Asante kwa kutembelea Nature.com. Unatumia toleo la kivinjari lenye usaidizi mdogo wa CSS. Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Utangamano katika Internet Explorer). Zaidi ya hayo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tunaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Huonyesha mzunguko wa slaidi tatu kwa wakati mmoja. Tumia vitufe vya Iliyotangulia na Inayofuata ili kupitia slaidi tatu kwa wakati mmoja, au tumia vitufe vya kutelezesha mwishoni ili kupitia slaidi tatu kwa wakati mmoja.
Chembe za silika zenye vinyweleo vilitayarishwa kwa njia ya sol-gel pamoja na marekebisho kadhaa ili kupata chembe zenye vinyweleo vipana. Chembe hizi zilitokana na N-phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate (PMI) na styrene kupitia upolimishaji wa uhamisho-mgawanyiko wa mnyororo wa nyuma (RAFT) ili kutoa poliamidi zilizounganishwa za N-phenylmaleimide. Awamu ya styrene (PMP) isiyobadilika. Nguzo nyembamba za chuma cha pua (kipenyo cha ndani cha 100 × 1.8 mm) zilijazwa na kifungashio cha tope. Utendaji wa kromatografia wa safu ya PMP ulipimwa ili kutenganisha mchanganyiko wa peptidi za sintetiki zenye peptidi tano (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amino acid enkephalin) na tryptic hydrolyzate ya serum albumin ya binadamu (HAS). Chini ya hali bora za utatuzi, idadi ya kinadharia ya sahani zenye mchanganyiko wa peptidi ilifikia sahani 280,000/mita za mraba. Kwa kulinganisha utendaji wa utengano wa safu iliyotengenezwa na safu ya kibiashara ya Ascentis Express RP-Amide, ilibainika kuwa ufanisi wa utengano wa safu ya PMP ulikuwa bora kuliko safu ya kibiashara kwa upande wa ufanisi na utatuzi wa utengano.
Sekta ya biofarmaceutical imekuwa soko linalopanuka duniani kote likiwa na ongezeko kubwa la hisa ya soko katika miaka ya hivi karibuni. Kwa ukuaji mkubwa wa tasnia ya biofarmaceutical1,2,3 kuna hitaji kubwa la uchambuzi wa peptidi na protini. Mbali na peptidi lengwa, uchafu mbalimbali huundwa wakati wa usanisi wa peptidi, kwa hivyo utakaso wa kromatografia unahitajika ili kupata usafi unaohitajika wa peptidi. Uchambuzi na uainishaji wa protini katika majimaji ya mwili, tishu, na seli ni kazi ngumu sana kutokana na idadi kubwa ya spishi zinazoweza kugunduliwa zilizopo katika sampuli moja. Ingawa spektrometri ya wingi ni zana bora ya kupanga peptidi na protini, ikiwa sampuli hizo zitaingizwa moja kwa moja kwenye spektrometri ya wingi, utengano hautakuwa wa kuridhisha. Tatizo hili linaweza kutatuliwa kwa kufanya kromatografia ya kioevu (LC) kabla ya uchambuzi wa MS, ambao utapunguza kiasi cha uchanganuzi unaoingia kwenye spektrometri ya wingi kwa wakati fulani4,5,6. Kwa kuongezea, uchanganuzi unaweza kujilimbikizia katika eneo nyembamba wakati wa utengano wa awamu ya kioevu, na hivyo kuzingatia uchanganuzi huu na kuongeza unyeti wa ugunduzi wa MS. Kromatografia ya kimiminika (LC) imeendelea kwa kiasi kikubwa katika muongo mmoja uliopita na imekuwa njia inayotumika sana kwa uchambuzi wa proteomiki7,8,9,10.
Kromatografia ya kioevu ya awamu ya nyuma (RP-LC) hutumika sana kusafisha na kutenganisha michanganyiko ya peptidi kwa kutumia silika iliyobadilishwa na oktadesili (ODS) kama awamu ya kudumu11,12,13. Hata hivyo, kutokana na muundo wao tata na asili ya amphoteric, awamu 14,15 za RP haziwezi kutoa utengano wa kuridhisha wa peptidi na protini. Kwa hivyo, uchambuzi wa peptidi na protini zenye vipande vya polar na visivyo vya polar unahitaji awamu za kudumu zilizoundwa maalum ili kuingiliana na kuhifadhi uchanganuzi huu16. Kromatografia mchanganyiko, ambayo hutoa mwingiliano wa multimodal, inaweza kuwa mbadala wa RP-LC kwa kutenganisha peptidi, protini, na michanganyiko mingine tata. Awamu kadhaa za kudumu za aina mchanganyiko zilitayarishwa na nguzo zilizojazwa na awamu hizi za kudumu zilitumika kutenganisha peptidi na protini17,18,19,20,21. Kutokana na uwepo wa vikundi vya polar na visivyo vya polar, awamu za stationary mode mchanganyiko (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar intercalation/RPLC) zinafaa kwa ajili ya utenganishaji wa peptidi na protini22,23,24,25,26,27,28. , awamu za stationary zilizounganishwa polar zenye vikundi vya polar vilivyounganishwa kwa ushirikiano zinaonyesha uwezo mzuri wa utenganishaji na uteuzi wa kipekee kwa wachambuzi wa polar na wasio wa polar kwa sababu utenganishaji hutegemea mwingiliano kati ya mchambuzi na awamu ya stationary. Mwingiliano wa multimodal 29,30,31,32. Hivi majuzi, Zhang et al. 30 walipata awamu za stationary za poliamini zilizositishwa na behenyl na kutenganisha hidrokaboni, dawamfadhaiko, flavonoids, nucleosides, estrojeni, na baadhi ya wachambuzi wengine kwa mafanikio. Nyenzo ya stationary iliyopachikwa polar ina vikundi vya polar na visivyo vya polar, kwa hivyo inaweza kutumika kutenganisha peptidi na protini katika sehemu za hydrophobic na hydrophilic. Safu wima za ndani ya polar (km, safu wima za C18 zenye ndani ya amide) zinapatikana chini ya jina la kibiashara la safu wima za Ascentis Express RP-Amide, lakini safu wima hizi zimetumika tu kwa ajili ya uchambuzi wa amini 33.
Katika utafiti wa sasa, awamu ya upachikaji wa polar (N-phenylmaleimide, polistini ya upachikaji) ilitayarishwa na kutathminiwa kwa utenganisho wa peptidi na mgawanyiko wa tryptic HSA. Mkakati ufuatao ulitumika kuandaa awamu ya upachikaji. Chembe za silika zenye vinyweleo zilitayarishwa kulingana na taratibu zilizoelezwa katika machapisho yetu ya awali, pamoja na mabadiliko fulani katika mipango ya maandalizi 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Uwiano wa urea, polyethilini glikoli (PEG), TMOS na asidi ya maji-asetiki ulirekebishwa ili kupata chembe za silika zenye ukubwa mkubwa wa vinyweleo. Pili, ligandi mpya ya phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate ilitengenezwa na chembe zake za silika zilizotokana zilitumika kuandaa awamu za upachikaji wa polar. Awamu ya upachikaji iliyopatikana ilifungwa kwenye safu ya chuma cha pua (kipenyo cha ndani 100 × 1.8 mm) kulingana na mpango ulioboreshwa wa upachikaji. Ufungashaji wa safu hiyo unasaidiwa na mtetemo wa kiufundi ili kuhakikisha safu sare ndani ya safu. Safu iliyojaa ilitathminiwa kwa ajili ya kutenganisha mchanganyiko wa peptidi zenye peptidi tano (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptidi ya leucine-enkephalin). na hidrolisiti za tryptic za albumini ya seramu ya binadamu (HSA). Ilibainika kuwa mchanganyiko wa peptidi na usagaji wa tryptic wa HSA vilitenganishwa kwa ubora na ufanisi mzuri. Ufanisi wa kutenganisha wa safu wima ya PMP ulilinganishwa na ule wa safu wima ya Ascentis Express RP-Amide. Ilibainika kuwa peptidi na protini zina ubora mzuri na ufanisi mkubwa wa kutenganisha kwenye safu wima ya PMP, na ufanisi wa kutenganisha wa safu wima ya PMP ni mkubwa kuliko ule wa safu wima ya Ascentis Express RP-Amide.
PEG (poliethilini glikoli), urea, asidi asetiki, trimethoksiorthosilicate (TMOS), trimethiliklorosilane (TMCS), tripsini, albino ya seramu ya binadamu (HSA), kloridi ya amonia, urea, heksamethilimethakryloyldisilazane (HMDS), kloridi ya methakryloyl (MC), styrene, 4-hydroxy-TEMPO, peroksidi ya benzoyl (BPO), asetonitrile (ACN) kwa HPLC, methanoli, 2-propanoli na asetoni. Kampuni ya Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Marekani).
Mchanganyiko wa urea (8 g), polyethilini glikoli (8 g) na mililita 8 za asidi asetiki 0.01 N. ulichanganywa kwa dakika 10, na mililita 24 za TMOS ziliongezwa hapo chini ya kupoeza barafu. Mchanganyiko wa mmenyuko ulipashwa joto kwa nyuzi joto 40 kwa saa 6 na kisha kwa nyuzi joto 120 kwa saa 8 kwenye autoclave ya chuma cha pua. Maji yalipunguzwa na mabaki yakaushwa kwa nyuzi joto 70 kwa saa 12. Vitalu laini vilivyokaushwa vilisagwa vizuri na kuchanganywa na chokaa kwenye oveni kwa nyuzi joto 550 kwa saa 12. Makundi matatu yalitayarishwa na kubainishwa ili kujaribu uwezekano wa kurudia ukubwa wa chembe, ukubwa wa vinyweleo na eneo la uso.
Kundi la polar na awamu isiyosimama kwa minyororo ya polystyrene. Utaratibu wa maandalizi umeelezwa hapa chini.
N-phenylmaleimide (200 mg) na isosianate ya methyl vinyl (100 mg) ziliyeyushwa katika toluini isiyo na maji, na kisha 0.1 ml ya 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) iliongezwa kwenye chupa ya mmenyuko ili kupata kopolimeri ya phenylmaleimide na isosianate ya methyl vinyl (PMCP). ) Mchanganyiko huo ulipashwa moto kwa 60°C kwa saa 3, ukachujwa na kukaushwa katika oveni kwa 40°C kwa saa 3.
Chembe za silika zilizokaushwa (2 g) zilitawanywa katika toluini kavu (100 ml), zikachanganywa na kuchanganywa kwa dakika 10 katika chupa ya chini ya duara ya mililita 500. PMCP (10 mg) iliyeyushwa katika toluini na kuongezwa kwa njia ya matone kwenye chupa ya mmenyuko kupitia funeli ya kuongeza. Mchanganyiko ulirudishwa kwenye 100°C kwa saa 8, ukachujwa, ukaoshwa na asetoni na kukaushwa kwa 60°C kwa saa 3. Kisha, chembe za silika zinazohusiana na PMCP (100 g) ziliyeyushwa katika toluini (200 ml), na 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) iliongezwa hapo mbele ya 100 μl ya dibutyltin dilaurate kama kichocheo. Mchanganyiko ulichanganywa kwa 50°C kwa saa 8, ukachujwa na kukaushwa kwa 50°C kwa saa 3.
Styrene (1 ml), benzoyl peroxide BPO (0.5 ml) na chembe za silika zilizounganishwa na TEMPO-PMCP (1.5 g) zilitawanywa katika toluini na kusafishwa kwa nitrojeni. Upolimishaji wa styrene ulifanyika kwa 100°C kwa saa 12. Bidhaa iliyotokana ilioshwa na methanoli na kukaushwa usiku kucha kwa 60°C. Mpango wa jumla wa mmenyuko unaonyeshwa kwenye mchoro wa kwanza.
Sampuli ziliondolewa gesi kwenye 393 K kwa saa 1 hadi shinikizo lililobaki la chini ya 10–3 Torr lilipopatikana. Kiasi cha N2 kilichofyonzwa kwa shinikizo la jamaa P/P0 = 0.99 kilitumika kubaini ujazo wa jumla wa vinyweleo. Mofolojia ya chembe za silika safi na zilizounganishwa na ligand ilichunguzwa kwa kutumia darubini ya elektroni ya kuchanganua (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japani). Sampuli kavu (chembe za silika safi na zilizounganishwa na ligand) ziliwekwa kwenye fimbo za alumini kwa kutumia mkanda wa kaboni. Dhahabu iliwekwa kwenye sampuli kwa kutumia kifaa cha kunyunyizia Q150T, na safu ya Au yenye unene wa nm 5 iliwekwa kwenye sampuli. Hii inaboresha ufanisi wa mchakato wa volteji ya chini na hutoa dawa ya kunyunyizia baridi kidogo. Uchambuzi wa elementi ulifanywa kwa kutumia kichambuzi cha utungaji wa elementi cha Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Kichambuzi cha ukubwa wa chembe cha Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 kilitumika kupata usambazaji wa ukubwa wa chembe. Chembe za silika ambazo hazijafunikwa na chembe za silika zilizofungwa na ligand (5 mg kila moja) zilitawanywa katika 5 ml ya isopropanol, zikawekwa kwa sauti kwa dakika 10, zikachanganywa kwa dakika 5, na kuwekwa kwenye benchi la macho la Mastersizer. Uchambuzi wa jotogravimetric unafanywa kwa kiwango cha 5 °C kwa dakika katika kiwango cha halijoto kuanzia 30 hadi 800 °C.
Nguzo nyembamba za chuma cha pua zilizofunikwa kwa nyuzi za kioo zenye vipimo (ID 100 × 1.8 mm) zilifungwa kwa njia ya kujaza tope kwa kufuata utaratibu sawa na katika marejeleo 31. Safu ya chuma cha pua (iliyofunikwa kwa glasi, ID 100 × 1 .8 mm) na sehemu ya kutolea iliyo na frit ya 1 µm iliunganishwa kwenye mashine ya kufungashia tope (Alltech Deerfield, IL, Marekani). Tayarisha usimamishaji wa awamu ya kusimama kwa kusimamisha 150 mg ya awamu ya kusimama katika 1.2 ml ya methanoli na kuiingiza kwenye safu ya hifadhi. Methanoli ilitumika kama kiyeyusho cha tope na kiyeyusho cha kudhibiti. Pakia safu kwa kutumia mfuatano wa shinikizo la 100 MP kwa dakika 10, 80 MP kwa dakika 15, na 60 MP kwa dakika 30. Mchakato wa kufungashia ulitumia vibrators viwili vya safu ya kromatografia ya gesi (Alltech, Deerfield, IL, Marekani) kwa mtetemo wa mitambo ili kuhakikisha ufungashaji wa safu wima. Funga kifungashio cha tope na uachilie shinikizo polepole ili kuzuia uharibifu wa kamba. Safu ilitenganishwa na pua ya tope na kifaa kingine kiliunganishwa kwenye sehemu ya kuingilia na kuunganishwa kwenye mfumo wa LC ili kujaribu utendaji wake.
MLC maalum ilijengwa kwa kutumia pampu ya LC (10AD Shimadzu, Japani), kipima sampuli chenye kitanzi cha sindano cha 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), kifaa cha kuondoa gesi kwenye utando (Shimadzu DGU-14A), na dirisha la kapilari la UV-VIS. Kifaa cha kugundua (UV-2075) na safu ndogo ya enamel. Tumia mirija nyembamba sana na fupi ya kuunganisha ili kupunguza athari za upanuzi wa safu wima zaidi. Baada ya kujaza safu wima, sakinisha kapilari (50 µm id 365) kwenye sehemu ya kutolea nje ya makutano ya kupunguza ya 1/16″ na usakinishe kapilari (50 µm) ya makutano ya kupunguza. Ukusanyaji wa data na usindikaji wa kromatogramu hufanywa kwa kutumia programu ya Multichro 2000. Katika 254 nm, ufyonzaji wa UV wa wachambuzi wa masomo ulifuatiliwa kwa 0. Data ya kromatografi ilichambuliwa kwa kutumia OriginPro8 (Northampton, MA).
Albamu ya damu ya binadamu, unga uliochanganywa na lyofili, ≥ 96% (electrophoresis ya jeli ya agarose) 3 mg iliyochanganywa na trypsin (1.5 mg), 4.0 M urea (1 ml) na 0.2 M ammonium bikaboneti (1 ml). Mmumunyo ulichanganywa kwa dakika 10 na kuwekwa kwenye maji kwenye joto la 37°C kwa saa 6, kisha ukawashwa na 1 ml ya 0.1% TFA. Chuja mchanganyiko na uhifadhi chini ya 4°C.
Mgawanyo wa mchanganyiko wa peptidi na HSA ya kuyeyusha tryptic kwenye safu wima ya PMP ulitathminiwa kando. Angalia hidrolisisi ya tryptic ya mchanganyiko wa peptidi na HSA iliyotengwa na safu wima ya PMP na ulinganishe matokeo na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide. Idadi ya sahani za kinadharia huhesabiwa kwa kutumia mlinganyo ufuatao:
Picha za SEM za chembechembe safi za silika na chembechembe za silika zilizounganishwa na ligand zinaonyeshwa kwenye Mchoro 2. Picha za SEM za chembechembe safi za silika (A, B) zinaonyesha umbo la duara ambapo chembechembe hizo zimerefushwa au zina ulinganifu usio wa kawaida ikilinganishwa na tafiti zetu za awali. Uso wa chembechembe za silika zilizounganishwa na ligand (C, D) ni laini kuliko ule wa chembechembe safi za silika, ambayo inaweza kuwa kutokana na minyororo ya polistirini inayofunika uso wa chembechembe za silika.
Kuchanganua mikrografu za elektroni za chembe safi za silika (A, B) na chembe za silika zilizofungwa na ligandi (C, D).
Usambazaji wa ukubwa wa chembe za chembe za silika safi na chembe za silika zilizofungwa na ligand unaonyeshwa kwenye Mchoro 2. 3(A). Mikunjo ya usambazaji wa ukubwa wa chembe za volumetric ilionyesha kuwa ukubwa wa chembe za silika uliongezeka baada ya marekebisho ya kemikali (Mchoro 3A). Data ya usambazaji wa ukubwa wa chembe za silika kutoka kwa utafiti wa sasa na utafiti uliopita inalinganishwa katika Jedwali 1(A). Ukubwa wa chembe za volumetric d(0.5) za PMP ulikuwa 3.36 µm, ikilinganishwa na thamani ya ad(0.5) ya 3.05 µm katika utafiti wetu uliopita (chembe za silika zilizofungwa na polystyrene)34. Kutokana na mabadiliko katika uwiano wa PEG, urea, TMOS na asidi asetiki katika mchanganyiko wa mmenyuko, usambazaji wa ukubwa wa chembe wa kundi hili ulikuwa mwembamba ikilinganishwa na utafiti wetu uliopita. Ukubwa wa chembe wa awamu ya PMP ni mkubwa kidogo kuliko ule wa awamu ya chembe za silika zilizofungwa na polystyrene ambazo tulisoma hapo awali. Hii ina maana kwamba utendaji kazi wa uso wa chembe za silika zenye styrene uliweka safu ya polistini pekee (0.97 µm) kwenye uso wa silika, huku katika awamu ya PMP unene wa safu ulikuwa 1.38 µm.
Usambazaji wa ukubwa wa chembe (A) na usambazaji wa ukubwa wa vinyweleo (B) vya chembe safi za silika na chembe za silika zilizofungwa na ligand.
Ukubwa wa vinyweleo, ujazo wa vinyweleo, na eneo la uso wa chembe za silika zilizotumika katika utafiti huu zinaonyeshwa katika Jedwali 1 (B). Wasifu wa PSD wa chembe za silika safi na chembe za silika zilizofungwa na ligandi zinaonyeshwa katika Mchoro 3(B). Matokeo yalilinganishwa na utafiti wetu uliopita34. Ukubwa wa vinyweleo vya chembe za silika safi na zilizofungwa na ligandi zilikuwa 310 Å na 241 Å, mtawalia, ikionyesha kwamba baada ya marekebisho ya kemikali, ukubwa wa vinyweleo ulipungua kwa 69 Å, kama inavyoonyeshwa katika Jedwali 1 (B), na mkunjo wa kuhama unaonyeshwa katika Mchoro. Eneo maalum la uso wa chembe za silika katika utafiti wa sasa ni 116 m2/g, ambalo linalinganishwa na utafiti wetu uliopita (124 m2/g). Kama inavyoonyeshwa katika Jedwali 1(B), eneo la uso (m2/g) la chembe za silika baada ya marekebisho ya kemikali pia lilipungua kutoka 116 m2/g hadi 105 m2/g.
Matokeo ya uchambuzi wa elementi wa awamu ya kudumu yanawasilishwa katika Jedwali. 2. Kiwango cha kaboni cha awamu ya sasa ya kudumu ni 6.35%, ambayo ni ya chini kuliko katika utafiti wetu uliopita (chembe za silika zinazohusiana na polistirini, 7.93%35 na 10.21%, mtawalia) 42. Kiwango cha kaboni cha awamu ya sasa ya kudumu hapa chini, kwani baadhi ya ligandi za polar kama vile phenylmaleimide methyl vinyl isocyanate (PCMP) na 4-hydroxy-TEMPO zimetumika pamoja na styrene katika utayarishaji wa SP. Asilimia ya uzito wa nitrojeni katika awamu ya sasa ya kudumu ni 2.21% ikilinganishwa na 0.1735 na 0.85% katika masomo ya awali42. Hii ina maana kwamba awamu ya sasa ya kudumu ina asilimia kubwa ya uzito wa nitrojeni kutokana na phenylmaleimide. Vile vile, bidhaa (4) na (5) zina kiwango cha kaboni cha 2.7% na 2.9%, mtawalia, huku bidhaa ya mwisho (6) ikiwa na kiwango cha kaboni cha 6.35%, kama inavyoonyeshwa kwenye Jedwali la 2. Uchambuzi wa Thermogravimetric (TGA) ulitumika katika awamu ya PMP isiyobadilika ili kujaribu kupunguza uzito, na mkunjo wa TGA unaonyeshwa kwenye Mchoro 4. Mkunjo wa TGA unaonyesha kupungua uzito kwa 8.6%, ambayo inalingana vyema na kiwango cha kaboni (6.35%), kwani ligandi hazina C 2 tu, bali pia N, O na H.
Isosianati ya phenylmaleimide-methylvinyl isosianati ilichaguliwa kurekebisha uso wa chembe za silika kwa sababu ya vikundi vyake vya polar phenylmaleimide na vinylisosianati. Vikundi vya isosianati ya vinyl vinaweza kuguswa zaidi na styrene kwa upolimishaji hai wa radical. Sababu ya pili ni kuingiza kikundi ambacho kina mwingiliano wa wastani na analyte na hakuna mwingiliano mkubwa wa kielektroniki kati ya analyte na awamu ya stationary, kwa kuwa sehemu ya phenylmaleimide haina chaji pepe kwenye pH ya kawaida. Polari ya awamu ya stationary inaweza kudhibitiwa na kiwango bora cha styrene na muda wa mmenyuko wa upolimishaji wa radical huru. Hatua ya mwisho ya mmenyuko (upolimishaji wa radical huru) ni muhimu kwani hubadilisha polari ya awamu ya stationary. Uchambuzi wa elementi ulifanywa ili kuangalia kiwango cha kaboni katika awamu hizi za stationary. Imeonekana kwamba kuongeza kiasi cha styrene na muda wa mmenyuko huongeza kiwango cha kaboni cha awamu ya stationary na kinyume chake. SP zilizoandaliwa na viwango tofauti vya styrene zina mizigo tofauti ya kaboni. Vile vile, awamu hizi zisizobadilika ziliwekwa kwenye nguzo za chuma cha pua na sifa zao za kromatografia (uchaguzi, azimio, thamani ya N, n.k.) zilikaguliwa. Kulingana na majaribio haya, muundo ulioboreshwa kwa ajili ya maandalizi ya awamu isiyobadilika ya PMP ulichaguliwa ili kutoa polarity iliyodhibitiwa na uhifadhi mzuri wa mchambuzi.
Safu wima ya PMP pia ilitathminiwa kwa ajili ya uchanganuzi wa michanganyiko mitano ya peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) kwa kutumia uwezo wa awamu inayotembea. 60/40 (v/v) ACN/maji (0.1% TFA) kwa kiwango cha mtiririko cha 80 µl/min. Chini ya hali bora ya utatuzi (sahani 200,000/m2), idadi ya sahani za kinadharia (N) kwa kila safu wima (100 × 1.8 mm) ni 20,000 ± 100. Thamani za N kwa safu wima tatu za PMP zinaonyeshwa kwenye Jedwali 3 na chromatogramu zinaonyeshwa kwenye Mchoro 5A. Uchambuzi wa haraka kwa kiwango cha juu cha mtiririko (700 µl/dakika) kwenye safu wima ya PMP, peptidi tano ziliondolewa ndani ya dakika moja, thamani bora ya N ya 13,500 ± 330 kwa kila safu wima (kipenyo cha 100 x 1.8 mm), sawa na sahani 135,000/m2 (Mchoro 5B). Safu wima tatu za ukubwa sawa (kipenyo cha ndani 100 x 1.8 mm) zilijazwa na makundi matatu tofauti ya awamu ya PMP ili kujaribu urejeleaji. Vichanganuzi vilirekodiwa kwa kila safu wima kwa kutenganisha mchanganyiko sawa wa jaribio kwenye kila safu wima kwa kutumia hali bora za urejeleaji, idadi ya sahani za kinadharia N, na muda wa kuhifadhi. Data ya urejeleaji kwa safu wima za PMP imeonyeshwa kwenye Jedwali 4. Urejeleaji wa safu wima ya PMP ulihusiana vyema na thamani za chini sana za %RSD kama inavyoonyeshwa kwenye Jedwali 3.
Mgawanyo wa michanganyiko ya peptidi kwenye safu wima ya PMP (B) na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide (A), awamu inayotembea ya 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), vipimo vya safu wima ya PMP (100 x 1.8 mm id), uchambuzi Mpangilio wa mchanganyiko wa misombo: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) na 5 (leusiki enkephalin).
Safu wima ya PMP (kipenyo cha ndani 100 x 1.8 mm) ilitathminiwa kwa ajili ya kutenganisha hidrolizati ya tryptic ya albino ya seramu ya binadamu na HPLC. Kromatogramu katika Mchoro 6 inaonyesha kwamba sampuli zimetenganishwa vizuri na azimio nzuri sana. Mifumo ya HSA ilichambuliwa kwa kutumia kiwango cha mtiririko cha 100 μl/min, awamu ya kuhama ya asetonitrile/maji ya 70/30 na 0.1% TFA. Utengano wa HSA uligawanywa katika vilele 17, kama inavyoonyeshwa kwenye kromatogramu (Mchoro 6), sambamba na peptidi 17. Ufanisi wa utengano wa vilele vya mtu binafsi kutoka kwa hidrolizati ya HSA ulihesabiwa na thamani zinaonyeshwa kwenye Jedwali 5.
Hidrolisiti za tryptic za HSA zilitenganishwa kwenye safu wima ya PMP (kipenyo cha ndani 100 x 1.8 mm), kiwango cha mtiririko (100 μl/min), awamu ya kuhama ya asetonitrile/maji 60/40, na 0.1% TFA.
ambapo L ni urefu wa safu, η ni mnato wa awamu inayotembea, ΔP ni shinikizo la nyuma la safu, na u ni kasi ya mstari wa awamu inayotembea. Upenyezaji wa safu wima ya PMP ulikuwa 2.5 × 10–14 m2, kiwango cha mtiririko kilikuwa 25 µl/min, 60/40 v/v kilitumika. ACN/maji. Upenyezaji wa safu wima ya PMP (ID 100 × 1.8 mm) ulikuwa sawa na ule wa utafiti wetu wa awali wa Ref.34. Upenyezaji wa safu wima iliyojazwa na chembe zenye vinyweleo vya juu juu ni 1.7×10 .6 µm, 2.5×10-14 m2 kwa chembe 5 µm43. Kwa hivyo, upenyezaji wa awamu ya PMP ni sawa na upenyezaji wa chembe za ganda la msingi zenye ukubwa wa 5 μm.
ambapo Wx ni uzito wa safu iliyojazwa klorofomu, Wy ni uzito wa safu iliyojazwa methanoli, na ρ ni msongamano wa kiyeyusho. Uzito wa methanoli (ρ = 0.7866) na klorofomu (ρ = 1.484). Unyevu wa jumla wa safu ya chembe ya silika-C18 (100 × 1.8 mm ID)34 na safu yetu ya C18-urea31 iliyosomwa hapo awali ilikuwa 0.63 na 0.55, mtawalia. Hii ina maana kwamba uwepo wa ligandi za urea hupunguza upenyezaji wa awamu ya stationary. Kwa upande mwingine, unyevu wa jumla wa safu ya PMP (kipenyo cha ndani 100 × 1.8 mm) ni 0.60. Nguzo za PMP hazipitishi maji mengi kuliko nguzo zilizojaa chembe za silika zilizofungwa na C18 kwa sababu katika awamu za stationary za aina ya C18 ligandi za C18 zimeunganishwa na chembe za silika katika minyororo ya mstari, huku katika awamu za stationary za aina ya polstyrene polima nene kiasi huundwa kuzunguka chembe. safu A. Katika jaribio la kawaida, unyeo wa safu huhesabiwa kama ifuatavyo:
Kwenye mchoro 7A, B inaonyesha michoro ya Van Deemter kwa safu wima ya PMP (id 100 x 1.8 mm) na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1.8 mm) chini ya hali sawa za utengano, 60/40 ACN/H2O na 0 .1% TFA 20 µl/min hadi 800 µl/min kwenye safu wima zote mbili. Thamani za chini kabisa za HETP kwa kiwango bora cha mtiririko (80 µl/min) zilikuwa 2.6 µm na 3.9 µm kwa safu wima ya PMP na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide, mtawalia. Thamani za HETP zinaonyesha kuwa ufanisi wa utengano wa safu wima ya PMP (id 100 x 1.8 mm) ni mkubwa zaidi kuliko ule wa safu wima ya Ascentis Express RP-Amide inayopatikana kibiashara (id 100 x 1.8 mm). Grafu ya van Deemter katika Mchoro 7(A) inaonyesha kwamba kupungua kwa thamani ya N si kubwa zaidi kwa mtiririko unaoongezeka ikilinganishwa na utafiti wetu uliopita. Ufanisi wa juu wa utenganishaji wa safu wima ya PMP (id 100 × 1.8 mm) ikilinganishwa na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide unategemea umbo na ukubwa wa chembe ulioboreshwa na utaratibu tata wa kufungasha safu wima unaotumika katika kazi ya sasa34.
(A) Kielelezo cha Van Deemter (kasi ya mstari ya HETP dhidi ya kasi ya awamu ya simu) kilichopatikana kwenye safu wima ya PMP (kitambulisho 100 x 1.8 mm) katika 60/40 ACN/H2O yenye 0.1% TFA. (B) Kielelezo cha Van Deemter (kasi ya mstari ya mstari ya awamu ya simu) kilichopatikana kwenye safu wima ya Ascentis Express RP-Amide (kitambulisho 100 x 1.8 mm) katika 60/40 ACN/H2O yenye 0.1% TFA.
Awamu ya polar stationary ya polistini iliyounganishwa iliandaliwa na kutathminiwa kwa ajili ya kutenganisha mchanganyiko wa peptidi za sintetiki na hidrolizati ya tryptic ya albino ya seramu ya binadamu (HSA) katika kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa juu. Utendaji wa kromatografia wa nguzo za PMP kwa michanganyiko ya peptidi ni bora katika suala la ufanisi na utatuzi wa utenganishaji. Ufanisi ulioboreshwa wa utenganishaji wa nguzo za PMP unatokana na sababu kadhaa kama vile ukubwa wa chembe ya silika na ukubwa wa vinyweleo, usanisi uliodhibitiwa wa awamu zisizobadilika, na vifaa tata vya kufungashia nguzo. Mbali na ufanisi mkubwa wa utenganishaji, faida nyingine ya awamu hii isiyobadilika ni shinikizo la nyuma la safu ya chini kwa viwango vya juu vya mtiririko. Nguzo za PMP zinaweza kuzaliana tena na zinaweza kutumika kuchambua michanganyiko ya peptidi na usagaji wa tryptic wa protini mbalimbali. Tunakusudia kutumia safu hii kwa ajili ya kutenganisha misombo hai ya kibiolojia kutoka kwa bidhaa asilia, dondoo za mimea ya dawa na uyoga katika kromatografia ya kioevu. Katika siku zijazo, nguzo za PMP pia zitatathminiwa kwa ajili ya kutenganisha protini na kingamwili za monokloni.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Uchunguzi kuhusu mifumo ya utenganishaji wa peptidi ya kromatografia ya awamu iliyogeuzwa sehemu ya I: Ukuzaji wa itifaki ya uainishaji wa safu wima. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Uchunguzi kuhusu mifumo ya utenganishaji wa peptidi ya kromatografia ya awamu iliyogeuzwa sehemu ya I: Ukuzaji wa itifaki ya uainishaji wa safu wima.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., na Petersson, P. Uchunguzi wa Mifumo ya Utenganishaji wa Peptidi kwa Kutumia Kromatografia ya Awamu ya Kinyume, Sehemu ya I: Kuunda Itifaki ya Uainishaji wa Safu. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Uchunguzi kuhusu mifumo ya utenganishaji wa peptidi ya kromatografia ya awamu iliyobadilishwa sehemu ya I: Ukuzaji wa itifaki ya sifa za safu wima. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Uchunguzi kuhusu mifumo ya utenganishaji wa peptidi ya kromatografia ya awamu iliyobadilishwa sehemu ya I: Ukuzaji wa itifaki ya sifa za safu wima.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., na Petersson, P. Uchunguzi wa Mifumo ya Utenganishaji wa Peptidi kwa Kutumia Kromatografia ya Awamu ya Kinyume, Sehemu ya I: Kuunda Itifaki ya Uainishaji wa Safu.J.色谱法。 1603,113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. na wengine. Mbinu za kuunda peptidi zinazofanya kazi zilizoboreshwa kwa ajili ya matibabu ya magonjwa ya kuambukiza. Bioteknolojia. Mafanikio 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptidi za matibabu sanisi: Sayansi na soko. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptidi za matibabu sanisi: Sayansi na soko.Vliege P, Lisowski V, Martinez J na Chreschatyski M. Peptidi za matibabu sanisi: sayansi na soko.Vliege P, Lisowski V, Martinez J na Khreschatsky M. Peptidi za matibabu sanisi: sayansi na soko. ugunduzi wa dawa. Leo 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografia ya kioevu ya proteomiki iliyoboreshwa. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografia ya kioevu ya proteomiki iliyoboreshwa.Tazama F., Smith RD na Shen Yu. Kromatografia ya kioevu ya proteomiki iliyoboreshwa. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Muundo wa juu wa protini 液相色谱.Tazama F., Smith RD na Shen Yu. Kromatografia ya kioevu ya proteomiki iliyoboreshwa.J. Kromatografia. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kipimo cha juu cha kromatografia ya kioevu-spektrometria ya wingi kinaweza kuchanganya metabolomiki zenye msingi mpana na proteomiki. mkundu. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Jukumu la UHPLC katika maendeleo ya dawa. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Jukumu la UHPLC katika maendeleo ya dawa.Chesnut, SM na Salisbury, JJ Jukumu la UHPLC katika maendeleo ya dawa.Chesnut, SM na Salisbury, JJ Jukumu la UHPLC katika ukuzaji wa dawa. J. Septemba Sayansi. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Vipengele vya msingi na vitendo vya kromatografia ya kioevu yenye shinikizo kubwa sana kwa ajili ya utenganishaji wa haraka. Wu, N. & Clausen, AM Vipengele vya msingi na vitendo vya kromatografia ya kioevu yenye shinikizo kubwa sana kwa ajili ya utenganishaji wa haraka.Wu, N. na Clausen, AM Vipengele vya msingi na vitendo vya kromatografia ya kioevu yenye shinikizo kubwa kwa ajili ya utengano wa haraka. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面. Wu, N. & Clausen, AM Vipengele vya msingi na vitendo vya kromatografia ya kioevu yenye shinikizo kubwa kwa ajili ya utenganishaji wa haraka.Wu, N. na Clausen, AM Vipengele vya msingi na vitendo vya kromatografia ya kioevu yenye shinikizo kubwa kwa ajili ya utengano wa haraka.J. Septemba. Sayansi. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Matumizi ya kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa hali ya juu katika utengenezaji wa dawa. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Matumizi ya kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa hali ya juu katika utengenezaji wa dawa.Ren, SA na Chelischeff, P. Matumizi ya kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa hali ya juu sana katika utengenezaji wa dawa. Wren, SA & Tchelitchef, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA na Tchelitcheff, P.Ren, SA na Chelischeff, P. Matumizi ya kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa hali ya juu katika utengenezaji wa dawa.J. Kromatografia. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrojeli yenye vinyweleo vingi inayotokana na emulsion ya mafuta ndani ya maji yenye awamu ya juu ya ndani kwa ajili ya utakaso bora wa enterovirusi 71. Mradi wa kemikali. Jarida 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Jukumu la kromatografia ya kioevu katika proteomiki. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Jukumu la kromatografia ya kioevu katika proteomiki.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. na Wilkins, JA Jukumu la kromatografia ya kioevu katika proteomiki. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. na Wilkins, JA Jukumu la kromatografia ya kioevu katika proteomiki.J. Kromatografia. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Mitindo mipya katika utenganishaji wa kromatografia ya kioevu ya awamu iliyobadilishwa ya peptidi na protini za matibabu: Nadharia na matumizi. & Guillarme, D. Mitindo mipya katika utenganishaji wa kromatografia ya kioevu ya awamu iliyobadilishwa ya peptidi na protini za matibabu: Nadharia na matumizi. & Guillarme, D. Новые тенденции katika разделении терапевтических пептидов na белков с помощью жидкостной хроматографии с обратевтических пептидов na белков с помощью жидкостной хроматографии с обратевтических пептидов. & Guillarme, D. Mitindo mipya katika utenganishaji wa peptidi za matibabu na protini kwa kutumia kromatografia ya kioevu ya awamu ya nyuma: nadharia na matumizi. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理质和应用. na Guillarme, D.na Guillarmé, D. Mitindo mipya katika utenganishaji wa peptidi na protini za matibabu kwa kutumia kromatografia ya kioevu ya awamu ya nyuma: nadharia na matumizi.J. Pharm. Sayansi ya Biomedical. mkundu. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Mgawanyiko wa peptidi zenye pande mbili kwa kutumia mfumo wa RP-RP-HPLC wenye pH tofauti katika vipimo vya kwanza na vya pili vya mgawanyo. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Mgawanyiko wa peptidi zenye pande mbili kwa kutumia mfumo wa RP-RP-HPLC wenye pH tofauti katika vipimo vya kwanza na vya pili vya mgawanyo.Gilar M., Olivova P., Dali AE na Gebler JK Mgawanyiko wa peptidi zenye pande mbili kwa kutumia mfumo wa RP-RP-HPLC wenye pH tofauti katika vipimo vya kwanza na vya pili vya mgawanyo.Gilar M., Olivova P., Dali AE na Gebler JK Mgawanyiko wa peptidi zenye pande mbili kwa kutumia thamani tofauti za pH katika vipimo vya kwanza na vya pili vya utenganisho kwa kutumia mfumo wa RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Uchunguzi wa uhamishaji wa wingi na sifa za kinetiki za nguzo za kromatografia zenye utendaji wa juu zilizojaa chembe za C18 zenye vinyweleo kamili na zenye vinyweleo vya juu juu ndogo kuliko 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Mitindo ya hivi karibuni na changamoto za uchambuzi katika utenganishaji, utambuzi, na uthibitishaji wa peptidi za kibiolojia za mimea. mkundu. Kiumbe mkundu. Kemikali. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Mandhari ya kiproteomiki ya ufalme wa uzima. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Baada ya matibabu ya peptidi za matibabu kwa kutumia kromatografia ya kioevu ya maandalizi. Molekuli (Basel, Uswisi) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia ya hali mchanganyiko na matumizi yake kwa biopolima. Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia ya hali mchanganyiko na matumizi yake kwa biopolima.Yang, Yu. na Geng, X. Kromatografia ya hali mchanganyiko na matumizi yake kwa biopolima. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia ya hali mchanganyiko na matumizi yake katika biopolima.Yang, Yu. na Gene, X. Kromatografia ya hali mchanganyiko na matumizi yake kwa biopolima.J. Kromatografia. A 1218(49), 8813–8825 (2011).