Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažuriranu verziju preglednika (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, stranicu prikazujemo bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje vrtuljak s tri slajda odjednom. Koristite gumbe Prethodno i Sljedeće za pomicanje kroz tri slajda odjednom ili upotrijebite klizače na kraju za pomicanje kroz tri slajda odjednom.
Porozne čestice silicijevog dioksida pripremljene su sol-gel metodom s nekim modifikacijama kako bi se dobile čestice širokih pora. Ove čestice su derivatizirane s N-fenilmaleimid-metilvinil izocijanatom (PMI) i stirenom putem polimerizacije s obrnutim prijenosom lanca i fragmentacijom (RAFT) kako bi se dobili poliamidi interkalirani s N-fenilmaleimidom. Stacionarna faza stirena (PMP). Kolone od nehrđajućeg čelika uskog promjera (unutarnjeg promjera 100 × 1,8 mm) bile su punjene suspenzijom. Kromatografske performanse PMP kolone procijenjene su kako bi se odvojila smjesa sintetskih peptida koja se sastoji od pet peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminokiselina enkefalin) i triptični hidrolizat humanog serumskog albumina (HAS). Pod optimalnim uvjetima eluiranja, teorijski broj ploča sa smjesom peptida dosegao je 280 000 ploča/m². Uspoređujući učinkovitost separacije razvijene kolone s komercijalnom Ascentis Express RP-Amide kolonom, uočeno je da je učinkovitost separacije PMP kolone bila superiornija u odnosu na komercijalnu kolonu u smislu učinkovitosti separacije i rezolucije.
Biofarmaceutska industrija postala je rastuće globalno tržište sa značajnim povećanjem tržišnog udjela posljednjih godina. S eksplozivnim rastom biofarmaceutske industrije1,2,3 postoji velika potreba za analizom peptida i proteina. Osim ciljnog peptida, tijekom sinteze peptida nastaju razne nečistoće, pa je potrebno kromatografsko pročišćavanje kako bi se postigla željena čistoća peptida. Analiza i karakterizacija proteina u tjelesnim tekućinama, tkivima i stanicama izuzetno je izazovan zadatak zbog velikog broja potencijalno detektabilnih vrsta prisutnih u jednom uzorku. Iako je masena spektrometrija učinkovit alat za sekvenciranje peptida i proteina, ako se takvi uzorci izravno unesu u maseni spektrometar, odvajanje će biti nezadovoljavajuće. Ovaj se problem može riješiti provođenjem tekućinske kromatografije (LC) prije MS analize, što će smanjiti količinu analita koji ulaze u maseni spektrometar u određenom trenutku4,5,6. Osim toga, analiti se mogu koncentrirati u uskom području tijekom odvajanja tekuće faze, čime se ti analiti koncentriraju i povećava osjetljivost MS detekcije. Tekućinska kromatografija (LC) značajno je napredovala tijekom posljednjeg desetljeća i postala je široko korištena metoda za proteomsku analizu7,8,9,10.
Tekućinska kromatografija obrnute faze (RP-LC) široko se koristi za pročišćavanje i odvajanje smjesa peptida korištenjem oktadecil-modificiranog silicija (ODS) kao stacionarne faze11,12,13. Međutim, zbog svoje složene strukture i amfoterne prirode,14,15 RP stacionarne faze ne mogu osigurati zadovoljavajuće odvajanje peptida i proteina. Stoga, analiza peptida i proteina s polarnim i nepolarnim fragmentima zahtijeva posebno dizajnirane stacionarne faze za interakciju i zadržavanje ovih analita16. Mješovita kromatografija, koja nudi multimodalne interakcije, može biti alternativa RP-LC za odvajanje peptida, proteina i drugih složenih smjesa. Pripremljeno je nekoliko stacionarnih faza miješanog tipa, a kolone napunjene tim stacionarnim fazama korištene su za odvajanje peptida i proteina17,18,19,20,21. Zbog prisutnosti polarnih i nepolarnih skupina, stacionarne faze miješanog načina rada (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polarna interkalacija/RPLC) prikladne su za odvajanje peptida i proteina22,23,24,25,26,27,28. , polarne interkalirane stacionarne faze s kovalentno vezanim polarnim skupinama pokazuju dobre mogućnosti odvajanja i jedinstvenu selektivnost za polarne i nepolarne analite jer odvajanje ovisi o interakciji između analita i stacionarne faze. Multimodalne interakcije 29,30,31,32. Nedavno su Zhang i sur. 30 dobili behenil-terminirane stacionarne faze poliamina i uspješno odvojili ugljikovodike, antidepresive, flavonoide, nukleozide, estrogene i neke druge analite. Polarno ugrađeni stacionarni materijal ima i polarne i nepolarne skupine, pa se može koristiti za odvajanje peptida i proteina na hidrofobne i hidrofilne dijelove. Polarne linijske kolone (npr. C18 kolone s linijskim amidom) dostupne su pod trgovačkim nazivom Ascentis Express RP-Amide kolone, ali te su kolone korištene samo za analizu amina 33.
U ovoj studiji, pripremljena je polarna ugrađena stacionarna faza (N-fenilmaleimid, ugrađeni polistiren) i procijenjena za odvajanje peptida i tripsinsko cijepanje HSA. Za pripremu stacionarne faze korištena je sljedeća strategija. Porozne čestice silicija pripremljene su prema postupcima opisanim u našim prethodnim publikacijama, s nekim promjenama u shemama pripreme 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Omjeri uree, polietilen glikola (PEG), TMOS-a i vodeno-octene kiseline prilagođeni su kako bi se dobile čestice silicija s velikim veličinama pora. Drugo, sintetiziran je novi fenilmaleimid-metilvinil izocijanatni ligand i njegove derivatizirane čestice silicija korištene su za pripremu polarnih ugrađenih stacionarnih faza. Dobivena stacionarna faza pakirana je u kolonu od nehrđajućeg čelika (unutarnji promjer 100 × 1,8 mm) prema optimiziranoj shemi pakiranja. Pakiranje kolone potpomognuto je mehaničkim vibracijama kako bi se osigurao jednoličan sloj unutar kolone. Napunjena kolona je procijenjena za odvajanje smjese peptida koja se sastoji od pet peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin peptid) i triptinskih hidrolizata humanog serumskog albumina (HSA). Uočeno je da se smjesa peptida i triptinska digestija HSA odvajaju s dobrom rezolucijom i učinkovitošću. Učinkovitost odvajanja PMP kolone uspoređena je s onom Ascentis Express RP-Amide kolone. Uočeno je da peptidi i proteini imaju dobru rezoluciju i visoku učinkovitost odvajanja na PMP koloni, a učinkovitost odvajanja PMP kolone je veća od one Ascentis Express RP-Amide kolone.
PEG (polietilen glikol), urea, octena kiselina, trimetoksiortosilikat (TMOS), trimetilklorosilan (TMCS), tripsin, humani serumski albumin (HSA), amonijev klorid, urea, heksametilmetakriloildisilazan (HMDS), metakriloil klorid (MC), stiren, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksid (BPO), acetonitril (ACN) za HPLC, metanol, 2-propanol i aceton. Tvrtka Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, SAD).
Smjesa uree (8 g), polietilen glikola (8 g) i 8 ml 0,01 N. octene kiseline miješana je 10 minuta, a zatim je dodano 24 ml TMOS-a uz hlađenje ledom. Reakcijska smjesa zagrijavana je na 40 °C tijekom 6 sati, a zatim na 120 °C tijekom 8 sati u autoklavu od nehrđajućeg čelika. Voda je dekantirana, a ostatak je sušen na 70 °C tijekom 12 sati. Osušeni mekani blokovi su glatko samljeveni i kalcinirani u pećnici na 550 °C tijekom 12 sati. Pripremljene su i karakterizirane tri serije kako bi se testirala ponovljivost veličina čestica, veličine pora i površine.
Polarna skupina i stacionarna faza za polistirenske lance. Postupak pripreme opisan je u nastavku.
N-fenilmaleimid (200 mg) i metil vinil izocijanat (100 mg) otopljeni su u bezvodnom toluenu, a zatim je u reakcijsku tikvicu dodano 0,1 ml 2,2'-azoizobutironitrila (AIBN) kako bi se dobio kopolimer fenilmaleimida i metil vinil izocijanata (PMCP). Smjesa je zagrijavana na 60 °C tijekom 3 sata, filtrirana i sušena u pećnici na 40 °C tijekom 3 sata.
Osušene čestice silicija (2 g) dispergirane su u suhom toluenu (100 ml), miješane i sonicirane 10 minuta u tikvici s okruglim dnom od 500 ml. PMCP (10 mg) otopljen je u toluenu i kap po kap dodan u reakcijsku tikvicu putem lijevka za dodavanje. Smjesa je refluksirana na 100 °C tijekom 8 sati, filtrirana, isprana acetonom i sušena na 60 °C tijekom 3 sata. Zatim su čestice silicija povezane s PMCP-om (100 g) otopljene u toluenu (200 ml) i dodan je 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) u prisutnosti 100 μl dibutilkositrovog dilaurata kao katalizatora. Smjesa je miješana na 50 °C tijekom 8 sati, filtrirana i sušena na 50 °C tijekom 3 sata.
Stiren (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) i čestice silicijevog dioksida vezane za TEMPO-PMCP (1,5 g) dispergirane su u toluenu i propuhane dušikom. Polimerizacija stirena provedena je na 100 °C tijekom 12 sati. Dobiveni produkt ispran je metanolom i sušen preko noći na 60 °C. Opća shema reakcije prikazana je na sl. 1.
Uzorci su degazirani na 393 K tijekom 1 sata dok se nije postigao rezidualni tlak manji od 10–3 Torr. Količina N2 adsorbiranog pri relativnom tlaku P/P0 = 0,99 korištena je za određivanje ukupnog volumena pora. Morfologija čistih i ligandima vezanih čestica silicija ispitana je pomoću skenirajućeg elektronskog mikroskopa (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Suhi uzorci (čisti silicijev dioksid i čestice silicija vezane ligandima) postavljeni su na aluminijske šipke pomoću ugljične trake. Zlato je naneseno na uzorak pomoću uređaja za raspršivanje Q150T, a na uzorak je nanesen sloj Au debljine 5 nm. To poboljšava učinkovitost niskonaponskog procesa i omogućuje fino hladno raspršivanje. Elementarna analiza provedena je pomoću analizatora elementarnog sastava Thermo Electron (Waltham, MA, SAD) Flash EA1112. Za dobivanje raspodjele veličine čestica korišten je analizator veličine čestica Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000. Neobložene čestice silicija i čestice silicija vezane za ligand (5 mg svaka) dispergirane su u 5 ml izopropanola, sonicirane 10 minuta, miješane 5 minuta i stavljene na optički stol Mastersizer. Termogravimetrijska analiza provodi se brzinom od 5 °C u minuti u temperaturnom rasponu od 30 do 800 °C.
Kolone od nehrđajućeg čelika uskog promjera obložene staklenim vlaknima dimenzija (ID 100 × 1,8 mm) pakirane su metodom punjenja suspenzijom slijedeći isti postupak kao u referenci 31. Kolona od nehrđajućeg čelika (obložena staklom, ID 100 × 1,8 mm) i izlaz koji sadrži fritu od 1 µm spojeni su na stroj za pakiranje suspenzijom (Alltech Deerfield, IL, SAD). Pripremite suspenziju stacionarne faze suspendiranjem 150 mg stacionarne faze u 1,2 ml metanola i uvođenjem u kolonu sa spremnikom. Metanol je korišten kao otapalo za suspenziju i kontrolno otapalo. Napunite kolonu primjenom niza tlakova od 100 MP tijekom 10 minuta, 80 MP tijekom 15 minuta i 60 MP tijekom 30 minuta. U procesu pakiranja korištena su dva vibratora plinske kromatografije (Alltech, Deerfield, IL, SAD) za mehaničke vibracije kako bi se osiguralo jednoliko pakiranje kolone. Zatvorite pakirnicu suspenzije i polako otpustite tlak kako biste spriječili oštećenje niza. Kolona je odvojena od mlaznice za suspenziju, a drugi priključak je pričvršćen na ulaz i spojen na LC sustav kako bi se testirao njezin rad.
Prilagođeni MLC konstruiran je korištenjem LC pumpe (10AD Shimadzu, Japan), uzorkivača s injekcijskom petljom od 50 nL (Valco (SAD) C14 W.05), membranskog degazatora (Shimadzu DGU-14A) i UV-VIS kapilarnog prozora. Detektorski uređaj (UV-2075) i emajlirana mikrokolona. Koristite vrlo uske i kratke spojne cijevi kako biste smanjili učinak dodatnog širenja kolone. Nakon punjenja kolone, instalirajte kapilaru (50 µm id 365) na izlazu redukcijskog spoja od 1/16″ i instalirajte kapilaru (50 µm) redukcijskog spoja. Prikupljanje podataka i obrada kromatograma provode se pomoću softvera Multichro 2000. Na 254 nm, UV apsorbancija analita praćena je na 0. Kromatografski podaci analizirani su pomoću OriginPro8 (Northampton, MA).
Ljudski serumski albumin, liofilizirani prašak, ≥ 96% (elektroforeza na agaroznom gelu) 3 mg pomiješano s tripsinom (1,5 mg), 4,0 M ureom (1 ml) i 0,2 M amonijevim bikarbonatom (1 ml). Otopina je miješana 10 minuta i držana u vodenoj kupelji na 37°C tijekom 6 sati, zatim ugašena s 1 ml 0,1% TFA. Otopina se filtrira i čuva na temperaturi ispod 4°C.
Razdvajanje smjese peptida i tripsinski razgrađenog HSA na PMP koloni procijenjeno je odvojeno. Provjerite tripsinsku hidrolizu smjese peptida i HSA razdvojenih PMP kolonom i usporedite rezultate s Ascentis Express RP-Amide kolonom. Broj teorijskih tanjura izračunava se pomoću sljedeće jednadžbe:
SEM slike čistih čestica silicija i čestica silicija vezanih ligandom prikazane su na slici 2. SEM slike čistih čestica silicija (A, B) pokazuju sferni oblik u kojem su čestice izdužene ili imaju nepravilnu simetriju u usporedbi s našim prethodnim studijama. Površina čestica silicija vezanih ligandom (C, D) je glatkija od površine čistih čestica silicija, što može biti posljedica polistirenskih lanaca koji prekrivaju površinu čestica silicija.
Skenirajuće elektronske mikrografije čistih čestica silicija (A, B) i čestica silicija vezanih za ligand (C, D).
Raspodjela veličine čestica čistog silicijevog dioksida i čestica silicijevog dioksida vezanih za ligand prikazana je na slici 2.3(A). Krivulje volumetrijske raspodjele veličine čestica pokazale su da se veličina čestica silicijevog dioksida povećala nakon kemijske modifikacije (slika 3A). Podaci o raspodjeli veličine čestica silicijevog dioksida iz trenutne i prethodne studije uspoređeni su u tablici 1(A). Volumetrijska veličina čestica d(0,5) PMP-a bila je 3,36 µm, u usporedbi s vrijednošću ad(0,5) od 3,05 µm u našoj prethodnoj studiji (čestice silicijevog dioksida vezane za polistiren)34. Zbog promjene omjera PEG-a, uree, TMOS-a i octene kiseline u reakcijskoj smjesi, raspodjela veličine čestica ove serije bila je uža u usporedbi s našom prethodnom studijom. Veličina čestica PMP faze nešto je veća od veličine čestica faze silicijevog dioksida vezanog za polistiren koju smo ranije proučavali. To znači da je površinska funkcionalizacija čestica silicija stirenom nanijela samo sloj polistirena (0,97 µm) na površinu silicija, dok je u PMP fazi debljina sloja bila 1,38 µm.
Raspodjela veličine čestica (A) i raspodjela veličine pora (B) čistih čestica silicija i čestica silicija vezanih za ligand.
Veličina pora, volumen pora i površina čestica silicija korištenih u ovoj studiji prikazani su u Tablici 1 (B). PSD profili čistih čestica silicija i čestica silicija vezanih ligandima prikazani su na Slikama 3 (B). Rezultati su usporedivi s našom prethodnom studijom34. Veličine pora čistih i čestica silicija vezanih ligandima bile su 310 Å odnosno 241 Å, što ukazuje da se nakon kemijske modifikacije veličina pora smanjila za 69 Å, kao što je prikazano u Tablici 1 (B), a krivulja pomaka prikazana je na Slici 3. Specifična površina čestica silicija u trenutnoj studiji iznosi 116 m2/g, što je usporedivo s našom prethodnom studijom (124 m2/g). Kao što je prikazano u Tablici 1 (B), površina (m2/g) čestica silicija nakon kemijske modifikacije također se smanjila sa 116 m2/g na 105 m2/g.
Rezultati elementarne analize stacionarne faze prikazani su u Tablici 2. Sadržaj ugljika u trenutnoj stacionarnoj fazi iznosi 6,35%, što je niže nego u našoj prethodnoj studiji (čestice silicija povezane s polistirenom, 7,93%35 i 10,21%)42. Sadržaj ugljika u trenutnoj stacionarnoj fazi prikazan je ispod, budući da su neki polarni ligandi poput fenilmaleimid metil vinil izocijanata (PCMP) i 4-hidroksi-TEMPO korišteni uz stiren u pripremi SP. Težinski postotak dušika u trenutnoj stacionarnoj fazi iznosi 2,21% u usporedbi s 0,1735 i 0,85% u prethodnim studijama42. To znači da trenutna stacionarna faza ima visok težinski postotak dušika zbog fenilmaleimida. Slično tome, produkti (4) i (5) imaju sadržaj ugljika od 2,7% odnosno 2,9%, dok konačni produkt (6) ima sadržaj ugljika od 6,35%, kao što je prikazano u Tablici 2. Termogravimetrijska analiza (TGA) korištena je na stacionarnoj fazi PMP-a za testiranje gubitka težine, a TGA krivulja prikazana je na Slici 4. TGA krivulja pokazuje gubitak težine od 8,6%, što je u dobrom skladu s udjelom ugljika (6,35%), budući da ligandi sadrže ne samo C, već i N, O i H.
Ligand fenilmaleimid-metilvinil izocijanat odabran je za modificiranje površine čestica silicijevog dioksida zbog svojih polarnih fenilmaleimidnih i vinilizocijanatnih skupina. Vinil izocijanatne skupine mogu dalje reagirati sa stirenom polimerizacijom živih radikala. Drugi razlog je umetanje skupine koja ima umjerene interakcije s analitom i nema jake elektrostatske interakcije između analita i stacionarne faze, budući da fenilmaleimidni dio nema virtualni naboj pri normalnom pH. Polaritet stacionarne faze može se kontrolirati optimalnom količinom stirena i vremenom reakcije polimerizacije slobodnih radikala. Završni korak reakcije (polimerizacija slobodnih radikala) je kritičan jer mijenja polaritet stacionarne faze. Elementarna analiza provedena je kako bi se provjerio sadržaj ugljika u tim stacionarnim fazama. Uočeno je da povećanje količine stirena i vremena reakcije povećava sadržaj ugljika u stacionarnoj fazi i obrnuto. SP pripremljeni s različitim koncentracijama stirena imaju različito opterećenje ugljikom. Slično tome, ove stacionarne faze stavljene su na kolone od nehrđajućeg čelika i provjerene su njihove kromatografske karakteristike (selektivnost, rezolucija, vrijednost N2 itd.). Na temelju ovih eksperimenata odabran je optimizirani sastav za pripremu stacionarne faze PMP-a kako bi se osigurala kontrolirana polarnost i dobro zadržavanje analita.
PMP kolona je također procijenjena za analizu pet smjesa peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin) korištenjem kapaciteta mobilne faze 60/40 (v/v) ACN/voda (0,1% TFA) pri brzini protoka od 80 µl/min. Pod optimalnim uvjetima elucije (200 000 ploča/m²), broj teorijskih ploča (N) po koloni (100 × 1,8 mm) iznosi 20 000 ± 100. Vrijednosti N za tri PMP kolone prikazane su u Tablici 3, a kromatogrami su prikazani na Slici 5A. Brza analiza pri visokoj brzini protoka (700 µl/min) na PMP koloni, pet peptida eluirano unutar jedne minute, izvrsna vrijednost N od 13 500 ± 330 po koloni (promjer 100 x 1,8 mm), što je ekvivalentno 135 000 ploča/m (slika 5B). Tri kolone iste veličine (unutarnji promjer 100 x 1,8 mm) napunjene su s tri različite serije stacionarne faze PMP-a kako bi se testirala ponovljivost. Analiti su zabilježeni za svaku kolonu odvajanjem iste testne smjese na svakoj koloni korištenjem optimalnih uvjeta elucije, broja teorijskih ploča N i vremena zadržavanja. Podaci o ponovljivosti za PMP kolone prikazani su u Tablici 4. Ponovljivost PMP kolone dobro se korelirala s vrlo niskim vrijednostima %RSD-a kao što je prikazano u Tablici 3.
Razdvajanje smjesa peptida na PMP koloni (B) i Ascentis Express RP-Amide koloni (A), mobilna faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimenzije PMP kolone (100 x 1,8 mm un. promjer), analiza. Redoslijed eluiranja spojeva: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (leucinska kiselina enkefalin).
PMP kolona (unutarnjeg promjera 100 x 1,8 mm) procijenjena je za odvajanje tripsinskog hidrolizata humanog serumskog albumina HPLC-om. Kromatogram na slici 6 pokazuje da su uzorci dobro odvojeni s vrlo dobrom rezolucijom. Otopine HSA analizirane su korištenjem brzine protoka od 100 μl/min, mobilne faze acetonitrila/vode 70/30 i 0,1% TFA. Cijepanje HSA podijeljeno je na 17 vrhova, kao što je prikazano na kromatogramu (slika 6), što odgovara 17 peptida. Izračunate su učinkovitosti odvajanja pojedinačnih vrhova od hidrolizata HSA, a vrijednosti su prikazane u tablici 5.
Triptični hidrolizati HSA odvojeni su na PMP koloni (unutarnji promjer 100 x 1,8 mm), brzina protoka (100 μl/min), mobilna faza 60/40 acetonitril/voda i 0,1% TFA.
gdje je L duljina kolone, η viskoznost mobilne faze, ΔP protutlak kolone, a u linearna brzina mobilne faze. Propusnost PMP kolone bila je 2,5 × 10–14 m2, brzina protoka bila je 25 µl/min, korišten je ACN/voda omjera 60/40 v/v. Propusnost PMP kolone (ID 100 × 1,8 mm) bila je slična onoj iz naše prethodne studije Ref.34. Propusnost kolone ispunjene površinski poroznim česticama iznosi 1,7 × 10,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 za čestice od 5 µm43. Stoga je propusnost PMP faze slična propusnosti čestica s jezgrom i ljuskom veličine 5 μm.
gdje je Wx masa kolone napunjene kloroformom, Wy je masa kolone napunjene metanolom, a ρ je gustoća otapala. Gustoća metanola (ρ = 0,7866) i kloroforma (ρ = 1,484). Ukupna poroznost kolone čestica silicija-C18 (100 × 1,8 mm unutarnji promjer)34 i naše prethodno proučavane kolone C18-urea31 bila je 0,63 odnosno 0,55. To znači da prisutnost liganada uree smanjuje propusnost stacionarne faze. S druge strane, ukupna poroznost PMP kolone (unutarnji promjer 100 × 1,8 mm) iznosi 0,60. PMP kolone su manje propusne od kolona napunjenih česticama silicija vezanim za C18 jer su u stacionarnim fazama tipa C18 ligandi C18 vezani za čestice silicija u linearnim lancima, dok se u stacionarnim fazama tipa polistirena oko čestica formira relativno debeli polimer. sloj A. U tipičnom eksperimentu, poroznost kolone izračunava se na sljedeći način:
Na sl. 7A i B prikazani su Van Deemterovi dijagrami za PMP kolonu (unutarnji promjer 100 x 1,8 mm) i Ascentis Express RP-Amide kolonu (unutarnji promjer 100 x 1,8 mm) pod istim uvjetima elucije, 60/40 ACN/H2O i 0,1% TFA od 20 µl/min do 800 µl/min na obje kolone. Minimalne HETP vrijednosti pri optimalnoj brzini protoka (80 µl/min) bile su 2,6 µm i 3,9 µm za PMP kolonu i Ascentis Express RP-Amide kolonu. HETP vrijednosti pokazuju da je učinkovitost separacije PMP kolone (unutarnji promjer 100 x 1,8 mm) mnogo veća od one komercijalno dostupne Ascentis Express RP-Amide kolone (unutarnji promjer 100 x 1,8 mm). Van Deemterov graf na slici 7(A) pokazuje da smanjenje vrijednosti N nije značajno veće s povećanjem protoka u usporedbi s našom prethodnom studijom. Veća učinkovitost odvajanja PMP kolone (id 100 × 1,8 mm) u usporedbi s Ascentis Express RP-Amide kolonom temelji se na poboljšanom obliku i veličini čestica te sofisticiranom postupku pakiranja kolone koji se koristi u trenutnom radu34.
(A) Van Deemterov dijagram (HETP u odnosu na linearnu brzinu mobilne faze) dobiven na PMP koloni (unutarnji promjer 100 x 1,8 mm) u 60/40 ACN/H2O s 0,1% TFA. (B) Van Deemterov dijagram (HETP u odnosu na linearnu brzinu mobilne faze) dobiven na Ascentis Express RP-Amide koloni (unutarnji promjer 100 x 1,8 mm) u 60/40 ACN/H2O s 0,1% TFA.
Polarna stacionarna faza interkaliranog polistirena pripremljena je i procijenjena za odvajanje smjese sintetskih peptida i triptinskog hidrolizata humanog serumskog albumina (HSA) u tekućinskoj kromatografiji visoke učinkovitosti. Kromatografske performanse PMP kolona za smjese peptida izvrsne su u smislu učinkovitosti odvajanja i rezolucije. Poboljšana učinkovitost odvajanja PMP kolona posljedica je nekoliko razloga kao što su veličina čestica silicija i veličina pora, kontrolirana sinteza stacionarnih faza i složeni materijali za pakiranje kolone. Osim visoke učinkovitosti odvajanja, još jedna prednost ove stacionarne faze je nizak povratni tlak kolone pri visokim protocima. PMP kolone su visoko reproducibilne i mogu se koristiti za analizu smjesa peptida i triptinsku razgradnju različitih proteina. Namjeravamo koristiti ovu kolonu za odvajanje bioaktivnih spojeva od prirodnih proizvoda, ekstrakata ljekovitog bilja i gljiva u tekućinskoj kromatografiji. U budućnosti će se PMP kolone također procijeniti za odvajanje proteina i monoklonskih antitijela.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Istraživanje sustava za odvajanje peptida reverzno-faznom kromatografijom, I. dio: Razvoj protokola za karakterizaciju kolone. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Istraživanje sustava za odvajanje peptida reverzno-faznom kromatografijom, I. dio: Razvoj protokola za karakterizaciju kolone.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. i Petersson, P. Istraživanje sustava za odvajanje peptida reverzno-faznom kromatografijom, I. dio: Razvoj protokola za karakterizaciju kolone. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Istraživanje sustava za odvajanje peptida reverzno-faznom kromatografijom, I. dio: Razvoj protokola za karakteristike kolone. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Istraživanje sustava za odvajanje peptida reverzno-faznom kromatografijom, I. dio: Razvoj protokola za karakteristike kolone.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. i Petersson, P. Istraživanje sustava za odvajanje peptida reverzno-faznom kromatografijom, I. dio: Razvoj protokola za karakterizaciju kolone.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. i dr. Metode za stvaranje poboljšanih aktivnih peptida za liječenje zaraznih bolesti. Biotehnologija. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetski terapijski peptidi: znanost i tržište. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetski terapijski peptidi: znanost i tržište.Vliege P, Lisowski V, Martinez J i Chreschatyski M. Sintetski terapijski peptidi: znanost i tržište.Vliege P, Lisowski V, Martinez J i Khreschatsky M. Sintetski terapijski peptidi: znanost i tržište. Otkriće lijekova. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Napredna proteomska tekućinska kromatografija. Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Napredna proteomska tekućinska kromatografija.Vidi F., Smith RD i Shen Yu. Napredna proteomska tekućinska kromatografija. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Napredni sastav proteina 液相色谱。Vidi F., Smith RD i Shen Yu. Napredna proteomska tekućinska kromatografija.J. Kromatografija. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. i dr. Napredna tekućinska kromatografija-masena spektrometrija može kombinirati široko zasnovanu metabolomiku i proteomiku. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM i Salisbury, JJ Uloga UHPLC-a u farmaceutskom razvoju. Chesnut, SM i Salisbury, JJ Uloga UHPLC-a u farmaceutskom razvoju.Chesnut, SM i Salisbury, JJ Uloga UHPLC-a u farmaceutskom razvoju.Chesnut, SM i Salisbury, JJ Uloga UHPLC-a u razvoju lijekova. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Temeljni i praktični aspekti ultravisokotlačne tekućinske kromatografije za brza odvajanja. Wu, N. & Clausen, AM Temeljni i praktični aspekti ultravisokotlačne tekućinske kromatografije za brza odvajanja.Wu, N. i Clausen, AM Temeljni i praktični aspekti visokotlačne tekućinske kromatografije za brzo odvajanje. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Osnovni i praktični aspekti ultravisokotlačne tekućinske kromatografije za brzo odvajanje.Wu, N. i Clausen, AM Temeljni i praktični aspekti visokotlačne tekućinske kromatografije za brzo odvajanje.J. rujan. Znanost. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA i Tchelitcheff, P. Upotreba ultraučinkovite tekućinske kromatografije u farmaceutskom razvoju. Wren, SA i Tchelitcheff, P. Upotreba ultraučinkovite tekućinske kromatografije u farmaceutskom razvoju.Ren, SA i Chelischeff, P. Upotreba tekućinske kromatografije ultra visoke učinkovitosti u farmaceutskom razvoju. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA i Tchelitcheff, P.Ren, SA i Chelischeff, P. Primjena ultraučinkovite tekućinske kromatografije u razvoju lijekova.J. Kromatografija. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. i dr. Monolitni makroporozni hidrogel dobiven iz emulzije ulja u vodi s visokim udjelom unutarnje faze za učinkovito pročišćavanje enterovirusa 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA Uloga tekućinske kromatografije u proteomici. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA Uloga tekućinske kromatografije u proteomici.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. i Wilkins, JA Uloga tekućinske kromatografije u proteomici. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. i Wilkins, JA Uloga tekućinske kromatografije u proteomici.J. Kromatografija. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Novi trendovi u separacijama terapeutskih peptida i proteina tekućinskom kromatografijom obrnute faze: Teorija i primjena. & Guillarme, D. Novi trendovi u separacijama terapeutskih peptida i proteina tekućinskom kromatografijom obrnute faze: Teorija i primjena. & Guillarme, D. Nove tendencije u dijeljenju terapeutskih peptida i bijelih uz pomoć tjelesne kromatografije s obrađenom fazom: teorija i aplikacije. & Guillarme, D. Novi trendovi u odvajanju terapijskih peptida i proteina reverzno-faznom tekućinskom kromatografijom: teorija i primjena. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.i Guillarmé, D. Novi trendovi u odvajanju terapijskih peptida i proteina reverzno-faznom tekućinskom kromatografijom: teorija i primjena.J. Pharm. Biomedical Science. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC Dvodimenzionalno odvajanje peptida korištenjem RP-RP-HPLC sustava s različitim pH u prvoj i drugoj dimenziji odvajanja. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC Dvodimenzionalno odvajanje peptida korištenjem RP-RP-HPLC sustava s različitim pH u prvoj i drugoj dimenziji odvajanja.Gilar M., Olivova P., Dali AE i Gebler JK Dvodimenzionalno odvajanje peptida korištenjem RP-RP-HPLC sustava s različitim pH u prvoj i drugoj dimenziji odvajanja.Gilar M., Olivova P., Dali AE i Gebler JK Dvodimenzionalno odvajanje peptida korištenjem različitih pH vrijednosti u prvoj i drugoj dimenziji odvajanja korištenjem RP-RP-HPLC sustava. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. i dr. Istraživanje prijenosa mase i kinetičkih karakteristika visokoučinkovitih kromatografskih kolona punjenih potpuno poroznim i površinski poroznim C18 česticama manjim od 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. i dr. Nedavni trendovi i analitički izazovi u izolaciji, identifikaciji i validaciji biljnih bioaktivnih peptida. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB i dr. Proteomski krajolik carstva života. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. i dr. Naknadna obrada terapijskih peptida preparativnom tekućinskom kromatografijom. Molecules (Basel, Švicarska) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. i Geng, X. Mješovita kromatografija i njezina primjena na biopolimere. Yang, Y. i Geng, X. Mješovita kromatografija i njezina primjena na biopolimere.Yang, Yu. i Geng, X. Mješovita kromatografija i njezina primjena na biopolimere. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. i Geng, X. Mješovita kromatografija i njezina primjena u biopolimerima.Yang, Yu. i Gene, X. Mješovita kromatografija i njezina primjena na biopolimere.J. Kromatografija. A 1218(49), 8813–8825 (2011).