Merci fir Äre Besuch op Nature.com. Dir benotzt eng Browserversioun mat limitéierter CSS-Ënnerstëtzung. Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). Zousätzlech, fir eng weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, weisen mir d'Websäit ouni Stiler a JavaScript.
Weist e Karussell vun dräi Folien gläichzäiteg un. Benotzt d'Knäppercher "Virdrun" an "Nächst" fir duerch dräi Folien gläichzäiteg ze navigéieren, oder benotzt d'Schieberknäppercher um Enn fir duerch dräi Folien gläichzäiteg ze navigéieren.
Poréis Kieselerdeeler goufen mat der Sol-Gel-Method mat e puer Modifikatioune virbereet, fir breetporeg Partikelen ze kréien. Dës Partikelen goufen mat N-Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PMI) a Styrol iwwer Reverse-Chain Transfer-Fragmentation (RAFT) Polymerisatioun derivatiséiert, fir N-Phenylmaleimid interkaléiert Polyamiden ze produzéieren. Styrol (PMP) stationär Phas. Schmuel Lächer an Edelstol (100 × 1,8 mm bannenzegen Duerchmiesser) goufen mat enger Schlammpackung gepackt. D'chromatographesch Leeschtung vun der PMP-Kolonn gouf evaluéiert, fir eng Mëschung aus synthetesche Peptiden ze trennen, déi aus fënnef Peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu-Aminosaier-Enkephalin) an tryptescht Hydrolysat vum mënschleche Serumalbumin (HAS) besteet. Ënner optimalen Elutiounsbedingungen huet déi theoretesch Zuel vu Placke mat enger Mëschung aus Peptiden 280.000 Placke/m² erreecht. Beim Verglach vun der Trennleistung vun der entwéckelter Kolonn mat der kommerzieller Ascentis Express RP-Amide Kolonn gouf festgestallt, datt d'Trennungseffizienz vun der PMP-Kolonn a punkto Trennungseffizienz an Opléisung besser war wéi déi vun der kommerzieller Kolonn.
D'biopharmazeutesch Industrie ass an de leschte Joren zu engem expandierende globale Maart ginn, mat enger bedeitender Erhéijung vum Maartundeel. Mam explosive Wuesstem vun der biopharmazeutesch Industrie1,2,3 gëtt et e grousse Besoin fir Peptid- a Proteinanalysen. Nieft dem Zilpeptid ginn och verschidden Ongereinheeten während der Peptidsynthese geformt, dofir ass eng chromatographesch Reinigung noutwendeg fir déi gewënscht Rengheet vum Peptid z'erreechen. D'Analyse a Charakteriséierung vu Proteinen a Kierperflëssegkeeten, Gewëss an Zellen ass eng extrem usprochsvoll Aufgab wéinst der grousser Zuel vu potenziell noweisbare Spezies, déi an enger eenzeger Prouf präsent sinn. Och wann d'Massenspektrometrie en effektivt Instrument fir d'Sequenzéierung vu Peptiden a Proteinen ass, wäert d'Trennung, wann esou Prouwe direkt an de Massenspektrometer agefouert ginn, net zefriddestellend sinn. Dëst Problem kann duerch Flëssegkeetschromatographie (LC) virun der MS-Analyse geléist ginn, wat d'Quantitéit vun Analyten, déi zu engem bestëmmten Zäitpunkt an de Massenspektrometer kommen, reduzéiert4,5,6. Zousätzlech kënnen d'Analyten während der Flëssegkeetsphaseneentrennung an engem enke Beräich konzentréiert ginn, wouduerch dës Analyten konzentréiert ginn an d'Sensibilitéit vun der MS-Detektioun erhéicht gëtt. D'Flëssegchromatographie (LC) huet sech an de leschten zéng Joer däitlech entwéckelt a ass eng wäit verbreet Method fir proteomesch Analysen ginn7,8,9,10.
Réckphas-Flëssegkeetschromatographie (RP-LC) gëtt wäit verbreet benotzt fir Mëschunge vu Peptiden ze purifizéieren an ze trennen andeems Octadecyl-modifizéiert Siliziumdioxid (ODS) als stationär Phas benotzt gëtt11,12,13. Wéinst hirer komplexer Struktur an amphoterer Natur14,15 kënnen RP-stationär Phasen awer keng zefriddestellend Trennung vu Peptiden a Proteinen ubidden. Dofir erfuerdert d'Analyse vu Peptiden a Proteinen mat polaren an netpolare Fragmenter speziell entwéckelt stationär Phasen fir dës Analyten ze interagéieren an ze behalen16. Gemëschte Chromatographie, déi multimodal Interaktiounen ubitt, kann eng Alternativ zu RP-LC sinn fir Peptiden, Proteinen an aner komplex Mëschungen ze trennen. Verschidde stationär Phasen vum gemëschten Typ goufen preparéiert a Kolonnen, déi mat dëse stationäre Phasen gefëllt waren, goufen benotzt fir Peptiden a Proteinen ze trennen17,18,19,20,21. Wéinst der Präsenz vu polaren an net-polare Gruppen si gemëschte Modus-stationär Phasen (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar Interkalatioun/RPLC) gëeegent fir d'Trennung vu Peptiden a Proteinen22,23,24,25,26,27,28. , polar interkaléiert stationär Phasen mat kovalent gebonnene polare Gruppen weisen gutt Trennungsméiglechkeeten an eng eenzegaarteg Selektivitéit fir polar an net-polar Analyten, well d'Trennung vun der Interaktioun tëscht dem Analyt an der stationärer Phas ofhänkt. Multimodal Interaktiounen29,30,31,32. Viru kuerzem hunn Zhang et al.30 Behenyl-terminéiert stationär Phasen vu Polyaminen kritt an erfollegräich Kuelewaasserstoffer, Antidepressiva, Flavonoiden, Nukleosiden, Östrogenen an e puer aner Analyten getrennt. Dat polar agebett stationärt Material huet souwuel polar wéi och net-polar Gruppen, sou datt et benotzt ka ginn fir Peptiden a Proteinen an hydrophob an hydrophil Deeler ze trennen. Polar Inline-Sailen (z.B. C18-Sailen mat Amid-Inline) sinn ënner dem Handelsnumm Ascentis Express RP-Amid-Sailen verfügbar, awer dës Sailen goufen nëmme fir d'Analyse vum Amin 33 benotzt.
An der aktueller Studie gouf eng polar agebett stationär Phas (N-Phenylmaleimid, agebett Polystyrol) virbereet an op Peptidtrennung an tryptesch HSA-Spaltung evaluéiert. Déi folgend Strategie gouf benotzt fir déi stationär Phas virzebereeden. Poréis Kieselertikeler goufen no de Prozedure virbereet, déi an eise fréiere Publikatioune beschriwwe sinn, mat e puer Ännerungen an de Virbereedungsschemaen 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. D'Verhältnisser vun Harnstoff, Polyethylenglykol (PEG), TMOS a wässeriger Essigsäure goufen ugepasst fir Kieselertikeler mat grousse Poregréissten ze kréien. Zweetens gouf e neie Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat-Ligand synthetiséiert an seng derivatiséiert Kieselertikeler goufen benotzt fir polar agebett stationär Phasen virzebereeden. Déi kritt stationär Phas gouf an eng Edelstahlkolonn (bannenduerchmiesser 100 × 1,8 mm) no engem optiméierte Packungsschema gepackt. D'Packung vun der Kolonn gëtt duerch mechanesch Schwéngung ënnerstëtzt fir eng eenheetlech Schicht an der Kolonn ze garantéieren. Déi gepackt Kolonn gouf op d'Trennung vun enger Mëschung aus Peptiden evaluéiert, déi aus fënnef Peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin-Peptid) an tryptischen Hydrolysaten aus mënschlechem Serumalbumin (HSA) besteet. Et gouf observéiert, datt d'Peptidmëschung an den HSA-Tryptik-Verdauungsprodukt sech mat gudder Opléisung an Effizienz getrennt hunn. D'Trennungseffizienz vun der PMP-Kolonn gouf mat där vun der Ascentis Express RP-Amid-Kolonn verglach. Et gouf observéiert, datt Peptiden a Proteinen eng gutt Opléisung an eng héich Trennungseffizienz op der PMP-Kolonn hunn, an d'Trennungseffizienz vun der PMP-Kolonn ass méi héich wéi déi vun der Ascentis Express RP-Amid-Kolonn.
PEG (Polyethylenglykol), Harnstoff, Essigsäure, Trimethoxyorthosilikat (TMOS), Trimethylchlorsilan (TMCS), Trypsin, mënschlecht Serumalbumin (HSA), Ammoniumchlorid, Harnstoff, Hexamethylmethacryloyldisilazan (HMDS), Methacryloylchlorid (MC), Styrol, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoylperoxid (BPO), Acetonitril (ACN) fir HPLC, Methanol, 2-Propanol an Aceton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
Eng Mëschung aus Harnstoff (8 g), Polyethylenglykol (8 g) an 8 ml 0,01 N Essigsäure gouf 10 Minutte laang geréiert, an 24 ml TMOS goufen ënner Äiskillung derbäigesat. D'Reaktiounsmëschung gouf 6 Stonnen bei 40 °C an duerno 8 Stonnen bei 120 °C an engem Autoklav aus Edelstol erhëtzt. D'Waasser gouf ofgedekantéiert an de Rescht gouf 12 Stonnen bei 70 °C gedréchent. Déi gedréchent mëll Blöcke goufen glat gemuel an an engem Uewen bei 550 °C fir 12 Stonnen kalzinéiert. Dräi Chargen goufen preparéiert a charakteriséiert fir d'Reproduzéierbarkeet vun de Partikelgréissten, der Poregréisst an der Uewerfläch ze testen.
Polar Grupp a stationär Phas fir Polystyrol Ketten. D'Virbereedungsprozedur gëtt hei ënnendrënner beschriwwen.
N-Phenylmaleimid (200 mg) a Methylvinylisocyanat (100 mg) goufen an wasserfreiem Toluol opgeléist, an duerno goufen 0,1 ml 2,2'-Azoisobutyronitril (AIBN) an de Reaktiounskolben bäigefüügt, fir e Copolymer vu Phenylmaleimid a Methylvinylisocyanat (PMCP) ze kréien. D'Mëschung gouf 3 Stonnen bei 60°C erhëtzt, gefiltert an 3 Stonnen an engem Uewen bei 40°C gedréchent.
Gedréchent Siliziumdioxid-Partikelen (2 g) goufen an dréchenem Toluol (100 ml) dispergéiert, geréiert an 10 Minutte laang an engem 500 ml Ronnbuedemkolben sonikéiert. PMCP (10 mg) gouf an Toluol opgeléist an iwwer en Zousaztrichter tropfenweis an de Reaktiounskolben bäigefüügt. D'Mëschung gouf 8 Stonnen bei 100 °C ënner Reflux gekacht, gefiltert, mat Aceton gewäsch an 3 Stonnen bei 60 °C gedréchent. Duerno goufen d'Siliziumdioxid-Partikelen, déi mat PMCP (100 g) assoziéiert waren, an Toluol (200 ml) opgeléist, an 4-Hydroxy-TEMPO (2 ml) gouf a Präsenz vun 100 μl Dibutylzinndilaurat als Katalysator bäigefüügt. D'Mëschung gouf 8 Stonnen bei 50 °C geréiert, gefiltert an 3 Stonnen bei 50 °C gedréchent.
Styrol (1 ml), Benzoylperoxid BPO (0,5 ml) a Siliziumdioxid-Partikelen, déi un TEMPO-PMCP (1,5 g) befestegt waren, goufen an Toluol dispergéiert a mat Stéckstoff gespullt. D'Polymerisatioun vum Styrol gouf 12 Stonnen bei 100 °C duerchgefouert. Dat resultéierend Produkt gouf mat Methanol gewäsch an iwwer Nuecht bei 60 °C gedréchent. De generelle Schema vun der Reaktioun ass an der Fig. een gewisen.
D'Prouwen goufen 1 Stonn bei 393 K entgast, bis en Reschtdrock vu manner wéi 10–3 Torr erreecht gouf. D'Quantitéit un N2, déi bei relativem Drock P/P0 = 0,99 adsorbéiert gouf, gouf benotzt fir de gesamte Porenvolumen ze bestëmmen. D'Morphologie vu reine a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen gouf mat engem Rasterelektronemikroskop (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan) ënnersicht. Dréche Prouwen (reng Siliziumdioxid a Ligand-gebonnen Siliziumdioxid-Partikelen) goufen mat Kuelestoffband op Aluminiumstangen placéiert. Gold gouf mat engem Q150T-Sputterapparat op d'Prouf ofgesat, an eng 5 nm déck Au-Schicht gouf op d'Prouf ofgesat. Dëst verbessert d'Effizienz vum Nidderspannungsprozess a suergt fir e feine Kaltsprëtzen. D'Elementaranalyse gouf mat engem Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 Elementarzesummesetzungsanalysator duerchgefouert. E Malvern Partikelgréisstanalysator (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 gouf benotzt fir d'Partikelgréisstverdeelung ze bestëmmen. Onbeschichtete Siliziumdioxid-Partikelen a Ligand-gebonnen Siliziumdioxid-Partikelen (jee 5 mg) goufen an 5 ml Isopropanol dispergéiert, 10 Minutte laang sonikéiert, 5 Minutte laang geréiert an op eng Mastersizer optesch Bench placéiert. D'Thermogravimetrisch Analyse gëtt mat enger Geschwindegkeet vu 5 °C pro Minutt am Temperaturberäich vun 30 bis 800 °C duerchgefouert.
Edelstahlsailen mat enger schmueler Kavitéit an den Dimensiounen (ID 100 × 1,8 mm) goufen duerch d'Schlammfëllungsmethod gepackt, no der selwechter Prozedur wéi an der Referenz 31. Eng Edelstahlsail (mat Glasfaserbeschichtung, ID 100 × 1,8 mm) an en Auslaaf mat engem 1 µm Frit goufen un eng Schlammverpackungsmaschinn (Alltech Deerfield, IL, USA) ugeschloss. Eng Suspension vun der stationärer Phas gëtt virbereet, andeems 150 mg vun der stationärer Phas an 1,2 ml Methanol suspendéiert an an eng Reservoirsail ageleet gëtt. Methanol gouf als Schlammléisungsmëttel a Kontrollléisungsmëttel benotzt. D'Sail gëtt gepackt, andeems eng Drocksequenz vun 100 MP fir 10 Minutten, 80 MP fir 15 Minutten a 60 MP fir 30 Minutten ugewannt gëtt. Beim Packungsprozess goufen zwéi Gaschromatographie-Sailenvibratoren (Alltech, Deerfield, IL, USA) fir mechanesch Schwéngungen benotzt, fir eng gläichméisseg Sailenpackung ze garantéieren. De Schlammpacker gëtt zougemaach a lues a lues den Drock ofgelooss, fir Schied un der String ze vermeiden. D'Kolonn gouf vun der Schlammdüs getrennt an eng aner Fitting gouf un den Inlet befestegt an un den LC-System ugeschloss fir hir Funktioun ze testen.
En individuellen MLC gouf mat enger LC-Pompel (10AD Shimadzu, Japan), engem Samplingapparat mat enger 50 nL Injektiounsschleef (Valco (USA) C14 W.05), engem Membranentgaser (Shimadzu DGU-14A) an engem UV-VIS Kapillarfënster gebaut. En Detektor (UV-2075) an eng emailléiert Mikrokolonn. Benotzt ganz schmuel a kuerz Verbindungsréier fir den Effekt vun enger zousätzlecher Kolonnenexpansioun ze minimiséieren. Nodeems d'Kolonn gefëllt gouf, installéiert e Kapillar (50 µm Id 365) um Ausgang vun der 1/16″ Reduktiounsjunktioun an e Kapillar (50 µm) vun der Reduktiounsjunktioun. D'Datenerfassung an d'Chromatogrammveraarbechtung ginn mat der Multichro 2000 Software duerchgefouert. Bei 254 nm gouf d'UV-Absorptioun vun den Analyten vun den Testpersounen bei 0 iwwerwaacht. Chromatographesch Donnéeë goufen mat OriginPro8 (Northampton, MA) analyséiert.
Mënschlecht Serumalbumin, lyophiliséiert Pulver, ≥ 96% (Agarosegelelektrophorese) 3 mg gemëscht mat Trypsin (1,5 mg), 4,0 M Harnstoff (1 ml) an 0,2 M Ammoniumbikarbonat (1 ml). D'Léisung gouf 10 Minutte laang geréiert an 6 Stonnen an engem Waasserbad bei 37°C gehale, duerno mat 1 ml 0,1% TFA ofgekillt. D'Léisung gefiltert a bei enger Temperatur vun 4°C lageren.
D'Trennung vun enger Mëschung aus Peptiden an tryptischem Verdauungs-HSA op enger PMP-Sail gouf separat evaluéiert. Kontrolléiert d'tryptesch Hydrolyse vun enger Mëschung aus Peptiden an HSA, déi vun enger PMP-Sail getrennt gouf, a vergläicht d'Resultater mat enger Ascentis Express RP-Amid-Sail. D'Zuel vun den theoretesche Placke gëtt mat der folgender Equatioun berechent:
SEM-Biller vu renge Siliziumdioxid-Partikelen a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen sinn an der Figur 2 gewisen. SEM-Biller vu renge Siliziumdioxid-Partikelen (A, B) weisen eng sphäresch Form, bei där d'Partikelen verlängert sinn oder eng onregelméisseg Symmetrie hunn am Verglach mat eise fréiere Studien. D'Uewerfläch vun de Siliziumdioxid-Partikelen, déi vum Ligand (C, D) gebonne sinn, ass méi glat wéi déi vu renge Siliziumdioxid-Partikelen, wat eventuell dorunner läit, datt d'Polystyrol-Ketten d'Uewerfläch vun de Siliziumdioxid-Partikelen bedecken.
Rasterelektronemikroskopesch Opname vu reinen Siliziumdioxid-Partikelen (A, B) a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen (C, D).
D'Partikelgréisstverdeelung vu pure Siliziumdioxid-Partikelen a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen ass an der Fig. 2.3(A) gewisen. Volumetresch Partikelgréisstverdeelungskurven hunn gewisen, datt d'Siliziumdioxid-Partikelgréisst no der chemescher Modifikatioun zougeholl huet (Fig. 3A). D'Siliziumdioxid-Partikelgréisstverdeelungsdaten aus der aktueller Studie an der viregter Studie ginn an der Tabell 1(A) verglach. Déi volumetresch Partikelgréisst d(0.5) vu PMP war 3.36 µm, am Verglach zum ad(0.5)-Wäert vun 3.05 µm an eiser viregter Studie (Polystyrol-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen)34. Wéinst der Ännerung vum Verhältnes vu PEG, Harnstoff, TMOS an Essigsäure an der Reaktiounsmëschung war d'Partikelgréisstverdeelung vun dësem Charge méi enk am Verglach mat eiser viregter Studie. D'Partikelgréisst vun der PMP-Phase ass liicht méi grouss wéi déi vun der Polystyrol-gebonnener Siliziumdioxid-Partikelphase, déi mir virdru studéiert hunn. Dëst bedeit, datt d'Uewerflächenfunktionaliséierung vu Siliziumdioxid-Partikelen mat Styrol nëmmen eng Polystyrol-Schicht (0,97 µm) op der Siliziumdioxid-Uewerfläch ofgesat huet, während an der PMP-Phas d'Schichtdicke 1,38 µm war.
Partikelgréisstverdeelung (A) a Poregréisstverdeelung (B) vu reine Siliziumdioxid-Partikelen a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen.
D'Poregréisst, de Porevolumen an d'Uewerfläch vun de Siliziumdioxid-Partikelen, déi an dëser Studie benotzt goufen, sinn an der Tabell 1 (B) gewisen. D'PSD-Profiler vu reine Siliziumdioxid-Partikelen a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen sinn an de Fig. 3(B) gewisen. D'Resultater ware vergläichbar mat eiser viregter Studie34. D'Poregréissten vu reine a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen waren 310 Å respektiv 241 Å, wat drop hiweist, datt no der chemescher Modifikatioun d'Poregréisst ëm 69 Å erofgaangen ass, wéi an der Tabell 1 (B) gewisen, an d'Verschiebungskurve ass an der Fig. gewisen. Déi spezifesch Uewerfläch vun de Siliziumdioxid-Partikelen an der aktueller Studie ass 116 m2/g, wat vergläichbar mat eiser viregter Studie ass (124 m2/g). Wéi an der Tabell 1(B) gewisen, ass d'Uewerfläch (m2/g) vun de Siliziumdioxid-Partikelen no der chemescher Modifikatioun och vun 116 m2/g op 105 m2/g erofgaangen.
D'Resultater vun der Elementaranalyse vun der stationärer Phas sinn an der Tabell 2 presentéiert. De Kuelestoffgehalt vun der aktueller stationärer Phas ass 6,35%, wat méi niddreg ass wéi an eiser viregter Studie (Kiseldioxidpartikelen, déi mat Polystyrol assoziéiert sinn, 7,93%35 respektiv 10,21%)42. De Kuelestoffgehalt vun der aktueller stationärer Phas ass hei ënnendrënner, well e puer polar Liganden wéi Phenylmaleimidmethylvinylisocyanat (PCMP) a 4-Hydroxy-TEMPO zousätzlech zu Styrol bei der Virbereedung vu SP benotzt goufen. De Gewiichtsprozentsaz vu Stickstoff an der aktueller stationärer Phas ass 2,21% am Verglach zu 0,1735 an 0,85% a fréiere Studien42. Dëst bedeit, datt déi aktuell stationär Phas en héije Gewiichtsprozentsaz vu Stickstoff huet wéinst dem Phenylmaleimid. Ähnlech hunn d'Produkter (4) an (5) e Kuelestoffgehalt vun 2,7% respektiv 2,9%, während dat fäerdegt Produkt (6) e Kuelestoffgehalt vun 6,35% huet, wéi an der Tabell 2 gewisen. Thermogravimetrisch Analyse (TGA) gouf op der stationärer Phas vum PMP benotzt fir de Gewiichtsverloscht ze testen, an d'TGA-Kurve ass an der Figur 4 gewisen. D'TGA-Kurve weist e Gewiichtsverloscht vun 8,6%, wat gutt mam Kuelestoffgehalt (6,35%) iwwereneestëmmt, well d'Liganden net nëmmen C1, mä och N2, O2 an H2 enthalen.
De Ligand Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat gouf gewielt fir d'Uewerfläch vun de Siliziumdioxid-Partikelen ze modifizéieren wéinst senge polare Phenylmaleimid- a Vinylisocyanatgruppen. Vinylisocyanatgruppen kënnen weider mat Styrol reagéieren duerch lieweg Radikalpolymerisatioun. Den zweete Grond ass et, eng Grupp anzeféieren, déi moderéiert Interaktioune mam Analyt huet an keng staark elektrostatesch Interaktiounen tëscht dem Analyt an der stationärer Phas, well d'Phenylmaleimid-Eenheet keng virtuell Ladung bei normalem pH-Wäert huet. D'Polaritéit vun der stationärer Phas kann duerch déi optimal Quantitéit u Styrol an d'Reaktiounszäit vun der fräier Radikalpolymerisatioun kontrolléiert ginn. De leschte Schrëtt vun der Reaktioun (fräier Radikalpolymerisatioun) ass entscheedend, well en d'Polaritéit vun der stationärer Phas ännert. Eng Elementaranalyse gouf duerchgefouert fir de Kuelestoffgehalt an dëse stationäre Phasen ze kontrolléieren. Et gouf observéiert, datt d'Erhéijung vun der Quantitéit u Styrol an der Reaktiounszäit de Kuelestoffgehalt vun der stationärer Phas erhéicht an ëmgekéiert. SPs, déi mat verschiddene Konzentratioune vu Styrol preparéiert ginn, hunn ënnerschiddlech Kuelestoffbelaaschtungen. Ähnlech goufen dës stationär Phasen op Edelstahlkolonnen placéiert an hir chromatographesch Charakteristiken (Selektivitéit, Opléisung, N-Wäert, etc.) goufen iwwerpréift. Baséierend op dësen Experimenter gouf eng optiméiert Zesummesetzung fir d'Virbereedung vun der PMP-stationärer Phas gewielt, fir eng kontrolléiert Polaritéit an eng gutt Retentioun vum Analyt ze garantéieren.
D'PMP-Kolonn gouf och fir d'Analyse vu fënnef Mëschunge vu Peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) mat Hëllef vun der Kapazitéit vun der mobiler Phase evaluéiert. 60/40 (v/v) ACN/Waasser (0,1% TFA) bei enger Duerchflussquote vun 80 µl/min. Ënner optimalen Elutiounsbedingungen (200.000 Placken/m²) ass d'Zuel vun den theoretesche Placken (N) pro Kolonn (100 × 1,8 mm) 20.000 ± 100. D'N-Wäerter fir déi dräi PMP-Kolonnen sinn an der Tabell 3 an d'Chromatogrammer sinn an der Figur 5A gewisen. Schnell Analyse bei héijer Duerchflussrate (700 µl/min) op enger PMP-Sail, fënnef Peptiden bannent enger Minutt eluéiert, exzellenten N-Wäert vun 13.500 ± 330 pro Sail (100 x 1,8 mm Duerchmiesser), entspriechend 135.000 Placken/m² (Fig. 5B). Dräi Sailen vun der selwechter Gréisst (bannenduerchmiesser 100 x 1,8 mm) goufen mat dräi verschiddene Chargen vun der stationärer PMP-Phase gefëllt fir d'Reproduzéierbarkeet ze testen. Analyte goufen fir all Sail opgeholl andeems déiselwecht Testmëschung op all Sail mat optimalen Elutiounsbedingungen, Zuel vun den theoretesche Placken N an der Retentiounszäit getrennt gouf. D'Reproduzéierbarkeetsdaten fir d'PMP-Sailen sinn an der Tabell 4 gewisen. D'Reproduzéierbarkeet vun der PMP-Sail huet gutt mat ganz niddrege %RSD-Wäerter korreléiert, wéi an der Tabell 3 gewisen.
Trennung vu Peptidmëschungen op enger PMP-Kolonn (B) an enger Ascentis Express RP-Amid-Kolonn (A), mobil Phase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), Dimensiounen vun der PMP-Kolonn (100 x 1,8 mm bannenzegen Duerchmiesser), Analyse Elutioun vun de Verbindungen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) a 5 (Leucinsäure-Enkephalin).
Eng PMP-Sail (bannenduerchmiesser 100 x 1,8 mm) gouf fir d'Trennung vum tryptesche Hydrolysat vum mënschleche Serumalbumin duerch HPLC evaluéiert. De Chromatogramm an der Figur 6 weist, datt d'Prouwe gutt getrennt sinn mat enger ganz gudder Opléisung. HSA-Léisunge goufen mat enger Duerchflussquote vun 100 μl/min, enger mobiler Phase vun 70/30 Acetonitril/Waasser an 0,1% TFA analyséiert. D'Spaltung vun HSA gouf a 17 Peaks opgedeelt, wéi am Chromatogramm (Fig. 6) gewisen, déi 17 Peptiden entspriechen. D'Trennungseffizienz vun den eenzelne Peaks vum HSA-Hydrolysat gouf berechent an d'Wäerter sinn an der Tabell 5 gewisen.
HSA-Tryptikhydrolysate goufen op enger PMP-Sail (bannenduerchmiesser 100 x 1,8 mm), Duerchflussrate (100 μl/min), mobiler Phas 60/40 Acetonitril/Waasser an 0,1% TFA getrennt.
wou L d'Kolonnlängt ass, η d'Viskositéit vun der mobiler Phas ass, ΔP den Géigendrock vun der Kolonn ass, an u d'linear Geschwindegkeet vun der mobiler Phas ass. D'Permeabilitéit vun der PMP-Kolonn war 2,5 × 10–14 m2, d'Duerchflussquote war 25 µl/min, 60/40 v/v gouf benotzt. ACN/Waasser. D'Permeabilitéit vun der PMP-Kolonn (ID 100 × 1,8 mm) war ähnlech wéi déi vun eiser viregter Ref.34-Studie. D'Permeabilitéit vun enger Kolonn, déi mat uewerflächlech porösen Partikelen gefëllt ass, ass 1,7×10,6 µm, 2,5×10-14 m2 fir 5 µm Partikelen43. Dofir ass d'Permeabilitéit vun der PMP-Phas ähnlech wéi d'Permeabilitéit vu Kär-Schuel-Partikelen mat enger Gréisst vu 5 μm.
woubei Wx d'Mass vun der mat Chloroform gefëllter Kolonn ass, Wy d'Mass vun der mat Methanol gefëllter Kolonn ass, an ρ d'Dicht vum Léisungsmëttel ass. D'Dicht vu Methanol (ρ = 0,7866) a Chloroform (ρ = 1,484). Déi total Porositéit vun der Silica-C18-Partikel-Kolonn (100 × 1,8 mm ID)34 an eiser virdru studéierter C18-Harnstoff31 Kolonn war 0,63 respektiv 0,55. Dëst bedeit, datt d'Präsenz vun Harnstoffliganden d'Permeabilitéit vun der stationärer Phas reduzéiert. Op der anerer Säit ass déi total Porositéit vun der PMP-Kolonn (bannenduerchmiesser 100 × 1,8 mm) 0,60. PMP-Kolonnen si manner permeabel wéi Kolonnen, déi mat C18-gebonnene Silica-Partikelen gepackt sinn, well a stationäre Phasen vum Typ C18 d'C18-Liganden un d'Silica-Partikelen a lineare Ketten gebonne sinn, während a stationäre Phasen vum Polystyrol-Typ e relativ décke Polymer ronderëm d'Partikelen geformt gëtt. Schicht A. An engem typeschen Experiment gëtt d'Kolonnporositéit wéi follegt berechent:
Op Fig. 7A, B weisen Van Deemter-Diagrammer fir eng PMP-Kolonn (Innendiameter 100 x 1,8 mm) an eng Ascentis Express RP-Amid-Kolonn (Innendiameter 100 x 1,8 mm) ënner de selwechten Elutiounsbedingungen, 60/40 ACN/H2O an 0,1% TFA 20 µl/min bis 800 µl/min op béide Kolonnen. Déi minimal HETP-Wäerter bei der optimaler Duerchflussrate (80 µl/min) waren 2,6 µm a 3,9 µm fir d'PMP-Kolonn respektiv d'Ascentis Express RP-Amid-Kolonn. D'HETP-Wäerter weisen, datt d'Trennungseffizienz vun der PMP-Kolonn (Innendiameter 100 x 1,8 mm) vill méi héich ass wéi déi vun der kommerziell verfügbarer Ascentis Express RP-Amid-Kolonn (Innendiameter 100 x 1,8 mm). De van Deemter-Grafik an der Fig. 7(A) weist, datt den Réckgang vum N-Wäert net signifikant méi héich ass mat zouhuelendem Flux am Verglach zu eiser viregter Studie. Déi méi héich Trennungseffizienz vun der PMP-Kolonn (Innendiameter 100 × 1,8 mm) am Verglach zu der Ascentis Express RP-Amid-Kolonn baséiert op der verbesserter Partikelform a -gréisst an der sophistikéierter Kolonnpackungsprozedur, déi an der aktueller Aarbecht benotzt gëtt34.
(A) Van Deemter-Diagramm (HETP vs. linear Geschwindegkeet vun der mobiler Phas) op enger PMP-Sail (Innendiameter 100 x 1,8 mm) an 60/40 ACN/H2O mat 0,1% TFA. (B) Van Deemter-Diagramm (HETP vs. linear Geschwindegkeet vun der mobiler Phas) op enger Ascentis Express RP-Amid-Sail (Innendiameter 100 x 1,8 mm) an 60/40 ACN/H2O mat 0,1% TFA.
Eng polar stationär Phas aus interkaléiertem Polystyrol gouf preparéiert an evaluéiert fir d'Trennung vun enger Mëschung aus synthetesche Peptiden an trypteschem Hydrolysat aus mënschlechem Serumalbumin (HSA) an der Héichleistungsflëssegkeetschromatographie. D'chromatographesch Leeschtung vu PMP-Sailen fir Peptidmëschungen ass exzellent wat d'Trennungseffizienz an d'Opléisung ugeet. Déi verbessert Trennungseffizienz vu PMP-Sailen ass op verschidde Grënn zeréckzeféieren, wéi z. B. d'Partikelgréisst a Poregréisst vu Siliziumdioxid, d'kontrolléiert Synthese vu stationäre Phasen a komplex Sailenpackmaterialien. Nieft der héijer Trennungseffizienz ass en anere Virdeel vun dëser stationärer Phas den niddrege Sailenréckdrock bei héijen Duerchflussraten. PMP-Sailen si gutt reproduzéierbar a kënne benotzt ginn fir Mëschunge vu Peptiden an d'tryptesch Verdauung vu verschiddene Proteinen z'analyséieren. Mir plangen dës Sail fir d'Trennung vu bioaktive Verbindungen aus Naturprodukter, Extrakter vu Medizinplanzen a Champignonen an der Flëssegkeetschromatographie ze benotzen. An Zukunft ginn PMP-Sailen och fir d'Trennung vu Proteinen an monoklonalen Antikörper evaluéiert.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Untersuchung vu Peptid-Trennungssystemer mat ëmgedréinter Phasenchromatographie Deel I: Entwécklung vun engem Protokoll fir d'Sailencharakteriséierung. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Untersuchung vun ëmgedréint Phasenchromatographie-Peptid-Trennungssystemer Deel I: Entwécklung vun engem Protokoll fir d'Sailencharakteriséierung.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., a Petersson, P. Untersuchung vu Peptid-Trennungssystemer duerch Reverse-Phase-Chromatographie, Deel I: Entwécklung vun engem Protokoll fir d'Sailencharakteriséierung. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Untersuchung vu Peptid-Trennungssystemer mat ëmgedréinter Phasenchromatographie Deel I: Entwécklung vun engem Protokoll fir Kolonnecharakteristiken. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Untersuchung vu Peptid-Trennungssystemer mat ëmgedréinter Phasenchromatographie Deel I: Entwécklung vun engem Protokoll fir Kolonnecharakteristiken.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., a Petersson, P. Untersuchung vu Peptid-Trennungssystemer duerch Reverse-Phase-Chromatographie, Deel I: Entwécklung vun engem Protokoll fir d'Sailencharakteriséierung.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Methoden fir d'Schafung vu verbesserte aktive Peptide fir d'Behandlung vun infektiösen Krankheeten. Biotechnologie. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetesch therapeutesch Peptiden: Wëssenschaft a Maart. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetesch therapeutesch Peptiden: Wëssenschaft a Maart.Vliege P, Lisowski V, Martinez J a Chreschatyski M. Synthetesch therapeutesch Peptiden: Wëssenschaft a Maart.Vliege P, Lisowski V, Martinez J a Khreschatsky M. Synthetesch therapeutesch Peptiden: Wëssenschaft a Maart. Medikamententdeckung. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Fortgeschratt proteomesch Flëssegkeetschromatographie. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Fortgeschratt proteomesch Flëssegkeetschromatographie.Kuckt F., Smith RD a Shen Yu. Fortgeschratt proteomesch Flëssegkeetschromatographie. Xie, F., Smith, RD, & Shen, Y. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Protein Composition 液相色谱.Kuckt F., Smith RD a Shen Yu. Fortgeschratt proteomesch Flëssegkeetschromatographie.J. Chromatographie. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Fortgeschratt Flëssegkeetschromatographie-Massenspektrometrie ass fäeg, breet baséiert Metabolomik a Proteomik ze kombinéieren. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ D'Roll vun UHPLC an der pharmazeutescher Entwécklung. Chesnut, SM & Salisbury, JJ D'Roll vun UHPLC an der pharmazeutescher Entwécklung.Chesnut, SM a Salisbury, JJ D'Roll vun UHPLC an der pharmazeutescher Entwécklung.Chesnut, SM a Salisbury, JJ D'Roll vun UHPLC an der Entwécklung vu Medikamenter. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamental a praktesch Aspekter vun der Ultrahochdrockflëssegkeetschromatographie fir séier Trennungen. Wu, N. & Clausen, AM Fundamental a praktesch Aspekter vun der Ultrahochdrockflëssegkeetschromatographie fir séier Trennungen.Wu, N. a Clausen, AM Fundamental a praktesch Aspekter vun der Héichdrockflëssegkeetschromatographie fir séier Trennung. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Grondleeënd a praktesch Aspekter vun der Ultrahochdrockflëssegkeetschromatographie fir séier Trennung.Wu, N. a Clausen, AM Fundamental a praktesch Aspekter vun der Héichdrockflëssegkeetschromatographie fir séier Trennung.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Benotzung vun der Ultra-Performance-Flëssegkeetschromatographie an der pharmazeutescher Entwécklung. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Benotzung vun der Ultra-Performance-Flëssegkeetschromatographie an der pharmazeutescher Entwécklung.Ren, SA a Chelischeff, P. D'Benotzung vun der Ultra-Héichleistungs-Flëssegkeetschromatographie an der pharmazeutescher Entwécklung. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用. Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA a Chelischeff, P. Uwendung vun der Ultra-Performance-Flëssegkeetschromatographie an der Medikamentenentwécklung.J. Chromatographie. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. E monolithesche makroporösen Hydrogel, deen aus enger Ueleg-an-Waasser-Emulsioun mat enger héijer interner Phase fir eng effizient Reinigung vum Enterovirus 71 gewonnen gëtt. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA D'Roll vun der Flëssegkeetschromatographie an der Proteomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA D'Roll vun der Flëssegkeetschromatographie an der Proteomik.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. a Wilkins, JA D'Roll vun der Flëssegchromatographie an der Proteomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C., & Wilkins, JA. Shi Y, Xiang R, Horváth C, Wilkins JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. a Wilkins, JA D'Roll vun der Flëssegchromatographie an der Proteomik.J. Chromatographie. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nei Trends an der Reverse-Phase-Flëssegchromatographie-Trennung vun therapeutesche Peptiden a Proteinen: Theorie an Uwendungen. & Guillarme, D. Nei Trends an der Reverse-Phase-Flëssegchromatographie-Trennung vun therapeutesche Peptiden a Proteinen: Theorie an Uwendungen. & Guillarme, D. фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Nei Trends an der Trennung vun therapeutesche Peptiden a Proteinen duerch Réckphas-Flëssegkeetschromatographie: Theorie an Uwendungen. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.a Guillarmé, D. Nei Trends an der Trennung vun therapeutesche Peptiden a Proteinen duerch Réckphas-Flëssegkeetschromatographie: Theorie an Uwendungen.J. Pharm. Biomedical Science. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Zweedimensional Trennung vu Peptiden mat Hëllef vum RP-RP-HPLC-System mat verschiddenem pH-Wäert an der éischter an zweeter Trennungsdimensiounen. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Zweedimensional Trennung vu Peptiden mat Hëllef vum RP-RP-HPLC-System mat verschiddenem pH-Wäert an der éischter an zweeter Trennungsdimensiounen.Gilar M., Olivova P., Dali AE a Gebler JK Zweedimensional Trennung vu Peptiden mat Hëllef vum RP-RP-HPLC-System mat verschiddenem pH-Wäert an der éischter an zweeter Trennungsdimensioun.Gilar M., Olivova P., Dali AE a Gebler JK Zweedimensional Trennung vu Peptiden mat verschiddene pH-Wäerter an der éischter an zweeter Trennungsdimensioun mam RP-RP-HPLC-System. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Ënnersichung vum Massentransfer a kineteschen Eegeschafte vun Héichleistungschromatographie-Sailen, déi mat vollporösen a superfiziel porösen C18-Partikelen méi kleng wéi 2 µm gepackt sinn. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Rezent Trends an analytesch Erausfuerderungen an der Isolatioun, Identifikatioun a Validatioun vu planzbioaktive Peptiden. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomesch Landschaft vum Räich vum Liewen. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Nobehandlung vun therapeutesche Peptiden duerch präparativ Flëssegkeetschromatographie. Molecules (Basel, Schwäiz) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-Mode Chromatographie an hir Uwendungen op Biopolymeren. Yang, Y. & Geng, X. Mixed-Mode Chromatographie an hir Uwendungen op Biopolymeren.Yang, Yu. a Geng, X. Mixed-Mode-Chromatographie an hir Uwendung op Biopolymeren. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Mixed-Mode-Chromatographie an hir Uwendung a Biopolymeren.Yang, Yu. a Gene, X. Mixed-Mode-Chromatographie an hir Uwendung op Biopolymeren.J. Chromatographie. A 1218(49), 8813–8825 (2011).