияи баландсифат, ки бо заррачаҳои комилан ковокӣ ва рӯякӣ ковокии C18 аз 2 мкм хурдтар баста шудаанд. J. Сентябри илм. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Пиовесана, С ва дигарон. Тамоюлҳои охирин ва мушкилоти таҳлилӣ дар ҷудокунӣ, муайянсозӣ ва тасдиқи пептидҳои биоактивии растанӣ. анус. Анал махлуқ. химиявй. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, ҶБ ва дигарон. Манзараи протеомикии салтанати ҳаёт. Табиат 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
Де Лука, К. Пас аз коркарди пептидҳои терапевтӣ бо хроматографияи моеъи тайёрӣ. Молекулҳо (Базел, Швейтсария) 26(15), 4688 (2021).
Янг, Ю. & Генг, X. Хроматографияи омехта ва татбиқи он ба биополимерҳо. Янг, Ю. & Генг, X. Хроматографияи омехта ва татбиқи он ба биополимерҳо.Ян, Ю. ва Генг, X. Хроматографияи режими омехта ва татбиқи он ба биополимерҳо. Янг, Ю. & Генг, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Янг, Ю. & Генг, X. Хроматографияи режими омехта ва татбиқи он дар биополимерҳо.Ян, Ю. ва Ген, X. Хроматографияи режими омехта ва татбиқи он ба биополимерҳо.J. Хроматография. A 1218 (49), 8813–8825 (2011).