Nature.com saytına daxil olduğunuz üçün təşəkkür edirik. Məhdud CSS dəstəyi olan brauzer versiyasından istifadə edirsiniz. Ən yaxşı təcrübə üçün yenilənmiş brauzerdən istifadə etməyinizi (və ya Internet Explorer-də Uyğunluq Rejimini deaktiv etməyinizi) tövsiyə edirik. Bundan əlavə, davamlı dəstəyi təmin etmək üçün saytı stillər və JavaScript olmadan göstəririk.
Eyni anda üç slayddan ibarət karuseli göstərir. Bir anda üç slayd arasında hərəkət etmək üçün Əvvəlki və Növbəti düymələrindən, yaxud bir anda üç slayd arasında hərəkət etmək üçün sonundakı sürgü düymələrindən istifadə edin.
Məsaməli silisium hissəcikləri geniş məsaməli hissəciklər əldə etmək üçün bəzi modifikasiyalarla sol-gel üsulu ilə hazırlanmışdır. Bu hissəciklər N-fenilmaleimid interkalatlı poliamidlər istehsal etmək üçün tərs zəncirli transfer-fraqmentasiya (RAFT) polimerləşməsi yolu ilə N-fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat (PMI) və stirol ilə törəmələşdirilmişdir. Stirol (PMP) stasionar fazası. Dar dəlikli paslanmayan polad sütunlar (daxili diametri 100 × 1,8 mm) suspenziya qablaşdırması ilə doldurulmuşdur. PMP sütununun xromatoqrafik göstəriciləri beş peptiddən (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amin turşusu enkefalin) və insan serum albumininin (HAS) triptik hidrolizatından ibarət sintetik peptidlərin qarışığını ayırmaq üçün qiymətləndirilmişdir. Optimal elüsiya şəraitində peptid qarışığı olan lövhələrin nəzəri sayı 280.000 lövhə/kvadrat metrə çatdı. Hazırlanmış sütunun ayrılma performansını kommersiya Ascentis Express RP-Amide sütunu ilə müqayisə etdikdə, PMP sütunun ayrılma səmərəliliyinin ayrılma səmərəliliyi və qətnamə baxımından kommersiya sütunundan daha yüksək olduğu müşahidə edildi.
Biofarmasevtika sənayesi son illərdə bazar payının əhəmiyyətli dərəcədə artması ilə genişlənən qlobal bazara çevrilib. Biofarmasevtika sənayesinin partlayıcı böyüməsi ilə1,2,3 peptid və zülal analizinə böyük ehtiyac var. Hədəf peptiddən əlavə, peptid sintezi zamanı müxtəlif çirklər əmələ gəlir, buna görə də peptidin istənilən təmizliyini əldə etmək üçün xromatoqrafik təmizləmə tələb olunur. Bədən mayelərində, toxumalarında və hüceyrələrində zülalların təhlili və xarakteristikası tək bir nümunədə mövcud olan çox sayda potensial aşkar edilə bilən növ səbəbindən olduqca çətin bir işdir. Kütlə spektrometriyası peptidləri və zülalları ardıcıllıqla təyin etmək üçün təsirli bir vasitə olsa da, bu cür nümunələr birbaşa kütlə spektrometrinə daxil edilərsə, ayrılma qeyri-qənaətbəxş olacaq. Bu problem, MS analizindən əvvəl maye xromatoqrafiyası (LC) aparmaqla həll edilə bilər ki, bu da müəyyən bir zamanda kütlə spektrometrinə daxil olan analitlərin miqdarını azaldacaq4,5,6. Bundan əlavə, analitlər maye fazasının ayrılması zamanı dar bir bölgədə cəmləşə bilər və bununla da bu analitləri cəmləşdirə və MS aşkarlama həssaslığını artıra bilər. Maye xromatoqrafiyası (MM) son on ildə əhəmiyyətli dərəcədə inkişaf etmiş və proteomik analiz üçün geniş istifadə olunan bir üsula çevrilmişdir7,8,9,10.
Əks fazalı maye xromatoqrafiyası (RP-LC), stasionar faza kimi oktadesil modifikasiya olunmuş silisiumdan (ODS) istifadə edərək peptid qarışıqlarını təmizləmək və ayırmaq üçün geniş istifadə olunur11,12,13. Lakin, mürəkkəb quruluşlarına və amfoter təbiətinə görə14,15 RP stasionar fazaları peptidlərin və zülalların qənaətbəxş şəkildə ayrılmasını təmin edə bilmir. Buna görə də, polyar və qeyri-polyar fraqmentləri olan peptidlərin və zülalların təhlili bu analitlərin qarşılıqlı təsiri və saxlanması üçün xüsusi hazırlanmış stasionar fazaları tələb edir16. Multimodal qarşılıqlı təsirlər təklif edən qarışıq xromatoqrafiya, peptidləri, zülalları və digər mürəkkəb qarışıqları ayırmaq üçün RP-LC-yə alternativ ola bilər. Bir neçə qarışıq tipli stasionar faza hazırlanmış və bu stasionar fazalarla doldurulmuş sütunlar peptidləri və zülalları ayırmaq üçün istifadə edilmişdir17,18,19,20,21. Qütb və qeyri-polyar qrupların mövcudluğuna görə qarışıq rejimli stasionar fazalar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polyar interkalasiya/RPLC) peptidlərin və zülalların ayrılması üçün uyğundur22,23,24,25,26,27,28. , kovalent şəkildə əlaqəli polyar qrupları olan polyar interkalasiyalı stasionar fazalar polyar və qeyri-polyar analitlər üçün yaxşı ayrılma imkanları və unikal selektivlik göstərir, çünki ayrılma analit və stasionar faza arasındakı qarşılıqlı təsirdən asılıdır. Multimodal qarşılıqlı təsirlər29,30,31,32. Bu yaxınlarda Zhang və digərləri 30 poliaminlərin behenil ilə bitən stasionar fazalarını əldə etdilər və karbohidrogenləri, antidepresanları, flavonoidləri, nukleozidləri, estrogenləri və bəzi digər analitləri uğurla ayırdılar. Qütblü stasionar material həm polyar, həm də qeyri-polyar qruplara malikdir, buna görə də peptidləri və zülalları hidrofob və hidrofil hissələrə ayırmaq üçün istifadə edilə bilər. Qütb daxili sütunlar (məsələn, amid daxili C18 sütunları) Ascentis Express RP-Amide sütunları ticarət adı altında mövcuddur, lakin bu sütunlar yalnız amin 33-ün analizi üçün istifadə edilmişdir.
Hazırkı tədqiqatda polyar yerləşdirmə stasionar fazası (N-fenilmaleimid, yerləşdirmə polistirolu) hazırlanmış və peptid ayrılması və triptik HSA parçalanması üçün qiymətləndirilmişdir. Stasionar fazanı hazırlamaq üçün aşağıdakı strategiyadan istifadə edilmişdir. Məsaməli silisium hissəcikləri əvvəlki nəşrlərimizdə təsvir edilən prosedurlara uyğun olaraq hazırlanmışdır və hazırlıq sxemləri 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39-da bəzi dəyişikliklər edilmişdir. Böyük məsamə ölçülərinə malik silisium hissəcikləri əldə etmək üçün karbamid, polietilen qlikol (PEG), TMOS və sulu-sirkə turşusunun nisbətləri tənzimlənmişdir. İkincisi, yeni bir fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat ligand sintez edilmiş və onun törəmə silisium hissəcikləri polyar yerləşdirmə stasionar fazaları hazırlamaq üçün istifadə edilmişdir. Əldə edilən stasionar faza optimallaşdırılmış qablaşdırma sxeminə uyğun olaraq paslanmayan polad sütuna (daxili diametri 100 × 1,8 mm) qablaşdırılmışdır. Sütunun qablaşdırılmasına sütunun içərisində vahid təbəqə təmin etmək üçün mexaniki vibrasiya kömək edir. Qablaşdırılmış sütun beş peptiddən (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lösin-enkefalin peptid) və insan serum albumininin (HSA) triptik hidrolizatlarından ibarət peptid qarışığının ayrılması üçün qiymətləndirilmişdir. Peptid qarışığının və HSA triptik həzmin yaxşı qətnamə və səmərəliliklə ayrıldığı müşahidə edilmişdir. PMP sütununun ayrılma səmərəliliyi Ascentis Express RP-Amide sütununun ayrılma səmərəliliyi ilə müqayisə edilmişdir. Peptidlərin və zülalların PMP sütununda yaxşı qətnamə və yüksək ayrılma səmərəliliyinə malik olduğu və PMP sütununun ayrılma səmərəliliyinin Ascentis Express RP-Amide sütununun ayrılma səmərəliliyindən daha yüksək olduğu müşahidə edilmişdir.
PEG (polietilen glikol), karbamid, sirkə turşusu, trimetoksiorthosilikat (TMOS), trimetilxlorosilan (TMCS), tripsin, insan serum albumin (HSA), ammonium xlorid, karbamid, heksametilmetakrilloildisilazan (HMDS), metakriloil xlorid (MC), stirol, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksid (BPO), HPLC üçün asetonitril (ACN), metanol, 2-propanol və aseton. Sigma-Aldrich Şirkəti (Sent-Luis, Missuri, ABŞ).
Karbamid (8 q), polietilen qlikol (8 q) və 8 ml 0,01 N sirkə turşusu qarışığı 10 dəqiqə qarışdırıldı və üzərinə buzla soyudulan 24 ml TMOS əlavə edildi. Reaksiya qarışığı paslanmayan polad avtoklavda 40°C-də 6 saat, sonra isə 120°C-də 8 saat qızdırıldı. Su süzüldü və qalıq 70°C-də 12 saat quruduldu. Qurudulmuş yumşaq bloklar hamar şəkildə üyüdüldü və 550°C-də sobada 12 saat kalsine edildi. Hissəcik ölçülərinin, məsamə ölçüsünün və səth sahəsinin təkrarlana bilməsini yoxlamaq üçün üç partiya hazırlandı və xarakterizə edildi.
Polistirol zəncirləri üçün polyar qrup və stasionar faza. Hazırlıq proseduru aşağıda təsvir edilmişdir.
N-fenilmaleimid (200 mq) və metil vinil izosiyanat (100 mq) susuz toluolda həll edildi və sonra fenilmaleimid və metil vinil izosiyanat (PMCP) kopolimeri əldə etmək üçün reaksiya kolbasına 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitril (AIBN) əlavə edildi. Qarışıq 60°C-də 3 saat qızdırıldı, süzüldü və 40°C-də sobada 3 saat quruduldu.
Qurudulmuş silisium hissəcikləri (2 q) quru toluolda (100 ml) dispersiya edilmiş, qarışdırılmış və 500 ml-lik dairəvi dibli kolbada 10 dəqiqə ultrasəslə işlənmişdir. PMCP (10 mq) toluolda həll edilmiş və əlavə huni vasitəsilə reaksiya kolbasına damcı şəklində əlavə edilmişdir. Qarışıq 100°C-də 8 saat ərzində reflüks edilmiş, süzülmüş, asetonla yuyulmuş və 60°C-də 3 saat ərzində qurudulmuşdur. Daha sonra PMCP (100 q) ilə əlaqəli silisium hissəcikləri toluolda (200 ml) həll edilmiş və katalizator kimi 100 μl dibutiltin dilauratın iştirakı ilə ona 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) əlavə edilmişdir. Qarışıq 50°C-də 8 saat ərzində qarışdırılmış, süzülmüş və 50°C-də 3 saat ərzində qurudulmuşdur.
Stirol (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) və TEMPO-PMCP-yə (1,5 q) birləşdirilmiş silisium hissəcikləri toluolda dispersləşdirildi və azotla təmizləndi. Stirolun polimerləşməsi 100°C-də 12 saat ərzində aparıldı. Nəticədə alınan məhsul metanol ilə yuyuldu və 60°C-də bir gecə quruduldu. Reaksiyanın ümumi sxemi şəkil 1-də göstərilmişdir.
Nümunələr 10-3 Torr-dan az qalıq təzyiq əldə edilənə qədər 393 K-də 1 saat ərzində qazsızlaşdırıldı. Ümumi məsamə həcmini təyin etmək üçün nisbi təzyiq P/P0 = 0.99-da adsorbsiya olunmuş N2 miqdarından istifadə edildi. Təmiz və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin morfologiyası skanlayıcı elektron mikroskopu (Hitachi High Technologies, Tokio, Yaponiya) istifadə edilərək araşdırıldı. Quru nümunələr (təmiz silisium və ligandla əlaqəli silisium hissəcikləri) karbon lent istifadə edərək alüminium çubuqlara yerləşdirildi. Qızıl nümunənin üzərinə Q150T püskürtmə cihazı istifadə edilərək çökdürüldü və nümunənin üzərinə 5 nm qalınlığında Au təbəqəsi çökdürüldü. Bu, aşağı gərginlikli prosesin səmərəliliyini artırır və incə soyuq püskürtmə təmin edir. Elementar analiz Thermo Electron (Waltham, MA, ABŞ) Flash EA1112 elementar tərkib analizatoru istifadə edilərək aparıldı. Zərrəcik ölçüsünün paylanmasını əldə etmək üçün Malvern hissəcik ölçüsü analizatoru (Worcestershire, Böyük Britaniya) Mastersizer 2000 istifadə edildi. Örtülməmiş silisium hissəcikləri və ligandla əlaqəli silisium hissəcikləri (hər biri 5 mq) 5 ml izopropanolda dispersləşdirildi, 10 dəqiqə ultrasəslə işləndi, 5 dəqiqə qarışdırıldı və Mastersizer optik tezgahına yerləşdirildi. Termoqravimetrik analiz 30 ilə 800 °C arasında temperatur diapazonunda dəqiqədə 5 °C sürətlə aparılır.
Ölçüləri (ID 100 × 1.8 mm) olan şüşə lifli astarlı dar dəlikli paslanmayan polad sütunlar 31-ci istinadda göstərilən prosedura uyğun olaraq şlam doldurma üsulu ilə qablaşdırıldı. Paslanmayan polad sütun (şüşə astarlı, ID 100 × 1.8 mm) və 1 µm frit ehtiva edən çıxış şlam qablaşdırma maşınına (Alltech Deerfield, IL, ABŞ) qoşuldu. Stasionar fazanın suspenziyasını 1,2 ml metanolda 150 mq stasionar fazanı suspenziya edərək və onu rezervuar sütununa dolduraraq hazırlayın. Şlam həlledicisi və nəzarət həlledicisi kimi metanol istifadə edildi. Sütunu 10 dəqiqə ərzində 100 MP, 15 dəqiqə ərzində 80 MP və 30 dəqiqə ərzində 60 MP təzyiq ardıcıllığı tətbiq edərək qablaşdırın. Qablaşdırma prosesində sütunun vahid qablaşdırılmasını təmin etmək üçün mexaniki vibrasiya üçün iki qaz xromatoqrafiya sütunu vibratorundan (Alltech, Deerfield, IL, ABŞ) istifadə edildi. Şlam qablaşdırıcısını bağlayın və ipin zədələnməsinin qarşısını almaq üçün təzyiqi yavaşca buraxın. Sütun suspenziya ucluğundan ayrıldı və işləməsini yoxlamaq üçün girişə başqa bir fitinq bərkidildi və LC sisteminə qoşuldu.
Xüsusi MLC, LC nasosu (10AD Shimadzu, Yaponiya), 50 nL enjeksiyon döngəsi olan nümunə götürən (Valco (ABŞ) C14 W.05), membran deqazatoru (Shimadzu DGU-14A) və UV-VIS kapilyar pəncərəsi istifadə edilərək quruldu. Detektor cihazı (UV-2075) və emal olunmuş mikrokolon. Əlavə sütun genişlənməsinin təsirini minimuma endirmək üçün çox dar və qısa birləşdirici borulardan istifadə edin. Sütunu doldurduqdan sonra, 1/16 düymlük reduksiya qovşağının çıxışına bir kapilyar (50 µm id 365) quraşdırın və reduksiya qovşağının bir kapilyarını (50 µm) quraşdırın. Məlumatların toplanması və xromatoqram emalı Multichro 2000 proqram təminatı istifadə edilərək həyata keçirilir. 254 nm-də subyektlərin analitlərinin UB udma qabiliyyəti 0-da izlənildi. Xromatoqrafik məlumatlar OriginPro8 (Northampton, MA) istifadə edilərək təhlil edildi.
İnsan serum albumin, liofilizasiya olunmuş toz, ≥ 96% (aqaroza gel elektroforez) 3 mq tripsin (1,5 mq), 4,0 M karbamid (1 ml) və 0,2 M ammonium bikarbonat (1 ml) ilə qarışdırılmışdır. Məhlul 10 dəqiqə qarışdırılmış və 37°C-də su hamamında 6 saat saxlanılmış, sonra 1 ml 0,1% TFA ilə söndürülmüşdür. Məhlulu süzün və 4°C-dən aşağı temperaturda saxlayın.
PMP sütununda peptidlər və triptik digest HSA qarışığının ayrılması ayrıca qiymətləndirildi. PMP sütunu ilə ayrılmış peptidlər və HSA qarışığının triptik hidrolizini yoxlayın və nəticələri Ascentis Express RP-Amide sütunu ilə müqayisə edin. Nəzəri lövhələrin sayı aşağıdakı tənlikdən istifadə etməklə hesablanır:
Təmiz silisium hissəciklərinin və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin SEM görüntüləri Şəkil 2-də göstərilmişdir. Təmiz silisium hissəciklərinin (A, B) SEM görüntüləri, əvvəlki tədqiqatlarımızla müqayisədə hissəciklərin uzandığı və ya nizamsız simmetriyaya malik olduğu sferik forma göstərir. Ligand (C, D) ilə əlaqəli silisium hissəciklərinin səthi təmiz silisium hissəciklərinin səthindən daha hamardır ki, bu da silisium hissəciklərinin səthini örtən polistirol zəncirləri ilə əlaqəli ola bilər.
Saf silisium hissəciklərinin (A, B) və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin (C, D) skan edən elektron mikroqrafları.
Təmiz silisium hissəciklərinin və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin hissəcik ölçüsü paylanması Şəkil 2. 3(A)-da göstərilmişdir. Həcm hissəcik ölçüsü paylanma əyriləri kimyəvi modifikasiyadan sonra silisium hissəcik ölçüsünün artdığını göstərdi (Şəkil 3A). Cari tədqiqatdan və əvvəlki tədqiqatdan əldə edilən silisium hissəcik ölçüsü paylanma məlumatları Cədvəl 1(A)-da müqayisə edilir. PMP-nin həcm hissəcik ölçüsü d(0.5) əvvəlki tədqiqatımızdakı ad(0.5) dəyərinin 3.05 µm olması ilə müqayisədə 3.36 µm idi (polistirolla əlaqəli silisium hissəcikləri)34. Reaksiya qarışığında PEG, karbamid, TMOS və sirkə turşusunun nisbətindəki dəyişiklik səbəbindən bu partiyanın hissəcik ölçüsü paylanması əvvəlki tədqiqatımızla müqayisədə daha dar idi. PMP fazasının hissəcik ölçüsü əvvəllər araşdırdığımız polistirolla əlaqəli silisium hissəcik fazasının ölçüsündən bir qədər böyükdür. Bu o deməkdir ki, stirol ilə silisium hissəciklərinin səth funksionalizasiyası silisium səthində yalnız bir polistirol təbəqəsi (0,97 µm) çökdürmüş, PMP fazasında isə təbəqənin qalınlığı 1,38 µm olmuşdur.
Təmiz silisium hissəciklərinin və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin hissəcik ölçüsü paylanması (A) və məsamə ölçüsü paylanması (B).
Bu tədqiqatda istifadə edilən silisium hissəciklərinin məsamə ölçüsü, məsamə həcmi və səth sahəsi Cədvəl 1-də (B) göstərilmişdir. Təmiz silisium hissəciklərinin və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin PSD profilləri Şəkil 3(B)-də göstərilmişdir. Nəticələr əvvəlki tədqiqatımızla müqayisə edilə bilərdi34. Təmiz və ligandla əlaqəli silisium hissəciklərinin məsamə ölçüləri müvafiq olaraq 310 Å və 241 Å olmuşdur ki, bu da kimyəvi modifikasiyadan sonra məsamə ölçüsünün Cədvəl 1-də (B) göstərildiyi kimi 69 Å azaldığını və sürüşmə əyrisinin Şəkil 1-də göstərildiyini göstərir. Cari tədqiqatda silisium hissəciklərinin xüsusi səth sahəsi 116 m2/q-dır ki, bu da əvvəlki tədqiqatımızla (124 m2/q) müqayisə edilə bilər. Cədvəl 1(B)-də göstərildiyi kimi, kimyəvi modifikasiyadan sonra silisium hissəciklərinin səth sahəsi (m2/q) də 116 m2/q-dan 105 m2/q-a qədər azalmışdır.
Stasionar fazanın elementar analizinin nəticələri Cədvəl 2-də təqdim olunur. Cari stasionar fazanın karbon tərkibi 6,35%-dir ki, bu da əvvəlki tədqiqatımızdan (polistirol ilə əlaqəli silisium hissəcikləri müvafiq olaraq 7,93%35 və 10,21%) daha aşağıdır 42. SP-nin hazırlanmasında stiroldan əlavə olaraq fenilmaleimid metil vinil izosiyanat (PCMP) və 4-hidroksi-TEMPO kimi bəzi polyar ligandlardan istifadə edildiyindən, cari stasionar fazanın karbon tərkibi aşağıdadır. Cari stasionar fazada azotun çəki faizi əvvəlki tədqiqatlarda 0,1735 və 0,85%-ə nisbətən 2,21%-dir42. Bu o deməkdir ki, cari stasionar fazada fenilmaleimid səbəbindən azotun çəki faizi yüksəkdir. Eynilə, (4) və (5) məhsullarında karbon miqdarı müvafiq olaraq 2,7% və 2,9% təşkil edir, son məhsulda (6) isə Cədvəl 2-də göstərildiyi kimi 6,35% karbon miqdarına malikdir. Çəki itkisini yoxlamaq üçün PMP-nin stasionar fazasında termoqravimetrik analiz (TGA) istifadə edilmişdir və TGA əyrisi Şəkil 4-də göstərilmişdir. TGA əyrisi 8,6% çəki itkisi göstərir ki, bu da karbon miqdarı (6,35%) ilə yaxşı uyğun gəlir, çünki ligandlarda yalnız C deyil, həm də N, O və H var.
Ligand fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat, polyar fenilmaleimid və vinilizosiyanat qruplarına görə silisium hissəciklərinin səthini dəyişdirmək üçün seçilmişdir. Vinil izosiyanat qrupları canlı radikal polimerləşmə yolu ilə stirol ilə daha da reaksiya verə bilər. İkinci səbəb, analitlə orta dərəcədə qarşılıqlı təsirə malik və analit ilə stasionar faza arasında güclü elektrostatik qarşılıqlı təsirlərə malik olmayan bir qrup daxil etməkdir, çünki fenilmaleimid hissəsinin normal pH-da virtual yükü yoxdur. Stasionar fazanın polyarlığı optimal stirol miqdarı və sərbəst radikal polimerləşmənin reaksiya müddəti ilə idarə oluna bilər. Reaksiyanın son mərhələsi (sərbəst radikal polimerləşmə) stasionar fazanın polyarlığını dəyişdirdiyi üçün vacibdir. Bu stasionar fazalardakı karbon tərkibini yoxlamaq üçün elementar analiz aparılmışdır. Stirol miqdarının və reaksiya müddətinin artırılmasının stasionar fazanın karbon tərkibini artırdığı və əksinə müşahidə edilmişdir. Müxtəlif konsentrasiyalı stirol ilə hazırlanmış SP-lər fərqli karbon yüklərinə malikdir. Eynilə, bu stasionar fazalar paslanmayan polad sütunlara yerləşdirildi və onların xromatoqrafik xüsusiyyətləri (selektivlik, qətnamə, N dəyəri və s.) yoxlanıldı. Bu təcrübələrə əsasən, nəzarət edilən polyarlığı və analitin yaxşı saxlanmasını təmin etmək üçün PMP stasionar fazasının hazırlanması üçün optimallaşdırılmış tərkib seçildi.
PMP sütunu, həmçinin mobil fazanın tutumundan istifadə edərək beş peptid qarışığının (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lösin-enkefalin) təhlili üçün qiymətləndirilmişdir. 60/40 (v/v) ACN/su (0.1% TFA) 80 µl/dəq axın sürətində. Optimal elusiya şəraitində (200.000 lövhə/m3), hər sütun üçün nəzəri lövhələrin sayı (N) (100 × 1.8 mm) 20.000 ± 100-dür. Üç PMP sütunu üçün N dəyərləri Cədvəl 3-də, xromatoqramlar isə Şəkil 5A-da göstərilmişdir. PMP sütununda yüksək axın sürətində (700 µl/dəq) sürətli analiz, bir dəqiqə ərzində beş peptid elusiya edildi, sütun başına 13500 ± 330 əla N dəyəri (100 x 1.8 mm diametr), 135.000 lövhə/m-ə bərabərdir (Şəkil 5B). Təkrarlana bilmə qabiliyyətini yoxlamaq üçün eyni ölçülü (daxili diametri 100 x 1.8 mm) üç sütun PMP stasionar fazasının üç fərqli partiyası ilə dolduruldu. Optimal elusiya şərtləri, nəzəri lövhələrin sayı N və saxlama müddəti istifadə edilərək hər sütunda eyni sınaq qarışığını ayırmaqla hər sütun üçün analitiklər qeyd edildi. PMP sütunları üçün təkrarlana bilmə məlumatları Cədvəl 4-də göstərilmişdir. PMP sütununun təkrarlana bilmə qabiliyyəti Cədvəl 3-də göstərildiyi kimi çox aşağı %RSD dəyərləri ilə yaxşı korrelyasiya etmişdir.
PMP sütununda (B) və Ascentis Express RP-Amide sütununda (A) peptid qarışıqlarının ayrılması, mobil fazalı 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP sütun ölçüləri (100 x 1.8 mm id), təhlil Birləşmələrin elusiya sırası: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) və 5 (lösin turşusu enkefalin).
İnsan serum albumininin triptik hidrolizatının HPLC ilə ayrılması üçün PMP sütunu (daxili diametri 100 x 1,8 mm) qiymətləndirilmişdir. Şəkil 6-dakı xromatoqram nümunələrin çox yaxşı qətnamə ilə yaxşı ayrıldığını göstərir. HSA məhlulları 100 μl/dəq axın sürəti, 70/30 asetonitril/su mobil fazası və 0,1% TFA istifadə edilərək təhlil edilmişdir. HSA-nın parçalanması xromatoqramda (Şəkil 6) göstərildiyi kimi, 17 peptidə uyğun olaraq 17 zirvəyə bölünmüşdür. HSA hidrolizatından fərdi zirvələrin ayrılma səmərəliliyi hesablanmış və dəyərlər Cədvəl 5-də göstərilmişdir.
HSA triptik hidrolizatları PMP sütununda (daxili diametri 100 x 1,8 mm), axın sürəti (100 μl/dəq), mobil fazalı 60/40 asetonitril/su və 0,1% TFA üzərində ayrılmışdır.
burada L sütunun uzunluğu, η mobil fazanın özlülüyü, ΔP sütunun əks təzyiqi və u mobil fazanın xətti sürətidir. PMP sütununun keçiriciliyi 2,5 × 10–14 m2, axın sürəti 25 µl/dəq, 60/40 v/v istifadə edilmişdir. ACN/su. PMP sütununun keçiriciliyi (ID 100 × 1,8 mm) əvvəlki İstinad 34 tədqiqatımıza bənzər idi. Səthi məsaməli hissəciklərlə doldurulmuş sütunun keçiriciliyi 5 µm hissəciklər üçün 1,7 × 10 .6 µm, 2,5 × 10-14 m2-dir43. Buna görə də, PMP fazasının keçiriciliyi 5 µm ölçüsündə nüvə-qabıq hissəciklərinin keçiriciliyinə bənzəyir.
burada Wx xloroformla doldurulmuş sütunun kütləsidir, Wy metanol ilə doldurulmuş sütunun kütləsidir və ρ həlledicinin sıxlığıdır. Metanolun sıxlığı (ρ = 0.7866) və xloroformun sıxlığı (ρ = 1.484). Silisium-C18 hissəcik sütununun (100 × 1.8 mm ID)34 və əvvəllər öyrəndiyimiz C18-karbamid31 sütununun ümumi məsaməliliyi müvafiq olaraq 0.63 və 0.55 idi. Bu o deməkdir ki, karbamid ligandlarının olması stasionar fazanın keçiriciliyini azaldır. Digər tərəfdən, PMP sütununun (daxili diametri 100 × 1.8 mm) ümumi məsaməliliyi 0.60-dır. PMP sütunları C18 ilə əlaqəli silisium hissəcikləri ilə dolu sütunlara nisbətən daha az keçiricidir, çünki C18 tipli stasionar fazalarda C18 ligandları silisium hissəciklərinə xətti zəncirlər şəklində birləşir, polistirol tipli stasionar fazalarda isə hissəciklərin ətrafında nisbətən qalın polimer əmələ gəlir. A təbəqəsi. Tipik bir təcrübədə sütun məsaməsi aşağıdakı kimi hesablanır:
Şəkil 7A və B-də eyni elusiya şərtləri altında, hər iki sütunda 60/40 ACN/H2O və 0,1% TFA 20 µl/dəq ilə 800 µl/dəq arasında PMP sütunu (id 100 x 1,8 mm) və Ascentis Express RP-Amide sütunu (id 100 x 1,8 mm) üçün Van Deemter qrafikləri göstərilir. Optimal axın sürətində (80 µl/dəq) minimum HETP dəyərləri PMP sütunu və Ascentis Express RP-Amide sütunu üçün müvafiq olaraq 2,6 µm və 3,9 µm idi. HETP dəyərləri göstərir ki, PMP sütununun (100 x 1,8 mm id) ayrılma səmərəliliyi kommersiya baxımından mövcud olan Ascentis Express RP-Amide sütununun (100 x 1,8 mm id) ayırma səmərəliliyindən daha yüksəkdir. Şəkil 7(A)-dakı van Deemter qrafiki göstərir ki, əvvəlki tədqiqatımızla müqayisədə axın artdıqca N dəyərində azalma əhəmiyyətli dərəcədə yüksək deyil. Ascentis Express RP-Amide sütununa nisbətən PMP sütununun daha yüksək ayrılma səmərəliliyi (id 100 × 1.8 mm) təkmilləşdirilmiş hissəcik forması və ölçüsünə və cari işdə istifadə edilən mürəkkəb sütun qablaşdırma proseduruna əsaslanır34.
(A) 0.1% TFA ilə 60/40 ACN/H2O-da PMP sütununda (id 100 x 1.8 mm) əldə edilmiş Van Deemter qrafiki (HETP vs. mobil faza xətti sürəti). (B) 0.1% TFA ilə 60/40 ACN/H2O-da Ascentis Express RP-Amide sütununda (id 100 x 1.8 mm) əldə edilmiş Van Deemter qrafiki (HETP vs. mobil faza xətti sürəti).
Yüksək performanslı maye xromatoqrafiyasında sintetik peptidlər və insan serum albumininin (HSA) triptik hidrolizatının qarışığının ayrılması üçün interkalatlı polistirolun polyar stasionar fazası hazırlanmış və qiymətləndirilmişdir. Peptid qarışıqları üçün PMP sütunlarının xromatoqrafik göstəriciləri ayrılma səmərəliliyi və qətnamə baxımından əladır. PMP sütunlarının təkmilləşdirilmiş ayrılma səmərəliliyi silisium hissəciklərinin ölçüsü və məsamə ölçüsü, stasionar fazaların nəzarətli sintezi və mürəkkəb sütun qablaşdırma materialları kimi bir neçə səbəbdən qaynaqlanır. Yüksək ayrılma səmərəliliyinə əlavə olaraq, bu stasionar fazanın digər bir üstünlüyü yüksək axın sürətində sütunun aşağı geri təzyiqidir. PMP sütunları yüksək dərəcədə təkrarlana bilir və peptid qarışıqlarını və müxtəlif zülalların triptik həzmini təhlil etmək üçün istifadə edilə bilər. Bu sütundan maye xromatoqrafiyada təbii məhsullardan, dərman bitkiləri ekstraktlarından və göbələklərdən bioaktiv birləşmələrin ayrılması üçün istifadə etməyi planlaşdırırıq. Gələcəkdə PMP sütunları da zülalların və monoklonal antikorların ayrılması üçün qiymətləndiriləcək.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Tərs fazalı xromatoqrafiya peptid ayırma sistemlərinin tədqiqi I hissə: Sütun xarakteristikası üçün protokolun hazırlanması. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Tərs fazalı xromatoqrafiya peptid ayırma sistemlərinin tədqiqi I hissə: Sütunun xarakteristikası üçün protokolun hazırlanması.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., və Petersson, P. Peptid Ayrılma Sistemlərinin Tərs Fazalı Xromatoqrafiya ilə Tədqiqi, I Hissə: Sütun Xarakteristikası üçün Protokolun Hazırlanması. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Tərs fazalı xromatoqrafiya peptid ayırma sistemlərinin tədqiqi I hissə: Sütun xüsusiyyətləri üçün protokolun hazırlanması. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Tərs fazalı xromatoqrafiya peptid ayırma sistemlərinin tədqiqi I hissə: Sütun xüsusiyyətləri üçün protokolun hazırlanması.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., və Petersson, P. Peptid Ayrılma Sistemlərinin Tərs Fazalı Xromatoqrafiya ilə Tədqiqi, I Hissə: Sütun Xarakteristikası üçün Protokolun Hazırlanması.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. və b. Yoluxucu xəstəliklərin müalicəsi üçün təkmilləşdirilmiş aktiv peptidlərin yaradılması üsulları. Biotexnologiya. Nailiyyətlər 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetik terapevtik peptidlər: Elm və bazar. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetik terapevtik peptidlər: Elm və bazar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J və Chreschatyski M. Sintetik terapevtik peptidlər: elm və bazar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J və Khreschatsky M. Sintetik terapevtik peptidlər: elm və bazar. Dərman kəşfi. Bu gün 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Qabaqcıl proteomik maye xromatoqrafiyası. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Qabaqcıl proteomik maye xromatoqrafiyası.Bax: F., Smith RD və Shen Yu. Qabaqcıl proteomik maye xromatoqrafiyası. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Qabaqcıl protein tərkibi 液相色谱。Bax: F., Smith RD və Shen Yu. Qabaqcıl proteomik maye xromatoqrafiyası.J. Xromatoqrafiya. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. və b. Qabaqcıl maye xromatoqrafiyası-kütlə spektrometriyası geniş əsaslı metabolomika və proteomikanı birləşdirə bilir. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM və Salisbury, JJ UHPLC-nin əczaçılıq inkişafında rolu. Chesnut, SM və Salisbury, JJ UHPLC-nin əczaçılıq inkişafında rolu.Chesnut, SM və Salisbury, JJ UHPLC-nin əczaçılıq inkişafında rolu.Chesnut, SM və Salisbury, JJ UHPLC-nin dərmanların hazırlanmasında rolu. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. və Clausen, AM Sürətli ayrılmalar üçün ultra yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyasının fundamental və praktik aspektləri. Wu, N. və Clausen, AM Sürətli ayrılmalar üçün ultra yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyasının fundamental və praktik aspektləri.Wu, N. və Clausen, AM Sürətli ayrılma üçün yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyasının fundamental və praktik aspektləri. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. və Clausen, AM Sürətli ayrılma üçün ultra yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyasının əsas və praktik aspektləri.Wu, N. və Clausen, AM Sürətli ayrılma üçün yüksək təzyiqli maye xromatoqrafiyasının fundamental və praktik aspektləri.J. Sentyabr Elmi. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA və Tchelitcheff, P. Əczaçılıq inkişafında ultra-performanslı maye xromatoqrafiyasının istifadəsi. Wren, SA və Tchelitcheff, P. Əczaçılıq inkişafında ultra-performanslı maye xromatoqrafiyasının istifadəsi.Ren, SA və Chelisheff, P. Əczaçılıq inkişafında ultra yüksək performanslı maye xromatoqrafiyasının istifadəsi. Wren, SA & Tchelicheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA və Tchelitcheff, P.Ren, SA və Chelisheff, P. Dərmanların hazırlanmasında ultra-performanslı maye xromatoqrafiyasının tətbiqi.J. Xromatoqrafiya. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. və b. Enterovirus 71-in səmərəli təmizlənməsi üçün yüksək daxili fazaya malik suda yağ emulsiyasından əldə edilən monolit makroməsaməli hidrogel. Kimyəvi layihə. Jurnal 401, 126051 (2020).
Şi, Y., Xiang, R., Horváth, C. və Wilkins, JA Maye xromatoqrafiyasının proteomikada rolu. Şi, Y., Xiang, R., Horváth, C. və Wilkins, JA Maye xromatoqrafiyasının proteomikada rolu.Şi, Y., Xiang, R., Horvath, C. və Wilkins, JA Maye xromatoqrafiyasının proteomikada rolu. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAŞi, Y., Xiang, R., Horvath, C. və Wilkins, JA Maye xromatoqrafiyasının proteomikada rolu.J. Xromatoqrafiya. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlərin və zülalların tərs fazalı maye xromatoqrafik ayrılmalarında yeni tendensiyalar: Nəzəriyyə və tətbiqlər. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlərin və zülalların tərs fazalı maye xromatoqrafik ayrılmalarında yeni tendensiyalar: Nəzəriyyə və tətbiqlər. & Guillarme, D. Novыe tendensial in razdelenii terapevticheskix peptidov və belkov s pomoщyu jidkostnoy xromatography of obraschennoy fazoy: nəzəriyyə və qəbul. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlərin və zülalların tərs fazalı maye xromatoqrafiyası ilə ayrılmasında yeni tendensiyalar: nəzəriyyə və tətbiqlər. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 və Guillarme, D.və Guillarmé, D. Terapevtik peptidlərin və zülalların tərs fazalı maye xromatoqrafiyası ilə ayrılmasında yeni tendensiyalar: nəzəriyyə və tətbiqlər.J. Pharm. Biotibbi Elm. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Birinci və ikinci ayırma ölçülərində fərqli pH olan RP-RP-HPLC sistemindən istifadə edərək peptidlərin ikiölçülü ayrılması. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Birinci və ikinci ayırma ölçülərində fərqli pH olan RP-RP-HPLC sistemindən istifadə edərək peptidlərin ikiölçülü ayrılması.Gilar M., Olivova P., Dali AE və Gebler JK Birinci və ikinci ayırma ölçülərində fərqli pH-a malik RP-RP-HPLC sistemindən istifadə edərək peptidlərin ikiölçülü ayrılması.Gilar M., Olivova P., Dali AE və Gebler JK RP-RP-HPLC sistemindən istifadə edərək birinci və ikinci ayırma ölçülərində fərqli pH dəyərlərindən istifadə edərək peptidlərin ikiölçülü ayrılması. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. və b. 2 µm-dən kiçik tam məsaməli və səthi məsaməli C18 hissəcikləri ilə dolu yüksək performanslı xromatoqrafiya sütunlarının kütlə ötürülməsi və kinetik xüsusiyyətlərinin tədqiqi. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. və b. Bitki bioaktiv peptidlərinin təcrid olunması, identifikasiyası və validasiyasında son tendensiyalar və analitik çətinliklər. anus. Anal məxluq. Kimyəvi. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB və başqaları. Həyat krallığının proteomik mənzərəsi. Təbiət 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. və b. Terapevtik peptidlərin preparativ maye xromatoqrafiyası ilə sonrakı müalicəsi. Molecules (Bazel, İsveçrə) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. və Geng, X. Qarışıq rejimli xromatoqrafiya və onun biopolimerlərə tətbiqi. Yang, Y. və Geng, X. Qarışıq rejimli xromatoqrafiya və onun biopolimerlərə tətbiqi.Yang, Yu. və Geng, X. Qarışıq rejimli xromatoqrafiya və onun biopolimerlərə tətbiqi. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. və Geng, X. Qarışıq rejimli xromatoqrafiya və onun biopolimerlərdə tətbiqi.Yang, Yu. və Gene, X. Qarışıq rejimli xromatoqrafiya və onun biopolimerlərə tətbiqi.J. Xromatoqrafiya. A 1218(49), 8813–8825 (2011).