Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Anjeun nganggo vérsi browser anu dukungan CSSna terbatas. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo browser anu diénggalan (atanapi mareuman Modeu Kompatibilitas dina Internet Explorer). Salian ti éta, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami nunjukkeun situs ieu tanpa gaya sareng JavaScript.
Nampilkeun korsel tilu slide sakaligus. Anggo tombol Sateuacanna sareng Salajengna pikeun ngaléngkah dina tilu slide sakaligus, atanapi anggo tombol slider di tungtungna pikeun ngaléngkah dina tilu slide sakaligus.
Partikel silika berpori disiapkeun ku metode sol-gel kalayan sababaraha modifikasi pikeun kéngingkeun partikel pori-pori lega. Partikel-partikel ieu diderivatisasi ku N-phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate (PMI) sareng stirena ngalangkungan polimérisasi reverse chain transfer-fragmentation (RAFT) pikeun ngahasilkeun poliamida interkalasi N-phenylmaleimide. Fase stasioner Stirena (PMP). Kolom stainless steel bore sempit (diaméter jero 100 × 1,8 mm) dipak ku packing slurry. Kinerja kromatografi kolom PMP dievaluasi pikeun misahkeun campuran péptida sintétis anu diwangun ku lima péptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amino acid enkephalin) sareng hidrolisat triptik tina albumin sérum manusa (HAS). Dina kaayaan élusi optimal, jumlah téoritis pelat kalayan campuran péptida ngahontal 280.000 pelat/sq.m. Ngabandingkeun kinerja pamisahan kolom anu dimekarkeun sareng kolom Ascentis Express RP-Amide komérsial, katitén yén efisiensi pamisahan kolom PMP langkung unggul tibatan kolom komérsial dina hal efisiensi sareng résolusi pamisahan.
Industri biofarmasi parantos janten pasar global anu ngembang kalayan paningkatan anu signifikan dina pangsa pasar dina sababaraha taun ka pengker. Kalayan kamekaran industri biofarmasi anu ngabeledug1,2,3 aya kabutuhan anu ageung pikeun analisis péptida sareng protéin. Salian ti péptida target, rupa-rupa pangotor kabentuk nalika sintésis péptida, janten purifikasi kromatografi diperyogikeun pikeun kéngingkeun kamurnian péptida anu dipikahoyong. Analisis sareng karakterisasi protéin dina cairan awak, jaringan, sareng sél mangrupikeun tugas anu nangtang pisan kusabab seueurna spésiés anu berpotensi dideteksi aya dina hiji sampel. Sanaos spéktrométri massa mangrupikeun alat anu efektif pikeun ngurut péptida sareng protéin, upami sampel sapertos kitu langsung diwanohkeun kana spéktrométer massa, pamisahan bakal henteu nyugemakeun. Masalah ieu tiasa direngsekeun ku ngalakukeun kromatografi cair (LC) sateuacan analisis MS, anu bakal ngirangan jumlah analit anu lebet kana spéktrométer massa dina waktos anu ditangtukeun4,5,6. Salaku tambahan, analit tiasa konsentrasi di daérah anu sempit nalika pamisahan fase cair, ku kituna konsentrasi analit ieu sareng ningkatkeun sensitivitas deteksi MS. Kromatografi cair (LC) parantos maju sacara signifikan salami dasawarsa ka pengker sareng parantos janten metode anu seueur dianggo pikeun analisis protéomik7,8,9,10.
Kromatografi cair fase tibalik (RP-LC) loba dipaké pikeun ngamurnikeun jeung misahkeun campuran péptida maké silika oktadesil-modifikasi (ODS) salaku fase stasioner11,12,13. Nanging, kusabab strukturna anu kompléks jeung sipat amfotérik,14,15 fase stasioner RP teu bisa nyadiakeun pamisahan péptida jeung protéin anu nyugemakeun. Ku alatan éta, analisis péptida jeung protéin kalawan fragmen polar jeung non-polar merlukeun fase stasioner anu dirancang husus pikeun berinteraksi jeung nahan analit ieu16. Kromatografi campuran, anu nawarkeun interaksi multimodal, bisa jadi alternatif pikeun RP-LC pikeun misahkeun péptida, protéin, jeung campuran kompléks lianna. Sababaraha fase stasioner tipe campuran disiapkeun jeung kolom anu dieusi ku fase stasioner ieu dipaké pikeun misahkeun péptida jeung protéin17,18,19,20,21. Kusabab ayana gugus polar sareng non-polar, fase stasioner mode campuran (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalasi polar/RPLC) cocog pikeun misahkeun péptida sareng protéin22,23,24,25,26,27,28. , fase stasioner interkalasi polar kalayan gugus polar anu kabeungkeut sacara kovalén nunjukkeun kamampuan misahkeun anu saé sareng selektivitas anu unik pikeun analit polar sareng non-polar sabab misahkeun gumantung kana interaksi antara analit sareng fase stasioner Interaksi multimodal 29,30,31,32. Anyar-anyar ieu, Zhang et al. 30 kéngingkeun fase stasioner poliamina anu diakhiri ku behenyl sareng suksés misahkeun hidrokarbon, antidepresan, flavonoid, nukléosida, éstrogén, sareng sababaraha analit sanésna. Bahan stasioner anu dipasang polar ngagaduhan gugus polar sareng non-polar, janten tiasa dianggo pikeun misahkeun péptida sareng protéin kana bagian hidrofobik sareng hidrofilik. Kolom segaris polar (misalna, kolom C18 kalayan segaris amida) sayogi kalayan nami dagang kolom Ascentis Express RP-Amide, tapi kolom ieu ngan ukur dianggo pikeun analisis amina 33.
Dina panilitian ayeuna, fase stasioner panyisipan polar (N-fenilmaleimida, polistirena panyisipan) disiapkeun sareng dievaluasi pikeun pamisahan péptida sareng pameulahan HSA triptik. Strategi ieu dianggo pikeun nyiapkeun fase stasioner. Partikel silika berpori disiapkeun numutkeun prosedur anu dijelaskeun dina publikasi kami sateuacana, kalayan sababaraha parobihan dina skéma persiapan 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Babandingan uréa, polietilen glikol (PEG), TMOS sareng asam asetat cai disaluyukeun pikeun kéngingkeun partikel silika kalayan ukuran pori anu ageung. Kadua, ligan fenilmaleimida-metilvinil isosianat anyar disintésis sareng partikel silika turunanna dianggo pikeun nyiapkeun fase stasioner panyisipan polar. Fase stasioner anu diala dipak kana kolom stainless steel (diaméter jero 100 × 1,8 mm) numutkeun skéma pengepakan anu dioptimalkeun. Pengepakan kolom dibantuan ku geteran mékanis pikeun mastikeun lapisan seragam dina kolom. Kolom anu dipak dievaluasi pikeun misahkeun campuran péptida anu diwangun ku lima péptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, péptida leusin-énkephalin), sareng hidrolisat triptik tina albumin sérum manusa (HSA). Katitén yén campuran péptida sareng digest triptik HSA misah kalayan résolusi sareng efisiensi anu saé. Efisiensi pamisahan kolom PMP dibandingkeun sareng kolom Ascentis Express RP-Amide. Katitén yén péptida sareng protéin gaduh résolusi anu saé sareng efisiensi pamisahan anu luhur dina kolom PMP, sareng efisiensi pamisahan kolom PMP langkung luhur tibatan kolom Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilen glikol), uréa, asam asetat, trimetoksisiortosilikat (TMOS), trimetilklorosilan (TMCS), tripsin, albumin sérum manusa (HSA), amonium klorida, uréa, heksametilmetakriloyldisilazana (HMDS), metakriloyl klorida (MC), stiréna, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil péroksida (BPO), asetonitril (ACN) pikeun HPLC, metanol, 2-propanol sareng aseton. Perusahaan Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, AS).
Campuran uréa (8 g), polietilen glikol (8 g) sareng 8 ml asam asetat 0,01 N. diaduk salami 10 menit, teras 24 ml TMOS ditambahkeun kana éta bari didinginkan ku és. Campuran réaksi dipanaskeun dina suhu 40°C salami 6 jam teras dina suhu 120°C salami 8 jam dina autoklaf stainless steel. Cai didekantasi sareng sésa-sésa dikeringkeun dina suhu 70°C salami 12 jam. Blok lemes anu garing digiling rata sareng dikalsinasi dina oven dina suhu 550°C salami 12 jam. Tilu bets disiapkeun sareng dicirikeun pikeun nguji réproduksibilitas ukuran partikel, ukuran pori sareng luas permukaan.
Gugus polar sareng fase diam pikeun ranté polistirena. Prosedur persiapan dijelaskeun di handap.
N-fenilmaleimida (200 mg) sareng metil vinil isosianat (100 mg) dileyurkeun dina toluéna anhidrat, teras 0,1 ml 2,2′-azoisobutironitril (AIBN) ditambahkeun kana labu réaksi pikeun kéngingkeun kopolimer fenilmaleimida sareng metil vinil isosianat (PMCP). ) Campuran ieu dipanaskeun dina suhu 60°C salami 3 jam, disaring sareng dikeringkeun dina oven dina suhu 40°C salami 3 jam.
Partikel silika garing (2 g) didisperkeun dina toluéna garing (100 ml), diaduk sareng disonikasi salami 10 menit dina labu dasar buleud 500 ml. PMCP (10 mg) leyur dina toluéna sareng ditambihkeun tetes demi tetes kana labu réaksi ngalangkungan corong tambahan. Campuran ieu diréflukskeun dina suhu 100°C salami 8 jam, disaring, dikumbah ku aseton sareng dikeringkeun dina suhu 60°C salami 3 jam. Teras, partikel silika anu aya hubunganana sareng PMCP (100 g) leyur dina toluéna (200 ml), sareng 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) ditambihkeun kana éta kalayan ayana 100 μl dibutiltin dilaurat salaku katalis. Campuran ieu diaduk dina suhu 50°C salami 8 jam, disaring sareng dikeringkeun dina suhu 50°C salami 3 jam.
Stiréna (1 ml), benzoil péroksida BPO (0,5 ml) sareng partikel silika anu napel kana TEMPO-PMCP (1,5 g) didisperkeun dina toluéna sareng dimurnikeun ku nitrogén. Polimerisasi stiréna dilaksanakeun dina suhu 100°C salami 12 jam. Produk anu dihasilkeun dikumbah ku metanol sareng dikeringkeun sapeuting dina suhu 60°C. Skéma umum réaksi dipidangkeun dina gambar hiji.
Sampel-sampel éta didegaskeun dina suhu 393 K salami 1 jam dugi ka tekanan sésa kirang ti 10–3 Torr kahontal. Jumlah N2 anu diserep dina tekanan relatif P/P0 = 0,99 dianggo pikeun nangtukeun total volume pori. Morfologi partikel silika murni sareng anu kaiket ku ligan dipariksa nganggo mikroskop éléktron scanning (Hitachi High Technologies, Tokyo, Jepang). Sampel garing (silika murni sareng partikel silika anu kaiket ku ligan) disimpen dina batang aluminium nganggo pita karbon. Emas diendapkeun dina sampel nganggo alat sputtering Q150T, sareng lapisan Au kandel 5 nm diendapkeun dina sampel. Ieu ningkatkeun efisiensi prosés tegangan rendah sareng nyayogikeun nyemprot tiis anu saé. Analisis unsur dilaksanakeun nganggo penganalisis komposisi unsur Thermo Electron (Waltham, MA, AS) Flash EA1112. Penganalisis ukuran partikel Malvern (Worcestershire, Inggris) Mastersizer 2000 dianggo pikeun kéngingkeun distribusi ukuran partikel. Partikel silika anu teu dilapis sareng partikel silika anu kaiket ku ligan (masing-masing 5 mg) didisperkeun dina 5 ml isopropanol, disonikasi salami 10 menit, diaduk salami 5 menit, teras disimpen dina méja optik Mastersizer. Analisis termogravimetri dilaksanakeun dina laju 5 °C per menit dina kisaran suhu ti 30 dugi ka 800 °C.
Kolom stainless steel bore sempit anu dilapis serat kaca kalayan diménsi (ID 100 × 1,8 mm) dipak ku metode ngeusian bubur nuturkeun prosedur anu sami sareng dina rujukan 31. Kolom stainless steel (dilapis kaca, ID 100 × 1,8 mm) sareng outlet anu ngandung frit 1 µm disambungkeun kana mesin pengemas bubur (Alltech Deerfield, IL, USA). Nyiapkeun suspénsi fase stasioner ku cara ngagantungkeun 150 mg fase stasioner dina 1,2 ml metanol sareng ngasupkeun kana kolom reservoir. Metanol dianggo salaku pangleyur bubur sareng pangleyur kontrol. Pak kolom ku cara nerapkeun runtuyan tekanan 100 MP salami 10 menit, 80 MP salami 15 menit, sareng 60 MP salami 30 menit. Prosés pengemasan nganggo dua vibrator kolom kromatografi gas (Alltech, Deerfield, IL, USA) pikeun geteran mékanis pikeun mastikeun pengemasan kolom anu seragam. Tutup packer bubur sareng leupaskeun tekanan lalaunan pikeun nyegah karusakan kana senar. Kolom éta dicabut tina nozzle slurry sareng pas anu sanés dipasang kana inlet sareng disambungkeun kana sistem LC pikeun nguji operasina.
MLC khusus diwangun nganggo pompa LC (10AD Shimadzu, Jepang), sampler kalayan loop injeksi 50 nL (Valco (AS) C14 W.05), degasser mémbran (Shimadzu DGU-14A), sareng jandela kapiler UV-VIS. Alat detektor (UV-2075) sareng mikrokolom enamel. Anggo tabung panyambung anu sempit pisan sareng pondok pikeun ngaminimalkeun pangaruh ékspansi kolom tambahan. Saatos ngeusian kolom, pasang kapiler (50 µm id 365) dina outlet sambungan pangurangan 1/16″ sareng pasang kapiler (50 µm) tina sambungan pangurangan. Pangumpulan data sareng pamrosésan kromatogram dilaksanakeun nganggo parangkat lunak Multichro 2000. Dina 254 nm, absorbansi UV tina analit subjek diawasi dina 0. Data kromatografi dianalisis nganggo OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin sérum manusa, bubuk liofilisasi, ≥ 96% (éléktroforésis gél agarosa) 3 mg dicampur sareng tripsin (1,5 mg), 4,0 M uréa (1 ml) sareng 0,2 M amonium bikarbonat (1 ml). Larutan ieu diaduk salami 10 menit sareng disimpen dina bak cai dina suhu 37°C salami 6 jam, teras didinginkan ku 1 ml 0,1% TFA. Saring larutan sareng simpen di handap 4°C.
Pamisahan campuran péptida sareng HSA digest triptik dina kolom PMP dievaluasi sacara misah. Pariksa hidrolisis triptik tina campuran péptida sareng HSA anu dipisahkeun ku kolom PMP sareng bandingkeun hasilna sareng kolom Ascentis Express RP-Amida. Jumlah pelat téoritis diitung nganggo persamaan ieu:
Gambar SEM partikel silika murni sareng partikel silika anu kaiket ku ligan dipidangkeun dina Gambar 2. Gambar SEM partikel silika murni (A, B) nunjukkeun bentuk buleud dimana partikelna manjang atanapi gaduh simétri anu henteu teratur dibandingkeun sareng panilitian kami sateuacana. Beungeut partikel silika anu kaiket ku ligan (C, D) langkung lemes tibatan partikel silika murni, anu tiasa disababkeun ku ranté polistirena anu nutupan beungeut partikel silika.
Mikrograf éléktron scanning partikel silika murni (A, B) sareng partikel silika anu kaiket ku ligan (C, D).
Distribusi ukuran partikel partikel silika murni sareng partikel silika anu kaiket ligan dipidangkeun dina Gambar 2.3(A). Kurva distribusi ukuran partikel volumetrik nunjukkeun yén ukuran partikel silika ningkat saatos modifikasi kimia (Gambar 3A). Data distribusi ukuran partikel silika tina panilitian ayeuna sareng panilitian sateuacana dibandingkeun dina Tabel 1(A). Ukuran partikel volumetrik d(0.5) tina PMP nyaéta 3.36 µm, dibandingkeun sareng nilai ad(0.5) 3.05 µm dina panilitian sateuacana (partikel silika anu kaiket polistirena)34. Kusabab parobahan dina babandingan PEG, uréa, TMOS sareng asam asetat dina campuran réaksi, distribusi ukuran partikel tina bets ieu langkung heureut dibandingkeun sareng panilitian sateuacana. Ukuran partikel fase PMP rada langkung ageung tibatan fase partikel silika anu kaiket polistirena anu urang pelajari sateuacanna. Ieu ngandung harti yén fungsionalisasi permukaan partikel silika kalayan stiréna ngan ukur ngendapkeun lapisan polistirena (0,97 µm) dina permukaan silika, sedengkeun dina fase PMP ketebalan lapisanna nyaéta 1,38 µm.
Sebaran ukuran partikel (A) sareng distribusi ukuran pori (B) partikel silika murni sareng partikel silika anu kaiket ku ligan.
Ukuran pori, volume pori, sareng luas permukaan partikel silika anu dianggo dina panilitian ieu dipidangkeun dina Tabel 1 (B). Profil PSD partikel silika murni sareng partikel silika anu kaiket ligan dipidangkeun dina Gambar 3(B). Hasilna sami sareng panilitian kami sateuacanna34. Ukuran pori partikel silika murni sareng anu kaiket ligan masing-masing nyaéta 310 Å sareng 241 Å, nunjukkeun yén saatos modifikasi kimia, ukuran pori turun 69 Å, sapertos anu dipidangkeun dina Tabel 1 (B), sareng kurva pergeseran dipidangkeun dina Gambar. Luas permukaan spésifik partikel silika dina panilitian ayeuna nyaéta 116 m2/g, anu sami sareng panilitian kami sateuacanna (124 m2/g). Sakumaha anu dipidangkeun dina Tabel 1(B), luas permukaan (m2/g) partikel silika saatos modifikasi kimia ogé turun tina 116 m2/g janten 105 m2/g.
Hasil analisis unsur fase diam dipidangkeun dina Tabel. 2. Kandungan karbon tina fase diam ayeuna nyaéta 6,35%, anu langkung handap tibatan dina panilitian kami sateuacanna (partikel silika anu aya hubunganana sareng polistirena, masing-masing 7,93%35 sareng 10,21%) 42. Kandungan karbon tina fase diam ayeuna di handap, kumargi sababaraha ligan polar sapertos fenilmaleimida metil vinil isosianat (PCMP) sareng 4-hidroksi-TEMPO parantos dianggo salian ti stirena dina persiapan SP. Persentase beurat nitrogén dina fase diam ayeuna nyaéta 2,21% dibandingkeun sareng 0,1735 sareng 0,85% dina panilitian sateuacana 42. Ieu ngandung harti yén fase diam ayeuna gaduh persentase beurat nitrogén anu luhur kusabab fenilmaleimida. Sarua kitu, produk (4) sareng (5) masing-masing gaduh kandungan karbon 2,7% sareng 2,9%, sedengkeun produk ahir (6) gaduh kandungan karbon 6,35%, sapertos anu dipidangkeun dina Tabel 2. Analisis termogravimetri (TGA) dianggo dina fase stasioner PMP pikeun nguji leungitna beurat, sareng kurva TGA dipidangkeun dina Gambar 4. Kurva TGA nunjukkeun leungitna beurat 8,6%, anu saluyu sareng kandungan karbon (6,35%), kumargi ligan henteu ngan ukur ngandung C, tapi ogé N, O sareng H.
Ligan fenilmaleimida-metilvinil isosianat dipilih pikeun ngarobih permukaan partikel silika kusabab gugus fenilmaleimida sareng vinilisosianat polarna. Gugus vinil isosianat tiasa salajengna réaksi sareng stiréna ku cara polimérisasi radikal hirup. Alesan kadua nyaéta pikeun nyelapkeun gugus anu gaduh interaksi sedeng sareng analit sareng teu aya interaksi éléktrostatik anu kuat antara analit sareng fase stasioner, kumargi gugus fenilmaleimida teu gaduh muatan virtual dina pH normal. Polaritas fase stasioner tiasa dikontrol ku jumlah stiréna anu optimal sareng waktos réaksi polimérisasi radikal bébas. Léngkah terakhir réaksi (polimérisasi radikal bébas) penting pisan sabab ngarobih polaritas fase stasioner. Analisis unsur dilaksanakeun pikeun mariksa eusi karbon dina fase stasioner ieu. Parantos dititénan yén ningkatkeun jumlah stiréna sareng waktos réaksi ningkatkeun eusi karbon tina fase stasioner sareng sabalikna. SP anu disiapkeun kalayan konsentrasi stiréna anu béda gaduh beban karbon anu béda. Sarua kitu, fase stasioner ieu disimpen dina kolom stainless steel sareng karakteristik kromatografi na (selektifitas, résolusi, nilai N, jsb.) dipariksa. Dumasar kana ékspérimén ieu, komposisi anu dioptimalkeun pikeun persiapan fase stasioner PMP dipilih pikeun nyayogikeun polaritas anu dikontrol sareng ingetan analit anu saé.
Kolom PMP ogé dievaluasi pikeun analisis lima campuran péptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusin-enkephalin) ngagunakeun kapasitas fase gerak. 60/40 (v/v) ACN/cai (0,1% TFA) dina laju aliran 80 µl/mnt. Dina kaayaan élusi optimal (200.000 pelat/m), jumlah pelat téoritis (N) per kolom (100 × 1,8 mm) nyaéta 20.000 ± 100. Nilai N pikeun tilu kolom PMP dipidangkeun dina Tabel 3 sareng kromatogram dipidangkeun dina Gambar 5A. Analisis gancang dina laju aliran anu luhur (700 µl/mnt) dina kolom PMP, lima péptida diélusi dina hiji menit, nilai N anu saé pisan nyaéta 13.500 ± 330 per kolom (diaméter 100 x 1,8 mm), sami sareng 135.000 pelat/m (Gambar 5B). Tilu kolom anu ukuranana sami (diaméter jero 100 x 1,8 mm) dieusi ku tilu angkatan fase stasioner PMP anu béda pikeun nguji réproduktibilitas. Analit dirékam pikeun unggal kolom ku cara misahkeun campuran tés anu sami dina unggal kolom nganggo kaayaan élusi optimal, jumlah pelat téoritis N, sareng waktos ingetan. Data réproduktibilitas pikeun kolom PMP dipidangkeun dina Tabel 4. Réproduktibilitas kolom PMP berkorelasi saé sareng nilai %RSD anu handap pisan sapertos anu dipidangkeun dina Tabel 3.
Pamisahan campuran péptida dina kolom PMP (B) sareng kolom Ascentis Express RP-Amide (A), fase gerak 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), diménsi kolom PMP (100 x 1,8 mm id), analisis Urutan élusi sanyawa: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) sareng 5 (asam leusat enkephalin).
Kolom PMP (diaméter jero 100 x 1,8 mm) dievaluasi pikeun misahkeun hidrolisat triptik tina albumin sérum manusa ku HPLC. Kromatogram dina Gambar 6 nunjukkeun yén sampel dipisahkeun kalayan saé kalayan résolusi anu saé pisan. Larutan HSA dianalisis nganggo laju aliran 100 μl/mnt, fase gerak 70/30 asetonitril/cai sareng 0,1% TFA. Pameuntasan HSA dibagi kana 17 puncak, sapertos anu dipidangkeun dina kromatogram (Gambar 6), anu saluyu sareng 17 péptida. Efisiensi pamisahan puncak individu tina hidrolisat HSA diitung sareng nilaina dipidangkeun dina Tabel 5.
Hidrolisat triptik HSA dipisahkeun dina kolom PMP (diaméter jero 100 x 1,8 mm), laju aliran (100 μl/mnt), fase gerak 60/40 asetonitril/cai, sareng 0,1% TFA.
dimana L nyaéta panjang kolom, η nyaéta viskositas fase gerak, ΔP nyaéta tekanan balik kolom, sareng u nyaéta kecepatan linier fase gerak. Permeabilitas kolom PMP nyaéta 2,5 × 10–14 m2, laju aliran nyaéta 25 µl/mnt, 60/40 v/v dianggo. ACN/cai. Permeabilitas kolom PMP (ID 100 × 1,8 mm) sami sareng panilitian Ref.34 kami sateuacanna. Permeabilitas kolom anu dieusi ku partikel porous superfisial nyaéta 1,7 × 10 .6 µm, 2,5 × 10-14 m2 pikeun partikel 5 µm43. Ku alatan éta, permeabilitas fase PMP sami sareng permeabilitas partikel inti-cangkang kalayan ukuran 5 μm.
dimana Wx nyaéta massa kolom anu dieusi ku kloroform, Wy nyaéta massa kolom anu dieusi ku metanol, sareng ρ nyaéta kapadetan pangleyur. Kapadetan metanol (ρ = 0,7866) sareng kloroform (ρ = 1,484). Total porositas kolom partikel silika-C18 (100 × 1,8 mm ID)34 sareng kolom C18-urea31 anu parantos ditalungtik sateuacanna nyaéta 0,63 sareng 0,55, masing-masing. Ieu ngandung harti yén ayana ligan urea ngirangan permeabilitas fase stasioner. Di sisi séjén, total porositas kolom PMP (diaméter jero 100 × 1,8 mm) nyaéta 0,60. Kolom PMP kirang permeabel tibatan kolom anu dieusi ku partikel silika anu kaiket ku C18 sabab dina fase stasioner tipe C18, ligan C18 napel kana partikel silika dina ranté linier, sedengkeun dina fase stasioner tipe polistirena, polimér anu relatif kandel kabentuk di sakitar partikel. lapisan A. Dina ékspérimén has, porositas kolom diitung sapertos kieu:
Dina gambar 7A, B nunjukkeun plot Van Deemter pikeun kolom PMP (id 100 x 1,8 mm) sareng kolom Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) dina kaayaan élusi anu sami, 60/40 ACN/H2O sareng 0 .1% TFA 20 µl/mnt dugi ka 800 µl/mnt dina dua kolom. Nilai HETP minimum dina laju aliran optimal (80 µl/mnt) nyaéta 2,6 µm sareng 3,9 µm pikeun kolom PMP sareng kolom Ascentis Express RP-Amide, masing-masing. Nilai HETP nunjukkeun yén efisiensi pamisahan kolom PMP (100 x 1,8 mm id) jauh langkung luhur tibatan kolom Ascentis Express RP-Amide anu sayogi sacara komersil (100 x 1,8 mm id). Grafik van Deemter dina Gambar 7(A) nunjukkeun yén panurunan nilai N henteu langkung luhur sacara signifikan kalayan ningkatna aliran dibandingkeun sareng panilitian kami sateuacanna. Efisiensi pamisahan kolom PMP anu langkung luhur (id 100 × 1,8 mm) dibandingkeun sareng kolom Ascentis Express RP-Amide dumasar kana bentuk sareng ukuran partikel anu ningkat sareng prosedur pengepakan kolom anu canggih anu dianggo dina padamelan ayeuna34.
(A) Plot Van Deemter (HETP vs. kecepatan linier fase gerak) anu diala dina kolom PMP (id 100 x 1,8 mm) dina 60/40 ACN/H2O kalayan 0,1% TFA. (B) Plot Van Deemter (HETP vs kecepatan linier fase gerak) anu diala dina kolom Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) dina 60/40 ACN/H2O kalayan 0,1% TFA.
Fase stasioner polar tina polistirena interkalasi disiapkeun sareng dievaluasi pikeun misahkeun campuran péptida sintétis sareng hidrolisat triptik tina albumin sérum manusa (HSA) dina kromatografi cair kinerja tinggi. Kinerja kromatografi kolom PMP pikeun campuran péptida saé pisan dina hal efisiensi sareng résolusi pamisahan. Éfisiensi pamisahan kolom PMP anu ningkat disababkeun ku sababaraha alesan sapertos ukuran partikel silika sareng ukuran pori, sintésis fase stasioner anu dikontrol, sareng bahan pengemasan kolom anu rumit. Salian ti efisiensi pamisahan anu luhur, kaunggulan sanés tina fase stasioner ieu nyaéta tekanan balik kolom anu handap dina laju aliran anu luhur. Kolom PMP tiasa diproduksi deui sareng tiasa dianggo pikeun nganalisis campuran péptida sareng pencernaan triptik tina rupa-rupa protéin. Kami badé nganggo kolom ieu pikeun misahkeun sanyawa bioaktif tina produk alami, ekstrak pepelakan ubar sareng suung dina kromatografi cair. Ka hareupna, kolom PMP ogé bakal dievaluasi pikeun misahkeun protéin sareng antibodi monoklonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Panalungtikan kana sistem pamisahan péptida kromatografi fase tibalik bagian I: Pangwangunan protokol pikeun karakterisasi kolom. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Panalungtikan kana sistem pamisahan péptida kromatografi fase tibalik bagian I: Pangwangunan protokol pikeun karakterisasi kolom.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., sareng Petersson, P. Panalungtikan Sistem Pamisahan Péptida ku Kromatografi Fase-Mundur, Bagian I: Ngembangkeun Protokol pikeun Karakterisasi Kolom. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Panalungtikan kana sistem pamisahan péptida kromatografi fase tibalik bagian I: Pangwangunan protokol pikeun karakteristik kolom. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Panalungtikan kana sistem pamisahan péptida kromatografi fase tibalik bagian I: Pangwangunan protokol pikeun karakteristik kolom.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., sareng Petersson, P. Panalungtikan Sistem Pamisahan Péptida ku Kromatografi Fase-Mundur, Bagian I: Ngembangkeun Protokol pikeun Karakterisasi Kolom.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. et al. Métode pikeun nyiptakeun péptida aktif anu ditingkatkeun pikeun pengobatan panyakit tepa. Biotéhnologi. Prestasi 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Péptida terapi sintétis: Élmu sareng pasar. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Péptida terapi sintétis: Élmu sareng pasar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J sareng Chreschatyski M. Peptida terapi sintétis: élmu sareng pasar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J sareng Khreschatsky M. Peptida terapi sintétis: élmu sareng pasar. panemuan ubar. Dinten ieu 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi cair protéomik canggih. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi cair protéomik canggih.Tempo F., Smith RD sareng Shen Yu. Kromatografi cair protéomik canggih. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Komposisi protéin canggih 液相色谱。Tempo F., Smith RD sareng Shen Yu. Kromatografi cair protéomik canggih.J. Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografi cair-spektrometri massa canggih sanggup ngagabungkeun metabolomik sareng protéomik anu lega. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peran UHPLC dina pamekaran farmasi. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peran UHPLC dina pamekaran farmasi.Chesnut, SM sareng Salisbury, JJ Peran UHPLC dina pamekaran farmasi.Chesnut, SM sareng Salisbury, JJ Peran UHPLC dina pamekaran ubar. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspék dasar sareng praktis kromatografi cair tekanan ultra luhur pikeun pamisahan anu gancang. Wu, N. & Clausen, AM Aspék dasar sareng praktis kromatografi cair tekanan ultra luhur pikeun pamisahan anu gancang.Wu, N. sareng Clausen, AM Aspék dasar sareng praktis kromatografi cair tekanan tinggi pikeun pamisahan anu gancang. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Aspék dasar sareng praktis kromatografi cair tekanan ultra-luhur pikeun pamisahan anu gancang.Wu, N. sareng Clausen, AM Aspék dasar sareng praktis kromatografi cair tekanan tinggi pikeun pamisahan anu gancang.J. Sept. Élmu. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Pamakéan kromatografi cair ultra-kinerja dina pamekaran farmasi. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Pamakéan kromatografi cair ultra-kinerja dina pamekaran farmasi.Ren, SA sareng Chelischeff, P. Panggunaan kromatografi cair kinerja ultra luhur dina pamekaran farmasi. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA sareng Chelischeff, P. Aplikasi kromatografi cair ultra-kinerja dina pamekaran ubar.J. Kromatografi. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrogel makropori monolitik anu diturunkeun tina émulsi minyak-dina-cai kalayan fase internal anu luhur pikeun purifikasi enterovirus anu efisien 71. Proyék kimia. Jurnal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peran kromatografi cair dina protéomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peran kromatografi cair dina protéomik.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. sareng Wilkins, JA Peran kromatografi cair dina protéomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. sareng Wilkins, JA Peran kromatografi cair dina protéomik.J. Kromatografi. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Tren anyar dina pamisahan kromatografi cair fase tibalik tina péptida sareng protéin terapi: Téori sareng aplikasi. & Guillarme, D. Tren anyar dina pamisahan kromatografi cair fase tibalik tina péptida sareng protéin terapi: Téori sareng aplikasi. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографира хроматографира теория и приложения. & Guillarme, D. Tren anyar dina pamisahan péptida terapi sareng protéin ku kromatografi cair fase terbalik: téori sareng aplikasi. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.sareng Guillarmé, D. Tren anyar dina pamisahan péptida terapi sareng protéin ku kromatografi cair fase terbalik: téori sareng aplikasi.J. Pharm. Élmu Biomédis. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pamisahan péptida dua diménsi nganggo sistem RP-RP-HPLC kalayan pH anu béda dina diménsi pamisahan kahiji sareng kadua. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pamisahan péptida dua diménsi nganggo sistem RP-RP-HPLC kalayan pH anu béda dina diménsi pamisahan kahiji sareng kadua.Gilar M., Olivova P., Dali AE sareng Gebler JK Pamisahan péptida dua diménsi nganggo sistem RP-RP-HPLC kalayan pH anu béda dina diménsi pamisahan kahiji sareng kadua.Gilar M., Olivova P., Dali AE sareng Gebler JK Pamisahan péptida dua diménsi nganggo nilai pH anu béda dina diménsi pamisahan kahiji sareng kadua nganggo sistem RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Panalungtikan ngeunaan transfer massa sareng karakteristik kinétik kolom kromatografi kinerja tinggi anu dipak ku partikel C18 anu pinuh porous sareng superfisial porous anu langkung alit tibatan 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Trénden panganyarna sareng tantangan analitis dina isolasi, idéntifikasi, sareng validasi péptida bioaktif tutuwuhan. anus. Makhluk anal. Kimia. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Bentang alam protéomik karajaan kahirupan. Alam 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Pasca-perawatan péptida terapi ku kromatografi cair preparatif. Molekul (Basel, Swiss) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran sareng aplikasina kana biopolimer. Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran sareng aplikasina kana biopolimer.Yang, Yu. sareng Geng, X. Kromatografi mode campuran sareng aplikasina kana biopolimer. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran sareng aplikasina dina biopolimer.Yang, Yu. sareng Gene, X. Kromatografi mode campuran sareng aplikasina kana biopolimer.J. Kromatografi. A 1218(49), 8813–8825 (2011).