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多孔質シリカ粒子は、広孔径粒子を得るためにいくつかの変更を加えたゾルゲル法によって調製された。これらの粒子は、逆連鎖移動開裂（RAFT）重合によりN-フェニルマレイミドメチルビニルイソシアネート（PMI）とスチレンで誘導体化され、N-フェニルマレイミドインターカレーションポリアミドが生成された。スチレン（PMP）固定相。狭径ステンレス鋼カラム（内径100×1.8 mm）にスラリー充填剤を充填した。PMPカラムのクロマトグラフィー性能は、5つのペプチド（Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、Leuアミノ酸エンケファリン）とヒト血清アルブミン（HAS）のトリプシン加水分解物からなる合成ペプチドの混合物を分離することによって評価された。最適な溶出条件下では、ペプチド混合物の理論上のプレート数は280,000プレート/平方メートルに達しました。開発したカラムの分離性能を市販のAscentis Express RP-Amideカラムと比較したところ、分離効率と分解能の点でPMPカラムの分離効率が市販カラムよりも優れていることがわかりました。
バイオ医薬品産業は、近年、市場シェアが大幅に増加し、拡大するグローバル市場となっています。バイオ医薬品産業の爆発的な成長に伴い、ペプチドおよびタンパク質分析に対するニーズが高まっています。ペプチド合成では、目的のペプチドに加えてさまざまな不純物が生成されるため、ペプチドの望ましい純度を得るにはクロマトグラフィーによる精製が必要です。体液、組織、細胞中のタンパク質の分析と特性評価は、1つのサンプル中に存在する可能性のある検出可能な種が多数あるため、非常に困難な作業です。質量分析法はペプチドやタンパク質の配列決定に有効なツールですが、このようなサンプルを質量分析計に直接導入すると、分離が不十分になります。この問題は、質量分析の前に液体クロマトグラフィー（LC）を実行することで解決できます。これにより、一定時間内に質量分析計に入る分析対象物の量を減らすことができます4,5,6。さらに、液相分離中に分析対象物質が狭い領域に濃縮されるため、これらの分析対象物質が濃縮され、MS検出の感度が高まります。液体クロマトグラフィー（LC）は過去10年間で大きく進歩し、プロテオミクス分析に広く使用される方法となっています7,8,9,10。
逆相液体クロマトグラフィー（RP-LC）は、固定相としてオクタデシル修飾シリカ（ODS）を使用してペプチドの混合物を精製および分離するために広く使用されています11,12,13。しかし、RP固定相は複雑な構造と両性の性質のため、14,15 ペプチドとタンパク質の満足のいく分離を提供できません。したがって、極性および非極性フラグメントを持つペプチドとタンパク質の分析には、これらの分析対象物と相互作用して保持するように特別に設計された固定相が必要です16。マルチモーダル相互作用を提供する混合クロマトグラフィーは、ペプチド、タンパク質、およびその他の複雑な混合物を分離するためのRP-LCの代替手段になり得ます。いくつかの混合タイプの固定相が準備され、これらの固定相を充填したカラムがペプチドとタンパク質の分離に使用されました17,18,19,20,21。極性基と非極性基が存在するため、混合モード固定相（WAX/RPLC、HILIC/RPLC、極性インターカレーション/RPLC）はペプチドとタンパク質の分離に適しています22,23,24,25,26,27,28。共有結合した極性基を持つ極性インターカレーション固定相は、分離が分析物と固定相との相互作用に依存するため、極性分析物と非極性分析物に対して優れた分離能力と独自の選択性を示します。マルチモーダル相互作用29,30,31,32。最近、Zhangら30はポリアミンのベヘニル末端固定相を取得し、炭化水素、抗うつ剤、フラボノイド、ヌクレオシド、エストロゲン、およびその他の分析物を分離することに成功しました。極性埋め込み固定材料は極性基と非極性基の両方を持つため、ペプチドとタンパク質を疎水性部分と親水性部分に分離するために使用できます。極性インラインカラム（例えば、アミドインライン付きC18カラム）は、Ascentis Express RP-Amideカラムという商標名で入手可能ですが、これらのカラムはアミン33の分析にのみ使用されています。
本研究では、極性埋め込み固定相（N-フェニルマレイミド、埋め込みポリスチレン）を調製し、ペプチド分離およびトリプシンHSA切断について評価した。固定相の調製には以下の戦略を用いた。多孔質シリカ粒子は、調製スキームに若干の変更を加えた上で、以前の論文31、34、35、36、37、38、39に記載されている手順に従って調製した。尿素、ポリエチレングリコール（PEG）、TMOS、および水性酢酸の比率を調整して、大きな細孔径のシリカ粒子を得た。次に、新しいフェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネート配位子を合成し、その誘導体化シリカ粒子を用いて極性埋め込み固定相を調製した。得られた固定相は、最適化された充填スキームに従ってステンレス鋼カラム（内径100×1.8 mm）に充填した。カラムの充填は、カラム内に均一な層を確保するために機械的振動によって補助される。充填カラムは、5種類のペプチド（Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリンペプチド）からなるペプチド混合物とヒト血清アルブミン（HSA）のトリプシン加水分解物の分離について評価された。ペプチド混合物とHSAトリプシン消化物は、良好な分離能と効率で分離されたことが観察された。PMPカラムの分離効率は、Ascentis Express RP-Amideカラムの分離効率と比較された。ペプチドとタンパク質はPMPカラム上で良好な分離能と高い分離効率を示し、PMPカラムの分離効率はAscentis Express RP-Amideカラムよりも高いことが観察された。
PEG（ポリエチレングリコール）、尿素、酢酸、トリメトキシオルトシリケート（TMOS）、トリメチルクロロシラン（TMCS）、トリプシン、ヒト血清アルブミン（HSA）、塩化アンモニウム、尿素、ヘキサメチルメタクリロイルジシラザン（HMDS）、メタクリロイルクロリド（MC）、スチレン、4-ヒドロキシ-TEMPO、過酸化ベンゾイル（BPO）、HPLC用アセトニトリル（ACN）、メタノール、2-プロパノール、アセトン。シグマアルドリッチ社（米国ミズーリ州セントルイス）。
尿素（8 g）、ポリエチレングリコール（8 g）、および0.01 N酢酸8 mlの混合物を10分間攪拌し、氷冷下でTMOS 24 mlを添加した。反応混合物をステンレス鋼オートクレーブで40℃で6時間、その後120℃で8時間加熱した。水をデカントし、残渣を70℃で12時間乾燥させた。乾燥した軟質ブロックを滑らかに粉砕し、オーブンで550℃で12時間焼成した。粒子サイズ、細孔サイズ、および表面積の再現性をテストするために、3つのバッチを準備して特性評価を行った。
ポリスチレン鎖用の極性基および固定相。調製手順は以下に説明する。
N-フェニルマレイミド（200 mg）とメチルビニルイソシアネート（100 mg）を無水トルエンに溶解し、次いで2,2′-アゾイソブチロニトリル（AIBN）0.1 mlを反応フラスコに加え、フェニルマレイミドとメチルビニルイソシアネートの共重合体（PMCP）を得た。混合物を60℃で3時間加熱し、濾過後、40℃のオーブンで3時間乾燥させた。
乾燥させたシリカ粒子（2 g）を乾燥トルエン（100 ml）に分散させ、500 mlの丸底フラスコで10分間攪拌し、超音波処理した。PMCP（10 mg）をトルエンに溶解し、添加漏斗を用いて反応フラスコに滴下した。混合物を100℃で8時間還流し、濾過し、アセトンで洗浄し、60℃で3時間乾燥させた。次に、PMCP（100 g）が付着したシリカ粒子をトルエン（200 ml）に溶解し、触媒としてジブチル錫ジラウレート100 μlの存在下で4-ヒドロキシ-TEMPO（2 ml）を加えた。混合物を50℃で8時間攪拌し、濾過し、50℃で3時間乾燥させた。
スチレン（1 ml）、過酸化ベンゾイル（BPO）（0.5 ml）、およびTEMPO-PMCPに付着したシリカ粒子（1.5 g）をトルエンに分散させ、窒素でパージした。スチレンの重合を100℃で12時間行った。得られた生成物をメタノールで洗浄し、60℃で一晩乾燥させた。反応の概略図を図1に示す。
試料は、残留圧力が 10–3 Torr 未満になるまで 393 K で 1 時間脱気した。相対圧力 P/P0 = 0.99 で吸着された N2 の量を使用して、全細孔容積を決定した。純粋なシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の形態は、走査型電子顕微鏡 (日立ハイテクノロジーズ、東京、日本) を使用して調べた。乾燥試料 (純粋なシリカとリガンド結合シリカ粒子) をカーボン テープを使用してアルミニウム ロッド上に置いた。Q150T スパッタリング装置を使用して試料上に金を蒸着し、5 nm 厚の Au 層を試料上に蒸着した。これにより、低電圧プロセスの効率が向上し、微細なコールド スプレーが可能になる。元素分析は、Thermo Electron (Waltham、MA、米国) Flash EA1112 元素組成分析装置を使用して行った。粒子サイズ分布を取得するために、Malvern 粒子サイズ分析装置 (Worcestershire、英国) Mastersizer 2000 を使用した。コーティングされていないシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子（それぞれ5 mg）を5 mlのイソプロパノールに分散させ、10分間超音波処理した後、5分間撹拌し、マスターサイザー光学ベンチに置いた。熱重量分析は、30～800℃の温度範囲で毎分5℃の速度で実施した。
寸法 (ID 100 × 1.8 mm) のガラス繊維ライニングされた狭径ステンレス鋼カラムは、文献 31 と同じ手順に従ってスラリー充填法で充填した。ステンレス鋼カラム (ガラスライニング、ID 100 × 1.8 mm) と 1 µm のフリットを含む出口をスラリー充填機 (Alltech Deerfield、IL、USA) に接続した。150 mg の固定相を 1.2 ml のメタノールに懸濁し、リザーバーカラムに供給して固定相の懸濁液を調製した。メタノールはスラリー溶媒およびコントロール溶媒として使用した。100 MP で 10 分、80 MP で 15 分、60 MP で 30 分という圧力シーケンスを適用してカラムを充填した。充填プロセスでは、均一なカラム充填を確保するために機械的振動を行う 2 台のガスクロマトグラフィーカラム振動機 (Alltech、Deerfield、IL、USA) を使用した。スラリー充填機を閉じ、ストリングの損傷を防ぐためにゆっくりと圧力を解放した。カラムをスラリーノズルから切り離し、別の継手を入口に取り付けてLCシステムに接続し、動作テストを行った。
カスタム MLC は、LC ポンプ (10AD 島津製作所、日本)、50 nL 注入ループ付きサンプラー (Valco (USA) C14 W.05)、メンブレン脱気装置 (島津製作所 DGU-14A)、および UV-VIS キャピラリー ウィンドウを使用して構築されました。検出器デバイス (UV-2075) とエナメル マイクロカラム。追加のカラム膨張の影響を最小限に抑えるために、非常に狭くて短い接続チューブを使用します。カラムを充填した後、1/16 インチ縮小接合部の出口にキャピラリー (50 µm 内径 365) を取り付け、縮小接合部にキャピラリー (50 µm) を取り付けます。データ収集とクロマトグラム処理は、Multichro 2000 ソフトウェアを使用して実行されます。254 nm で、対象分析物の UV 吸光度を 0 でモニターしました。クロマトグラフィー データは、OriginPro8 (Northampton, MA) を使用して分析されました。
ヒト血清アルブミン（凍結乾燥粉末、純度96%以上（アガロースゲル電気泳動））3 mgをトリプシン（1.5 mg）、4.0 M尿素（1 ml）、0.2 M炭酸水素アンモニウム（1 ml）と混合した。溶液を10分間撹拌し、37℃のウォーターバスで6時間保持した後、0.1% TFA 1 mlを加えて反応を停止させた。溶液を濾過し、4℃以下で保存した。
ペプチドとトリプシン消化HSAの混合物のPMPカラムでの分離を個別に評価した。PMPカラムで分離したペプチドとHSAの混合物のトリプシン加水分解を確認し、その結果をAscentis Express RP-Amideカラムの結果と比較する。理論段数は次の式を用いて計算する。
図2に、純粋なシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子のSEM画像を示す。純粋なシリカ粒子（A、B）のSEM画像では、粒子が球形であることがわかるが、以前の研究と比較すると、粒子は細長く、対称性が不規則である。リガンド結合シリカ粒子（C、D）の表面は、純粋なシリカ粒子の表面よりも滑らかであるが、これはシリカ粒子の表面を覆うポリスチレン鎖によるものと考えられる。
純粋なシリカ粒子（A、B）とリガンド結合シリカ粒子（C、D）の走査型電子顕微鏡写真。
純粋なシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の粒子サイズ分布を図 2 に示します。 3(A) 体積粒子サイズ分布曲線は、化学修飾後にシリカ粒子サイズが増加したことを示しています (図 3A)。今回の研究と以前の研究のシリカ粒子サイズ分布データを表 1(A) で比較します。 PMP の体積粒子サイズ d(0.5) は 3.36 µm であり、以前の研究 (ポリスチレン結合シリカ粒子) の ad(0.5) 値 3.05 µm と比較しています 34。反応混合物中の PEG、尿素、TMOS、酢酸の比率の変化により、このバッチの粒子サイズ分布は以前の研究と比較して狭くなりました。 PMP 相の粒子サイズは、以前に研究したポリスチレン結合シリカ粒子相の粒子サイズよりもわずかに大きくなっています。これは、シリカ粒子をスチレンで表面官能化すると、シリカ表面にポリスチレン層（0.97 µm）のみが堆積するのに対し、PMP相では層の厚さが1.38 µmであったことを意味する。
純粋シリカ粒子およびリガンド結合シリカ粒子の粒径分布（A）と細孔径分布（B）。
本研究で使用したシリカ粒子の細孔サイズ、細孔容積、表面積を表1（B）に示す。純粋なシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子のPSDプロファイルを図3（B）に示す。結果は、我々の以前の研究34と同等であった。純粋なシリカ粒子とリガンド結合シリカ粒子の細孔サイズはそれぞれ310 Åと241 Åであり、表1（B）に示すように、化学修飾後に細孔サイズが69 Å減少したことを示しており、シフト曲線を図に示す。本研究のシリカ粒子の比表面積は116 m2/gであり、これは我々の以前の研究（124 m2/g）と同等である。表1（B）に示すように、化学修飾後のシリカ粒子の表面積（m2/g）も116 m2/gから105 m2/gに減少した。
固定相の元素分析の結果を表2に示す。現在の固定相の炭素含有量は6.35%であり、これは我々の以前の研究（ポリスチレンと結合したシリカ粒子、それぞれ7.93%35および10.21%）42よりも低い。現在の固定相の炭素含有量が低いのは、SPの調製においてスチレンに加えてフェニルマレイミドメチルビニルイソシアネート（PCMP）や4-ヒドロキシ-TEMPOなどの極性配位子が使用されているためである。現在の固定相の窒素の重量パーセントは2.21%であり、以前の研究42の0.1735および0.85%と比較すると高い。これは、現在の固定相がフェニルマレイミドのために窒素の重量パーセントが高いことを意味する。同様に、生成物（4）と（5）の炭素含有量はそれぞれ2.7%と2.9%であり、最終生成物（6）の炭素含有量は6.35%である（表2参照）。PMPの固定相に対して熱重量分析（TGA）を用いて重量減少を調べたところ、TGA曲線は図4に示されている。TGA曲線は8.6%の重量減少を示しており、配位子にはCだけでなくN、O、Hも含まれているため、炭素含有量（6.35%）とよく一致している。
配位子フェニルマレイミド-メチルビニルイソシアネートは、その極性フェニルマレイミド基とビニルイソシアネート基のため、シリカ粒子の表面修飾に選択された。ビニルイソシアネート基は、リビングラジカル重合によりスチレンとさらに反応することができる。2つ目の理由は、フェニルマレイミド部分は通常のpHでは仮想電荷を持たないため、分析対象物との相互作用が中程度で、分析対象物と固定相との間に強い静電相互作用を持たない基を導入するためである。固定相の極性は、スチレンの最適量とフリーラジカル重合の反応時間によって制御できる。反応の最終段階（フリーラジカル重合）は、固定相の極性を変化させるため重要である。これらの固定相の炭素含有量を確認するために元素分析を行った。スチレンの量と反応時間を増やすと固定相の炭素含有量が増加し、その逆もまた同様であることが観察された。異なる濃度のスチレンで調製されたSPは、異なる炭素負荷を持つ。同様に、これらの固定相をステンレス鋼カラムに充填し、そのクロマトグラフィー特性（選択性、分離度、N値など）を調べた。これらの実験に基づき、分析対象物の極性を制御し、良好な保持を実現するPMP固定相の調製に最適な組成を選択した。
PMPカラムは、移動相60/40 (v/v) ACN/水 (0.1% TFA) の容量を用いて、5種類のペプチド混合物 (Gly-Tyr、Gly-Leu-Tyr、Gly-Gly-Tyr-Arg、Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg、ロイシンエンケファリン) の分析についても評価されました。流速は80 µl/minです。最適な溶出条件 (200,000プレート/m) では、カラム (100 × 1.8 mm) あたりの理論段数 (N) は20,000 ± 100です。3つのPMPカラムのN値は表3に示されており、クロマトグラムは図5Aに示されています。 PMPカラムで高速分析（700 µl/分）を行ったところ、1分以内に5つのペプチドが溶出され、カラム（直径100 x 1.8 mm）あたり13,500 ± 330という優れたN値が得られ、これは135,000プレート/mに相当します（図5B）。再現性をテストするために、同じサイズ（内径100 x 1.8 mm）の3本のカラムに3種類の異なるバッチのPMP固定相を充填しました。各カラムで同じテスト混合物を最適な溶出条件で分離することにより、各カラムの分析対象物を記録し、理論段数Nと保持時間を示しました。PMPカラムの再現性データは表4に示されています。PMPカラムの再現性は、表3に示すように、非常に低い%RSD値とよく相関していました。
PMPカラム（B）とAscentis Express RP-Amideカラム（A）を用いたペプチド混合物の分離、移動相60/40 ACN/H2O（TFA 0.1%）、PMPカラム寸法（100 x 1.8 mm id）、分析化合物の溶出順序：1（Gly-Tyr）、2（Gly-Leu-Tyr）、3（Gly-Gly-Tyr-Arg）、4（Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg）、5（ロイシン酸エンケファリン）。
PMPカラム（内径100×1.8 mm）を用いて、HPLCによるヒト血清アルブミンのトリプシン加水分解物の分離を評価した。図6のクロマトグラムは、サンプルが非常に良好な分離度でよく分離されていることを示している。HSA溶液は、流速100 μl/min、移動相70/30アセトニトリル/水、0.1% TFAを用いて分析した。クロマトグラム（図6）に示すように、HSAの切断は17個のピークに分かれ、17個のペプチドに対応していた。HSA加水分解物からの個々のピークの分離効率を計算し、その値を表5に示す。
HSAトリプシン加水分解物をPMPカラム（内径100×1.8mm）、流速100μl/分、移動相60/40アセトニトリル/水、0.1% TFAで分離した。
ここで、L はカラムの長さ、η は移動相の粘度、ΔP はカラムの背圧、u は移動相の線速度です。PMP カラムの透過率は 2.5 × 10–14 m2、流量は 25 µl/min、60/40 v/v を使用しました。ACN/水。PMP カラム (ID 100 × 1.8 mm) の透過率は、以前の Ref.34 の研究と同様でした。表面多孔質粒子で満たされたカラムの透過率は 1.7×10 .6 µm、5 µm 粒子の場合は 2.5×10-14 m2 です 43。したがって、PMP 相の透過率は、5 μm サイズのコアシェル粒子の透過率と同様です。
ここで、Wx はクロロホルムを充填したカラムの質量、Wy はメタノールを充填したカラムの質量、ρ は溶媒の密度です。メタノールの密度 (ρ = 0.7866) とクロロホルムの密度 (ρ = 1.484)。シリカ-C18 粒子カラム (100 × 1.8 mm ID)34 と、以前に研究した C18-尿素カラム 31 の全多孔度は、それぞれ 0.63 と 0.55 でした。これは、尿素リガンドの存在が固定相の透過性を低下させることを意味します。一方、PMP カラム (内径 100 × 1.8 mm) の全多孔度は 0.60 です。 PMPカラムは、C18結合シリカ粒子を充填したカラムよりも透過性が低い。これは、C18型固定相ではC18リガンドが線状鎖でシリカ粒子に結合しているのに対し、ポリスチレン型固定相では粒子の周囲に比較的厚いポリマー層が形成されるためである。典型的な実験では、カラムの多孔度は次のように計算される。
図7A、Bには、PMPカラム（内径100×1.8mm）とAscentis Express RP-Amideカラム（内径100×1.8mm）について、同じ溶出条件（60/40 ACN/H2O、0.1% TFA、20µl/min～800µl/min）でのVan Deemterプロットを示します。最適流速（80µl/min）での最小HETP値は、PMPカラムで2.6µm、Ascentis Express RP-Amideカラムで3.9µmでした。HETP値は、PMPカラム（100×1.8mm id）の分離効率が市販のAscentis Express RP-Amideカラム（100×1.8mm id）よりもはるかに高いことを示しています。図7(A)のファン・デームターグラフは、N値の減少が、以前の研究と比較して流量の増加に伴って著しく大きくないことを示している。PMPカラム(id 100 × 1.8 mm)の分離効率がAscentis Express RP-Amideカラムよりも高いのは、改良された粒子形状とサイズ、および本研究で使用した高度なカラム充填手順に基づいている34。
(A) 0.1% TFA を含む 60/40 ACN/H2O 中で PMP カラム (id 100 x 1.8 mm) で得られた Van Deemter プロット (HETP 対移動相線速度)。(B) 0.1% TFA を含む 60/40 ACN/H2O 中で Ascentis Express RP-Amide カラム (id 100 x 1.8 mm) で得られた Van Deemter プロット (HETP 対移動相線速度)。
インターカレーションポリスチレンの極性固定相を調製し、合成ペプチドとヒト血清アルブミン（HSA）のトリプシン加水分解物の混合物の高速液体クロマトグラフィーにおける分離について評価した。ペプチド混合物に対するPMPカラムのクロマトグラフィー性能は、分離効率と分解能の点で優れている。PMPカラムの分離効率の向上は、シリカ粒子のサイズと細孔サイズ、固定相の制御された合成、および複雑なカラム充填材など、いくつかの理由によるものである。高い分離効率に加えて、この固定相のもう1つの利点は、高流量での低いカラム背圧である。PMPカラムは再現性が高く、ペプチド混合物と様々なタンパク質のトリプシン消化物の分析に使用できる。我々は、このカラムを、天然物、薬用植物抽出物、およびキノコからの生理活性化合物の液体クロマトグラフィーによる分離に使用する予定である。将来的には、PMPカラムをタンパク質およびモノクローナル抗体の分離についても評価する予定である。
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