Dankon pro via vizito al Nature.com. Vi uzas retumilan version kun limigita CSS-subteno. Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruecan Reĝimon en Internet Explorer). Krome, por certigi daŭran subtenon, ni montras la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Montras karuselon de tri lumbildoj samtempe. Uzu la butonojn Antaŭa kaj Sekva por moviĝi tra tri lumbildoj samtempe, aŭ uzu la butonojn de la ŝovilo ĉe la fino por moviĝi tra tri lumbildoj samtempe.
Poraj siliciaj partikloj estis preparitaj per la sol-ĝela metodo kun kelkaj modifoj por akiri larĝporajn partiklojn. Ĉi tiuj partikloj estis derivigitaj per N-fenilmaleimido-metilvinila izocianato (PMI) kaj stireno per inversa ĉentransiga-fragmentiĝo (RAFT) polimerigo por produkti N-fenilmaleimidajn interkalaciitajn poliamidojn. Stireno (PMP) senmova fazo. Mallarĝaj ŝtalaj kolonoj (100 × 1.8 mm interna diametro) estis pakitaj per ŝlama pakado. La kromatografia agado de la PMP-kolono estis taksita por apartigi miksaĵon de sintezaj peptidoj konsistantaj el kvin peptidoj (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminoacido enkefalino) kaj triptika hidrolizato de homa seruma albumino (HAS). Sub optimumaj eluaj kondiĉoj, la teoria nombro de platoj kun miksaĵo de peptidoj atingis 280,000 platojn/kv.m. Komparante la apartigan efikecon de la evoluigita kolono kun la komerca Ascentis Express RP-Amide kolono, oni observis, ke la apartiga efikeco de la PMP-kolono estis pli bona ol la komerca kolono rilate al apartiga efikeco kaj distingivo.
La biofarmacia industrio fariĝis kreskanta tutmonda merkato kun signifa kresko de merkatparto en la lastaj jaroj. Kun la eksplodema kresko de la biofarmacia industrio1,2,3 ekzistas granda bezono por peptidaj kaj proteinaj analizoj. Aldone al la cela peptido, diversaj malpuraĵoj formiĝas dum peptida sintezo, do kromatografia purigo estas necesa por atingi la deziratan purecon de la peptido. La analizo kaj karakterizado de proteinoj en korpaj fluidoj, histoj kaj ĉeloj estas ekstreme malfacila tasko pro la granda nombro da eble detekteblaj specioj ĉeestantaj en ununura specimeno. Kvankam mas-spektrometrio estas efika ilo por sekvenci peptidojn kaj proteinojn, se tiaj specimenoj estas rekte enkondukitaj en la mas-spektrometron, la apartigo estos nekontentiga. Ĉi tiu problemo povas esti solvita per likva kromatografio (LC) antaŭ MS-analizo, kiu reduktos la kvanton da analitoj enirantaj la mas-spektrometron en difinita tempo4,5,6. Krome, analitoj povas koncentriĝi en mallarĝa regiono dum likvafaza apartigo, tiel koncentrante ĉi tiujn analitojn kaj pliigante la sentemon de MS-detekto. Likva kromatografio (LC) signife progresis dum la pasinta jardeko kaj fariĝis vaste uzata metodo por proteomika analizo7,8,9,10.
Inversfaza likva kromatografio (RP-LC) estas vaste uzata por purigi kaj apartigi miksaĵojn de peptidoj uzante oktadecil-modifitan silician oksidon (ODS) kiel la senmovan fazon11,12,13. Tamen, pro ilia kompleksa strukturo kaj amfotera naturo,14,15 RP-senmovaj fazoj ne povas provizi kontentigan apartigon de peptidoj kaj proteinoj. Tial, la analizo de peptidoj kaj proteinoj kun polusaj kaj nepolusaj fragmentoj postulas speciale dizajnitajn senmovajn fazojn por interagi kaj reteni ĉi tiujn analitojn16. Miksita kromatografio, kiu ofertas multimodalajn interagojn, povas esti alternativo al RP-LC por apartigi peptidojn, proteinojn kaj aliajn kompleksajn miksaĵojn. Pluraj mikstipaj senmovaj fazoj estis preparitaj kaj kolonoj plenigitaj per ĉi tiuj senmovaj fazoj estis uzitaj por apartigi peptidojn kaj proteinojn17,18,19,20,21. Pro la ĉeesto de polusaj kaj nepolusaj grupoj, miksreĝimaj senmovaj fazoj (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polusa interkalacio/RPLC) taŭgas por la apartigo de peptidoj kaj proteinoj22,23,24,25,26,27,28. Polusaj interkalaciitaj senmovaj fazoj kun kovalente ligitaj polusaj grupoj montras bonajn apartigkapablojn kaj unikan selektivecon por polusaj kaj nepolusaj analitoj, ĉar la apartigo dependas de la interago inter la analito kaj la senmova fazo. Multimodalaj interagoj29,30,31,32. Lastatempe, Zhang et al.30 akiris behenil-finitajn senmovajn fazojn de poliaminoj kaj sukcese apartigis hidrokarbonojn, antidepresiaĵojn, flavonoidojn, nukleozidojn, estrogenojn kaj kelkajn aliajn analitojn. La poluse enigita senmova materialo havas kaj polusajn kaj nepolusajn grupojn, do ĝi povas esti uzata por apartigi peptidojn kaj proteinojn en hidrofobajn kaj hidrofilajn partojn. Polusaj enliniaj kolumnoj (ekz., C18-kolumnoj kun amido enlinia) estas haveblaj sub la komerca nomo Ascentis Express RP-Amide-kolonoj, sed ĉi tiuj kolumnoj estis uzitaj nur por la analizo de amino 33.
En la nuna studo, polusa enkorpiga stacionara fazo (N-fenilmaleimido, enkorpiga polistireno) estis preparita kaj taksita por peptida apartigo kaj tripta HSA-disigo. La sekva strategio estis uzata por prepari la stacionaran fazon. Poraj siliciaj partikloj estis preparitaj laŭ la proceduroj priskribitaj en niaj antaŭaj publikaĵoj, kun kelkaj ŝanĝoj en la preparaj skemoj 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. La proporcioj de ureo, polietilena glikolo (PEG), TMOS kaj akva-acetata acido estis adaptitaj por akiri siliciajn partiklojn kun grandaj porgrandecoj. Due, nova fenilmaleimido-metilvinila izocianata ligando estis sintezita kaj ĝiaj derivitaj siliciaj partikloj estis uzataj por prepari polusajn enkorpigajn stacionarajn fazojn. La akirita stacionara fazo estis pakita en rustorezistŝtalan kolonon (interna diametro 100 × 1.8 mm) laŭ optimumigita paka skemo. La pakado de la kolono estas helpata per mekanika vibrado por certigi unuforman tavolon ene de la kolono. La pakita kolono estis taksita por apartigo de miksaĵo de peptidoj konsistantaj el kvin peptidoj (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leŭcino-enkefalina peptido) kaj triptikaj hidrolizaĵoj de homa seruma albumino (HSA). Oni observis, ke la peptida miksaĵo kaj la HSA-triptika digesto apartigis kun bona distingivo kaj efikeco. La apartiga efikeco de la PMP-kolono estis komparita kun tiu de la Ascentis Express RP-Amide kolono. Oni observis, ke peptidoj kaj proteinoj havas bonan distingivon kaj altan apartigan efikecon sur la PMP-kolono, kaj la apartiga efikeco de la PMP-kolono estas pli alta ol tiu de la Ascentis Express RP-Amide kolono.
PEG (polietilena glikolo), ureo, acetata acido, trimetoksoriolsilikato (TMOS), trimetilklorosilano (TMCS), tripsino, homa seruma albumino (HSA), amonia klorido, ureo, heksametilmetakriloildisilazano (HMDS), metakriloila klorido (MC), stireno, 4-hidroksi-TEMPO, benzoila peroksido (BPO), acetonitrilo (ACN) por HPLC, metanolo, 2-propanolo kaj acetono. Sigma-Aldrich Company (Sankta Luiso, Misurio, Usono).
Miksaĵo de ureo (8 g), polietilen-glikolo (8 g) kaj 8 ml da 0,01 N acetata acido estis kirlita dum 10 minutoj, kaj 24 ml da TMOS estis aldonitaj al ĝi sub glacia malvarmigo. La reakcia miksaĵo estis varmigita je 40 °C dum 6 horoj kaj poste je 120 °C dum 8 horoj en aŭtoklavo el neoksidebla ŝtalo. La akvo estis dekantita kaj la restaĵo estis sekigita je 70 °C dum 12 horoj. La sekigitaj molaj blokoj estis glate muelitaj kaj kalcinitaj en forno je 550 °C dum 12 horoj. Tri aroj estis preparitaj kaj karakterizitaj por testi la reprodukteblecon de partiklaj grandecoj, pora grandeco kaj surfaca areo.
Polusa grupo kaj senmova fazo por polistirenaj ĉenoj. La preparproceduro estas priskribita sube.
N-fenilmaleimido (200 mg) kaj metilvinilizocianato (100 mg) estis solvitaj en anhidra tolueno, kaj poste 0,1 ml da 2,2′-azoizobutironitrilo (AIBN) estis aldonita al la reakcia flakono por akiri kopolimeron de fenilmaleimido kaj metilvinilizocianato (PMCP). ) La miksaĵo estis varmigita je 60 °C dum 3 horoj, filtrita kaj sekigita en forno je 40 °C dum 3 horoj.
Sekigitaj siliciaj partikloj (2 g) estis dispersitaj en seka tolueno (100 ml), kirlitaj kaj sonigitaj dum 10 minutoj en 500 ml rondfunda flakono. PMCP (10 mg) estis solvita en tolueno kaj aldonita gute al la reakcia flakono per aldona funelo. La miksaĵo estis refluigita je 100 °C dum 8 horoj, filtrita, lavita per acetono kaj sekigita je 60 °C dum 3 horoj. Poste, la siliciaj partikloj asociitaj kun PMCP (100 g) estis solvitaj en tolueno (200 ml), kaj 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) estis aldonita al ĝi en la ĉeesto de 100 μl da dibutilstana dilaŭrato kiel katalizilo. La miksaĵo estis kirlita je 50 °C dum 8 horoj, filtrita kaj sekigita je 50 °C dum 3 horoj.
Stireno (1 ml), benzoila peroksido BPO (0,5 ml) kaj silikaj partikloj alkroĉitaj al TEMPO-PMCP (1,5 g) estis dispersitaj en tolueno kaj purigitaj per nitrogeno. La polimerigo de stireno estis efektivigita je 100 °C dum 12 horoj. La rezulta produkto estis lavita per metanolo kaj sekigita dumnokte je 60 °C. La ĝenerala skemo de la reakcio estas montrita en figuro unu.
La specimenoj estis sengasigitaj je 393 K dum 1 horo ĝis resta premo malpli ol 10–3 Torr estis atingita. La kvanto de N2 adsorbita je relativa premo P/P0 = 0.99 estis uzata por determini la totalan porvolumenon. La morfologio de puraj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj estis ekzamenita per skana elektrona mikroskopo (Hitachi High Technologies, Tokio, Japanio). Sekaj specimenoj (pura silicia kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj) estis metitaj sur aluminiajn stangojn uzante karbonan bendon. Oro estis deponita sur la specimenon uzante ŝprucitan aparaton Q150T, kaj 5 nm dika Au-tavolo estis deponita sur la specimenon. Ĉi tio plibonigas la efikecon de la malalttensia procezo kaj provizas fajnan malvarman ŝprucadon. Elementa analizo estis farita uzante elementan konsistanalizilon Thermo Electron (Waltham, MA, Usono) Flash EA1112. Malvern-partikla grandecanalizilo (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 estis uzata por akiri la partiklan grandecdistribuon. Nekovritaj siliciaj partikloj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj (po 5 mg) estis dispersigitaj en 5 ml da izopropanolo, sonigitaj dum 10 minutoj, skuitaj dum 5 minutoj, kaj metitaj sur Mastersizer optikan benkon. Termogravimetria analizo estas efektivigita je rapideco de 5 °C minute en la temperaturintervalo de 30 ĝis 800 °C.
Vitrofibro-kovritaj mallarĝkalibraj rustorezistaŝtalaj kolonoj kun dimensioj (ID 100 × 1.8 mm) estis pakitaj per ŝlama pleniga metodo sekvante la saman proceduron kiel en referenco 31. Kolono el rustorezista ŝtalo (vitrokovrita, ID 100 × 1.8 mm) kaj elirejo enhavanta 1 µm friton estis konektitaj al ŝlama pakmaŝino (Alltech Deerfield, IL, Usono). Preparu suspendon de la senmova fazo suspendante 150 mg de la senmova fazo en 1.2 ml da metanolo kaj nutrante ĝin en rezervujan kolonon. Metanolo estis uzata kiel la ŝlama solvilo kaj kontrola solvilo. Pakigu la kolonon aplikante premsekvencon de 100 MP dum 10 minutoj, 80 MP dum 15 minutoj, kaj 60 MP dum 30 minutoj. La pakprocezo uzis du gaskromatografiajn kolumnvibrilojn (Alltech, Deerfield, IL, Usono) por mekanika vibrado por certigi unuforman kolumnan pakadon. Fermu la ŝlaman pakilon kaj malrapide liberigu la premon por malhelpi difekton al la ĉeno. La kolono estis malkonektita de la suspensiaĵajuto kaj alia konektilo estis alkroĉita al la enirejo kaj konektita al la LC-sistemo por testi ĝian funkciadon.
Speciala MLC estis konstruita uzante LC-pumpilon (10AD Shimadzu, Japanio), samplilon kun 50 nL injekta buklo (Valco (Usono) C14 W.05), membranan sengasigilon (Shimadzu DGU-14A), kaj UV-VIS kapilaran fenestron. Detektila aparato (UV-2075) kaj emajlita mikrokolumno. Uzu tre mallarĝajn kaj mallongajn konektajn tubojn por minimumigi la efikon de plia kolumna ekspansio. Post plenigo de la kolumno, instalu kapilaron (50 µm id 365) ĉe la elirejo de la 1/16″ redukta krucvojo kaj instalu kapilaron (50 µm) de la redukta krucvojo. Datenkolektado kaj kromatograma prilaborado estas faritaj per la programaro Multichro 2000. Je 254 nm, la UV-absorbo de la koncernaj analitoj estis monitorita je 0. Kromatografiaj datumoj estis analizitaj per OriginPro8 (Northampton, MA).
Homa seruma albumino, liofiligita pulvoro, ≥ 96% (agaroza ĝela elektroforezo) 3 mg miksita kun tripsino (1.5 mg), 4.0 M ureo (1 ml) kaj 0.2 M amonia bikarbonato (1 ml). La solvaĵo estis kirita dum 10 minutoj kaj konservita en akvobano je 37 °C dum 6 horoj, poste estingita per 1 ml da 0.1% TFA. Filtru la solvaĵon kaj konservu sub 4 °C.
Apartigo de miksaĵo de peptidoj kaj triptika digestaĵo HSA sur PMP-kolumno estis taksita aparte. Kontrolu la triptikan hidrolizon de miksaĵo de peptidoj kaj HSA apartigitaj per PMP-kolumno kaj komparu la rezultojn kun Ascentis Express RP-Amide-kolumno. La nombro de teoriaj platoj estas kalkulita per la sekva ekvacio:
SEM-bildoj de puraj siliciaj partikloj kaj per ligando ligitaj siliciaj partikloj estas montritaj en Figuro 2. SEM-bildoj de puraj siliciaj partikloj (A, B) montras sferan formon, en kiu la partikloj estas plilongigitaj aŭ havas neregulan simetrion kompare kun niaj antaŭaj studoj. La surfaco de la siliciaj partikloj ligitaj de la ligando (C, D) estas pli glata ol tiu de puraj siliciaj partikloj, kio eble ŝuldiĝas al la polistirenaj ĉenoj kovrantaj la surfacon de la siliciaj partikloj.
Skanantaj elektronaj mikrografoj de puraj siliciaj partikloj (A, B) kaj liganto-ligitaj siliciaj partikloj (C, D).
La distribuo de partikla grandeco de puraj siliciaj partikloj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj estas montrita en Fig. 2.3(A). Volumetraj kurboj de partikla grandeco montris, ke la silicia partikla grandeco pliiĝis post kemia modifo (Fig. 3A). La datumoj pri la distribuo de siliciaj partikla grandeco de la nuna studo kaj la antaŭa studo estas komparitaj en Tabelo 1(A). La volumetra partikla grandeco d(0.5) de PMP estis 3.36 µm, kompare kun la valoro ad(0.5) de 3.05 µm en nia antaŭa studo (polistireno-ligitaj siliciaj partikloj)34. Pro la ŝanĝo en la proporcio de PEG, ureo, TMOS kaj acetata acido en la reakcia miksaĵo, la distribuo de partikla grandeco de ĉi tiu aro estis pli mallarĝa kompare kun nia antaŭa studo. La partikla grandeco de la PMP-fazo estas iomete pli granda ol tiu de la polistireno-ligita silicia partikla fazo, kiun ni studis pli frue. Tio signifas, ke la surfaca funkciigo de siliciaj partikloj kun stireno deponis nur polistirenan tavolon (0,97 µm) sur la silician surfacon, dum en la PMP-fazo la tavoldikeco estis 1,38 µm.
Distribuo de partikla grandeco (A) kaj distribuo de pora grandeco (B) de puraj siliciaj partikloj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj.
La porgrandeco, porvolumeno, kaj surfacareo de la siliciaj partikloj uzitaj en ĉi tiu studo estas montritaj en Tabelo 1 (B). La PSD-profiloj de puraj siliciaj partikloj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj estas montritaj en Fig. 3 (B). La rezultoj estis kompareblaj al nia antaŭa studo34. La porgrandecoj de puraj kaj ligando-ligitaj siliciaj partikloj estis 310 Å kaj 241 Å, respektive, indikante ke post kemia modifo, la porgrandeco malpliiĝis je 69 Å, kiel montrite en Tabelo 1 (B), kaj la ŝovkurbo estas montrita en Fig. La specifa surfacareo de siliciaj partikloj en la nuna studo estas 116 m²/g, kio estas komparebla al nia antaŭa studo (124 m²/g). Kiel montrite en Tabelo 1 (B), la surfacareo (m²/g) de siliciaj partikloj post kemia modifo ankaŭ malpliiĝis de 116 m²/g al 105 m²/g.
La rezultoj de elementa analizo de la senmova fazo estas prezentitaj en Tabelo 2. La karbona enhavo de la nuna senmova fazo estas 6,35%, kio estas pli malalta ol en nia antaŭa studo (silikopartikloj asociitaj kun polistireno, 7,93%35 kaj 10,21%, respektive)42. La karbona enhavo de la nuna senmova fazo estas sube, ĉar iuj polusaj ligandoj kiel fenilmaleimido metilvinila izocianato (PCMP) kaj 4-hidroksi-TEMPO estis uzitaj aldone al stireno en la preparado de SP. La peza procento de nitrogeno en la nuna senmova fazo estas 2,21% kompare kun 0,1735 kaj 0,85% en antaŭaj studoj42. Ĉi tio signifas, ke la nuna senmova fazo havas altan pezan procenton de nitrogeno pro la fenilmaleimido. Simile, produktoj (4) kaj (5) havas karbonan enhavon de 2,7% kaj 2,9%, respektive, dum la fina produkto (6) havas karbonan enhavon de 6,35%, kiel montrite en Tabelo 2. Termogravimetria analizo (TGA) estis uzata sur la senmova fazo de PMP por testi pezperdon, kaj la TGA-kurbo estas montrita en Figuro 4. La TGA-kurbo montras pezperdon de 8,6%, kio bone kongruas kun la karbonan enhavon (6,35%), ĉar la ligandoj enhavas ne nur C, sed ankaŭ N, O kaj H.
La ligando fenilmaleimido-metilvinila izocianato estis elektita por modifi la surfacon de la siliciaj partikloj pro ĝiaj polusaj fenilmaleimidaj kaj vinilizocianataj grupoj. Vinilizocianataj grupoj povas plue reagi kun stireno per vivanta radikala polimerigo. La dua kialo estas enmeti grupon, kiu havas moderajn interagojn kun la analito kaj neniujn fortajn elektrostatikajn interagojn inter la analito kaj la stacionara fazo, ĉar la fenilmaleimida parto ne havas virtualan ŝargon je normala pH. La poluseco de la stacionara fazo povas esti kontrolita per la optimuma kvanto de stireno kaj la reakcia tempo de la libera radikala polimerigo. La fina paŝo de la reakcio (libera radikala polimerigo) estas kritika, ĉar ĝi ŝanĝas la polusecon de la stacionara fazo. Elementa analizo estis efektivigita por kontroli la karbonan enhavon en ĉi tiuj stacionaraj fazoj. Oni observis, ke pliigo de la kvanto de stireno kaj la reakcia tempo pliigas la karbonan enhavon de la stacionara fazo kaj inverse. SP-oj preparitaj kun malsamaj koncentriĝoj de stireno havas malsamajn karbonajn ŝarĝojn. Simile, ĉi tiuj senmovaj fazoj estis metitaj sur kolonojn el neoksidebla ŝtalo kaj iliaj kromatografiaj karakterizaĵoj (selektiveco, distingivo, N-valoro, ktp.) estis kontrolitaj. Surbaze de ĉi tiuj eksperimentoj, optimumigita konsisto por la preparado de la PMP-senmova fazo estis elektita por provizi kontrolitan polusecon kaj bonan retenon de la analito.
La PMP-kolumno ankaŭ estis taksita por la analizo de kvin miksaĵoj de peptidoj (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leŭcino-enkefalino) uzante la kapaciton de la movebla fazo. 60/40 (v/v) ACN/akvo (0.1% TFA) je flukvanto de 80 µl/min. Sub optimumaj eluciaj kondiĉoj (200 000 platoj/m²), la nombro de teoriaj platoj (N) por kolumno (100 × 1.8 mm) estas 20 000 ± 100. La N-valoroj por la tri PMP-kolumnoj estas montritaj en Tabelo 3 kaj la kromatogramoj estas montritaj en Figuro 5A. Rapida analizo je alta flukvanto (700 µl/min) sur PMP-kolumno, kvin peptidoj eluitaj ene de unu minuto, bonega N-valoro de 13 500 ± 330 por kolumno (100 x 1,8 mm diametro), ekvivalenta al 135 000 platoj/m² (Fig. 5B). Tri kolumnoj de la sama grandeco (interna diametro 100 x 1,8 mm) estis plenigitaj per tri malsamaj aroj de PMP-stacionara fazo por testi reprodukteblecon. Analitoj estis registritaj por ĉiu kolumno apartigante la saman testmiksaĵon sur ĉiu kolumno uzante optimumajn eluajn kondiĉojn, nombron de teoriaj platoj N, kaj retentempon. La reprodukteblecaj datumoj por la PMP-kolumnoj estas montritaj en Tabelo 4. La reproduktebleco de la PMP-kolumno bone korelaciis kun tre malaltaj %RSD-valoroj kiel montrite en Tabelo 3.
Apartigo de peptidaj miksaĵoj sur PMP-kolumno (B) kaj Ascentis Express RP-Amide-kolumno (A), movebla fazo 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP-kolumnaj dimensioj (100 x 1.8 mm id), analizo. Elua ordo de kombinaĵoj: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) kaj 5 (leuka acido-enkefalino).
PMP-kolumno (interna diametro 100 x 1.8 mm) estis taksita por la apartigo de la triptika hidrolizaĵo de homa seruma albumino per HPLC. La kromatogramo en Figuro 6 montras, ke la specimenoj estas bone apartigitaj kun tre bona distingivo. HSA-solvaĵoj estis analizitaj uzante flukvanton de 100 μl/min, moveblan fazon de 70/30 acetonitrilo/akvo kaj 0.1% TFA. La disigo de HSA estis dividita en 17 pintojn, kiel montrite en la kromatogramo (Figuro 6), respondantajn al 17 peptidoj. La apartigaj efikecoj de individuaj pintoj de la HSA-hidrolizaĵo estis kalkulitaj kaj la valoroj estas montritaj en Tabelo 5.
HSA-triptikaj hidrolizaĵoj estis apartigitaj sur PMP-kolono (interna diametro 100 x 1,8 mm), flukvanto (100 μl/min), movebla fazo 60/40 acetonitrilo/akvo, kaj 0,1% TFA.
kie L estas la longo de la kolono, η estas la viskozeco de la movebla fazo, ΔP estas la kontraŭpremo de la kolono, kaj u estas la lineara rapido de la movebla fazo. La permeablo de la PMP-kolono estis 2,5 × 10–14 m2, la flukvanto estis 25 µl/min, 60/40 v/v estis uzata. ACN/akvo. La permeablo de la PMP-kolono (ID 100 × 1,8 mm) estis simila al tiu de nia antaŭa studo Ref.34. La permeablo de kolono plenigita per supraĵe poraj partikloj estas 1,7×10,6 µm, 2,5×10-14 m2 por 5 µm partikloj43. Tial, la permeablo de la PMP-fazo estas simila al la permeablo de kerno-ŝelaj partikloj kun grandeco de 5 μm.
kie Wx estas la maso de la kolono plenigita per kloroformo, Wy estas la maso de la kolono plenigita per metanolo, kaj ρ estas la denseco de la solvilo. Denseco de metanolo (ρ = 0,7866) kaj kloroformo (ρ = 1,484). La totala poreco de la silikoksida-C18-partikla kolono (100 × 1,8 mm ID)34 kaj nia antaŭe studita C18-ureo31 kolono estis 0,63 kaj 0,55, respektive. Ĉi tio signifas, ke la ĉeesto de ureo-ligandoj reduktas la permeablon de la senmova fazo. Aliflanke, la totala poreco de la PMP-kolono (interna diametro 100 × 1,8 mm) estas 0,60. PMP-kolonoj estas malpli permeablaj ol kolonoj plenigitaj per C18-ligitaj silikoksidaj partikloj, ĉar en C18-tipaj senmovaj fazoj la C18-ligandoj estas ligitaj al la silikoksidaj partikloj en liniaj ĉenoj, dum en polistirenaj tipaj senmovaj fazoj relative dika polimero formiĝas ĉirkaŭ la partikloj. tavolo A. En tipa eksperimento, la poreco de la kolono estas kalkulata jene:
En fig. 7A, B montras Van Deemter-diagramojn por PMP-kolumno (interna diametro 100 x 1.8 mm) kaj Ascentis Express RP-Amide-kolumno (interna diametro 100 x 1.8 mm) sub la samaj eluaj kondiĉoj, 60/40 ACN/H2O kaj 0.1% TFA 20 µl/min ĝis 800 µl/min sur ambaŭ kolumnoj. La minimumaj HETP-valoroj ĉe la optimuma flukvanto (80 µl/min) estis 2.6 µm kaj 3.9 µm por la PMP-kolumno kaj la Ascentis Express RP-Amide-kolumno, respektive. La HETP-valoroj montras, ke la apartiga efikeco de la PMP-kolumno (100 x 1.8 mm interna diametro) estas multe pli alta ol tiu de la komerce havebla Ascentis Express RP-Amide-kolumno (100 x 1.8 mm interna diametro). La grafikaĵo de van Deemter en Fig. 7(A) montras, ke la malpliiĝo de N-valoro ne estas signife pli alta kun kreskanta fluo kompare kun nia antaŭa studo. La pli alta apartiga efikeco de la PMP-kolumno (interna diametro 100 × 1,8 mm) kompare kun la Ascentis Express RP-Amida kolumno baziĝas sur la plibonigita partikla formo kaj grandeco kaj la sofistika kolumna paka proceduro uzata en la nuna laboro34.
(A) Van Deemter-diagramo (HETP kontraŭ lineara rapido de la movebla fazo) akirita sur PMP-kolumno (interna diametro 100 x 1,8 mm) en 60/40 ACN/H2O kun 0,1% TFA. (B) Van Deemter-diagramo (HETP kontraŭ lineara rapido de la movebla fazo) akirita sur Ascentis Express RP-Amide-kolumno (interna diametro 100 x 1,8 mm) en 60/40 ACN/H2O kun 0,1% TFA.
Polusa senmova fazo el interkalaciita polistireno estis preparita kaj taksita por la apartigo de miksaĵo de sintezaj peptidoj kaj triptika hidrolizato de homa seruma albumino (HSA) en alt-efikeca likva kromatografio. La kromatografia agado de PMP-kolonoj por peptidaj miksaĵoj estas bonega rilate al apartiga efikeco kaj rezolucio. La plibonigita apartiga efikeco de PMP-kolonoj ŝuldiĝas al pluraj kialoj, kiel ekzemple la grandeco de silikaj partikloj kaj porgrandeco, kontrolita sintezo de senmovaj fazoj, kaj kompleksaj kolumnaj pakaj materialoj. Aldone al la alta apartiga efikeco, alia avantaĝo de ĉi tiu senmova fazo estas la malalta kolumna malantaŭa premo ĉe altaj flurapidecoj. PMP-kolonoj estas tre reprodukteblaj kaj povas esti uzataj por analizi miksaĵojn de peptidoj kaj triptikan digestadon de diversaj proteinoj. Ni intencas uzi ĉi tiun kolonon por la apartigo de bioaktivaj kombinaĵoj de naturaj produktoj, ekstraktoj de kuracherboj kaj fungoj en likva kromatografio. Estonte, PMP-kolonoj ankaŭ estos taksitaj por la apartigo de proteinoj kaj monoklonaj antikorpoj.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Esploro pri inversfazaj kromatografiaj peptidaj apartigsistemoj parto I: Evoluigo de protokolo por kolumna karakterizado. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Esploro pri inversfazaj kromatografiaj peptidaj apartigsistemoj parto I: Evoluigo de protokolo por kolumna karakterizado.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., kaj Petersson, P. Esploro de Peptidaj Apartigaj Sistemoj per Inversa Faza Kromatografio, Parto I: Evoluigante Protokolon por Kolona Karakterizado. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Esploro pri inversfazaj kromatografiaj peptidaj apartigsistemoj parto I: Evoluigo de protokolo por kolumnaj karakterizaĵoj. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Esploro pri inversfazaj kromatografiaj peptidaj apartigsistemoj parto I: Evoluigo de protokolo por kolumnaj karakterizaĵoj.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., kaj Petersson, P. Esploro de Peptidaj Apartigaj Sistemoj per Inversa Faza Kromatografio, Parto I: Evoluigante Protokolon por Kolona Karakterizado.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Metodoj por krei plibonigitajn aktivajn peptidojn por la traktado de infektaj malsanoj. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintezaj terapiaj peptidoj: Scienco kaj merkato. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintezaj terapiaj peptidoj: Scienco kaj merkato.Vliege P, Lisowski V, Martinez J kaj Chreschatyski M. Sintezaj terapiaj peptidoj: scienco kaj merkato.Vliege P, Lisowski V, Martinez J kaj Khreschatsky M. Sintezaj terapiaj peptidoj: scienco kaj merkato. malkovro de medikamentoj. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Altnivela proteomika likva kromatografio. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Altnivela proteomika likva kromatografio.Vidu F., Smith RD kaj Shen Yu. Altnivela proteomika likva kromatografio. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Altnivela proteinkonsisto 液相色谱。Vidu F., Smith RD kaj Shen Yu. Altnivela proteomika likva kromatografio.J. Kromatografio. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Altnivela likva kromatografio-amasa spektrometrio kapablas kombini larĝbazan metabolomikon kaj proteomikon. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ La rolo de UHPLC en farmacia disvolviĝo. Chesnut, SM & Salisbury, JJ La rolo de UHPLC en farmacia disvolviĝo.Chesnut, SM kaj Salisbury, JJ La rolo de UHPLC en farmacia disvolviĝo.Chesnut, SM kaj Salisbury, JJ La rolo de UHPLC en medikamentevoluigo. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentaj kaj praktikaj aspektoj de ultraalta premo likva kromatografio por rapidaj apartigoj. Wu, N. & Clausen, AM Fundamentaj kaj praktikaj aspektoj de ultraalta premo likva kromatografio por rapidaj apartigoj.Wu, N. kaj Clausen, AM Fundamentaj kaj praktikaj aspektoj de altprema likva kromatografio por rapida apartigo. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Bazaj kaj praktikaj aspektoj de ultra-altaprema likva kromatografio por rapida apartigo.Wu, N. kaj Clausen, AM Fundamentaj kaj praktikaj aspektoj de altprema likva kromatografio por rapida apartigo.J. Sept. Scienco. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Uzo de ultra-efikeca likva kromatografio en farmacia disvolviĝo. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Uzo de ultra-efikeca likva kromatografio en farmacia disvolviĝo.Ren, SA kaj Chelischeff, P. La uzo de ultra-alta rendimenta likva kromatografio en farmacia disvolviĝo. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA kaj Tchelitcheff, P.Ren, SA kaj Chelischeff, P. Apliko de ultra-efikeca likva kromatografio en medikamentevoluigo.J. Kromatografio. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolita makropora hidroĝelo derivita de oleo-en-akva emulsio kun alta interna fazo por efika purigo de enteroviruso 71. Kemia projekto. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA La rolo de likva kromatografio en proteomiko. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA La rolo de likva kromatografio en proteomiko.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. kaj Wilkins, JA La rolo de likva kromatografio en proteomiko. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. kaj Wilkins, JA La rolo de likva kromatografio en proteomiko.J. Kromatografio. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Novaj tendencoj en inversfazaj likvaj kromatografiaj apartigoj de terapiaj peptidoj kaj proteinoj: Teorio kaj aplikoj. & Guillarme, D. Novaj tendencoj en inversfazaj likvaj kromatografiaj apartigoj de terapiaj peptidoj kaj proteinoj: Teorio kaj aplikoj. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жомощью жомодкосогоских с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Novaj tendencoj en la apartigo de terapiaj peptidoj kaj proteinoj per inversfaza likva kromatografio: teorio kaj aplikoj. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.kaj Guillarmé, D. Novaj tendencoj en la apartigo de terapiaj peptidoj kaj proteinoj per inversfaza likva kromatografio: teorio kaj aplikoj.J. Pharm. Biomedicina Scienco. anuso. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Du-dimensia apartigo de peptidoj uzante RP-RP-HPLC-sistemon kun malsama pH en la unua kaj dua apartigaj dimensioj. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Du-dimensia apartigo de peptidoj uzante RP-RP-HPLC-sistemon kun malsama pH en la unua kaj dua apartigaj dimensioj.Gilar M., Olivova P., Dali AE kaj Gebler JK Du-dimensia apartigo de peptidoj uzante la RP-RP-HPLC-sistemon kun malsama pH en la unua kaj dua apartigaj dimensioj.Gilar M., Olivova P., Dali AE kaj Gebler JK Dudimensia apartigo de peptidoj uzante malsamajn pH-valorojn en la unua kaj dua apartigaj dimensioj uzante la RP-RP-HPLC-sistemon. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Esploro pri la amastranslokigo kaj kinetikaj karakterizaĵoj de alt-efikecaj kromatografiaj kolumnoj plenigitaj per tute poraj kaj supraĵe poraj C18-partikloj pli malgrandaj ol 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Lastatempaj tendencoj kaj analizaj defioj en la izolado, identigo kaj validigo de plantaj bioaktivaj peptidoj. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomika pejzaĝo de la regno de vivo. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Posttraktado de terapiaj peptidoj per prepara likva kromatografio. Molecules (Bazel, Svislando) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Miksitreĝima kromatografio kaj ĝiaj aplikoj al biopolimeroj. Yang, Y. & Geng, X. Miksitreĝima kromatografio kaj ĝiaj aplikoj al biopolimeroj.Yang, Yu. kaj Geng, X. Miksitreĝima kromatografio kaj ĝia apliko al biopolimeroj. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Miksitreĝima kromatografio kaj ĝia apliko en biopolimeroj.Yang, Yu. kaj Gene, X. Miksitreĝima kromatografio kaj ĝia apliko al biopolimeroj.J. Kromatografio. A 1218(49), 8813–8825 (2011).