Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. U gebruikt een browserversie met beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site bovendien zonder stijlen en JavaScript.
Toont een carrousel met drie dia's tegelijk. Gebruik de knoppen Vorige en Volgende om door drie dia's tegelijk te bladeren, of gebruik de schuifregelaars aan het einde om door drie dia's tegelijk te bladeren.
Poreuze silicadeeltjes werden bereid met behulp van de sol-gelmethode, met enkele aanpassingen om deeltjes met wijde poriën te verkrijgen. Deze deeltjes werden gederevatiseerd met N-fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat (PMI) en styreen via reverse chain transfer-fragmentation (RAFT) polymerisatie om N-fenylmaleïmide-geïntercaleerde polyamiden te produceren. Styreen (PMP) werd gebruikt als stationaire fase. Smalle roestvrijstalen kolommen (100 × 1,8 mm binnendiameter) werden gevuld met een slurry. De chromatografische prestaties van de PMP-kolom werden geëvalueerd voor de scheiding van een mengsel van synthetische peptiden, bestaande uit vijf peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminozuur-enkefaline) en trypsinehydrolysaat van humaan serumalbumine (HAS). Onder optimale elutieomstandigheden bereikte het theoretische aantal platen met een mengsel van peptiden 280.000 platen/m². Bij vergelijking van de scheidingsprestaties van de ontwikkelde kolom met de commerciële Ascentis Express RP-Amide kolom werd geconstateerd dat de scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom superieur was aan die van de commerciële kolom, zowel wat betreft scheidingsefficiëntie als resolutie.
De biofarmaceutische industrie is uitgegroeid tot een wereldwijde markt met een aanzienlijke toename van het marktaandeel in de afgelopen jaren. Door de explosieve groei van de biofarmaceutische industrie1,2,3 is er een grote behoefte aan peptide- en eiwitanalyse. Naast het doelpeptide worden er tijdens de peptidesynthese diverse onzuiverheden gevormd, waardoor chromatografische zuivering nodig is om de gewenste zuiverheid van het peptide te verkrijgen. De analyse en karakterisering van eiwitten in lichaamsvloeistoffen, weefsels en cellen is een uiterst uitdagende taak vanwege het grote aantal potentieel detecteerbare soorten dat in één monster aanwezig is. Hoewel massaspectrometrie een effectief hulpmiddel is voor het sequencen van peptiden en eiwitten, zal de scheiding onbevredigend zijn als dergelijke monsters rechtstreeks in de massaspectrometer worden gebracht. Dit probleem kan worden opgelost door vloeistofchromatografie (LC) uit te voeren vóór de MS-analyse, waardoor de hoeveelheid analyten die op een bepaald moment de massaspectrometer binnenkomt, wordt verminderd4,5,6. Bovendien kunnen analyten zich tijdens de vloeistoffasescheiding in een smal gebied concentreren, waardoor deze analyten worden geconcentreerd en de gevoeligheid van de MS-detectie toeneemt. Vloeistofchromatografie (LC) heeft de afgelopen tien jaar een aanzienlijke vooruitgang geboekt en is uitgegroeid tot een veelgebruikte methode voor proteomische analyse7,8,9,10.
Omgekeerde-fase vloeistofchromatografie (RP-LC) wordt veel gebruikt voor het zuiveren en scheiden van mengsels van peptiden met behulp van octadecyl-gemodificeerd silica (ODS) als stationaire fase11,12,13. Vanwege hun complexe structuur en amfotere aard14,15 kunnen RP-stationaire fasen echter geen bevredigende scheiding van peptiden en eiwitten bieden. Daarom vereist de analyse van peptiden en eiwitten met polaire en niet-polaire fragmenten speciaal ontworpen stationaire fasen die interactie aangaan met en deze analyten vasthouden16. Gemengde chromatografie, die multimodale interacties biedt, kan een alternatief zijn voor RP-LC voor het scheiden van peptiden, eiwitten en andere complexe mengsels. Verschillende gemengde stationaire fasen werden bereid en kolommen gevuld met deze stationaire fasen werden gebruikt om peptiden en eiwitten te scheiden17,18,19,20,21. Door de aanwezigheid van polaire en niet-polaire groepen zijn stationaire fasen met gemengde modi (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polaire intercalatie/RPLC) geschikt voor de scheiding van peptiden en eiwitten22,23,24,25,26,27,28. Polaire geïntercaleerde stationaire fasen met covalent gebonden polaire groepen vertonen goede scheidingsmogelijkheden en een unieke selectiviteit voor polaire en niet-polaire analyten, omdat de scheiding afhangt van de interactie tussen de analyt en de stationaire fase (multimodale interacties)29,30,31,32. Recentelijk hebben Zhang et al.30 behenyl-geëindigde stationaire fasen van polyaminen verkregen en met succes koolwaterstoffen, antidepressiva, flavonoïden, nucleosiden, oestrogenen en enkele andere analyten gescheiden. Het polair ingebedde stationaire materiaal bevat zowel polaire als niet-polaire groepen, waardoor het gebruikt kan worden om peptiden en eiwitten te scheiden in hydrofobe en hydrofiele delen. Polaire inline-kolommen (bijvoorbeeld C18-kolommen met amide-inline) zijn verkrijgbaar onder de handelsnaam Ascentis Express RP-Amide-kolommen, maar deze kolommen zijn alleen gebruikt voor de analyse van amine 33.
In de huidige studie werd een polaire stationaire fase (N-fenylmaleïmide, ingebed polystyreen) bereid en geëvalueerd voor peptidescheiding en trypsine-HSA-splitsing. De volgende strategie werd gebruikt om de stationaire fase te bereiden. Poreuze silicadeeltjes werden bereid volgens de procedures beschreven in onze eerdere publicaties, met enkele aanpassingen in de bereidingsschema's 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. De verhoudingen van ureum, polyethyleenglycol (PEG), TMOS en waterig azijnzuur werden aangepast om silicadeeltjes met grote poriegrootte te verkrijgen. Vervolgens werd een nieuwe fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaatligand gesynthetiseerd en werden de daarvan afgeleide silicadeeltjes gebruikt om polaire stationaire fasen te bereiden. De verkregen stationaire fase werd in een roestvrijstalen kolom (binnendiameter 100 × 1,8 mm) gepakt volgens een geoptimaliseerd pakschema. Het vullen van de kolom werd ondersteund door mechanische vibratie om een ​​uniforme laag in de kolom te garanderen. De gepakte kolom werd geëvalueerd voor de scheiding van een mengsel van peptiden, bestaande uit vijf peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkefalinepeptide), en trypsinehydrolysaten van humaan serumalbumine (HSA). Het bleek dat het peptidemengsel en het trypsinehydrolysaat van HSA goed gescheiden konden worden, zowel qua resolutie als efficiëntie. De scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom werd vergeleken met die van de Ascentis Express RP-Amide-kolom. Hieruit bleek dat peptiden en eiwitten goed gescheiden kunnen worden op de PMP-kolom, en dat de scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom hoger is dan die van de Ascentis Express RP-Amide-kolom.
PEG (polyethyleenglycol), ureum, azijnzuur, trimethoxyorthosilicaat (TMOS), trimethylchloorsilaan (TMCS), trypsine, humaan serumalbumine (HSA), ammoniumchloride, ureum, hexamethylmethacryloyldisilazaan (HMDS), methacryloylchloride (MC), styreen, 4-hydroxy-TEMPO, benzoylperoxide (BPO), acetonitril (ACN) voor HPLC, methanol, 2-propanol en aceton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, VS).
Een mengsel van ureum (8 g), polyethyleenglycol (8 g) en 8 ml 0,01 N azijnzuur werd 10 minuten geroerd, waarna 24 ml TMOS onder ijskoeling werd toegevoegd. Het reactiemengsel werd gedurende 6 uur verhit tot 40 °C en vervolgens gedurende 8 uur tot 120 °C in een roestvrijstalen autoclaaf. Het water werd afgegoten en het residu werd gedroogd bij 70 °C gedurende 12 uur. De gedroogde zachte blokken werden fijn vermalen en gecalcineerd in een oven bij 550 °C gedurende 12 uur. Drie batches werden bereid en gekarakteriseerd om de reproduceerbaarheid van de deeltjesgrootte, poriegrootte en oppervlakte te testen.
Polaire groep en stationaire fase voor polystyreenketens. De bereidingsprocedure wordt hieronder beschreven.
N-fenylmaleïmide (200 mg) en methylvinylisocyanaat (100 mg) werden opgelost in watervrije tolueen, waarna 0,1 ml 2,2'-azoisobutyronitril (AIBN) aan de reactiekolf werd toegevoegd om een ​​copolymeer van fenylmaleïmide en methylvinylisocyanaat (PMCP) te verkrijgen. Het mengsel werd gedurende 3 uur verwarmd tot 60 °C, gefilterd en vervolgens 3 uur gedroogd in een oven bij 40 °C.
Gedroogde silicadeeltjes (2 g) werden gedispergeerd in droge tolueen (100 ml), geroerd en gedurende 10 minuten gesoniceerd in een rondbodemkolf van 500 ml. PMCP (10 mg) werd opgelost in tolueen en druppelgewijs via een druppeltoevoertrechter aan de reactiekolf toegevoegd. Het mengsel werd gedurende 8 uur bij 100 °C gerefluxd, gefilterd, gewassen met aceton en gedroogd bij 60 °C gedurende 3 uur. Vervolgens werden de silicadeeltjes met PMCP (100 g) opgelost in tolueen (200 ml) en werd 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) daaraan toegevoegd in aanwezigheid van 100 μl dibutyltindilauraat als katalysator. Het mengsel werd gedurende 8 uur bij 50 °C geroerd, gefilterd en gedroogd bij 50 °C gedurende 3 uur.
Styreen (1 ml), benzoylperoxide (BPO) (0,5 ml) en silicadeeltjes gekoppeld aan TEMPO-PMCP (1,5 g) werden gedispergeerd in tolueen en gespoeld met stikstof. De polymerisatie van styreen werd uitgevoerd bij 100 °C gedurende 12 uur. Het resulterende product werd gewassen met methanol en een nacht gedroogd bij 60 °C. Het algemene reactieschema is weergegeven in figuur 1.
De monsters werden gedurende 1 uur bij 393 K ontgast totdat een restdruk van minder dan 10–3 Torr werd bereikt. De hoeveelheid geadsorbeerde N2 bij een relatieve druk P/P0 = 0,99 werd gebruikt om het totale porievolume te bepalen. De morfologie van zuivere en ligandgebonden silicadeeltjes werd onderzocht met behulp van een scanningelektronenmicroscoop (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Droge monsters (zuivere silica en ligandgebonden silicadeeltjes) werden met behulp van koolstoftape op aluminium staven geplaatst. Goud werd op het monster afgezet met een Q150T sputterapparaat, waarbij een 5 nm dikke Au-laag werd aangebracht. Dit verbetert de efficiëntie van het laagspanningsproces en zorgt voor een fijne koudspuiting. Elementanalyse werd uitgevoerd met een Thermo Electron (Waltham, MA, VS) Flash EA1112 elementanalyseapparaat. Een Malvern Mastersizer 2000 deeltjesgrootteanalysator (Worcestershire, VK) werd gebruikt om de deeltjesgrootteverdeling te bepalen. Ongecoate silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes (elk 5 mg) werden gedispergeerd in 5 ml isopropanol, gedurende 10 minuten gesoniceerd, 5 minuten geroerd en op een Mastersizer optische bank geplaatst. Thermogravimetrische analyse werd uitgevoerd met een snelheid van 5 °C per minuut in het temperatuurbereik van 30 tot 800 °C.
Met glasvezel beklede, smalle roestvrijstalen kolommen met afmetingen (binnendiameter 100 × 1,8 mm) werden gevuld met behulp van de slurry-vulmethode volgens dezelfde procedure als in referentie 31. De roestvrijstalen kolom (glasvezel bekleed, binnendiameter 100 × 1,8 mm) en een uitlaat met een frit van 1 µm werden aangesloten op een slurry-vulmachine (Alltech Deerfield, IL, VS). Bereid een suspensie van de stationaire fase door 150 mg van de stationaire fase te suspenderen in 1,2 ml methanol en deze in een reservoirkolom te brengen. Methanol werd gebruikt als slurry-oplosmiddel en als controle-oplosmiddel. Vul de kolom door een druksequentie toe te passen van 100 MPa gedurende 10 min, 80 MPa gedurende 15 min en 60 MPa gedurende 30 min. Tijdens het vulproces werden twee gaschromatografiekolomvibratoren (Alltech, Deerfield, IL, VS) gebruikt voor mechanische vibratie om een ​​uniforme kolomvulling te garanderen. Sluit de slurrypacker en laat de druk langzaam ontsnappen om schade aan de leidingen te voorkomen. De kolom werd losgekoppeld van de slurry-sproeier en een andere koppeling werd aan de inlaat bevestigd en aangesloten op het LC-systeem om de werking ervan te testen.
Er werd een aangepaste MLC geconstrueerd met behulp van een LC-pomp (10AD Shimadzu, Japan), een sampler met een injectielus van 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), een membraanontgasser (Shimadzu DGU-14A) en een UV-VIS-capillairvenster. De detector (UV-2075) en de geëmailleerde microkolom werden gebruikt. Er werden zeer smalle en korte verbindingsbuizen gebruikt om het effect van extra kolomexpansie te minimaliseren. Na het vullen van de kolom werd een capillair (50 µm binnendiameter 365) aan de uitgang van de 1/16″ reducerende verbinding geplaatst en een capillair (50 µm) in de reducerende verbinding zelf. Gegevensverzameling en chromatogramverwerking werden uitgevoerd met de Multichro 2000-software. Bij 254 nm werd de UV-absorptie van de te analyseren stoffen gemeten. Chromatografische gegevens werden geanalyseerd met OriginPro8 (Northampton, MA).
3 mg humaan serumalbumine, gelyofiliseerd poeder, ≥ 96% (agarosegelelektroforese), gemengd met trypsine (1,5 mg), 4,0 M ureum (1 ml) en 0,2 M ammoniumbicarbonaat (1 ml). De oplossing werd 10 minuten geroerd en vervolgens 6 uur in een waterbad van 37 °C gehouden, waarna deze werd geblust met 1 ml 0,1% TFA. Filter de oplossing en bewaar deze beneden 4 °C.
De scheiding van een mengsel van peptiden en trypsine-verteerd HSA op een PMP-kolom werd afzonderlijk geëvalueerd. Controleer de trypsinehydrolyse van een mengsel van peptiden en HSA, gescheiden door een PMP-kolom, en vergelijk de resultaten met die van een Ascentis Express RP-Amide-kolom. Het aantal theoretische schotels wordt berekend met behulp van de volgende vergelijking:
SEM-afbeeldingen van zuivere silicadeeltjes en aan ligand gebonden silicadeeltjes zijn weergegeven in Figuur 2. De SEM-afbeeldingen van zuivere silicadeeltjes (A, B) tonen een bolvorm waarbij de deeltjes langwerpig zijn of een onregelmatige symmetrie hebben in vergelijking met onze eerdere studies. Het oppervlak van de aan het ligand gebonden silicadeeltjes (C, D) is gladder dan dat van de zuivere silicadeeltjes, wat mogelijk te wijten is aan de polystyreenketens die het oppervlak van de silicadeeltjes bedekken.
Scanning elektronenmicroscopische beelden van zuivere silicadeeltjes (A, B) en aan liganden gebonden silicadeeltjes (C, D).
De deeltjesgrootteverdeling van zuivere silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes wordt weergegeven in Fig. 2. 3(A). Volumetrische deeltjesgrootteverdelingscurven lieten zien dat de silicadeeltjesgrootte toenam na chemische modificatie (Fig. 3A). De gegevens over de deeltjesgrootteverdeling van silica uit de huidige studie en de vorige studie worden vergeleken in Tabel 1(A). De volumetrische deeltjesgrootte d(0,5) van PMP was 3,36 µm, vergeleken met een ad(0,5)-waarde van 3,05 µm in onze vorige studie (polystyreengebonden silicadeeltjes)34. Door de verandering in de verhouding van PEG, ureum, TMOS en azijnzuur in het reactiemengsel was de deeltjesgrootteverdeling van deze batch smaller vergeleken met onze vorige studie. De deeltjesgrootte van de PMP-fase is iets groter dan die van de polystyreengebonden silicadeeltjesfase die we eerder bestudeerden. Dit betekent dat bij de oppervlaktefunctionalering van silicadeeltjes met styreen slechts een polystyreenlaag (0,97 µm) op het silica-oppervlak werd afgezet, terwijl in de PMP-fase de laagdikte 1,38 µm bedroeg.
Deeltjesgrootteverdeling (A) en poriegrootteverdeling (B) van zuivere silicadeeltjes en aan liganden gebonden silicadeeltjes.
De poriegrootte, het porievolume en het oppervlakte van de silicadeeltjes die in dit onderzoek zijn gebruikt, worden weergegeven in Tabel 1 (B). De PSD-profielen van zuivere silicadeeltjes en ligand-gebonden silicadeeltjes worden weergegeven in Fig. 3(B). De resultaten waren vergelijkbaar met die van ons eerdere onderzoek34. De poriegrootte van zuivere en ligand-gebonden silicadeeltjes was respectievelijk 310 Å en 241 Å, wat aangeeft dat na chemische modificatie de poriegrootte met 69 Å is afgenomen, zoals weergegeven in Tabel 1 (B). De verschuivingscurve is weergegeven in Fig. Het specifieke oppervlakte van de silicadeeltjes in dit onderzoek is 116 m2/g, wat vergelijkbaar is met ons eerdere onderzoek (124 m2/g). Zoals weergegeven in Tabel 1(B), is het oppervlakte (m2/g) van de silicadeeltjes na chemische modificatie ook afgenomen van 116 m2/g tot 105 m2/g.
De resultaten van de elementanalyse van de stationaire fase worden weergegeven in tabel 2. Het koolstofgehalte van de huidige stationaire fase bedraagt ​​6,35%, wat lager is dan in ons eerdere onderzoek (silicadeeltjes geassocieerd met polystyreen, respectievelijk 7,93%35 en 10,21%)42. Het lagere koolstofgehalte van de huidige stationaire fase is te verklaren doordat naast styreen ook enkele polaire liganden zoals fenylmaleïmidemethylvinylisocyanaat (PCMP) en 4-hydroxy-TEMPO zijn gebruikt bij de bereiding van de stationaire fase. Het gewichtspercentage stikstof in de huidige stationaire fase bedraagt ​​2,21%, vergeleken met 0,1735% en 0,85% in eerdere onderzoeken42. Dit betekent dat de huidige stationaire fase een hoog gewichtspercentage stikstof bevat als gevolg van het fenylmaleïmide. Op dezelfde manier hebben producten (4) en (5) een koolstofgehalte van respectievelijk 2,7% en 2,9%, terwijl het eindproduct (6) een koolstofgehalte van 6,35% heeft, zoals weergegeven in Tabel 2. Thermogravimetrische analyse (TGA) werd gebruikt op de stationaire fase van PMP om gewichtsverlies te testen, en de TGA-curve is weergegeven in Figuur 4. De TGA-curve toont een gewichtsverlies van 8,6%, wat goed overeenkomt met het koolstofgehalte (6,35%), aangezien de liganden niet alleen C, maar ook N, O en H bevatten.
De ligand fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat werd gekozen om het oppervlak van de silicadeeltjes te modificeren vanwege de polaire fenylmaleïmide- en vinylisocyanaatgroepen. Vinylisocyanaatgroepen kunnen verder reageren met styreen door middel van levende radicaalpolymerisatie. Een tweede reden was het inbrengen van een groep die matige interacties vertoont met de analyt en geen sterke elektrostatische interacties tussen de analyt en de stationaire fase, aangezien de fenylmaleïmide-eenheid bij normale pH geen virtuele lading heeft. De polariteit van de stationaire fase kan worden geregeld door de optimale hoeveelheid styreen en de reactietijd van de vrije radicaalpolymerisatie. De laatste stap van de reactie (vrije radicaalpolymerisatie) is cruciaal omdat deze de polariteit van de stationaire fase verandert. Elementanalyse werd uitgevoerd om het koolstofgehalte in deze stationaire fasen te controleren. Er werd waargenomen dat een verhoging van de hoeveelheid styreen en de reactietijd het koolstofgehalte van de stationaire fase verhoogt en omgekeerd. Stationaire fasen bereid met verschillende styreenconcentraties hebben verschillende koolstofbelastingen. Op dezelfde manier werden deze stationaire fasen op roestvrijstalen kolommen geplaatst en werden hun chromatografische eigenschappen (selectiviteit, resolutie, N-waarde, enz.) gecontroleerd. Op basis van deze experimenten werd een geoptimaliseerde samenstelling voor de bereiding van de PMP-stationaire fase gekozen om een ​​gecontroleerde polariteit en goede retentie van de analyt te garanderen.
De PMP-kolom werd ook geëvalueerd voor de analyse van vijf peptidenmengsels (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkefaline) met behulp van de capaciteit van de mobiele fase. 60/40 (v/v) ACN/water (0,1% TFA) bij een stroomsnelheid van 80 µl/min. Onder optimale elutieomstandigheden (200.000 platen/m) bedraagt ​​het aantal theoretische platen (N) per kolom (100 × 1,8 mm) 20.000 ± 100. De N-waarden voor de drie PMP-kolommen worden weergegeven in Tabel 3 en de chromatogrammen in Figuur 5A. Snelle analyse bij een hoge stroomsnelheid (700 µl/min) op een PMP-kolom: vijf peptiden werden binnen één minuut geëlueerd, uitstekende N-waarde van 13.500 ± 330 per kolom (100 x 1,8 mm diameter), equivalent aan 135.000 platen/m (Fig. 5B). Drie kolommen van dezelfde grootte (binnendiameter 100 x 1,8 mm) werden gevuld met drie verschillende batches PMP-stationaire fase om de reproduceerbaarheid te testen. Analytes werden voor elke kolom geregistreerd door hetzelfde testmengsel op elke kolom te scheiden met behulp van optimale elutieomstandigheden, aantal theoretische platen N en retentietijd. De reproduceerbaarheidsgegevens voor de PMP-kolommen worden weergegeven in Tabel 4. De reproduceerbaarheid van de PMP-kolom correleerde goed met zeer lage %RSD-waarden, zoals weergegeven in Tabel 3.
Scheiding van peptidemengsels op een PMP-kolom (B) en een Ascentis Express RP-Amide-kolom (A), mobiele fase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), afmetingen PMP-kolom (100 x 1,8 mm binnendiameter), analyse Elutievolgorde van verbindingen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) en 5 (leucinezuur-enkefaline).
Een PMP-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm) werd geëvalueerd voor de scheiding van het trypsinehydrolysaat van humaan serumalbumine (HSA) met behulp van HPLC. Het chromatogram in figuur 6 laat zien dat de monsters goed gescheiden zijn met een zeer goede resolutie. HSA-oplossingen werden geanalyseerd met een stroomsnelheid van 100 μl/min, een mobiele fase van 70/30 acetonitril/water en 0,1% TFA. De splitsing van HSA werd verdeeld in 17 pieken, zoals weergegeven in het chromatogram (figuur 6), overeenkomend met 17 peptiden. De scheidingsefficiëntie van de afzonderlijke pieken van het HSA-hydrolysaat werd berekend en de waarden zijn weergegeven in tabel 5.
HSA-trypsinehydrolysaten werden gescheiden op een PMP-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm), stroomsnelheid (100 μl/min), mobiele fase 60/40 acetonitril/water, en 0,1% TFA.
waarbij L de kolomlengte is, η de viscositeit van de mobiele fase, ΔP de tegendruk van de kolom en u de lineaire snelheid van de mobiele fase. De permeabiliteit van de PMP-kolom was 2,5 × 10–14 m2, de stroomsnelheid was 25 µl/min, er werd een 60/40 v/v mengsel van ACN/water gebruikt. De permeabiliteit van de PMP-kolom (ID 100 × 1,8 mm) was vergelijkbaar met die van onze eerdere studie in Ref.34. De permeabiliteit van een kolom gevuld met oppervlakkig poreuze deeltjes is 1,7 × 10 .6 µm, 2,5 × 10-14 m2 voor deeltjes van 5 µm43. Daarom is de permeabiliteit van de PMP-fase vergelijkbaar met de permeabiliteit van kern-manteldeeltjes met een grootte van 5 µm.
waarbij Wx de massa is van de kolom gevuld met chloroform, Wy de massa van de kolom gevuld met methanol en ρ de dichtheid van het oplosmiddel. Dichtheid van methanol (ρ = 0,7866) en chloroform (ρ = 1,484). De totale porositeit van de silica-C18-deeltjeskolom (100 × 1,8 mm ID)34 en onze eerder bestudeerde C18-ureum31-kolom was respectievelijk 0,63 en 0,55. Dit betekent dat de aanwezigheid van ureumliganden de permeabiliteit van de stationaire fase vermindert. Aan de andere kant is de totale porositeit van de PMP-kolom (binnendiameter 100 × 1,8 mm) 0,60. PMP-kolommen zijn minder permeabel dan kolommen gevuld met C18-gebonden silicadeeltjes, omdat in stationaire fasen van het C18-type de C18-liganden in lineaire ketens aan de silicadeeltjes zijn gehecht, terwijl in stationaire fasen van het polystyreen-type een relatief dikke polymeerlaag rond de deeltjes wordt gevormd. In een typisch experiment wordt de kolomporositeit als volgt berekend:
Figuur 7A en 7B tonen Van Deemter-plots voor een PMP-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm) en een Ascentis Express RP-Amide-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm) onder dezelfde elutieomstandigheden: 60/40 ACN/H2O en 0,1% TFA, met een stroomsnelheid van 20 µl/min tot 800 µl/min op beide kolommen. De minimale HETP-waarden bij de optimale stroomsnelheid (80 µl/min) waren respectievelijk 2,6 µm en 3,9 µm voor de PMP-kolom en de Ascentis Express RP-Amide-kolom. De HETP-waarden tonen aan dat de scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm) veel hoger is dan die van de commercieel verkrijgbare Ascentis Express RP-Amide-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm). De van Deemter-grafiek in figuur 7(A) laat zien dat de afname van de N-waarde niet significant groter is bij een toenemende stroom in vergelijking met onze vorige studie. De hogere scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom (id 100 × 1,8 mm) ten opzichte van de Ascentis Express RP-Amide-kolom is gebaseerd op de verbeterde deeltjesvorm en -grootte en de geavanceerde kolomvulprocedure die in dit onderzoek is gebruikt34.
(A) Van Deemter-grafiek (HETP versus lineaire snelheid van de mobiele fase) verkregen op een PMP-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm) in 60/40 ACN/H2O met 0,1% TFA. (B) Van Deemter-grafiek (HETP versus lineaire snelheid van de mobiele fase) verkregen op een Ascentis Express RP-Amide-kolom (binnendiameter 100 x 1,8 mm) in 60/40 ACN/H2O met 0,1% TFA.
Een polaire stationaire fase van geïntercaleerd polystyreen (PMP) werd bereid en geëvalueerd voor de scheiding van een mengsel van synthetische peptiden en trypsinehydrolysaat van humaan serumalbumine (HSA) in hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC). De chromatografische prestaties van PMP-kolommen voor peptidemengsels zijn uitstekend wat betreft scheidingsefficiëntie en resolutie. De verbeterde scheidingsefficiëntie van PMP-kolommen is te danken aan verschillende factoren, zoals de deeltjesgrootte en poriegrootte van silica, de gecontroleerde synthese van stationaire fasen en complexe kolomvulmaterialen. Naast de hoge scheidingsefficiëntie is een ander voordeel van deze stationaire fase de lage tegendruk in de kolom bij hoge stroomsnelheden. PMP-kolommen zijn zeer reproduceerbaar en kunnen worden gebruikt voor de analyse van mengsels van peptiden en trypsinehydrolysaat van diverse eiwitten. We zijn van plan deze kolom te gebruiken voor de scheiding van bioactieve stoffen uit natuurproducten, extracten van medicinale planten en paddenstoelen in vloeistofchromatografie. In de toekomst zullen PMP-kolommen ook worden geëvalueerd voor de scheiding van eiwitten en monoklonale antilichamen.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Onderzoek naar omgekeerde fase chromatografie peptidescheidingssystemen deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakterisering. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Onderzoek naar omgekeerde fase chromatografie peptidescheidingssystemen deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakterisering.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., en Petersson, P. Onderzoek naar peptidescheidingssystemen door middel van omgekeerde fasechromatografie, deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakterisering. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Onderzoek naar omgekeerde fase chromatografie peptidescheidingssystemen deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakteristieken. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Onderzoek naar omgekeerde fase chromatografie peptidescheidingssystemen deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakteristieken.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., en Petersson, P. Onderzoek naar peptidescheidingssystemen door middel van omgekeerde fasechromatografie, deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakterisering.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Methoden voor het creëren van verbeterde actieve peptiden voor de behandeling van infectieziekten. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetische therapeutische peptiden: wetenschap en markt. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetische therapeutische peptiden: wetenschap en markt.Vliege P, Lisowski V, Martinez J en Chreschatyski M. Synthetische therapeutische peptiden: wetenschap en markt.Vliege P, Lisowski V, Martinez J en Khreschatsky M. Synthetische therapeutische peptiden: wetenschap en markt. Drug Discovery. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Geavanceerde proteomische vloeistofchromatografie. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Geavanceerde proteomische vloeistofchromatografie.Zie F., Smith RD en Shen Yu. Geavanceerde proteomische vloeistofchromatografie. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Geavanceerde eiwitsamenstelling.Zie F., Smith RD en Shen Yu. Geavanceerde proteomische vloeistofchromatografie.J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Geavanceerde vloeistofchromatografie-massaspectrometrie maakt het mogelijk om breed opgezette metabolomics en proteomics te combineren. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ De rol van UHPLC in farmaceutische ontwikkeling. Chesnut, SM & Salisbury, JJ De rol van UHPLC in farmaceutische ontwikkeling.Chesnut, SM en Salisbury, JJ De rol van UHPLC in farmaceutische ontwikkeling.Chesnut, SM en Salisbury, JJ. De rol van UHPLC in de ontwikkeling van geneesmiddelen. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktische aspecten van ultrahogedruk vloeistofchromatografie voor snelle scheidingen. Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktische aspecten van ultrahogedruk vloeistofchromatografie voor snelle scheidingen.Wu, N. en Clausen, AM. Fundamentele en praktische aspecten van hogedrukvloeistofchromatografie voor snelle scheiding. Wu, N. & Clausen, AM Wu, N. & Clausen, AM Basis- en praktische aspecten van ultra-hogedruk vloeistofchromatografie voor snelle scheiding.Wu, N. en Clausen, AM. Fundamentele en praktische aspecten van hogedrukvloeistofchromatografie voor snelle scheiding.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Gebruik van ultra-performance vloeistofchromatografie in farmaceutische ontwikkeling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Gebruik van ultra-performance vloeistofchromatografie in farmaceutische ontwikkeling.Ren, SA en Chelischeff, P. Het gebruik van ultra-high-performance vloeistofchromatografie in farmaceutische ontwikkeling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA en Chelischeff, P. Toepassing van ultra-performance vloeistofchromatografie in geneesmiddelenontwikkeling.J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Een monolithische macroporeuze hydrogel afgeleid van een olie-in-water-emulsie met een hoge interne fase voor efficiënte zuivering van enterovirus 71. Chemisch project. Tijdschrift 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA De rol van vloeistofchromatografie in proteomics. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA De rol van vloeistofchromatografie in proteomics.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. en Wilkins, JA. De rol van vloeistofchromatografie in de proteomics. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. en Wilkins, JA. De rol van vloeistofchromatografie in de proteomics.J. Chromatography. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nieuwe trends in omgekeerde-fase vloeistofchromatografische scheidingen van therapeutische peptiden en eiwitten: theorie en toepassingen. & Guillarme, D. Nieuwe trends in omgekeerde-fase vloeistofchromatografische scheidingen van therapeutische peptiden en eiwitten: theorie en toepassingen. & Guillarme, D. хроматографии с обращенной фазой: теория en приложения. & Guillarme, D. Nieuwe trends in de scheiding van therapeutische peptiden en eiwitten door middel van omgekeerde fase vloeistofchromatografie: theorie en toepassingen. & Guillarme, D. & Guillarme, D.en Guillarmé, D. Nieuwe trends in de scheiding van therapeutische peptiden en eiwitten door middel van omgekeerde fase vloeistofchromatografie: theorie en toepassingen.J. Pharm. Biomedical Science. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tweedimensionale scheiding van peptiden met behulp van een RP-RP-HPLC-systeem met verschillende pH-waarden in de eerste en tweede scheidingsdimensie. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tweedimensionale scheiding van peptiden met behulp van een RP-RP-HPLC-systeem met verschillende pH-waarden in de eerste en tweede scheidingsdimensie.Gilar M., Olivova P., Dali AE en Gebler JK Tweedimensionale scheiding van peptiden met behulp van het RP-RP-HPLC-systeem met verschillende pH-waarden in de eerste en tweede scheidingsdimensie.Gilar M., Olivova P., Dali AE en Gebler JK Tweedimensionale scheiding van peptiden met behulp van verschillende pH-waarden in de eerste en tweede scheidingsdimensie met behulp van het RP-RP-HPLC-systeem. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Onderzoek naar de massaoverdracht en kinetische kenmerken van hoogwaardige chromatografiekolommen gevuld met volledig poreuze en oppervlakkig poreuze C18-deeltjes kleiner dan 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Recente trends en analytische uitdagingen bij de isolatie, identificatie en validatie van bioactieve peptiden uit planten. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomisch landschap van het rijk der levens. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Nabehandeling van therapeutische peptiden door preparatieve vloeistofchromatografie. Molecules (Basel, Zwitserland) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Gemengde-moduschromatografie en de toepassingen ervan op biopolymeren. Yang, Y. & Geng, X. Gemengde-moduschromatografie en de toepassingen ervan op biopolymeren.Yang, Yu. en Geng, X. Gemengde moduschromatografie en de toepassing ervan op biopolymeren. Yang, Y. & Geng, X. Yang, Y. & Geng, X. Gemengde moduschromatografie en de toepassing ervan in biopolymeren.Yang, Yu. en Gene, X. Gemengde modus chromatografie en de toepassing ervan op biopolymeren.J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).