Ташаккур барои боздид аз Nature.com. Шумо версияи браузерро бо дастгирии маҳдуди CSS истифода мебаред. Барои беҳтарин таҷриба, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Реҷаи Мутобиқатро дар Internet Explorer ғайрифаъол кунед). Илова бар ин, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript нишон медиҳем.
Карусели се слайдро якбора нишон медиҳад. Барои гузаштан аз се слайд дар як вақт тугмаҳои "Пешина" ва "Баъдӣ"-ро истифода баред, ё барои гузаштан аз се слайд дар як вақт тугмаҳои лағжандаро дар охир истифода баред.
Зарраҳои кремнийи сӯрохдор бо усули сол-гел бо баъзе тағйиротҳо барои ба даст овардани зарраҳои васеъсӯрохдор омода карда шуданд. Ин зарраҳо бо N-фенилмалеимид-метилвинил изоцианат (PMI) ва стирол тавассути полимеризатсияи интиқоли занҷири баръакс-фрагментатсия (RAFT) барои истеҳсоли полиамидҳои байникалятсионии N-фенилмалеимид ҳосил карда шуданд. Фазаи статсионарии стирол (PMP). Сутунҳои пӯлоди зангногири борик (диаметри дохилии 100 × 1.8 мм) бо бастабандии шламӣ печонида шуданд. Иҷрои хроматографии сутуни PMP барои ҷудо кардани омехтаи пептидҳои синтетикӣ, ки аз панҷ пептид (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, энкефалини аминокислотаи Leu) ва гидролизати триптикии албумини зардоби инсон (HAS) иборат буд, арзёбӣ карда шуд. Дар шароити беҳтарини элюсия, шумораи назариявии пластинаҳо бо омехтаи пептидҳо ба 280,000 пластина/м2 расид. Ҳангоми муқоисаи самаранокии ҷудокунии сутуни таҳияшуда бо сутуни тиҷоратии Ascentis Express RP-Amide мушоҳида шуд, ки самаранокии ҷудокунии сутуни PMP аз ҷиҳати самаранокии ҷудокунӣ ва ҳалли он нисбат ба сутуни тиҷоратӣ бартарӣ дорад.
Саноати биофармасевтӣ дар солҳои охир ба бозори ҷаҳонии густаришёбанда табдил ёфтааст, ки саҳми бозорро ба таври назаррас афзоиш медиҳад. Бо рушди босуръати саноати биофармасевтӣ1,2,3 ниёз ба таҳлили пептид ва сафедаҳо зиёд аст. Илова бар пептиди мақсаднок, ҳангоми синтези пептидҳо ифлосҳои гуногун ба вуҷуд меоянд, аз ин рӯ, барои ба даст овардани покии дилхоҳи пептид тозакунии хроматографӣ лозим аст. Таҳлил ва тавсифи сафедаҳо дар моеъҳои бадан, бофтаҳо ва ҳуҷайраҳо вазифаи хеле душвор аст, зеро шумораи зиёди намудҳои эҳтимолан ошкоршаванда дар як намуна мавҷуданд. Гарчанде ки спектрометрияи массавӣ воситаи муассир барои секвенсия кардани пептидҳо ва сафедаҳо мебошад, агар чунин намунаҳо мустақиман ба спектрометри массавӣ ворид карда шаванд, ҷудокунӣ ғайриқаноатбахш хоҳад буд. Ин мушкилотро метавон бо роҳи анҷом додани хроматографияи моеъ (ХМ) пеш аз таҳлили MS ҳал кард, ки миқдори аналитҳои воридшаванда ба спектрометри массавиро дар вақти муайян кам мекунад4,5,6. Илова бар ин, аналитҳо метавонанд ҳангоми ҷудокунии фазаи моеъ дар минтақаи танг ҷамъ шаванд ва бо ин васила ин аналитҳоро ҷамъ кунанд ва ҳассосияти ошкоркунии MS-ро афзоиш диҳанд. Хроматографияи моеъ (ХМ) дар даҳсолаи охир ба таври назаррас пешрафт кардааст ва ба як усули васеъ истифодашаванда барои таҳлили протеомӣ табдил ёфтааст7,8,9,10.
Хроматографияи моеъи фазаи баръакс (RP-LC) барои тоза кардан ва ҷудо кардани омехтаҳои пептидҳо бо истифода аз кремнийи бо октадесил тағйирёфта (ODS) ҳамчун фазаи статсионарӣ васеъ истифода мешавад11,12,13. Аммо, аз сабаби сохтори мураккаб ва хусусияти амфотерикии онҳо14,15, фазаҳои статсионии RP наметавонанд ҷудокунии қаноатбахши пептидҳо ва сафедаҳоро таъмин кунанд. Аз ин рӯ, таҳлили пептидҳо ва сафедаҳо бо пораҳои қутбӣ ва ғайриқутбӣ барои ҳамкорӣ ва нигоҳ доштани ин аналитҳо фазаҳои статсионии махсус тарҳрезишударо талаб мекунад16. Хроматографияи омехта, ки таъсири мутақобилаи мултимодалиро пешниҳод мекунад, метавонад алтернатива ба RP-LC барои ҷудо кардани пептидҳо, сафедаҳо ва дигар омехтаҳои мураккаб бошад. Якчанд фазаҳои статсионии навъи омехта омода карда шуданд ва сутунҳое, ки бо ин фазаҳои статсионарӣ пур карда шудаанд, барои ҷудо кардани пептидҳо ва сафедаҳо истифода шуданд17,18,19,20,21. Аз сабаби мавҷудияти гурӯҳҳои қутбӣ ва ғайриқутбӣ, фазаҳои статсионарии режими омехта (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, интеркалятсияи қутбӣ/RPLC) барои ҷудо кардани пептидҳо ва сафедаҳо мувофиқанд22,23,24,25,26,27,28. , фазаҳои статсионарии байниқутбӣ бо гурӯҳҳои қутбии ковалентӣ бо пайвандҳои ковалентӣ қобилиятҳои хуби ҷудокунӣ ва интихоби беназирро барои аналитҳои қутбӣ ва ғайриқутбӣ нишон медиҳанд, зеро ҷудокунӣ аз таъсири мутақобилаи байни аналит ва фазаи статсионарии вобаста аст. Таъсири мутақобилаи бисёрмодалӣ 29,30,31,32. Ба наздикӣ, Zhang et al. 30 фазаҳои статсионарии полиаминҳои бегенил-терминатсияшударо ба даст оварданд ва гидрокарбонҳо, антидепрессантҳо, флавоноидҳо, нуклеозидҳо, эстрогенҳо ва баъзе аналитҳои дигарро бомуваффақият ҷудо карданд. Маводи статсионарии дарунсохти қутбӣ ҳам гурӯҳҳои қутбӣ ва ҳам ғайриқутбӣ дорад, аз ин рӯ онро барои ҷудо кардани пептидҳо ва сафедаҳо ба қисмҳои гидрофобӣ ва гидрофилӣ истифода бурдан мумкин аст. Сутунҳои қутбӣ (масалан, сутунҳои C18 бо амидҳои дохилӣ) бо номи тиҷоратии сутунҳои Ascentis Express RP-Amide дастрасанд, аммо ин сутунҳо танҳо барои таҳлили амин 33 истифода шудаанд.
Дар таҳқиқоти ҷорӣ, фазаи статсионарии ҷойгиркунии қутбӣ (N-фенилмалеимид, полистироли ҷойгиркунӣ) барои ҷудокунии пептидҳо ва шикастани триптикии HSA омода ва арзёбӣ карда шуд. Барои тайёр кардани фазаи статсионарии зерин стратегияи зерин истифода шуд. Зарраҳои кремнийи сӯрохдор мувофиқи тартибе, ки дар нашрияҳои қаблии мо тавсиф шудаанд, бо баъзе тағйирот дар схемаҳои тайёрӣ 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 омода карда шуданд. Таносуби карбамид, полиэтиленгликол (PEG), TMOS ва кислотаи обӣ-сирко барои ба даст овардани зарраҳои кремний бо андозаи сӯрохиҳои калон танзим карда шуданд. Дуюм, лиганд нави фенилмалеимид-метилвинилизоцианат синтез карда шуд ва зарраҳои кремнийи ҳосилшудаи он барои тайёр кардани фазаҳои статсионарии қутбӣ истифода шуданд. Фазаи статсионарии ҳосилшуда мувофиқи схемаи оптимизатсияшудаи бастабандӣ ба сутуни пӯлоди зангногир (диаметри дарунии 100 × 1.8 мм) бастабандӣ карда шуд. Бастабандии сутун бо ларзиши механикӣ барои таъмини қабати якхела дар дохили сутун кӯмак мекунад. Сутуни бастабандишуда барои ҷудо кардани омехтаи пептидҳо, ки аз панҷ пептид (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, пептиди лейцин-энкефалин) ва гидролизатҳои триптикии албумини зардоби инсон (HSA) иборат буд, арзёбӣ карда шуд. Мушоҳида карда шуд, ки омехтаи пептид ва ҳазми триптикии HSA бо қарори хуб ва самаранокӣ ҷудо шудаанд. Самаранокии ҷудокунии сутуни PMP бо сутуни Ascentis Express RP-Amide муқоиса карда шуд. Мушоҳида карда шуд, ки пептидҳо ва сафедаҳо дар сутуни PMP қарори хуб ва самаранокии баланди ҷудокунӣ доранд ва самаранокии ҷудокунии сутуни PMP нисбат ба сутуни Ascentis Express RP-Amide баландтар аст.
PEG (полиэтиленгликол), мочевина, кислотаи сирко, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трипсин, албумини зардоби инсон (HSA), хлориди аммоний, мочевина, гексаметилметакрилойлдисилазан (HMDS), метакрилои хлорид (MC), стирол, 4-гидрокси-TEMPO, бензоилпероксид (BPO), ацетонитрил (ACN) барои HPLC, метанол, 2-пропанол ва ацетон. Ширкати Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, ИМА).
Омехтаи карбамид (8 г), полиэтиленгликол (8 г) ва 8 мл кислотаи сиркои 0,01 Н ба муддати 10 дақиқа омехта карда шуд ва ба он 24 мл TMOS дар яхдон илова карда шуд. Омехтаи реаксия дар автоклави пӯлоди зангногир дар ҳарорати 40°C барои 6 соат ва сипас дар ҳарорати 120°C барои 8 соат гарм карда шуд. Об тоза карда шуд ва боқимонда дар ҳарорати 70°C барои 12 соат хушк карда шуд. Блокҳои нарми хушкшуда ба таври ҳамвор майда карда шуданд ва дар танӯр дар ҳарорати 550°C барои 12 соат калсий карда шуданд. Се партия барои санҷидани такроршавандагии андозаи зарраҳо, андозаи сӯрохиҳо ва масоҳати сатҳ омода ва тавсиф карда шуданд.
Гурӯҳи қутбӣ ва фазаи статсионарӣ барои занҷирҳои полистирол. Тартиби омодасозӣ дар зер тавсиф шудааст.
N-фенилмалеимид (200 мг) ва метилвинил изоцианат (100 мг) дар толуоли беоб ҳал карда шуданд ва сипас 0,1 мл 2,2′-азоиизобутиронитрил (AIBN) ба колбаи реаксия илова карда шуд, то сополимери фенилмалеимид ва метилвинил изоцианат (PMCP) ба даст оварда шавад.) Омехта дар ҳарорати 60°C барои 3 соат гарм карда шуд, филтр карда шуд ва дар танӯр дар ҳарорати 40°C барои 3 соат хушк карда шуд.
Зарраҳои хушки кремний (2 г) дар толуоли хушк (100 мл) пароканда карда, дар колбаи поёнии мудаввари 500 мл барои 10 дақиқа омехта ва бо ултрасадо коркард карда шуданд. PMCP (10 мг) дар толуол ҳал карда шуд ва тавассути қифи иловагӣ ба колбаи реаксия қатра-қатра илова карда шуд. Омехта дар ҳарорати 100°C барои 8 соат рефлюкс карда шуд, филтр карда шуд, бо ацетон шуста шуд ва дар ҳарорати 60°C барои 3 соат хушк карда шуд. Сипас, зарраҳои кремний, ки бо PMCP (100 г) алоқаманд буданд, дар толуол (200 мл) ҳал карда шуданд ва ба он 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) дар ҳузури 100 мкл дибутилтин дилаурат ҳамчун катализатор илова карда шуд. Омехта дар ҳарорати 50°C барои 8 соат омехта карда шуд, филтр карда шуд ва дар ҳарорати 50°C барои 3 соат хушк карда шуд.
Стирол (1 мл), пероксиди бензоил BPO (0,5 мл) ва зарраҳои кремний, ки ба TEMPO-PMCP (1,5 г) пайваст карда шудаанд, дар толуол пароканда ва бо нитроген тоза карда шуданд. Полимеризатсияи стирол дар ҳарорати 100°C ба муддати 12 соат анҷом дода шуд. Маҳсулоти ҳосилшуда бо метанол шуста шуда, дар ҳарорати 60°C як шабонарӯз хушк карда шуд. Схемаи умумии реаксия дар расми 1 нишон дода шудааст.
Намунаҳо дар ҳарорати 393 К ба муддати 1 соат то ба даст овардани фишори боқимондаи камтар аз 10-3 Торр дегазатсия карда шуданд. Миқдори N2, ки дар фишори нисбӣ P/P0 = 0.99 адсорбсия шудааст, барои муайян кардани ҳаҷми умумии сӯрохиҳо истифода шуд. Морфологияи зарраҳои холис ва лиганд пайвастшудаи кремний бо лиганд бо истифода аз микроскопи электронии сканкунӣ (Hitachi High Technologies, Токио, Ҷопон) таҳқиқ карда шуд. Намунаҳои хушк (зарраҳои холис ва кремний бо лиганд пайвастшуда) бо истифода аз лентаи карбонӣ ба чӯбҳои алюминий ҷойгир карда шуданд. Тилло бо истифода аз дастгоҳи пошидани Q150T ба намуна гузошта шуд ва қабати ғафсии Au бо ғафсии 5 нм ба намуна гузошта шуд. Ин самаранокии раванди шиддати пастро беҳтар мекунад ва пошидани хунуки майдаро таъмин мекунад. Таҳлили элементҳо бо истифода аз таҳлилгари таркиби элементҳои Thermo Electron (Waltham, MA, ИМА) Flash EA1112 анҷом дода шуд. Барои ба даст овардани тақсимоти андозаи зарраҳо, таҳлилгари андозаи зарраҳои Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 истифода шуд. Зарраҳои пӯшониданашудаи кремний ва зарраҳои кремнийи пайвастшуда бо лиганд (ҳар кадом 5 мг) дар 5 мл изопропанол пароканда карда шуданд, ба муддати 10 дақиқа бо ултрасадо коркард карда шуданд, ба муддати 5 дақиқа омехта карда шуданд ва дар мизи оптикии Mastersizer ҷойгир карда шуданд. Таҳлили термогравиметрӣ бо суръати 5°C дар як дақиқа дар диапазони ҳарорат аз 30 то 800°C анҷом дода мешавад.
Сутунҳои аз пӯлоди зангногир бо пӯшиши борик бо нахи шишагин бо андозаҳо (ID 100 × 1.8 мм) бо усули пур кардани шлам бо ҳамон тартибе, ки дар истиноди 31 зикр шудааст, бастабандӣ карда шуданд. Сутуни аз пӯлоди зангногир (пӯшиши бо шишагин, ID 100 × 1.8 мм) ва баромадгоҳи дорои фрити 1 мкм ба мошини бастабандии шлам (Alltech Deerfield, IL, ИМА) пайваст карда шуд. Суспензияи фазаи статсионариро бо гузоштани 150 мг фазаи статсионари дар 1.2 мл метанол ва ворид кардани он ба сутуни захиравӣ омода кунед. Метанол ҳамчун ҳалкунандаи шлам ва ҳалкунандаи назоратӣ истифода шуд. Сутунро бо истифода аз пайдарпайии фишори 100 МП барои 10 дақиқа, 80 МП барои 15 дақиқа ва 60 МП барои 30 дақиқа бастабандӣ кунед. Раванди бастабандӣ барои ларзиши механикӣ ду вибратори сутуни хроматографияи газӣ (Alltech, Deerfield, IL, ИМА) истифода бурд, то бастабандии якхелаи сутун таъмин карда шавад. Бастабандии шламро пӯшед ва фишорро оҳиста раҳо кунед, то аз осеб дидани ресмон пешгирӣ кунед. Сутун аз сӯрохии лӯла ҷудо карда шуд ва барои санҷидани кори он як фитинги дигар ба вуруд васл карда шуд ва ба системаи LC пайваст карда шуд.
MLC-и фармоишӣ бо истифода аз насоси LC (10AD Shimadzu, Ҷопон), намунагир бо ҳалқаи тазриқи 50 нл (Valco (USA) C14 W.05), дегазери мембрана (Shimadzu DGU-14A) ва тирезаи капиллярии UV-VIS сохта шуд. Дастгоҳи детектор (UV-2075) ва микросутуни сирдор. Барои кам кардани таъсири васеъшавии иловагии сутун аз найчаҳои пайвасткунандаи хеле танг ва кӯтоҳ истифода баред. Пас аз пур кардани сутун, дар баромадгоҳи пайванди коҳишдиҳандаи 1/16 дюймӣ як капилляр (50 µm id 365) насб кунед ва як капилляри (50 µm)-и пайванди коҳишдиҳандаро насб кунед. Ҷамъоварии маълумот ва коркарди хроматограмма бо истифода аз нармафзори Multichro 2000 анҷом дода мешавад. Дар 254 нм, ҷабби ултрабунафши таҳлилшавандагон дар 0 назорат карда шуд. Маълумоти хроматографӣ бо истифода аз OriginPro8 (Нортгемптон, MA) таҳлил карда шуд.
Албумини хунобаи инсон, хокаи лиофилизатсияшуда, ≥ 96% (электрофорези гел агароза) 3 мг бо трипсин (1.5 мг), 4.0 М мочевина (1 мл) ва 0.2 М бикарбонати аммоний (1 мл) омехта карда шудааст. Маҳлул барои 10 дақиқа омехта карда шуд ва дар ваннаи обӣ дар ҳарорати 37°C барои 6 соат нигоҳ дошта шуд, сипас бо 1 мл 0.1% TFA хомӯш карда шуд. Маҳлулро филтр кунед ва дар ҳарорати аз 4°C паст нигоҳ доред.
Ҷудокунии омехтаи пептидҳо ва триптикии дайҷест HSA дар сутуни PMP алоҳида арзёбӣ карда шуд. Гидролизи триптикии омехтаи пептидҳо ва HSA-ро, ки бо сутуни PMP ҷудо карда шудааст, санҷед ва натиҷаҳоро бо сутуни Ascentis Express RP-Amide муқоиса кунед. Шумораи лавҳаҳои назариявӣ бо истифода аз муодилаи зерин ҳисоб карда мешавад:
Тасвирҳои SEM-и зарраҳои холиси кремний ва зарраҳои кремний бо лиганд пайвастшуда дар расми 2 нишон дода шудаанд. Тасвирҳои SEM-и зарраҳои холиси кремний (A, B) шакли курашаклро нишон медиҳанд, ки дар он зарраҳо дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблии мо дароз ё симметрияи номунтазам доранд. Сатҳи зарраҳои кремний, ки бо лиганд (C, D) пайваст шудаанд, нисбат ба зарраҳои холиси кремний ҳамвортар аст, ки ин метавонад аз сабаби занҷирҳои полистирол, ки сатҳи зарраҳои кремнийро пӯшонидаанд, бошад.
Микрографҳои электронии сканкунии зарраҳои холиси кремний (A, B) ва зарраҳои кремнийи пайвастшуда ба лиганд (C, D).
Тақсимоти андозаи зарраҳои зарраҳои холиси кремний ва зарраҳои кремнийи пайвастшуда бо лиганд дар расми 2.3(A) нишон дода шудааст. Хатҳои тақсимоти андозаи зарраҳои ҳаҷмӣ нишон доданд, ки андозаи зарраҳои кремний пас аз тағирёбии кимиёвӣ афзоиш ёфтааст (Расми 3A). Маълумоти тақсимоти андозаи зарраҳои кремний аз таҳқиқоти ҷорӣ ва таҳқиқоти қаблӣ дар Ҷадвали 1(A) муқоиса карда шудаанд. Андозаи ҳаҷмии зарраҳои d(0.5)-и PMP 3.36 мкм буд, дар муқоиса бо арзиши ad(0.5)-и 3.05 мкм дар таҳқиқоти қаблии мо (зарраҳои кремнийи пайвастшудаи полистирол)34. Аз сабаби тағирёбии таносуби PEG, мочевина, TMOS ва кислотаи сирко дар омехтаи реаксия, тақсимоти андозаи зарраҳои ин партия нисбат ба таҳқиқоти қаблии мо тангтар буд. Андозаи зарраҳои фазаи PMP нисбат ба фазаи зарраҳои кремнийи пайвастшуда бо полистирол, ки мо қаблан омӯхта будем, каме калонтар аст. Ин маънои онро дорад, ки функсионализатсияи сатҳии зарраҳои кремний бо стирол танҳо як қабати полистирол (0.97 µm)-ро дар сатҳи кремний гузоштааст, дар ҳоле ки дар марҳилаи PMP ғафсии қабат 1.38 µm буд.
Тақсимоти андозаи зарраҳо (A) ва тақсимоти андозаи сӯрохиҳо (B)-и зарраҳои холиси кремний ва зарраҳои кремнийи пайвастшуда бо лиганд.
Андозаи сӯрохиҳо, ҳаҷми сӯрохиҳо ва масоҳати сатҳи зарраҳои кремний, ки дар ин таҳқиқот истифода шудаанд, дар Ҷадвали 1 (B) нишон дода шудаанд. Профилҳои PSD-и зарраҳои кремнийи холис ва зарраҳои кремнийи пайвастшуда бо лиганд дар расми 3 (B) нишон дода шудаанд. Натиҷаҳо бо таҳқиқоти қаблии мо34 муқоисашаванда буданд. Андозаи сӯрохиҳои зарраҳои кремнийи холис ва пайвастшуда бо лиганд мутаносибан 310 Å ва 241 Å буданд, ки нишон медиҳад, ки пас аз тағир додани кимиёвӣ, андозаи сӯрохиҳо 69 Å коҳиш ёфтааст, чунон ки дар Ҷадвали 1 (B) нишон дода шудааст ва каҷи тағирот дар расм нишон дода шудааст. Масоҳати сатҳи мушаххаси зарраҳои кремний дар таҳқиқоти ҷорӣ 116 м2/г аст, ки бо таҳқиқоти қаблии мо (124 м2/г) муқоисашаванда аст. Тавре ки дар Ҷадвали 1 (B) нишон дода шудааст, масоҳати сатҳи (м2/г) зарраҳои кремний пас аз тағир додани кимиёвӣ низ аз 116 м2/г то 105 м2/г коҳиш ёфтааст.
Натиҷаҳои таҳлили элементии фазаи статсионарӣ дар Ҷадвали 2 оварда шудаанд. Миқдори карбони фазаи статсионии ҷорӣ 6,35% аст, ки нисбат ба таҳқиқоти қаблии мо (зарраҳои кремний, ки бо полистирол алоқаманданд, мутаносибан 7,93%35 ва 10,21%) камтар аст. Миқдори карбони фазаи статсионии ҷорӣ дар зер оварда шудааст, зеро баъзе лигандҳои қутбӣ, ба монанди фенилмалеимид, метилвинил изоцианат (PCMP) ва 4-гидрокси-TEMPO, илова бар стирол, ҳангоми тайёр кардани SP истифода шудаанд. Фоизи вазни нитроген дар фазаи статсионии ҷорӣ 2,21% дар муқоиса бо 0,1735 ва 0,85% дар таҳқиқоти қаблӣ42 аст. Ин маънои онро дорад, ки фазаи статсионии ҷорӣ фоизи вазнии нитрогенро аз сабаби фенилмалеимид дорад. Ба ҳамин монанд, маҳсулоти (4) ва (5) мутаносибан 2,7% ва 2,9% карбон доранд, дар ҳоле ки маҳсулоти ниҳоӣ (6) 6,35% карбон дорад, чунон ки дар Ҷадвали 2 нишон дода шудааст. Таҳлили термогравиметрӣ (TGA) дар марҳилаи статсионарии PMP барои санҷиши аз даст додани вазн истифода шудааст ва каҷи TGA дар расми 4 нишон дода шудааст. Каҷи TGA аз даст додани вазнро 8,6% нишон медиҳад, ки бо миқдори карбон (6,35%) мувофиқати хуб дорад, зеро лигандҳо на танҳо C, балки N, O ва H-ро низ дар бар мегиранд.
Лиганди фенилмалеимид-метилвинил изоцианат барои тағир додани сатҳи зарраҳои кремний аз сабаби гурӯҳҳои фенилмалеимид ва винилизоцианати қутбӣ интихоб карда шуд. Гурӯҳҳои изоцианати винил метавонанд бо стирол тавассути полимеризатсияи радикалии зинда минбаъд реаксия кунанд. Сабаби дуюм ворид кардани гурӯҳе мебошад, ки бо аналит таъсири мутақобилаи мӯътадил дорад ва байни аналит ва фазаи статсионарӣ таъсири мутақобилаи қавии электростатикӣ надорад, зеро қисми фенилмалеимид дар рН муқаррарӣ заряди виртуалӣ надорад. Қутбии фазаи статсионариро метавон тавассути миқдори оптималии стирол ва вақти реаксияи полимеризатсияи радикалии озод идора кард. Қадами ниҳоии реаксия (полимеризатсияи радикалии озод) муҳим аст, зеро он қутбии фазаи статсионариро тағйир медиҳад. Таҳлили элементӣ барои санҷидани миқдори карбон дар ин фазаҳои статсионарӣ гузаронида шуд. Мушоҳида шудааст, ки зиёд кардани миқдори стирол ва вақти реаксия миқдори карбони фазаи статсионариро зиёд мекунад ва баръакс. SP-ҳое, ки бо консентратсияҳои гуногуни стирол омода карда шудаанд, бори гуногуни карбон доранд. Ба ҳамин монанд, ин фазаҳои статсионарӣ дар сутунҳои пӯлоди зангногир ҷойгир карда шуданд ва хусусиятҳои хроматографии онҳо (интихобӣ, ҳалли масъала, арзиши N ва ғайра) санҷида шуданд. Дар асоси ин таҷрибаҳо, таркиби оптимизатсияшуда барои тайёр кардани фазаи статсионарии PMP интихоб карда шуд, то қутбияти назоратшаванда ва нигоҳдории хуби аналитро таъмин кунад.
Сутуни PMP инчунин барои таҳлили панҷ омехтаи пептидҳо (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин) бо истифода аз иқтидори фазаи мобилӣ арзёбӣ карда шуд. 60/40 (v/v) ACN/об (0.1% TFA) бо суръати ҷараёни 80 мкл/дақ. Дар шароити элюсияи оптималӣ (200,000 пластина/м), шумораи пластинаҳои назариявӣ (N) дар як сутун (100 × 1.8 мм) 20,000 ± 100 аст. Арзишҳои N барои се сутуни PMP дар Ҷадвали 3 ва хроматограммаҳо дар Расми 5A нишон дода шудаанд. Таҳлили босуръат бо суръати баланди ҷараён (700 мкл/дақ) дар сутуни PMP, панҷ пептид дар давоми як дақиқа элюсия карда шуданд, арзиши аълои N 13,500 ± 330 дар як сутун (диаметри 100 x 1.8 мм), ки ба 135,000 пластина/м баробар аст (Расми 5B). Се сутун бо андозаи якхела (диаметри дарунӣ 100 x 1.8 мм) бо се партияи гуногуни фазаи статсионарии PMP пур карда шуданд, то такрорпазириро санҷанд. Аналитҳо барои ҳар як сутун бо ҷудо кардани ҳамон омехтаи санҷишӣ дар ҳар як сутун бо истифода аз шароити оптималии элюсия, шумораи пластинаҳои назариявӣ N ва вақти нигоҳдорӣ сабт карда шуданд. Маълумоти такрорпазирӣ барои сутунҳои PMP дар Ҷадвали 4 нишон дода шудаанд. Такрорпазирии сутуни PMP бо арзишҳои хеле пасти %RSD, тавре ки дар Ҷадвали 3 нишон дода шудааст, хуб коррелятсия кард.
Ҷудо кардани омехтаҳои пептидӣ дар сутуни PMP (B) ва сутуни Ascentis Express RP-Amide (A), фазаи мобилӣ 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), андозаи сутуни PMP (100 x 1.8 мм id), таҳлил Тартиби элютсияи пайвастагиҳо: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ва 5 (энкефалин кислотаи лейкӣ).
Сутуни PMP (диаметри дарунии 100 x 1.8 мм) барои ҷудо кардани гидролизати триптикии албумини зардоби инсон бо истифода аз HPLC арзёбӣ карда шуд. Хроматограмма дар расми 6 нишон медиҳад, ки намунаҳо бо қарори хеле хуб хуб ҷудо карда шудаанд. Маҳлулҳои HSA бо истифода аз суръати ҷараёни 100 мкл/дақ, фазаи мобилии 70/30 ацетонитрил/об ва 0.1% TFA таҳлил карда шуданд. Таҷзияи HSA ба 17 қулла тақсим карда шуд, чунон ки дар хроматограмма (Расми 6) нишон дода шудааст, ки ба 17 пептид мувофиқат мекунад. Самаранокии ҷудокунии қуллаҳои инфиродӣ аз гидролизати HSA ҳисоб карда шуданд ва арзишҳо дар Ҷадвали 5 нишон дода шудаанд.
Гидролизатҳои триптикии HSA дар сутуни PMP (диаметри дарунӣ 100 x 1.8 мм), суръати ҷараён (100 мкл/дақ), фазаи мобилӣ 60/40 ацетонитрил/об ва 0.1% TFA ҷудо карда шуданд.
ки дар он L дарозии сутун, η часпакии фазаи мобилӣ, ΔP фишори бозгашти сутун ва u суръати хаттии фазаи мобилӣ мебошад. Гузариши сутуни PMP 2,5 × 10–14 м2, суръати ҷараён 25 мкл/дақ буд, 60/40 v/v истифода шуд. ACN/об. Гузариши сутуни PMP (ID 100 × 1,8 мм) ба таҳқиқоти қаблии Ref.34-и мо монанд буд. Гузариши сутун, ки бо зарраҳои сатҳии сӯрохдор пур карда шудааст, 1,7 × 10 .6 мкм, 2,5 × 10-14 м2 барои зарраҳои 5 мкм43 аст. Аз ин рӯ, гузариши фазаи PMP ба гузариши зарраҳои пӯсти аслӣ бо андозаи 5 мкм монанд аст.
ки дар он Wx массаи сутуни пур аз хлороформ, Wy массаи сутуни пур аз метанол ва ρ зичии ҳалкунанда аст. Зичии метанол (ρ = 0.7866) ва хлороформ (ρ = 1.484). Сӯрохии умумии сутуни зарраҳои кремний-C18 (100 × 1.8 мм ID)34 ва сутуни қаблан омӯхташудаи C18-карбамид31 мутаносибан 0.63 ва 0.55 буданд. Ин маънои онро дорад, ки мавҷудияти лигандҳои карбамид гузариши фазаи статсионариро коҳиш медиҳад. Аз тарафи дигар, сӯрохии умумии сутуни PMP (диаметри дарунии 100 × 1.8 мм) 0.60 аст. Сутунҳои PMP нисбат ба сутунҳое, ки бо зарраҳои кремний пайвастшудаи C18 пур карда шудаанд, камтар гузаришпазиранд, зеро дар фазаҳои статсионарии навъи C18 лигандҳои C18 ба зарраҳои кремний дар занҷирҳои хаттӣ пайваст мешаванд, дар ҳоле ки дар фазаҳои статсионарии навъи полистирол полимери нисбатан ғафс дар атрофи зарраҳо ташаккул меёбад. қабати А. Дар як таҷрибаи маъмулӣ, сӯрохии сутун чунин ҳисоб карда мешавад:
Дар расми 7A ва B диаграммаҳои Ван Деемтер барои сутуни PMP (id 100 x 1.8 мм) ва сутуни Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1.8 мм) дар шароити якхелаи элюсия, аз 60/40 ACN/H2O ва 0.1% TFA 20 µl/min то 800 µl/min дар ҳарду сутун нишон дода шудаанд. Арзишҳои ҳадди ақали HETP дар суръати оптималии ҷараён (80 µl/min) мутаносибан 2.6 µm ва 3.9 µm барои сутуни PMP ва сутуни Ascentis Express RP-Amide буданд. Арзишҳои HETP нишон медиҳанд, ки самаранокии ҷудокунии сутуни PMP (100 x 1.8 mm id) нисбат ба сутуни Ascentis Express RP-Amide, ки ба таври тиҷоратӣ дастрас аст (100 x 1.8 mm id) хеле баландтар аст. Графики ван Демтер дар расми 7(A) нишон медиҳад, ки коҳиши арзиши N бо афзоиши ҷараён дар муқоиса бо таҳқиқоти қаблии мо ба таври назаррас баландтар нест. Самаранокии баланди ҷудокунии сутуни PMP (id 100 × 1.8 мм) дар муқоиса бо сутуни Ascentis Express RP-Amide ба шакл ва андозаи беҳтаршудаи зарраҳо ва тартиби мураккаби бастабандии сутун, ки дар кори ҷорӣ истифода мешавад, асос ёфтааст34.
(A) Нақшаи Ван Димтер (суръати хаттии HETP нисбат ба суръати хаттии фазаи мобилӣ), ки дар сутуни PMP (id 100 x 1.8 мм) дар 60/40 ACN/H2O бо 0.1% TFA ба даст оварда шудааст. (B) Нақшаи Ван Димтер (суръати хаттии HETP нисбат ба суръати хаттии фазаи мобилӣ), ки дар сутуни Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1.8 мм) дар 60/40 ACN/H2O бо 0.1% TFA ба даст оварда шудааст.
Фазаи стационарии қутбии полистироли байникалятсияшуда барои ҷудо кардани омехтаи пептидҳои синтетикӣ ва гидролизати триптикии албумини зардоби инсон (HSA) дар хроматографияи моеъи баландсифат омода ва арзёбӣ карда шуд. Самаранокии хроматографии сутунҳои PMP барои омехтаҳои пептидӣ аз ҷиҳати самаранокии ҷудокунӣ ва ҳалли он аъло аст. Самаранокии беҳтаршудаи ҷудокунии сутунҳои PMP аз якчанд сабабҳо, ба монанди андозаи зарраҳои кремний ва андозаи сӯрохиҳо, синтези назоратшавандаи фазаҳои стационарӣ ва маводҳои мураккаби бастабандии сутун вобаста аст. Илова бар самаранокии баланди ҷудокунӣ, бартарии дигари ин фазаи стационарӣ фишори пасти сутун дар суръати баланди ҷараён аст. Сутунҳои PMP хеле такроршавандаанд ва метавонанд барои таҳлили омехтаҳои пептидҳо ва ҳазми триптикии сафедаҳои гуногун истифода шаванд. Мо ният дорем, ки ин сутунро барои ҷудо кардани пайвастагиҳои биоактивӣ аз маҳсулоти табиӣ, экстрактҳои растаниҳои шифобахш ва занбӯруғҳо дар хроматографияи моеъ истифода барем. Дар оянда, сутунҳои PMP инчунин барои ҷудо кардани сафедаҳо ва антителоҳои моноклоналӣ арзёбӣ карда мешаванд.
Филд, Ҷ.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ҷ., Тогерсен, Х. ва Петерссон, П. Таҳқиқоти системаҳои ҷудокунии пептидҳои хроматографияи фазаи баръакс қисми I: Таҳияи протокол барои тавсифи сутун. Филд, Ҷ.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ҷ., Тогерсен, Х. ва Петерссон, П. Таҳқиқоти системаҳои ҷудокунии пептидҳои хроматографияи фазаи баръакс қисми I: Таҳияи протокол барои тавсифи сутун.Филд, Ҷ.К., Оверби, М.Р., Лау, Ҷ., Тогерсен, Х., ва Петерссон, П. Таҳқиқи системаҳои ҷудокунии пептидҳо бо истифода аз хроматографияи фазаи баръакс, Қисми I: Таҳияи протокол барои тавсифи сутун. Филд, Ҷ.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ҷ., Тогерсен, Х. ва Петерссон, П. Таҳқиқоти системаҳои ҷудокунии пептидҳои хроматографияи фазаи баръакс қисми I: Таҳияи протокол барои хусусиятҳои сутун. Филд, Ҷ.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ҷ., Тогерсен, Х. ва Петерссон, П. Таҳқиқоти системаҳои ҷудокунии пептидҳои хроматографияи фазаи баръакс қисми I: Таҳияи протокол барои хусусиятҳои сутун.Филд, Ҷ.К., Оверби, М.Р., Лау, Ҷ., Тогерсен, Х., ва Петерссон, П. Таҳқиқи системаҳои ҷудокунии пептидҳо бо истифода аз хроматографияи фазаи баръакс, Қисми I: Таҳияи протокол барои тавсифи сутун.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Гомес, Б. ва дигарон. Усулҳои эҷоди пептидҳои фаъоли беҳтаршуда барои табобати бемориҳои сироятӣ. Биотехнология. Дастовардҳо 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинес, Ҷ. ва Хрестчатиский, М. Пептидҳои терапевтии синтетикӣ: Илм ва бозор. Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинес, Ҷ. ва Хрестчатиский, М. Пептидҳои терапевтии синтетикӣ: Илм ва бозор.Влиҷ П., Лисовски В., Мартинес Ҷ. ва Хрешатиски М. Пептидҳои терапевтии синтетикӣ: илм ва бозор.Влиеге П., Лисовски В., Мартинес Ҷ. ва Хрешацкий М. Пептидҳои терапевтии синтетикӣ: илм ва бозор. Кашфи доруҳо. Имрӯз 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Сие, Ф., Смит, РД ва Шен, Ю. Хроматографияи моеъи протеомии пешрафта. Сие, Ф., Смит, РД ва Шен, Ю. Хроматографияи моеъи протеомии пешрафта.Нигаред ба Ф., Смит РД ва Шен Ю. Хроматографияи моеъи протеомии пешрафта. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Таркиби пешрафтаи протеин 液相色谱。Нигаред ба Ф., Смит РД ва Шен Ю. Хроматографияи моеъи протеомии пешрафта.Ҷ. Хроматография. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. ва дигарон. Хроматографияи пешрафтаи моеъ-спектрометрияи массавӣ қодир аст, ки метаболомикаи васеъ ва протеомикаро муттаҳид кунад. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, С.М. ва Салисбери, Ҷ.Ҷ. Нақши UHPLC дар рушди дорусозӣ. Чеснат, С.М. ва Салисбери, Ҷ.Ҷ. Нақши UHPLC дар рушди дорусозӣ.Чеснат, С.М. ва Салисбери, Ҷ.Ҷ. Нақши UHPLC дар рушди дорусозӣ.Чеснат, С.М. ва Салисбери, Ҷ.Ҷ. Нақши UHPLC дар таҳияи доруҳо. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Ву, Н. ва Клаузен, AM Ҷанбаҳои асосӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори ултрабаланд барои ҷудокунии зуд. Ву, Н. ва Клаузен, AM Ҷанбаҳои асосӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори ултрабаланд барои ҷудокунии зуд.Ву, Н. ва Клаузен, AM Ҷанбаҳои асосӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори баланд барои ҷудокунии босуръат. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Ву, Н. ва Клаузен, А.М. Ҷанбаҳои асосӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори ултра баланд барои ҷудокунии босуръат.Ву, Н. ва Клаузен, AM Ҷанбаҳои асосӣ ва амалии хроматографияи моеъи фишори баланд барои ҷудокунии босуръат.J. Sep. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. ва Челитчефф, П. Истифодаи хроматографияи моеъи ултрасамаранок дар таҳияи дорусозӣ. Рен, С.А. ва Челитчефф, П. Истифодаи хроматографияи моеъи ултрасамаранок дар таҳияи дорусозӣ.Рен, SA ва Челишефф, П. Истифодаи хроматографияи моеъи ултра-баландсифат дар таҳияи дорусозӣ. Wren, SA & Tchelicheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Рен, SA ва Челитчефф, П.Рен, SA ва Челишефф, П. Татбиқи хроматографияи моеъи ултрасамаранок дар таҳияи доруворӣ.Ҷ. Хроматография. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. ва дигарон. Гидрогели макросӯрохии монолитӣ, ки аз эмульсияи равған дар об бо фазаи баланди дохилӣ барои тозакунии самараноки энтеровирус 71 гирифта шудааст. Лоиҳаи кимиёвӣ. Маҷаллаи 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. ва Вилкинс, ҶА Нақши хроматографияи моеъ дар протеомика. Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. ва Вилкинс, ҶА Нақши хроматографияи моеъ дар протеомика.Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. ва Вилкинс, Ҷ.А. Нақши хроматографияи моеъ дар протеомика. Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. & Уилкинс, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С ва Вилкинс, Ҷ.АШи, Ю., Сян, Р., Хорват, С. ва Вилкинс, Ҷ.А. Нақши хроматографияи моеъ дар протеомика.Ҷ. Хроматография. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вутей, Ҷ.-Л. & Гилларм, Д. Тамоюлҳои нав дар ҷудокунии хроматографии моеъи фазаи баръакси пептидҳо ва сафедаҳои терапевтӣ: Назария ва татбиқҳо. & Гилларм, Д. Тамоюлҳои нав дар ҷудокунии хроматографии моеъи фазаи баръакси пептидҳо ва сафедаҳои терапевтӣ: Назария ва татбиқҳо. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов ва белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория ва приложения. & Гилларм, Д. Тамоюлҳои нав дар ҷудо кардани пептидҳо ва сафедаҳои терапевтӣ тавассути хроматографияи моеъи фазаи баръакс: назария ва татбиқҳо. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 ва Гилярм, Д.ва Гилларме, Д. Тамоюлҳои нав дар ҷудо кардани пептидҳо ва сафедаҳои терапевтӣ тавассути хроматографияи моеъи фазаи баръакс: назария ва татбиқҳо.J. Pharm. Илми биотиббӣ. анус. 69, 9–27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дэйли, А.Э. ва Геблер, Ҷ.К. Ҷудокунии дученакаи пептидҳо бо истифода аз системаи RP-RP-HPLC бо рН-и гуногун дар андозаҳои ҷудокунии якум ва дуюм. Гилар, М., Оливова, П., Дэйли, А.Э. ва Геблер, Ҷ.К. Ҷудокунии дученакаи пептидҳо бо истифода аз системаи RP-RP-HPLC бо рН-и гуногун дар андозаҳои ҷудокунии якум ва дуюм.Гилар М., Оливова П., Дали А.Е. ва Геблер Ҷ.К. Ҷудокунии дученакаи пептидҳо бо истифода аз системаи RP-RP-HPLC бо рН-и гуногун дар андозаҳои якум ва дуюми ҷудокунӣ.Гилар М., Оливова П., Дали А.Е. ва Геблер Ҷ.К. Ҷудокунии дученакаи пептидҳо бо истифода аз арзишҳои гуногуни рН дар андозаҳои якум ва дуюми ҷудокунӣ бо истифода аз системаи RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Феллитти, С. ва дигарон. Таҳқиқоти интиқоли масса ва хусусиятҳои кинетикии сутунҳои хроматографияи баландсифат, ки бо зарраҳои пурра сӯрохдор ва сатҳӣ сӯрохдори C18 хурдтар аз 2 мкм пур карда шудаанд. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Пиовесана, С. ва дигарон. Тамоюлҳои охирин ва мушкилоти таҳлилӣ дар ҷудокунӣ, муайянкунӣ ва тасдиқи пептидҳои биоактивии растанӣ. анус. Махлуқи аналӣ. Кимиёвӣ. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Ҷ.Б. ва дигарон. Манзараи протеомикии салтанати ҳаёт. Табиат 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
Де Лука, К. ва дигарон. Табобати пас аз пептидҳои терапевтӣ бо истифода аз хроматографияи моеъи тайёрӣ. Молекулаҳо (Базел, Швейтсария) 26(15), 4688 (2021).
Янг, Ю. ва Генг, Х. Хроматографияи режими омехта ва татбиқи он ба биополимерҳо. Янг, Ю. ва Генг, Х. Хроматографияи режими омехта ва татбиқи он ба биополимерҳо.Янг, Ю. ва Генг, Х. Хроматографияи режими омехта ва татбиқи он ба биополимерҳо. Янг, Ю. & Генг, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Янг, Ю. ва Генг, Х. Хроматографияи режими омехта ва татбиқи он дар биополимерҳо.Янг, Ю. ва Ҷин, Х. Хроматографияи режими омехта ва татбиқи он ба биополимерҳо.Ҷ. Хроматография. A 1218(49), 8813–8825 (2011).