Asante kwa kutembelea Nature.com. Unatumia toleo la kivinjari lenye uwezo mdogo wa kutumia CSS. Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Upatanifu katika Internet Explorer). Kwa kuongeza, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Huonyesha jukwa la slaidi tatu kwa wakati mmoja. Tumia vitufe vilivyotangulia na Vifuatavyo ili kupitia slaidi tatu kwa wakati mmoja, au tumia vitufe vya kutelezesha vilivyo mwishoni ili kupitia slaidi tatu kwa wakati mmoja.
Chembe za silika zenye vinyweleo zilitayarishwa kwa njia ya sol-gel na marekebisho kadhaa ili kupata chembe za pore pana. Chembechembe hizi zilitolewa na N-phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate (PMI) na styrene kupitia upolimishaji wa uhamishaji wa mnyororo wa kinyume (RAFT) ili kutoa poliamidi zilizounganishwa za N-phenylmaleimide. Styrene (PMP) awamu ya stationary. Nguzo nyembamba za chuma cha pua (kipenyo cha ndani cha 100 × 1.8 mm) zilipakiwa na pakiti ya tope. Utendaji wa kromatografia wa safu ya PMP ulitathminiwa ili kutenganisha mchanganyiko wa peptidi za synthetic zinazojumuisha peptidi tano (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amino acid enkephalin) na tryptic ya humanS hydrolyzant album. Chini ya hali bora ya uboreshaji, idadi ya kinadharia ya sahani zilizo na mchanganyiko wa peptidi ilifikia sahani 280,000 kwa sq.m. Ikilinganisha utendaji wa utengano wa safu iliyoendelezwa na safu ya kibiashara ya Ascentis Express RP-Amide, ilionekana kuwa ufanisi wa utengano wa safu ya PMP ulikuwa bora kuliko safu ya kibiashara katika suala la ufanisi wa kutenganisha na azimio.
Sekta ya dawa ya kibayolojia imekuwa soko la kimataifa linalopanuka na ongezeko kubwa la sehemu ya soko katika miaka ya hivi karibuni. Pamoja na kukua kwa kasi kwa tasnia ya dawa ya kibayolojia1,2,3 kuna hitaji kubwa la uchanganuzi wa peptidi na protini. Mbali na peptidi inayolengwa, uchafu mbalimbali huundwa wakati wa usanisi wa peptidi, hivyo utakaso wa kromatografia unahitajika ili kupata usafi unaohitajika wa peptidi. Uchambuzi na uainishaji wa protini katika vimiminika vya mwili, tishu na seli ni kazi yenye changamoto nyingi kutokana na idadi kubwa ya spishi zinazoweza kutambulika zilizopo katika sampuli moja. Ingawa spectrometry ya wingi ni zana bora ya kupanga peptidi na protini, ikiwa sampuli kama hizo zitaletwa moja kwa moja kwenye spectrometa ya wingi, utengano hautakuwa wa kuridhisha. Tatizo hili linaweza kutatuliwa kwa kufanya chromatography ya kioevu (LC) kabla ya uchambuzi wa MS, ambayo itapunguza kiasi cha wachambuzi wanaoingia kwenye spectrometer ya molekuli kwa wakati fulani4,5,6. Kwa kuongeza, wachambuzi wanaweza kuzingatia katika eneo nyembamba wakati wa kutenganisha awamu ya kioevu, na hivyo kuzingatia wachambuzi hawa na kuongeza unyeti wa kugundua MS. Kromatografia ya kioevu (LC) imeendelea sana katika muongo mmoja uliopita na imekuwa njia inayotumika sana kwa uchanganuzi wa proteomic7,8,9,10.
Kromatografia ya kioevu ya awamu ya kurudi nyuma (RP-LC) hutumiwa sana kusafisha na kutenganisha michanganyiko ya peptidi kwa kutumia silika iliyobadilishwa octadecyl (ODS) kama awamu ya tuli11,12,13. Hata hivyo, kutokana na muundo wao changamano na asili ya amphoteric, awamu za stationary 14,15 RP haziwezi kutoa utengano wa kuridhisha wa peptidi na protini. Kwa hiyo, uchanganuzi wa peptidi na protini zilizo na vipande vya polar na zisizo za polar unahitaji awamu maalum za stationary ili kuingiliana na kuhifadhi wachambuzi hawa16. Kromatografia iliyochanganywa, ambayo hutoa mwingiliano wa aina nyingi, inaweza kuwa mbadala wa RP-LC kwa kutenganisha peptidi, protini na michanganyiko mingine changamano. Awamu kadhaa zilizochanganywa za stationary zilitayarishwa na safu wima zilizojazwa na awamu hizi za kusimama zilitumiwa kutenganisha peptidi na protini17,18,19,20,21. Kwa sababu ya uwepo wa vikundi vya polar na visivyo vya polar, awamu za hali ya mchanganyiko (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, mwingiliano wa polar/RPLC) zinafaa kwa mgawanyo wa peptidi na protini22,23,24,25,26,27,28. , awamu za polar zilizoingiliana zilizo na vikundi vya polar vilivyounganishwa kwa ushirikiano huonyesha uwezo mzuri wa utengano na uteuzi wa kipekee kwa uchanganuzi wa polar na zisizo za polar kwa sababu utengano unategemea mwingiliano kati ya analyte na awamu ya stationary Mwingiliano wa Multimodal 29,30,31,32. Hivi karibuni, Zhang et al. 30 zilipata awamu za kusimama kwa behenyl zilizokomeshwa za polyamine na kutenganisha hidrokaboni kwa ufanisi, dawamfadhaiko, flavonoidi, nukleosidi, estrojeni, na vichanganuzi vingine. Nyenzo isiyosimama ya polar iliyopachikwa ina vikundi vya polar na visivyo vya polar, kwa hivyo inaweza kutumika kutenganisha peptidi na protini katika sehemu za haidrofobi na haidrofili. Safu wima za mstari wa polar (km, safu wima za C18 zilizo na mstari wa amide) zinapatikana chini ya jina la biashara safu wima za Ascentis Express RP-Amide, lakini safu wima hizi zimetumika tu kwa uchanganuzi wa amini 33.
Katika utafiti wa sasa, awamu ya upachikaji ya polar (N-phenylmaleimide, kupachika polystyrene) ilitayarishwa na kutathminiwa kwa utenganisho wa peptidi na mpasuko wa tryptic HSA. Mkakati ufuatao ulitumika kuandaa awamu ya kusimama. Vipande vya silika vya porous vilitayarishwa kulingana na taratibu zilizoelezwa katika machapisho yetu ya awali, na baadhi ya mabadiliko katika mipango ya maandalizi 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Uwiano wa urea, polyethilini glycol (PEG), TMOS na asidi ya maji-acetic ilirekebishwa ili kupata chembe kubwa za silika na ukubwa wa silika. Pili, ligand mpya ya phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate iliundwa na chembe zake za silika zilizotolewa zilitumiwa kuandaa awamu za stationary zilizopachikwa za polar. Awamu ya kusimama iliyopatikana ilipakiwa kwenye safu ya chuma cha pua (kipenyo cha ndani 100 × 1.8 mm) kulingana na mpango ulioboreshwa wa kufunga. Ufungashaji wa safu unasaidiwa na vibration ya mitambo ili kuhakikisha safu ya sare ndani ya safu. Safu iliyojaa ilitathminiwa kwa ajili ya kutenganishwa kwa mchanganyiko wa peptidi zinazojumuisha peptidi tano (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin peptidi). na hydrolysates ya tryptic ya albin ya seramu ya binadamu (HSA). Ilibainika kuwa mchanganyiko wa peptidi na mmeng'enyo wa tryptic wa HSA vilitenganishwa kwa azimio na ufanisi mzuri. Ufanisi wa utengano wa safu ya PMP ulilinganishwa na ule wa safu ya Ascentis Express RP-Amide. Ilionekana kuwa peptidi na protini zina azimio nzuri na ufanisi wa juu wa kujitenga kwenye safu ya PMP, na ufanisi wa utengano wa safu ya PMP ni wa juu zaidi kuliko safu ya Ascentis Express RP-Amide.
Kigingi (polyethilini glikoli), urea, asidi asetiki, trimethoxyorthosilicate (TMOS), trimethoxyorthosilicate (TMCS), trypsin, albin ya serum ya binadamu (HSA), kloridi ya ammoniamu, urea, hexamethylmethacryloyldisilazane (HMDS), methacryloyl kloridi, hydrostyrene, TPO, EM4 (BPO), asetonitrile (ACN) kwa HPLC, methanoli, 2-propanol na asetoni. Kampuni ya Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).
Mchanganyiko wa urea (8 g), polyethilini glikoli (8 g) na 8 ml ya asidi asetiki 0.01 N. ilichochewa kwa dakika 10, na 24 ml ya TMOS iliongezwa hapo chini ya baridi ya barafu. Mchanganyiko wa mmenyuko ulipashwa joto kwa 40 ° C kwa saa 6 na kisha saa 120 ° C kwa saa 8 katika autoclave ya chuma cha pua. Maji yalipunguzwa na mabaki yalikaushwa kwa 70 ° C kwa masaa 12. Vitalu vya laini vilivyokaushwa vilisagwa vizuri na kukaushwa katika oveni ifikapo 550°C kwa masaa 12. Vikundi vitatu vilitayarishwa na kuainishwa ili kujaribu kuzaliana kwa ukubwa wa chembe, saizi ya vinyweleo na eneo la uso.
Kikundi cha polar na awamu ya stationary kwa minyororo ya polystyrene. Utaratibu wa maandalizi umeelezwa hapa chini.
N-phenylmaleimide (200 mg) na methyl vinyl isocyanate (100 mg) ziliyeyushwa katika toluini isiyo na maji, na kisha 0.1 ml ya 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) iliongezwa kwenye chupa ya majibu ili kupata copolymer ya phenylmaleimide na vinyl vinyl isosocyanate (PM). ) Mchanganyiko huo umewashwa kwa joto la 60 ° C kwa saa 3, kuchujwa na kukaushwa katika tanuri ya 40 ° C kwa saa 3.
Chembe za silika zilizokaushwa (2 g) hutawanywa katika toluini kavu (100 ml), zikiwa zimechochewa na sonicated kwa dakika 10 kwenye chupa ya chini ya 500 ml. PMCP (miligramu 10) iliyeyushwa katika toluini na kuongezwa kwa kushuka kwa chupa ya majibu kupitia faneli ya kuongeza. Mchanganyiko huo ulirudishwa kwa 100 ° C kwa masaa 8, kuchujwa, kuosha na asetoni na kukaushwa kwa 60 ° C kwa saa 3. Kisha, chembe za silika zinazohusiana na PMCP (100 g) ziliyeyushwa katika toluini (200 ml), na 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) iliongezwa hapo mbele ya 100 μl ya dibutyltin dilaurate kama kichocheo. Mchanganyiko huo ulichochewa kwa 50 ° C kwa masaa 8, kuchujwa na kukaushwa kwa 50 ° C kwa masaa 3.
Styrene (1 ml), peroxide ya benzoli BPO (0.5 ml) na chembe za silika zilizounganishwa na TEMPO-PMCP (1.5 g) zilitawanywa katika toluini na kusafishwa kwa nitrojeni. Upolimishaji wa styrene ulifanyika kwa 100 ° C kwa masaa 12. Bidhaa iliyosababishwa ilioshwa na methanoli na kukaushwa usiku kucha kwa 60°C. Mpango wa jumla wa majibu unaonyeshwa kwenye Mtini. moja.
Sampuli ziliondolewa gesi kwa 393 K kwa h 1 hadi shinikizo la mabaki la chini ya 10-3 Torr lilipatikana. Kiasi cha N2 kilichotangazwa kwa shinikizo la jamaa P/P0 = 0.99 kilitumiwa kuamua jumla ya kiasi cha pore. Mofolojia ya chembe za silika safi na zilizofungamana na ligand ilichunguzwa kwa kutumia hadubini ya elektroni ya kuchanganua (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Sampuli za kavu (silica safi na chembe za silika zilizofungwa ligand) ziliwekwa kwenye fimbo za alumini kwa kutumia mkanda wa kaboni. Dhahabu iliwekwa kwenye sampuli kwa kutumia kifaa cha kunyunyiza cha Q150T, na safu ya Au ya nm 5 iliwekwa kwenye sampuli. Hii inaboresha ufanisi wa mchakato wa voltage ya chini na hutoa dawa nzuri ya baridi. Uchanganuzi wa kimsingi ulifanywa kwa kutumia kichanganuzi cha msingi cha utunzi cha Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Kichanganuzi cha ukubwa wa chembe cha Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 kilitumiwa kupata usambazaji wa saizi ya chembe. Uncoated silika chembe na ligand-amefungwa silika chembe (5 mg kila) walikuwa kutawanywa katika 5 ml ya isopropanol, sonicated kwa dakika 10, kuchafuka kwa dakika 5, na kuwekwa kwenye benchi Mastersizer macho. Uchunguzi wa Thermogravimetric unafanywa kwa kiwango cha 5 ° C kwa dakika katika kiwango cha joto kutoka 30 hadi 800 ° C.
Fiber ya kioo iliyo na safu nyembamba ya chuma cha pua yenye vipimo (ID 100 × 1.8 mm) ilipakiwa kwa njia ya kujaza tope kwa kufuata utaratibu sawa na katika marejeleo 31. Safu ya chuma cha pua (kioo kilichowekwa mstari, kitambulisho cha 100 × 1 .8 mm) na plagi iliyo na 1 µm fritter ya grit iliyounganishwa (Zote ziliunganishwa IL, Marekani). Tayarisha kusimamishwa kwa awamu ya stationary kwa kusimamisha 150 mg ya awamu ya stationary katika 1.2 ml ya methanoli na kulisha ndani ya safu ya hifadhi. Methanoli ilitumika kama kutengenezea tope na kutengenezea kudhibiti. Pakia safu kwa kutumia mlolongo wa shinikizo wa MP 100 kwa dakika 10, Mbunge 80 kwa dakika 15, na Mbunge 60 kwa dakika 30. Mchakato wa kufunga ulitumia vitetemeshi viwili vya safu wima ya kromatografia ya gesi (Alltech, Deerfield, IL, USA) kwa mtetemo wa kiufundi ili kuhakikisha ufungashaji wa safu wima sawa. Funga kifungashio cha tope na toa shinikizo polepole ili kuzuia uharibifu wa kamba. Safu ilikatwa kutoka kwa pua ya tope na kipengee kingine kiliambatishwa kwenye ingizo na kuunganishwa kwenye mfumo wa LC ili kujaribu utendakazi wake.
MLC maalum iliundwa kwa kutumia pampu ya LC (10AD Shimadzu, Japani), sampuli iliyo na kitanzi cha sindano ya nL 50 (Valco (Marekani) C14 W.05), kifaa cha kusafisha utando (Shimadzu DGU-14A), na dirisha la kapilari la UV-VIS. Kifaa cha detector (UV-2075) na safu ndogo ya enamelled. Tumia mirija nyembamba na fupi ya kuunganisha ili kupunguza athari ya upanuzi wa safu ya ziada. Baada ya kujaza safu, sakinisha kapilari (50 µm id 365) kwenye sehemu ya makutano ya kupunguza 1/16″ na usakinishe kapilari (50 µm) ya makutano ya kupunguza. Ukusanyaji wa data na usindikaji wa kromatogramu hufanywa kwa kutumia programu ya Multichro 2000. Katika nm 254, ufyonzaji wa UV wa vichanganuzi vya masomo ulifuatiliwa kwa 0. Data ya Chromatographic ilichanganuliwa kwa kutumia OriginPro8 (Northampton, MA).
Albamini ya seramu ya binadamu, poda ya lyophilized, ≥ 96% (electrophoresis ya gel ya agarose) 3 mg iliyochanganywa na trypsin (1.5 mg), urea 4.0 M (1 ml) na 0.2 M ammonium bicarbonate (1 ml) . Suluhisho lilichochewa kwa dakika 10 na kuwekwa katika umwagaji wa maji kwa 37 ° C kwa h 6, kisha kuzimwa na 1 ml ya 0.1% TFA. Chuja suluhisho na uhifadhi chini ya 4°C.
Mgawanyo wa mchanganyiko wa peptidi na tryptic digest HSA kwenye safu ya PMP ilitathminiwa tofauti. Angalia hidrolisisi ya tryptic ya mchanganyiko wa peptidi na HSA ikitenganishwa na safu wima ya PMP na ulinganishe matokeo na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide. Idadi ya sahani za kinadharia huhesabiwa kwa kutumia equation ifuatayo:
Picha za SEM za chembe za silika safi na chembe za silika zilizounganishwa na ligand zimeonyeshwa kwenye Mchoro 2. Picha za SEM za chembe za silika safi (A, B) zinaonyesha umbo la duara ambalo chembe hizo zimerefushwa au zina ulinganifu usio wa kawaida ikilinganishwa na masomo yetu ya awali. Uso wa chembe za silika zilizofungwa na ligand (C, D) ni laini zaidi kuliko ile ya chembe za silika safi, ambayo inaweza kuwa kutokana na minyororo ya polystyrene inayofunika uso wa chembe za silika.
Inachanganua maikrografu za elektroni za chembe za silika safi (A, B) na chembe za silika zilizofungamana na ligand (C, D).
Usambazaji wa saizi ya chembe ya chembe za silika safi na chembe za silika zilizofungwa na ligand umeonyeshwa kwenye Mchoro 2. 3 (A). Volumetric particle kawaida usambazaji curves ilionyesha kuwa silika particle kawaida kuongezeka baada ya muundo kemikali (Mtini. 3A). Data ya usambazaji wa ukubwa wa chembe ya silika kutoka kwa utafiti wa sasa na utafiti wa awali unalinganishwa katika Jedwali 1(A). Ukubwa wa chembe d(0.5) wa PMP ulikuwa 3.36 µm, ikilinganishwa na thamani ya tangazo (0.5) ya 3.05 µm katika utafiti wetu wa awali (chembe za silika zilizounganishwa za polystyrene)34. Kutokana na mabadiliko katika uwiano wa PEG, urea, TMOS na asidi asetiki katika mchanganyiko wa mmenyuko, usambazaji wa ukubwa wa chembe za kundi hili ulikuwa mdogo ikilinganishwa na utafiti wetu wa awali. Ukubwa wa chembe ya awamu ya PMP ni kubwa kidogo kuliko ile ya awamu ya chembe ya silika iliyofungwa na polystyrene ambayo tulijifunza hapo awali. Hii ina maana kwamba utendakazi wa uso wa chembe za silika na styrene uliweka tu safu ya polystyrene (0.97 µm) kwenye uso wa silika, wakati katika awamu ya PMP unene wa safu ulikuwa 1.38 µm.
Usambazaji wa saizi ya chembe (A) na usambazaji wa saizi ya pore (B) ya chembe safi za silika na chembe za silika zilizounganishwa na ligand.
Saizi ya tundu, kiasi cha tundu, na eneo la uso la chembe za silika zilizotumika katika utafiti huu zimeonyeshwa katika Jedwali 1 (B). Profaili za PSD za chembe za silika safi na chembe za silika zilizofungwa na ligand zinaonyeshwa kwenye Mtini. 3 (B). Matokeo yalilinganishwa na utafiti wetu uliopita34. Saizi za pore za chembe za silika safi na zilizofungamana na ligand zilikuwa 310 Å na 241 Å, mtawaliwa, ikionyesha kuwa baada ya urekebishaji wa kemikali, saizi ya pore ilipungua kwa 69 Å, kama inavyoonyeshwa kwenye Jedwali 1 (B), na mzunguko wa mabadiliko umeonyeshwa kwenye Mtini. Sehemu maalum ya uso wa chembe za silika 1, ambayo ni 6 m2 ya somo la sasa la utafiti wetu (124 m2/g). Kama inavyoonyeshwa katika Jedwali 1(B), eneo la uso (m2/g) la chembe za silika baada ya urekebishaji wa kemikali pia lilipungua kutoka 116 m2/g hadi 105 m2/g.
Matokeo ya uchambuzi wa kimsingi wa awamu ya stationary yanawasilishwa kwenye Jedwali. 2. Maudhui ya kaboni ya awamu ya sasa ya stationary ni 6.35%, ambayo ni ya chini kuliko katika utafiti wetu uliopita (chembe za silika zinazohusiana na polystyrene, 7.93% 35 na 10.21%, kwa mtiririko huo) 42. Maudhui ya kaboni ya awamu ya sasa ya stationary hapa chini, kwa kuwa baadhi ya ligandi za polar kama vile phenylmaleimide methyl-POPC zimetumika hydroxy-hydroxyMP. pamoja na styrene katika maandalizi ya SP. Asilimia ya uzito wa nitrojeni katika awamu ya sasa ya kusimama ni 2.21% ikilinganishwa na 0.1735 na 0.85% katika masomo ya awali42. Hii ina maana kwamba awamu ya sasa ya stationary ina asilimia kubwa ya uzito wa nitrojeni kutokana na phenylmaleimide. Vile vile, bidhaa (4) na (5) zina maudhui ya kaboni ya 2.7% na 2.9%, kwa mtiririko huo, wakati bidhaa ya mwisho (6) ina maudhui ya kaboni ya 6.35%, kama inavyoonyeshwa katika Jedwali la 2. Uchambuzi wa Thermogravimetric (TGA) ulitumiwa kwenye awamu ya stationary ya PMP kupima kupoteza uzito, na TGA Figure ya TGA inaonyesha kupoteza uzito. 8.6%, ambayo inakubaliana vizuri na maudhui ya kaboni (6.35%), kwani ligand hazina C tu, bali pia N, O na H.
Ligand phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate ilichaguliwa kurekebisha uso wa chembe za silika kwa sababu ya makundi yake ya polar phenylmaleimide na vinylisocyanate. Vikundi vya isosianati vya vinyl vinaweza kuguswa zaidi na styrene kwa kuishi upolimishaji mkali. Sababu ya pili ni kuingiza kikundi ambacho kina mwingiliano wa wastani na kichanganuzi na kisicho na mwingiliano mkali wa kielektroniki kati ya kichanganuzi na awamu ya tuli, kwa kuwa sehemu ya phenylmaleimide haina chaji pepe katika pH ya kawaida. Polarity ya awamu ya tuli inaweza kudhibitiwa na kiasi bora cha styrene na wakati wa majibu ya upolimishaji wa bure wa radical. Hatua ya mwisho ya mmenyuko (upolimishaji wa radical bure) ni muhimu kwani inabadilisha polarity ya awamu ya kusimama. Uchanganuzi wa kimsingi ulifanywa ili kuangalia yaliyomo kwenye kaboni katika awamu hizi za kusimama. Imeonekana kuwa kuongeza kiasi cha styrene na wakati wa majibu huongeza maudhui ya kaboni ya awamu ya stationary na kinyume chake. SP zilizoandaliwa na viwango tofauti vya styrene zina mizigo tofauti ya kaboni. Vile vile, awamu hizi za kusimama ziliwekwa kwenye nguzo za chuma cha pua na sifa zao za chromatografia (uteuzi, azimio, thamani ya N, nk) ziliangaliwa. Kulingana na majaribio haya, muundo ulioboreshwa kwa ajili ya maandalizi ya awamu ya kusimama ya PMP ulichaguliwa ili kutoa polarity iliyodhibitiwa na uhifadhi mzuri wa uchanganuzi.
Safu ya PMP pia ilitathminiwa kwa uchanganuzi wa michanganyiko mitano ya peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) kwa kutumia uwezo wa awamu ya simu. 60/40 (v/v) ACN/maji (0.1% TFA) kwa kiwango cha mtiririko wa 80 µl/min. Chini ya hali bora zaidi za kufichua (vibao 200,000/m), idadi ya bati za kinadharia (N) kwa kila safu (100 × 1.8 mm) ni 20,000 ± 100. Thamani za N za safu wima tatu za PMP zinaonyeshwa katika Jedwali la 3 na kromatogramu zinaonyeshwa kwenye Mchoro 5A. Uchanganuzi wa haraka katika kiwango cha juu cha mtiririko (700 µl/min) kwenye safu wima ya PMP, peptidi tano hazijapatikana ndani ya dakika moja, thamani bora ya N ya 13,500 ± 330 kwa kila safu (kipenyo cha mm 100 x 1.8), sawa na sahani 135,000/m (Kielelezo 5B). Safu wima tatu za ukubwa sawa (kipenyo cha ndani cha 100 x 1.8 mm) zilijazwa na beti tatu tofauti za awamu ya kusimama ya PMP ili kupima uwezo wa kuzalisha tena. Vichanganuzi vilirekodiwa kwa kila safu kwa kutenganisha mchanganyiko sawa wa majaribio kwenye kila safu kwa kutumia hali bora zaidi za kufichua, idadi ya vibao vya kinadharia N, na muda wa kubaki. Data ya uzalishaji tena wa safu wima za PMP imeonyeshwa katika Jedwali la 4. Uzalishaji upya wa safu wima ya PMP ulihusiana vyema na thamani za chini sana za %RSD kama inavyoonyeshwa katika Jedwali la 3.
Mgawanyo wa mchanganyiko wa peptidi kwenye safu wima ya PMP (B) na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide (A), awamu ya rununu 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), vipimo vya safu wima ya PMP ( kitambulisho cha 100 x 1.8 mm) , uchambuzi Mpangilio wa Elution wa misombo: 1 (Gly-Tyr-Tyr), 2 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) na 5 ( leucic acid enkephalin).
Safu ya PMP (kipenyo cha ndani 100 x 1.8 mm) ilitathminiwa kwa ajili ya kutenganishwa kwa hidrolisisi ya tryptic ya albin ya seramu ya binadamu na HPLC. Chromatogram katika Mchoro 6 inaonyesha kwamba sampuli zimetenganishwa vizuri na azimio nzuri sana. Suluhu za HSA zilichambuliwa kwa kutumia kiwango cha mtiririko wa 100 μl/min, awamu ya rununu ya 70/30 asetonitrile/maji na 0.1% TFA. Cleavage ya HSA iligawanywa katika vilele 17, kama inavyoonekana katika chromatogram (Mtini. 6), sambamba na 17 peptides. Ufanisi wa mgawanyo wa vilele vya mtu binafsi kutoka kwa hidrolizati ya HSA ulihesabiwa na maadili yanaonyeshwa katika Jedwali la 5.
HSA tryptic hidrolisisi zilitenganishwa kwenye safu wima ya PMP (kipenyo cha ndani 100 x 1.8 mm), kiwango cha mtiririko (100 μl/min), awamu ya rununu 60/40 asetonitrili/maji, na 0.1% TFA.
ambapo L ni urefu wa safu, η ni mnato wa awamu ya simu, ΔP ni shinikizo la nyuma la safu, na u ni kasi ya mstari wa awamu ya simu. Upenyezaji wa safu ya PMP ulikuwa 2.5 × 10-14 m2, kiwango cha mtiririko kilikuwa 25 µl/min, 60/40 v/v ilitumika. ACN/maji. Upenyezaji wa safu wima ya PMP (ID 100 × 1.8 mm) ulikuwa sawa na ule wa utafiti wetu wa awali wa Ref.34. Upenyezaji wa safu iliyojazwa na chembe chembe za vinyweleo vya juu juu ni 1.7×10 .6 µm, 2.5×10-14 m2 kwa chembe 5 µm43. Kwa hiyo, upenyezaji wa awamu ya PMP ni sawa na upenyezaji wa chembe za msingi za shell na ukubwa wa 5 μm.
ambapo Wx ni wingi wa safu iliyojazwa klorofomu, Wy ni wingi wa safu iliyojazwa na methanoli, na ρ ni msongamano wa kiyeyusho. Msongamano wa methanoli (ρ = 0.7866) na kloroform (ρ = 1.484). Jumla ya uthabiti wa safu wima ya silika-C18 (ID 100 × 1.8 mm)34 na safu yetu iliyosomwa hapo awali ya C18-urea31 ilikuwa 0.63 na 0.55, mtawalia. Hii ina maana kwamba kuwepo kwa ligand za urea hupunguza upenyezaji wa awamu ya stationary. Kwa upande mwingine, jumla ya porosity ya safu ya PMP (kipenyo cha ndani 100 × 1.8 mm) ni 0.60. Nguzo za PMP hazipenyekeki kuliko safu wima zilizopakiwa na chembechembe za silika zilizofungamana na C18 kwa sababu katika awamu za kusimama za aina ya C18 ligandi za C18 huunganishwa kwenye chembe za silika katika minyororo ya mstari, huku katika awamu za kusimama za aina ya polystyrene polima nene kiasi huundwa kuzunguka chembe. safu A. Katika jaribio la kawaida, uthabiti wa safu wima huhesabiwa kama ifuatavyo:
Kwenye mtini. 7A, B inaonyesha viwanja vya Van Deemter vya safu wima ya PMP (id 100 x 1.8 mm) na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1.8 mm) chini ya hali sawa za uboreshaji, 60/40 ACN/H2O na 0 .1% TFA 20 µl/min kwa safu wima 80min hadi 80min. Thamani za chini kabisa za HETP katika kiwango bora cha mtiririko (80 µl/min) zilikuwa 2.6 µm na 3.9 µm kwa safu wima ya PMP na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide, mtawalia. Thamani za HETP zinaonyesha kuwa ufanisi wa utengano wa safu wima ya PMP (kitambulisho cha 100 x 1.8 mm) ni wa juu zaidi kuliko safu wima ya Ascentis Express RP-Amide inayouzwa kibiashara (kitambulisho cha 100 x 1.8 mm). Grafu ya van Deemter katika Kielelezo 7 (A) inaonyesha kuwa kupungua kwa thamani ya N sio juu sana na kuongezeka kwa mtiririko ikilinganishwa na utafiti wetu wa awali. Ufanisi wa juu wa utenganishaji wa safu wima ya PMP (id 100 × 1.8 mm) ikilinganishwa na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide inategemea umbo na ukubwa wa chembe ulioboreshwa na utaratibu wa kisasa wa kufunga safu unaotumiwa katika kazi ya sasa34.
(A) Van Deemter plot (HETP dhidi ya kasi ya mstari wa awamu ya simu) iliyopatikana kwenye safu wima ya PMP (id 100 x 1.8 mm) katika 60/40 ACN/H2O yenye 0.1% TFA. (B) Mpango wa Van Deemter (HETP dhidi ya kasi ya mstari wa awamu ya simu) uliopatikana kwenye safu wima ya Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1.8 mm) katika 60/40 ACN/H2O yenye 0.1% TFA.
Awamu ya polar iliyosimama ya polistyrene iliyounganishwa ilitayarishwa na kutathminiwa kwa ajili ya kutenganisha mchanganyiko wa peptidi sanisi na hidrolisisi ya tryptic ya albin ya seramu ya binadamu (HSA) katika kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu. Utendaji wa kromatografia wa safu wima za PMP kwa michanganyiko ya peptidi ni bora katika suala la ufanisi wa utengano na azimio. Ufanisi ulioboreshwa wa utenganisho wa nguzo za PMP unatokana na sababu kadhaa kama vile ukubwa wa chembe ya silika na saizi ya tundu, usanisi unaodhibitiwa wa awamu zisizosimama, na nyenzo changamano za upakiaji. Mbali na ufanisi wa juu wa kujitenga, faida nyingine ya awamu hii ya kusimama ni shinikizo la chini la safu ya nyuma katika viwango vya juu vya mtiririko. Nguzo za PMP zinaweza kuzaliana sana na zinaweza kutumika kuchanganua michanganyiko ya peptidi na usagaji wa tryptic wa protini mbalimbali. Tuna nia ya kutumia safu hii kwa kutenganisha misombo ya bioactive kutoka kwa bidhaa za asili, dondoo za mimea ya dawa na uyoga katika chromatography ya kioevu. Katika siku zijazo, safu wima za PMP pia zitatathminiwa kwa ajili ya kutenganisha protini na kingamwili za monokloni.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Uchunguzi wa mifumo ya utenganishaji ya peptidi ya awamu ya kromatografia sehemu ya I: Uundaji wa itifaki ya uainishaji wa safu wima. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Uchunguzi katika mifumo ya utenganishaji ya peptidi ya awamu ya kromatografia sehemu ya I: Uundaji wa itifaki ya uainishaji wa safu wima.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., na Petersson, P. Uchunguzi wa Mifumo ya Kutenganisha Peptidi kwa Kromatografia ya Awamu ya Nyuma, Sehemu ya I: Kutengeneza Itifaki ya Uainishaji wa Safu wima. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Uchunguzi wa mifumo ya utenganishaji ya peptidi ya awamu ya kromatografia sehemu ya I: Uundaji wa itifaki ya sifa za safuwima. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Uchunguzi wa mifumo ya utenganishaji ya peptidi ya awamu ya kromatografia sehemu ya I: Uundaji wa itifaki ya sifa za safuwima.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., na Petersson, P. Uchunguzi wa Mifumo ya Kutenganisha Peptidi kwa Kromatografia ya Awamu ya Nyuma, Sehemu ya I: Kutengeneza Itifaki ya Uainishaji wa Safu wima.J.色谱法。 1603,113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. na wenzake. Njia za kuunda peptidi zilizoboreshwa kwa matibabu ya magonjwa ya kuambukiza. Bayoteknolojia. Mafanikio 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptidi za matibabu ya syntetisk: Sayansi na soko. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptidi za matibabu ya syntetisk: Sayansi na soko.Vliege P, Lisowski V, Martinez J na Chreschatyski M. Peptidi za matibabu ya Synthetic: sayansi na soko.Vliege P, Lisowski V, Martinez J na Khreschatsky M. Peptidi za matibabu ya synthetic: sayansi na soko. ugunduzi wa dawa. Leo 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografia ya kioevu ya protini ya juu. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografia ya kioevu ya protini ya juu.Tazama F., Smith RD na Shen Yu. Kromatografia ya kioevu ya protini ya juu. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Muundo wa juu wa protini 液相色谱.Tazama F., Smith RD na Shen Yu. Kromatografia ya kioevu ya protini ya juu.J. Chromatografia. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. na wengine. Kioevu cha hali ya juu cha kromatografia-mass spectrometry ina uwezo wa kuchanganya metabolomiki pana na proteomics. mkundu. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Jukumu la UHPLC katika ukuzaji wa dawa. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Jukumu la UHPLC katika ukuzaji wa dawa.Chesnut, SM na Salisbury, JJ Jukumu la UHPLC katika ukuzaji wa dawa.Chesnut, SM na Salisbury, JJ Jukumu la UHPLC katika ukuzaji wa dawa za kulevya. J. Septemba Sayansi. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Vipengele vya kimsingi na vya vitendo vya kromatografia ya kioevu ya shinikizo la juu kwa utengano wa haraka. Wu, N. & Clausen, AM Vipengele vya kimsingi na vya vitendo vya kromatografia ya kioevu ya shinikizo la juu kwa utengano wa haraka.Wu, N. na Clausen, AM Vipengele vya kimsingi na vya vitendo vya kromatografia ya kioevu ya shinikizo la juu kwa utengano wa haraka. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面. Wu, N. & Clausen, AM Vipengele vya kimsingi na vya vitendo vya kromatografia ya kioevu ya shinikizo la juu kwa utengano wa haraka.Wu, N. na Clausen, AM Vipengele vya kimsingi na vya vitendo vya kromatografia ya kioevu ya shinikizo la juu kwa utengano wa haraka.Sayansi ya J. Septemba. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitchef, P. Matumizi ya kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa hali ya juu katika maendeleo ya dawa. Wren, SA & Tchelitchef, P. Matumizi ya kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa hali ya juu katika maendeleo ya dawa.Ren, SA na Chelischeff, P. Matumizi ya kromatografia ya kioevu ya utendaji wa juu katika ukuzaji wa dawa. Wren, SA & Tchelitchef, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelitchef, P.Ren, SA na Chelischeff, P. Utumiaji wa kromatografia ya kioevu inayofanya kazi zaidi katika ukuzaji wa dawa.J. Chromatografia. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. na wenzake. Hydrogel monolithic macroporous inayotokana na emulsion ya mafuta ya maji na awamu ya juu ya ndani kwa ajili ya utakaso wa ufanisi wa enterovirus 71. Kemikali. mradi. Jarida 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Jukumu la kromatografia ya kioevu katika proteomics. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Jukumu la kromatografia ya kioevu katika proteomics.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. na Wilkins, JA Jukumu la kromatografia ya kioevu katika proteomics. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. na Wilkins, JA Jukumu la kromatografia ya kioevu katika proteomics.J. Chromatografia. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Mitindo mipya ya utenganisho wa kromatografia ya awamu ya kioevu ya peptidi na protini za matibabu: Nadharia na matumizi. & Guillarme, D. Mitindo mipya ya utenganisho wa kromatografia ya awamu ya kioevu ya peptidi na protini za matibabu: Nadharia na matumizi. & Guillarme, D. Новые тенденции katika разделении терапевтических пептидов na белков с помощью жидкостной хроматографии с обратевтических пептидов na белков с помощью жидкостной хроматографии с обратевтических пептидов. & Guillarme, D. Mitindo mipya ya utenganishaji wa peptidi za matibabu na protini kwa kromatografia ya kioevu ya awamu: nadharia na matumizi. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理质和应用. na Guillarme, D.na Guillarmé, D. Mitindo mipya ya utenganisho wa peptidi za matibabu na protini kwa kromatografia ya kioevu ya awamu: nadharia na matumizi.J. Pharm. Sayansi ya Biomedical. mkundu. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Mgawanyo wa pande mbili wa peptidi kwa kutumia mfumo wa RP-RP-HPLC wenye pH tofauti katika vipimo vya utengano wa kwanza na wa pili. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Mgawanyo wa pande mbili wa peptidi kwa kutumia mfumo wa RP-RP-HPLC wenye pH tofauti katika vipimo vya utengano wa kwanza na wa pili.Gilar M., Olivova P., Dali AE na Gebler JK Mgawanyo wa pande mbili wa peptidi kwa kutumia mfumo wa RP-RP-HPLC wenye pH tofauti katika vipimo vya utengano wa kwanza na wa pili.Gilar M., Olivova P., Dali AE na Gebler JK Mgawanyiko wa pande mbili wa peptidi kwa kutumia maadili tofauti ya pH katika vipimo vya utenganisho wa kwanza na wa pili kwa kutumia mfumo wa RP-RP-HPLC. J. Septemba Sayansi. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Uchunguzi wa uhamishaji mkubwa na sifa za kinetiki za safu wima za kromatografia ya utendakazi wa hali ya juu zilizopakiwa na chembe chembe za C18 zenye vinyweleo kamili na zenye upenyo wa juu juu chini ya 2 µm. J. Septemba Sayansi. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Mitindo ya hivi majuzi na changamoto za uchanganuzi katika utengaji, utambulisho na uthibitishaji wa peptidi amilifu za mimea. mkundu. Mkundu wa kiumbe. Kemikali. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB na wenzake. Mazingira ya Proteomic ya ufalme wa maisha. Asili 582 (7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Matibabu ya baada ya peptidi za matibabu kwa kromatografia ya kioevu ya maandalizi. Molekuli (Basel, Uswizi) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia ya hali-mseto na matumizi yake kwa biopolima. Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia ya hali-mseto na matumizi yake kwa biopolima.Yang, Yu. na Geng, X. Kromatografia ya modi mchanganyiko na matumizi yake kwa biopolima. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia ya modi mchanganyiko na matumizi yake katika biopolima.Yang, Yu. na Gene, X. Kromatografia ya modi mchanganyiko na matumizi yake kwa biopolima.J. Chromatografia. A 1218(49), 8813–8825 (2011).