Tankewol foar jo besite oan Nature.com. Jo brûke in browserferzje mei beheinde CSS-stipe. Foar de bêste ûnderfining riede wy oan dat jo in bywurke browser brûke (of Kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer útskeakelje). Derneist, om trochgeande stipe te garandearjen, litte wy de side sjen sûnder stilen en JavaScript.
Toant in karrousel fan trije dia's tagelyk. Brûk de knoppen Foarige en Folgjende om troch trije dia's tagelyk te gean, of brûk de skúfknoppen oan 'e ein om troch trije dia's tagelyk te gean.
Poreuze silika-dieltsjes waarden taret mei de sol-gel-metoade mei wat oanpassingen om dieltsjes mei brede poaren te krijen. Dizze dieltsjes waarden derivatisearre mei N-fenylmaleimide-methylvinylisocyanaat (PMI) en styreen fia reverse chain transfer-fragmentation (RAFT) polymerisaasje om N-fenylmaleimide ynterkalearre polyamiden te produsearjen. Styreen (PMP) stasjonêre faze. Smelle roestfrij stielen kolommen (100 × 1,8 mm binnendiameter) waarden ynpakt mei in slurrypakking. De chromatografyske prestaasjes fan 'e PMP-kolom waarden evaluearre om in mingsel fan synthetyske peptiden te skieden besteande út fiif peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu-aminosoer enkefaline) en tryptyske hydrolysaat fan minsklik serumalbumine (HAS). Under optimale elúsjeomstannichheden berikte it teoretyske oantal platen mei in mingsel fan peptiden 280.000 platen/m². By it fergelykjen fan de skiedingsprestaasjes fan 'e ûntwikkele kolom mei de kommersjele Ascentis Express RP-Amide-kolom, waard waarnommen dat de skiedingseffisjinsje fan 'e PMP-kolom superieur wie oan 'e kommersjele kolom yn termen fan skiedingseffisjinsje en resolúsje.
De biofarmaseutyske yndustry is in útwreidzjende wrâldwide merk wurden mei in wichtige tanimming fan merkoandiel yn 'e lêste jierren. Mei de eksplosive groei fan 'e biofarmaseutyske yndustry1,2,3 is der in grutte needsaak foar peptide- en proteïne-analyze. Neist it doelpeptide wurde ferskate ûnreinheden foarme tidens peptidesynteze, dus chromatografyske suvering is fereaske om de winske suverens fan it peptide te krijen. De analyze en karakterisaasje fan proteïnen yn lichemsfloeistoffen, weefsels en sellen is in ekstreem útdaagjende taak fanwegen it grutte oantal potinsjeel detektearbere soarten oanwêzich yn ien stekproef. Hoewol massaspektrometry in effektyf ark is foar it sekwinsjearjen fan peptiden en proteïnen, sil de skieding net befredigjend wêze as sokke stekproeven direkt yn 'e massaspektrometer ynfierd wurde. Dit probleem kin oplost wurde troch floeistofchromatografy (LC) út te fieren foar MS-analyze, wat de hoemannichte analyten dy't de massaspektrometer op in bepaald momint yngeane sil ferminderje4,5,6. Derneist kinne analyten konsintrearje yn in smel gebiet tidens floeibere fazeskieding, wêrtroch dizze analyten konsintrearre wurde en de gefoelichheid fan MS-deteksje fergruttet. Floeibere chromatografy (LC) is de lêste tsien jier flink foarútgong makke en is in breed brûkte metoade wurden foar proteomyske analyze7,8,9,10.
Reverse-phase floeistofchromatografy (RP-LC) wurdt in soad brûkt om mingsels fan peptiden te suverjen en te skieden mei octadecyl-modifisearre silika (ODS) as de stasjonêre faze11,12,13. Fanwegen har komplekse struktuer en amfotere aard kinne14,15 RP stasjonêre fazen lykwols gjin befredigjende skieding fan peptiden en proteïnen leverje. Dêrom fereasket de analyze fan peptiden en proteïnen mei poal- en net-poalfragminten spesjaal ûntworpen stasjonêre fazen om te ynteraksje en dizze analyten te behâlden16. Mingde chromatografy, dy't multimodale ynteraksjes biedt, kin in alternatyf wêze foar RP-LC foar it skieden fan peptiden, proteïnen en oare komplekse mingsels. Ferskate mingde-type stasjonêre fazen waarden taret en kolommen fol mei dizze stasjonêre fazen waarden brûkt om peptiden en proteïnen te skieden17,18,19,20,21. Troch de oanwêzigens fan poal- en net-poalgroepen binne mingde-modus stasjonêre fazen (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, poalynterkalaasje/RPLC) geskikt foar de skieding fan peptiden en aaiwiten22,23,24,25,26,27,28. , Poalynterkalearre stasjonêre fazen mei kovalent bûne poalgroepen litte goede skiedingsmooglikheden en unike selektiviteit sjen foar poal- en net-poalanalyten, om't de skieding ôfhinklik is fan 'e ynteraksje tusken de analyt en de stasjonêre faze. Multimodale ynteraksjes29,30,31,32. Koartlyn hawwe Zhang et al.30 behenyl-beëinige stasjonêre fazen fan polyaminen krigen en mei súkses koalwetterstoffen, antidepressiva, flavonoïden, nukleosiden, oestrogenen en guon oare analyten skieden. It poal ynbêde stasjonêre materiaal hat sawol poal- as net-poalgroepen, sadat it brûkt wurde kin om peptiden en aaiwiten te skieden yn hydrofobe en hydrofile dielen. Polare inline-kolommen (bygelyks C18-kolommen mei amide inline) binne te krijen ûnder de hannelsnamme Ascentis Express RP-Amide-kolommen, mar dizze kolommen binne allinich brûkt foar de analyze fan amine 33.
Yn 'e hjoeddeiske stúdzje waard in poal ynbêde stasjonêre faze (N-fenylmaleimide, ynbêde polystyreen) taret en evaluearre foar peptideskieding en tryptyske HSA-splitsing. De folgjende strategy waard brûkt om de stasjonêre faze ta te rieden. Poreuze silikapartikels waarden taret neffens de prosedueres beskreaun yn ús eardere publikaasjes, mei wat feroarings yn tariedingsskema's 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. De ferhâldingen fan urea, polyethyleenglycol (PEG), TMOS en wetterich-azijnzuur waarden oanpast om silikapartikels mei grutte poargrutte te krijen. Twadder waard in nije fenylmaleimide-methylvinylisocyanaatligand synthetisearre en waarden syn derivatisearre silikapartikels brûkt om poal ynbêde stasjonêre fazen ta te rieden. De krigen stasjonêre faze waard ynpakt yn in roestfrij stielen kolom (binnendiameter 100 × 1,8 mm) neffens in optimalisearre ynpakskema. It ynpakken fan 'e kolom wurdt holpen troch meganyske trilling om in unifoarme laach binnen de kolom te garandearjen. De ynpakte kolom waard evaluearre foar de skieding fan in mingsel fan peptiden besteande út fiif peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkefaline peptide) en tryptyske hydrolysaten fan minsklik serumalbumine (HSA). Der waard waarnommen dat it peptidemingsel en de HSA tryptyske digest mei goede resolúsje en effisjinsje skieden. De skiedingseffisjinsje fan 'e PMP-kolom waard fergelike mei dy fan 'e Ascentis Express RP-Amide-kolom. Der waard waarnommen dat peptiden en aaiwiten in goede resolúsje en hege skiedingseffisjinsje hawwe op 'e PMP-kolom, en de skiedingseffisjinsje fan 'e PMP-kolom is heger as dy fan 'e Ascentis Express RP-Amide-kolom.
PEG (polyethyleenglycol), urea, jittiksoer, trimetoksyorthosilikaat (TMOS), trimethylchlorosilaan (TMCS), trypsine, minsklik serumalbumine (HSA), ammoniumchloride, urea, hexamethylmethacryloyldisilazaan (HMDS), methacryloylchloride (MC), styreen, 4-hydroxy-TEMPO, benzoylperoxide (BPO), acetonitril (ACN) foar HPLC, methanol, 2-propanol en aceton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, Feriene Steaten).
In mingsel fan urea (8 g), polyetyleenglycol (8 g) en 8 ml 0,01 N jittiksoer waard 10 minuten roerd, en 24 ml TMOS waard dêr ûnder iiskoeling oan tafoege. It reaksjemingsel waard 6 oeren ferwaarme by 40 °C en dêrnei 8 oeren by 120 °C yn in autoklaaf fan roestfrij stiel. It wetter waard dekantearre en it residu waard 12 oeren droege by 70 °C. De droege sêfte blokken waarden glêd fermalen en 12 oeren kalsinearre yn in oven by 550 °C. Trije batches waarden taret en karakterisearre om de reprodusearberens fan dieltsjegrutte, poargrutte en oerflakte te testen.
Poalgroep en stasjonêre faze foar polystyreenketens. De tariedingsproseduere wurdt hjirûnder beskreaun.
N-fenylmaleimide (200 mg) en metylvinylisocyanaat (100 mg) waarden oplost yn wetterfrije tolueen, en doe waard 0,1 ml 2,2′-azoisobutyronitril (AIBN) tafoege oan 'e reaksjeflesse om in kopolymeer fan fenylmaleimide en metylvinylisocyanaat (PMCP) te krijen. ) It mingsel waard 3 oeren ferwaarme by 60 °C, filtere en 3 oeren droege yn in oven by 40 °C.
Droege silikapartikels (2 g) waarden ferspraat yn droege tolueen (100 ml), roerd en sonikearre foar 10 minuten yn in rûnbodemkolf fan 500 ml. PMCP (10 mg) waard oplost yn tolueen en dripkes foar dripkes tafoege oan 'e reaksjekolf fia in tafoegingstrechter. It mingsel waard 8 oeren by 100 °C ûnder reflux ferwaarme, filtere, wosken mei aceton en 3 oeren by 60 °C droege. Dêrnei waarden de silikapartikels dy't ferbûn wiene mei PMCP (100 g) oplost yn tolueen (200 ml), en waard 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) dêroan tafoege yn 'e oanwêzigens fan 100 μl dibutyltindilauraat as katalysator. It mingsel waard 8 oeren by 50 °C roerd, filtere en 3 oeren by 50 °C droege.
Styreen (1 ml), benzoylperoxide BPO (0,5 ml) en silika-dieltsjes dy't oan TEMPO-PMCP (1,5 g) fêstmakke wiene, waarden ferspraat yn tolueen en mei stikstof trochspoeld. De polymerisaasje fan styreen waard 12 oeren by 100 °C útfierd. It resultearjende produkt waard wosken mei metanol en oernachtich droege by 60 °C. It algemiene skema fan 'e reaksje wurdt werjûn yn fig. ien.
De samples waarden 1 oere lang ûntgast by 393 K oant in restdruk fan minder as 10–3 Torr waard krigen. De hoemannichte N2 dy't adsorbearre waard by relative druk P/P0 = 0,99 waard brûkt om it totale poarvolume te bepalen. De morfology fan suvere en ligand-bûne silikapartikels waard ûndersocht mei in scanning-elektronenmikroskoop (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Droege samples (suvere silika en ligand-bûne silikapartikels) waarden mei koalstoftape op aluminiumstangen pleatst. Goud waard op it sample ôfset mei in Q150T-sputterapparaat, en in 5 nm dikke Au-laach waard op it sample ôfset. Dit ferbetteret de effisjinsje fan it leechspanningsproses en soarget foar fyn kâld spuiten. Elemintêre analyze waard útfierd mei in Thermo Electron (Waltham, MA, Feriene Steaten) Flash EA1112 elemintêre gearstallingsanalysator. In Malvern-partikelgrutte-analysator (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 waard brûkt om de dieltsjegrutteferdieling te krijen. Uncoated silikapartikels en ligand-bûne silikapartikels (5 mg elk) waarden ferspraat yn 5 ml isopropanol, 10 minuten sonikearre, 5 minuten skodde en op in Mastersizer optyske bank pleatst. Thermogravimetryske analyze wurdt útfierd mei in snelheid fan 5 °C per minuut yn it temperatuerberik fan 30 oant 800 °C.
RVS-kolommen mei in smelle boring en glêstriedbekleding mei ôfmjittings (ID 100 × 1,8 mm) waarden ynpakt mei de slurry-folmetoade neffens deselde proseduere as yn referinsje 31. In roestfrij stielen kolom (bekleed mei glêstried, ID 100 × 1,8 mm) en in útlaat mei in 1 µm fritte waarden ferbûn mei in slurry-ferpakkingsmasine (Alltech Deerfield, IL, Feriene Steaten). Tariede in suspensje fan 'e stasjonêre faze troch 150 mg fan 'e stasjonêre faze te suspendearjen yn 1,2 ml methanol en it yn in reservoirkolom te fieden. Methanol waard brûkt as it slurry-oplosmiddel en kontrôle-oplosmiddel. Pak de kolom yn troch in druksekwinsje fan 100 MP ta te passen foar 10 minuten, 80 MP foar 15 minuten en 60 MP foar 30 minuten. It ynpakproses brûkte twa gaschromatografykolomvibrators (Alltech, Deerfield, IL, Feriene Steaten) foar meganyske trilling om unifoarme kolompakking te garandearjen. Slút de slurrypakker en lit de druk stadich los om skea oan 'e snaar te foarkommen. De kolom waard loskeppele fan 'e slurry-spuitkop en in oare fitting waard oan 'e ynlaat befestige en ferbûn mei it LC-systeem om de wurking te testen.
In oanpaste MLC waard boud mei in LC-pomp (10AD Shimadzu, Japan), in sampler mei in 50 nL ynjeksjelus (Valco (USA) C14 W.05), in membraanûntgasser (Shimadzu DGU-14A), en in UV-VIS kapillêr finster. Detektorapparaat (UV-2075) en geëmailleerde mikrokolom. Brûk tige smelle en koarte ferbiningsbuizen om it effekt fan ekstra kolomútwreiding te minimalisearjen. Nei it foljen fan 'e kolom, ynstallearje in kapillêr (50 µm id 365) by de útgong fan 'e 1/16″ redusearjende junction en ynstallearje in kapillêr (50 µm) fan 'e redusearjende junction. Gegevensferzameling en chromatogramferwurking wurde útfierd mei de Multichro 2000 software. By 254 nm waard de UV-absorbânsje fan 'e ûnderwerpen analyten kontroleare by 0. Chromatografyske gegevens waarden analysearre mei OriginPro8 (Northampton, MA).
Minsklik serumalbumine, lyofilisearre poeier, ≥ 96% (agarosegelelektroforese) 3 mg mingd mei trypsine (1,5 mg), 4,0 M urea (1 ml) en 0,2 M ammoniumbikarbonaat (1 ml). De oplossing waard 10 minuten roerd en 6 oeren yn in wetterbad by 37 °C hâlden, doe blust mei 1 ml 0,1% TFA. Filtrearje de oplossing en bewarje ûnder 4 °C.
Skieding fan in mingsel fan peptiden en tryptyske digest HSA op in PMP-kolom waard apart evaluearre. Kontrolearje de tryptyske hydrolyse fan in mingsel fan peptiden en HSA skieden troch in PMP-kolom en fergelykje de resultaten mei in Ascentis Express RP-Amide-kolom. It oantal teoretyske platen wurdt berekkene mei de folgjende fergeliking:
SEM-ôfbyldings fan suvere silikadieltsjes en ligand-bûne silikadieltsjes wurde werjûn yn figuer 2. SEM-ôfbyldings fan suvere silikadieltsjes (A, B) litte in sferyske foarm sjen wêryn't de dieltsjes langwerpich binne of unregelmjittige symmetry hawwe yn ferliking mei ús eardere stúdzjes. It oerflak fan 'e silikadieltsjes bûn troch de ligand (C, D) is glêder as dat fan suvere silikadieltsjes, wat mooglik te tankjen is oan de polystyreenketens dy't it oerflak fan 'e silikadieltsjes bedekke.
Skannende elektronenmikrofoto's fan suvere silikapartikels (A, B) en ligand-bûne silikapartikels (C, D).
De dieltsjegrutteferdieling fan suvere silikapartikels en ligand-bûne silikapartikels wurdt werjûn yn Fig. 2.3(A). Volumetryske dieltsjegrutteferdielingskurven lieten sjen dat de silikapartikelgrutte tanommen is nei gemyske modifikaasje (Fig. 3A). De silikapartikelgrutteferdielingsgegevens fan 'e hjoeddeiske stúdzje en de foarige stúdzje wurde fergelike yn Tabel 1(A). De volumetryske dieltsjegrutte d(0.5) fan PMP wie 3.36 µm, fergelike mei de ad(0.5)-wearde fan 3.05 µm yn ús foarige stúdzje (polystyreen-bûne silikapartikels)34. Fanwegen de feroaring yn 'e ferhâlding fan PEG, urea, TMOS en jittiksoer yn it reaksjemingsel wie de dieltsjegrutteferdieling fan dizze batch smeller yn ferliking mei ús foarige stúdzje. De dieltsjegrutte fan 'e PMP-faze is wat grutter as dy fan 'e polystyreen-bûne silikapartikelfaze dy't wy earder bestudearre hawwe. Dit betsjut dat de oerflakfunksjonalisaasje fan silikapartikels mei styreen allinich in polystyreenlaach (0,97 µm) op it silika-oerflak ôfsette, wylst yn 'e PMP-faze de laachdikte 1,38 µm wie.
Partikelgrutteferdieling (A) en poargrutteferdieling (B) fan suvere silikapartikels en ligand-bûne silikapartikels.
De poargrutte, poarvolume en oerflakte fan 'e silikapartikels dy't yn dizze stúdzje brûkt binne, wurde werjûn yn tabel 1 (B). De PSD-profilen fan suvere silikapartikels en ligand-bûne silikapartikels wurde werjûn yn ôfb. 3 (B). De resultaten wiene te fergelykjen mei ús foarige stúdzje34. De poargruttes fan suvere en ligand-bûne silikapartikels wiene respektivelik 310 Å en 241 Å, wat oanjout dat nei gemyske modifikaasje de poargrutte mei 69 Å ôfnaam, lykas werjûn yn tabel 1 (B), en de ferskowingskromme wurdt werjûn yn ôfb. It spesifike oerflakte fan silikapartikels yn 'e hjoeddeiske stúdzje is 116 m2/g, wat te fergelykjen is mei ús foarige stúdzje (124 m2/g). Lykas werjûn yn tabel 1 (B), naam it oerflakte (m2/g) fan silikapartikels nei gemyske modifikaasje ek ôf fan 116 m2/g nei 105 m2/g.
De resultaten fan elemintêre analyze fan 'e stasjonêre faze wurde presintearre yn tabel 2. It koalstofgehalte fan 'e hjoeddeiske stasjonêre faze is 6,35%, wat leger is as yn ús foarige stúdzje (silikadieltsjes assosjeare mei polystyreen, 7,93%35 en 10,21%, respektivelik) 42. It koalstofgehalte fan 'e hjoeddeiske stasjonêre faze hjirûnder, om't guon poallige liganden lykas fenylmaleimide methylvinylisocyanaat (PCMP) en 4-hydroxy-TEMPO neist styreen brûkt binne by de tarieding fan SP. It gewichtspersintaazje stikstof yn 'e hjoeddeiske stasjonêre faze is 2,21% yn ferliking mei 0,1735 en 0,85% yn eardere stúdzjes42. Dit betsjut dat de hjoeddeiske stasjonêre faze in heech gewichtspersintaazje stikstof hat fanwegen it fenylmaleimide. Op deselde wize hawwe produkten (4) en (5) in koalstofynhâld fan respektivelik 2,7% en 2,9%, wylst it einprodukt (6) in koalstofynhâld fan 6,35% hat, lykas te sjen is yn tabel 2. Thermogravimetryske analyze (TGA) waard brûkt op 'e stasjonêre faze fan PMP om gewichtsferlies te testen, en de TGA-kromme wurdt werjûn yn figuer 4. De TGA-kromme lit in gewichtsferlies fan 8,6% sjen, wat yn goede oerienkomst is mei it koalstofynhâld (6,35%), om't de liganden net allinich C befetsje, mar ek N, O en H.
De ligand fenylmaleimide-methylvinylisocyanaat waard keazen om it oerflak fan 'e silika-dieltsjes te modifisearjen fanwegen syn poalêre fenylmaleimide- en vinylisocyanaatgroepen. Vinylisocyanaatgroepen kinne fierder reagearje mei styreen troch libbene radikale polymerisaasje. De twadde reden is om in groep yn te foegjen dy't matige ynteraksjes hat mei de analyte en gjin sterke elektrostatyske ynteraksjes tusken de analyte en de stasjonêre faze, om't de fenylmaleimide-groep gjin firtuele lading hat by normale pH. De polariteit fan 'e stasjonêre faze kin wurde kontroleare troch de optimale hoemannichte styreen en de reaksjetiid fan 'e frije radikale polymerisaasje. De lêste stap fan 'e reaksje (frije radikale polymerisaasje) is kritysk, om't it de polariteit fan 'e stasjonêre faze feroaret. Elementêre analyze waard útfierd om it koalstofgehalte yn dizze stasjonêre fazen te kontrolearjen. It is waarnommen dat it ferheegjen fan 'e hoemannichte styreen en de reaksjetiid it koalstofgehalte fan 'e stasjonêre faze fergruttet en oarsom. SP's dy't taret binne mei ferskillende konsintraasjes styreen hawwe ferskillende koalstofladingen. Op deselde wize waarden dizze stasjonêre fazen op roestfrij stielen kolommen pleatst en waarden har chromatografyske skaaimerken (selektiviteit, resolúsje, N-wearde, ensfh.) kontrolearre. Op basis fan dizze eksperiminten waard in optimalisearre gearstalling keazen foar de tarieding fan 'e PMP stasjonêre faze om kontroleare polariteit en goede behâld fan 'e analyt te leverjen.
De PMP-kolom waard ek evaluearre foar de analyze fan fiif mingsels fan peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkefaline) mei de kapasiteit fan 'e mobile faze. 60/40 (v/v) ACN/wetter (0,1% TFA) by in streamsnelheid fan 80 µl/min. Under optimale eluasjeomstannichheden (200.000 platen/m²) is it oantal teoretyske platen (N) per kolom (100 × 1,8 mm) 20.000 ± 100. De N-wearden foar de trije PMP-kolommen wurde werjûn yn tabel 3 en de chromatogrammen wurde werjûn yn figuer 5A. Snelle analyze by hege streamsnelheid (700 µl/min) op in PMP-kolom, fiif peptiden eluearren binnen ien minút, poerbêste N-wearde fan 13.500 ± 330 per kolom (100 x 1,8 mm diameter), lykweardich oan 135.000 platen/m² (Fig. 5B). Trije kolommen fan deselde grutte (binnendiameter 100 x 1,8 mm) waarden fol mei trije ferskillende batches fan PMP stasjonêre faze om de reprodusearberens te testen. Analyten waarden foar elke kolom registrearre troch itselde testmingsel op elke kolom te skieden mei optimale elúsjebetingsten, oantal teoretyske platen N, en retinsjetiid. De reprodusearberensgegevens foar de PMP-kolommen wurde werjûn yn tabel 4. De reprodusearberens fan 'e PMP-kolom korrelearre goed mei heul lege %RSD-wearden lykas werjûn yn tabel 3.
Skieding fan peptidemingsels op in PMP-kolom (B) en in Ascentis Express RP-Amide-kolom (A), mobile faze 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP-kolomôfmjittings (100 x 1,8 mm id), analyze Eluasjefolchoarder fan ferbiningen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) en 5 (leucinezuur-enkefaline).
In PMP-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm) waard evaluearre foar de skieding fan it tryptyske hydrolysaat fan minsklik serumalbumine troch HPLC. It chromatogram yn figuer 6 lit sjen dat de samples goed skieden binne mei in tige goede resolúsje. HSA-oplossingen waarden analysearre mei in streamsnelheid fan 100 μl/min, in mobile faze fan 70/30 acetonitril/wetter en 0,1% TFA. De splitsing fan HSA waard ferdield yn 17 pieken, lykas te sjen is yn it chromatogram (fig. 6), dy't oerienkomme mei 17 peptiden. De skiedingseffisjinsjes fan yndividuele pieken fan it HSA-hydrolysaat waarden berekkene en de wearden wurde werjûn yn tabel 5.
HSA tryptyske hydrolysaten waarden skieden op in PMP-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm), streamingsnelheid (100 μl/min), mobile faze 60/40 acetonitril/wetter, en 0,1% TFA.
wêrby't L de kolomlingte is, η de viskositeit fan 'e mobile faze is, ΔP de tsjindruk fan 'e kolom is, en u de lineêre snelheid fan 'e mobile faze is. De permeabiliteit fan 'e PMP-kolom wie 2,5 × 10–14 m2, de streamsnelheid wie 25 µl/min, 60/40 v/v waard brûkt. ACN/wetter. De permeabiliteit fan 'e PMP-kolom (ID 100 × 1,8 mm) wie fergelykber mei dy fan ús foarige Ref.34-stúdzje. De permeabiliteit fan in kolom fol mei oerflakkich poreuze dieltsjes is 1,7 × 10,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 foar 5 µm dieltsjes43. Dêrom is de permeabiliteit fan 'e PMP-faze fergelykber mei de permeabiliteit fan kearn-skil dieltsjes mei in grutte fan 5 μm.
wêrby't Wx de massa is fan 'e kolom fol mei chloroform, Wy de massa is fan 'e kolom fol mei metanol, en ρ de tichtheid fan it oplosmiddel. Tichtheid fan metanol (ρ = 0.7866) en chloroform (ρ = 1.484). De totale porositeit fan 'e silika-C18-dieltsjeskolom (100 × 1.8 mm ID)34 en ús earder bestudearre C18-urea31-kolom wie respektivelik 0.63 en 0.55. Dit betsjut dat de oanwêzigens fan ureumliganden de permeabiliteit fan 'e stasjonêre faze ferminderet. Oan 'e oare kant is de totale porositeit fan 'e PMP-kolom (binnendiameter 100 × 1.8 mm) 0.60. PMP-kolommen binne minder permeabel as kolommen ynpakt mei C18-bûne silikadieltsjes, om't yn stasjonêre fazen fan it C18-type de C18-liganden oan 'e silikadieltsjes yn lineêre keatlingen fêstmakke binne, wylst yn stasjonêre fazen fan it polystyreen-type in relatyf dik polymeer om 'e dieltsjes hinne foarme wurdt. laach A. Yn in typysk eksperimint wurdt kolomporositeit as folget berekkene:
Op fig. 7A, B litte Van Deemter-plots sjen foar in PMP-kolom (id 100 x 1,8 mm) en in Ascentis Express RP-Amide-kolom (id 100 x 1,8 mm) ûnder deselde elúsjebetingsten, 60/40 ACN/H2O en 0,1% TFA 20 µl/min oant 800 µl/min op beide kolommen. De minimale HETP-wearden by de optimale streamsnelheid (80 µl/min) wiene respektivelik 2,6 µm en 3,9 µm foar de PMP-kolom en de Ascentis Express RP-Amide-kolom. De HETP-wearden litte sjen dat de skiedingseffisjinsje fan 'e PMP-kolom (100 x 1,8 mm id) folle heger is as dy fan 'e kommersjeel beskikbere Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 x 1,8 mm id). De van Deemter-grafyk yn Fig. 7(A) lit sjen dat de ôfname yn N-wearde net signifikant heger is mei tanimmende stream yn ferliking mei ús foarige stúdzje. De hegere skiedingseffisjinsje fan 'e PMP-kolom (id 100 × 1,8 mm) yn ferliking mei de Ascentis Express RP-Amide-kolom is basearre op 'e ferbettere dieltsjefoarm en -grutte en de ferfine kolompakkingsproseduere dy't brûkt wurdt yn it hjoeddeiske wurk34.
(A) Van Deemter-plot (HETP tsjin lineêre snelheid fan mobile faze) krigen op in PMP-kolom (id 100 x 1,8 mm) yn 60/40 ACN/H2O mei 0,1% TFA. (B) Van Deemter-plot (HETP tsjin lineêre snelheid fan mobile faze) krigen op in Ascentis Express RP-Amide-kolom (id 100 x 1,8 mm) yn 60/40 ACN/H2O mei 0,1% TFA.
In poalstasjonêre faze fan ynterkalearre polystyreen waard taret en evaluearre foar de skieding fan in mingsel fan syntetyske peptiden en tryptyske hydrolysaat fan minsklik serumalbumine (HSA) yn hege prestaasjes floeistofchromatografy. De chromatografyske prestaasjes fan PMP-kolommen foar peptidemingsels binne poerbêst yn termen fan skiedingseffisjinsje en resolúsje. De ferbettere skiedingseffisjinsje fan PMP-kolommen is te tankjen oan ferskate redenen lykas silika-dieltsjesgrutte en poarjegrutte, kontroleare synteze fan stasjonêre fazen, en komplekse kolompakkingsmaterialen. Neist de hege skiedingseffisjinsje is in oar foardiel fan dizze stasjonêre faze de lege kolomtegendruk by hege streamsnelheden. PMP-kolommen binne tige reprodusearber en kinne brûkt wurde om mingsels fan peptiden en tryptyske spiisfertarring fan ferskate proteïnen te analysearjen. Wy binne fan doel dizze kolom te brûken foar de skieding fan bioaktive ferbiningen fan natuerlike produkten, ekstrakten fan medisinale planten en paddestoelen yn floeistofchromatografy. Yn 'e takomst sille PMP-kolommen ek evaluearre wurde foar de skieding fan proteïnen en monoklonale antistoffen.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersyk nei peptideskiedingssystemen mei omkearde fazechromatografy diel I: Untwikkeling fan in protokol foar kolomkarakterisaasje. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersyk nei peptideskiedingssystemen mei omkearde fazechromatografy diel I: Untwikkeling fan in protokol foar kolomkarakterisaasje.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., en Petersson, P. Undersyk nei peptideskiedingssystemen troch omkearde-faze-chromatografy, diel I: Untwikkeljen fan in protokol foar kolomkarakterisaasje. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersyk nei peptideskiedingssystemen mei omkearde fazechromatografy diel I: Untwikkeling fan in protokol foar kolomkarakteristiken. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersyk nei peptideskiedingssystemen mei omkearde fazechromatografy diel I: Untwikkeling fan in protokol foar kolomkarakteristiken.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., en Petersson, P. Undersyk nei peptideskiedingssystemen troch omkearde-faze-chromatografy, diel I: Untwikkeljen fan in protokol foar kolomkarakterisaasje.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Metoaden foar it meitsjen fan ferbettere aktive peptiden foar de behanneling fan ynfeksjesykten. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetyske terapeutyske peptiden: Wittenskip en merk. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetyske terapeutyske peptiden: Wittenskip en merk.Vliege P, Lisowski V, Martinez J en Chreschatyski M. Syntetyske terapeutyske peptiden: wittenskip en merk.Vliege P, Lisowski V, Martinez J en Khreschatsky M. Syntetyske terapeutyske peptiden: wittenskip en merk. ûntdekking fan medisinen. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Avansearre proteomyske floeistofchromatografy. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Avansearre proteomyske floeistofchromatografy.Sjoch F., Smith RD en Shen Yu. Avansearre proteomyske floeistofchromatografy. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD, & Shen, Y. Avansearre protein gearstalling 液相色谱.Sjoch F., Smith RD en Shen Yu. Avansearre proteomyske floeistofchromatografy.J. Chromatografy. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Avansearre floeistofchromatografy-massaspektrometry is yn steat om breed basearre metabolomika en proteomika te kombinearjen. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ De rol fan UHPLC yn farmaseutyske ûntwikkeling. Chesnut, SM & Salisbury, JJ De rol fan UHPLC yn farmaseutyske ûntwikkeling.Chesnut, SM en Salisbury, JJ De rol fan UHPLC yn farmaseutyske ûntwikkeling.Chesnut, SM en Salisbury, JJ De rol fan UHPLC yn medisynûntwikkeling. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktyske aspekten fan ultrahege druk floeistofchromatografy foar snelle skiedingen. Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktyske aspekten fan ultrahege druk floeistofchromatografy foar snelle skiedingen.Wu, N. en Clausen, AM Fundamentele en praktyske aspekten fan hegedruk floeistofchromatografy foar rappe skieding. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Basis- en praktyske aspekten fan ultrahege druk floeistofchromatografy foar rappe skieding.Wu, N. en Clausen, AM Fundamentele en praktyske aspekten fan hegedruk floeistofchromatografy foar rappe skieding.J. Sept. Wittenskip. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Gebrûk fan ultra-prestaasje floeistofchromatografy yn farmaseutyske ûntwikkeling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Gebrûk fan ultra-prestaasje floeistofchromatografy yn farmaseutyske ûntwikkeling.Ren, SA en Chelischeff, P. It gebrûk fan ultra hege prestaasjes floeistofchromatografy yn farmaseutyske ûntwikkeling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用. Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA en Chelischeff, P. Tapassing fan ultra-prestaasje floeistofchromatografy yn medisynûntwikkeling.J. Chromatografy. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. In monolityske makroporeuze hydrogel ôflaat fan in oalje-yn-wetter-emulsie mei in hege ynterne faze foar effisjinte suvering fan enterovirus 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA De rol fan floeistofchromatografy yn proteomika. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA De rol fan floeistofchromatografy yn proteomika.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. en Wilkins, JA De rol fan floeistofchromatografy yn proteomika. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. en Wilkins, JA De rol fan floeistofchromatografy yn proteomika.J. Chromatografy. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nije trends yn omkearde-faze floeibere chromatografyske skiedingen fan terapeutyske peptiden en proteïnen: Teory en tapassingen. & Guillarme, D. Nije trends yn omkearde-faze floeibere chromatografyske skiedingen fan terapeutyske peptiden en proteïnen: Teory en tapassingen. & Guillarme, D. фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Nije trends yn 'e skieding fan terapeutyske peptiden en proteïnen troch omkearde faze floeistofchromatografy: teory en tapassingen. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.en Guillarmé, D. Nije trends yn 'e skieding fan terapeutyske peptiden en aaiwiten troch omkearde faze floeistofchromatografy: teory en tapassingen.J. Pharm. Biomedyske Wittenskip. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Twadiminsjonale skieding fan peptiden mei it RP-RP-HPLC-systeem mei ferskillende pH yn earste en twadde skiedingsdiminsjes. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Twadiminsjonale skieding fan peptiden mei it RP-RP-HPLC-systeem mei ferskillende pH yn earste en twadde skiedingsdiminsjes.Gilar M., Olivova P., Dali AE en Gebler JK Twadiminsjonale skieding fan peptiden mei it RP-RP-HPLC-systeem mei ferskillende pH yn 'e earste en twadde skiedingsdiminsjes.Gilar M., Olivova P., Dali AE en Gebler JK Twadiminsjonale skieding fan peptiden mei ferskate pH-wearden yn 'e earste en twadde skiedingsdiminsjes mei it RP-RP-HPLC-systeem. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Undersyk nei de massa-oerdracht en kinetyske skaaimerken fan hege-prestaasjechromatografykolommen ynpakt mei folslein poreuze en oerflakkich poreuze C18-dieltsjes lytser as 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Resinte trends en analytyske útdagings yn 'e isolaasje, identifikaasje en falidaasje fan plantaardige bioaktive peptiden. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomysk lânskip fan it keninkryk fan it libben. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Neibehanneling fan terapeutyske peptiden troch preparative floeistofchromatografy. Molecules (Basel, Switserlân) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatografy en har tapassingen op biopolymeren. Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatografy en har tapassingen op biopolymeren.Yang, Yu. en Geng, X. Mixed mode chromatography en de tapassing dêrfan op biopolymeren. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Mixed mode chromatography en de tapassing dêrfan yn biopolymers.Yang, Yu. en Gene, X. Mixed mode chromatography en de tapassing dêrfan op biopolymeren.J. Chromatografy. A 1218(49), 8813–8825 (2011).