Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Ön korlátozott CSS-támogatású böngészőverziót használ. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy frissítse böngészőjét (vagy tiltsa le a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Ezenkívül a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
Három diából álló forgószalagot jelenít meg egyszerre. Az Előző és Következő gombokkal egyszerre három dián, vagy a végén található csúszkagombokkal egyszerre három dián lapozhat.
A porózus szilícium-dioxid részecskéket szol-gél módszerrel állították elő, némi módosítással a széles pórusú részecskék előállítása érdekében. Ezeket a részecskéket N-fenilmaleimid-metilvinil-izocianáttal (PMI) és sztirollal derivatizálták fordított láncátviteli fragmentációval (RAFT) polimerizációval, így N-fenilmaleimid interkalált poliamidokat állítottak elő. Sztirol (PMP) állófázis. Keskeny furatú rozsdamentes acél oszlopokat (100 × 1,8 mm belső átmérőjű) szuszpenziós töltettel töltöttek meg. A PMP oszlop kromatográfiás teljesítményét öt peptidből (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminosav enkefalin) és humán szérumalbumin (HAS) triptikus hidrolizátumából álló szintetikus peptidek keverékének elválasztására értékelték. Optimális elúciós körülmények között a peptidkeverékkel rendelkező lemezek elméleti száma elérte a 280 000 lemezt/négyzetmétert. A kifejlesztett oszlop elválasztási teljesítményének összehasonlításakor a kereskedelmi forgalomban kapható Ascentis Express RP-Amide oszloppal megfigyelték, hogy a PMP oszlop elválasztási hatékonysága mind az elválasztási hatékonyság, mind a felbontás tekintetében meghaladta a kereskedelmi forgalomban kapható oszlopét.
A biofarmakológiai ipar egyre bővülő globális piaccá vált, és az elmúlt években jelentősen megnőtt a piaci részesedése. A biofarmakológiai ipar robbanásszerű növekedésével1,2,3 nagy igény van a peptid- és fehérjeelemzésre. A célpeptid mellett a peptidszintézis során különféle szennyeződések is keletkeznek, ezért a peptid kívánt tisztaságának eléréséhez kromatográfiás tisztításra van szükség. A testnedvekben, szövetekben és sejtekben található fehérjék elemzése és jellemzése rendkívül kihívást jelentő feladat a mintában jelen lévő nagyszámú potenciálisan kimutatható faj miatt. Bár a tömegspektrometria hatékony eszköz a peptidek és fehérjék szekvenálására, ha az ilyen mintákat közvetlenül a tömegspektrométerbe juttatják, az elválasztás nem lesz kielégítő. Ez a probléma megoldható folyadékkromatográfiával (LC) az MS-analízis előtt, ami csökkenti az adott idő alatt a tömegspektrométerbe jutó analitok mennyiségét4,5,6. Ezenkívül az analitok a folyadékfázisú elválasztás során egy szűk tartományban koncentrálódhatnak, ezáltal koncentrálva ezeket az analitokat és növelve az MS-detektálás érzékenységét. A folyadékkromatográfia (LC) az elmúlt évtizedben jelentősen fejlődött, és széles körben használt módszerré vált a proteomikai analízisben7,8,9,10.
A fordított fázisú folyadékkromatográfiát (RP-LC) széles körben alkalmazzák peptidkeverékek tisztítására és szétválasztására, oktadecil-módosított szilícium-dioxidot (ODS) használva állófázisként11,12,13. Komplex szerkezetük és amfoter jellegük miatt azonban14,15 az RP állófázisok nem tudják biztosítani a peptidek és fehérjék kielégítő elválasztását. Ezért a poláris és nem poláris fragmenseket tartalmazó peptidek és fehérjék elemzéséhez speciálisan tervezett állófázisokra van szükség, amelyek kölcsönhatásba lépnek és megtartják ezeket az analitokat16. A vegyes kromatográfia, amely multimodális kölcsönhatásokat kínál, alternatívát jelenthet az RP-LC-vel szemben a peptidek, fehérjék és más komplex keverékek elválasztására. Számos vegyes típusú állófázist készítettek, és ezekkel az állófázisokkal töltött oszlopokat használtak a peptidek és fehérjék elválasztására17,18,19,20,21. A poláris és nem poláris csoportok jelenléte miatt a vegyes módú állófázisok (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, poláris interkaláció/RPLC) alkalmasak peptidek és fehérjék elválasztására22,23,24,25,26,27,28. A kovalensen kötött poláris csoportokkal rendelkező poláris interkalált állófázisok jó elválasztási képességet és egyedülálló szelektivitást mutatnak poláris és nem poláris analitok esetében, mivel az elválasztás az analit és az állófázis közötti kölcsönhatástól függ. Multimodális kölcsönhatások 29,30,31,32. Nemrégiben Zhang és munkatársai 30 behenil-terminális poliaminok állófázisait állították elő, és sikeresen elválasztottak szénhidrogéneket, antidepresszánsokat, flavonoidokat, nukleozidokat, ösztrogéneket és néhány más analitot. A poláris beágyazott állóanyag poláris és nem poláris csoportokat is tartalmaz, így peptidek és fehérjék hidrofób és hidrofil részekre bontására is használható. A poláris inline oszlopok (pl. C18 oszlopok amid inline-nal) Ascentis Express RP-Amide oszlopok márkanéven kaphatók, de ezeket az oszlopokat eddig csak a 33-as amin elemzésére használták.
Jelen vizsgálatban egy poláris beágyazó állófázist (N-fenilmaleimid, beágyazó polisztirol) állítottunk elő és értékeltünk peptidszétválasztás és tripszines HSA hasítás szempontjából. Az állófázis előállításához a következő stratégiát alkalmaztuk. A porózus szilícium-dioxid-részecskéket a korábbi publikációinkban leírtak szerint állítottuk elő, a 31., 34., 35., 36., 37., 38., 39. előkészítési sémákban végrehajtott néhány változtatással. A karbamid, polietilénglikol (PEG), TMOS és vizes ecetsav arányait úgy módosítottuk, hogy nagy pórusméretű szilícium-dioxid-részecskéket kapjunk. Másodszor, egy új fenilmaleimid-metilvinil-izocianát ligandumot szintetizáltunk, és annak derivatizált szilícium-dioxid-részecskéket használtunk fel poláris beágyazott állófázisok előállítására. A kapott állófázist egy rozsdamentes acél oszlopba (belső átmérő 100 × 1,8 mm) töltöttük egy optimalizált csomagolási séma szerint. Az oszlop töltését mechanikai vibráció segíti, hogy az oszlopon belül egyenletes réteg alakuljon ki. A töltött oszlopot öt peptidből (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin peptid) álló peptidkeverék és humán szérumalbumin (HSA) triptikus hidrolizátumainak elválasztására értékelték. Megfigyelték, hogy a peptidkeverék és a HSA triptikus emésztése jó felbontással és hatékonysággal választott el. A PMP oszlop elválasztási hatékonyságát összehasonlították az Ascentis Express RP-Amide oszlopéval. Megfigyelték, hogy a peptidek és fehérjék jó felbontással és magas elválasztási hatékonysággal rendelkeznek a PMP oszlopon, és a PMP oszlop elválasztási hatékonysága magasabb, mint az Ascentis Express RP-Amide oszlopé.
PEG (polietilénglikol), karbamid, ecetsav, trimetoxi-ortoszilikát (TMOS), trimetil-klórszilán (TMCS), tripszin, humán szérumalbumin (HSA), ammónium-klorid, karbamid, hexametil-metakriloil-diszilazán (HMDS), metakriloil-klorid (MC), sztirol, 4-hidroxi-TEMPO, benzoil-peroxid (BPO), acetonitril (ACN) HPLC-hez, metanol, 2-propanol és aceton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
8 g karbamid, 8 g polietilénglikol és 8 ml 0,01 N ecetsav elegyét 10 percig kevertettük, majd jeges hűtés közben 24 ml TMOS-t adtunk hozzá. A reakcióelegyet 6 órán át 40 °C-on, majd 8 órán át 120 °C-on melegítettük rozsdamentes acél autoklávban. A vizet dekantáltuk, és a maradékot 12 órán át 70 °C-on szárítottuk. A szárított puha tömböket simára őröltük, majd 12 órán át 550 °C-on kalcináltuk kemencében. Három tételt készítettünk elő és jellemeztünk a részecskeméretek, a pórusméret és a felület reprodukálhatóságának vizsgálata céljából.
Poláris csoport és állófázis polisztirol láncokhoz. Az előállítási eljárást az alábbiakban ismertetjük.
200 mg N-fenilmaleimidet és 100 mg metil-vinil-izocianátot oldottunk vízmentes toluolban, majd 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitrilt (AIBN) adtunk a reakcióedényhez, így fenilmaleimid és metil-vinil-izocianát (PMCP) kopolimert kaptunk. Az elegyet 3 órán át 60 °C-on melegítettük, szűrtük, és 40 °C-on 3 órán át szárítottuk kemencében.
Szárított szilícium-dioxid részecskéket (2 g) diszpergáltunk száraz toluolban (100 ml), kevertettük és ultrahanggal kezeltük 10 percig egy 500 ml-es gömblombikban. PMCP-t (10 mg) oldottunk toluolban, és cseppenként adtuk a reakcióedénybe egy adagolótölcséren keresztül. Az elegyet 100 °C-on 8 órán át refluxáltuk, majd szűrtük, acetonnal mostuk, és 60 °C-on 3 órán át szárítottuk. Ezután a PMCP-vel (100 g) asszociált szilícium-dioxid részecskéket 200 ml toluolban oldottuk, és 100 μl dibutil-ón-dilaurát katalizátor jelenlétében 2 ml 4-hidroxi-TEMPO-t adtunk hozzá. Az elegyet 50 °C-on 8 órán át kevertettük, szűrtük és 50 °C-on 3 órán át szárítottuk.
Sztirolt (1 ml), benzoil-peroxidot (BPO) (0,5 ml) és TEMPO-PMCP-hez (1,5 g) kapcsolt szilícium-dioxid részecskéket toluolban diszpergáltunk, majd nitrogénnel átöblítettünk. A sztirol polimerizációját 100 °C-on 12 órán át végeztük. A kapott terméket metanollal mostuk, majd egy éjszakán át 60 °C-on szárítottuk. A reakció általános vázlatát az 1. ábra mutatja.
A mintákat 393 K-en 1 órán át gáztalanítottuk, amíg a maradék nyomás 10–3 Torr alatt lett. A teljes pórustérfogat meghatározására a P/P0 = 0,99 relatív nyomáson adszorbeált N2 mennyiségét használtuk. A tiszta és ligandumhoz kötött szilícium-dioxid-részecskék morfológiáját pásztázó elektronmikroszkóppal (Hitachi High Technologies, Tokió, Japán) vizsgáltuk. A száraz mintákat (tiszta szilícium-dioxid és ligandumhoz kötött szilícium-dioxid-részecskék) szénszalag segítségével alumínium rudakra helyeztük. Az aranyat Q150T porlasztóberendezéssel vittük fel a mintára, és egy 5 nm vastag Au réteget vittünk fel a mintára. Ez javítja az alacsony feszültségű eljárás hatékonyságát és finom hidegporlasztást biztosít. Az elemanalízist Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elemösszetétel-analizátorral végeztük. A részecskeméret-eloszlás meghatározásához Malvern részecskeméret-analizátort (Worcestershire, Egyesült Királyság) Mastersizer 2000 használtunk. Bevonat nélküli szilícium-dioxid-részecskéket és ligandumhoz kötött szilícium-dioxid-részecskéket (egyenként 5 mg) 5 ml izopropanolban diszpergáltunk, 10 percig ultrahanggal kezeltük, 5 percig kevertük, majd Mastersizer optikai padra helyeztük. A termogravimetriás analízist percenként 5 °C sebességgel végeztük 30 és 800 °C közötti hőmérsékleten.
Üvegszállal bélelt, keskeny furatú, 100 × 1,8 mm méretű rozsdamentes acél oszlopokat töltöttünk meg szuszpenziós töltésű módszerrel, a 31. hivatkozásban leírtak szerint. Egy rozsdamentes acél oszlopot (üvegszállal bélelt, 100 × 1,8 mm belső átmérőjű) és egy 1 µm-es frittet tartalmazó kimenetet csatlakoztattunk egy szuszpenziós csomagológéphez (Alltech Deerfield, IL, USA). Az állófázis szuszpenzióját úgy készítettük el, hogy 150 mg állófázist 1,2 ml metanolban szuszpendáltunk, és egy tartályoszlopba töltöttük. A metanolt szuszpenziós oldószerként és kontroll oldószerként használtuk. Az oszlopot a következő nyomássorozat alkalmazásával töltöttük fel: 100 MP 10 percig, 80 MP 15 percig és 60 MP 30 percig. A töltési folyamat során két gázkromatográfiás oszlopvibrátort (Alltech, Deerfield, IL, USA) használtunk mechanikai rezgés biztosítására az oszlop egyenletes töltésének biztosítása érdekében. Zárjuk le a szuszpenziós csomagolót, és lassan engedjük ki a nyomást, hogy elkerüljük a kábel károsodását. Az oszlopot leválasztották a zagyfúvókáról, és egy másik szerelvényt csatlakoztattak a bemenethez, majd az LC-rendszerhez csatlakoztatták a működésének tesztelése érdekében.
Egyedi MLC-t készítettünk LC pumpával (10AD Shimadzu, Japán), 50 nL-es befecskendező hurokkal ellátott mintavevővel (Valco (USA) C14 W.05), membrán gáztalanítóval (Shimadzu DGU-14A) és UV-VIS kapilláris ablakkal. Detektor eszköz (UV-2075) és zománcozott mikrooszlop. Nagyon keskeny és rövid összekötő csöveket használtunk az oszlop további tágulási hatásának minimalizálása érdekében. Az oszlop feltöltése után egy kapillárist (50 µm belső átmérőjű, 365 mm) szereltünk fel az 1/16″-es redukáló átmenet kimenetére, és egy másik kapillárist (50 µm) a redukáló átmenetbe is. Az adatgyűjtést és a kromatogram-feldolgozást a Multichro 2000 szoftverrel végeztük. 254 nm-en a vizsgált analitok UV-abszorbanciáját 0 értéken monitoroztuk. A kromatográfiás adatokat OriginPro8 (Northampton, MA) szoftverrel elemeztük.
Humán szérumalbumin, liofilizált por, ≥ 96% (agaróz gélelektroforézis) 3 mg, tripszinnel (1,5 mg), 4,0 M karbamiddal (1 ml) és 0,2 M ammónium-hidrogén-karbonáttal (1 ml) összekeverve. Az oldatot 10 percig kevertettük, majd 6 órán át 37°C-os vízfürdőben tartottuk, és 1 ml 0,1%-os TFA-val leállítottuk a reakciót. Az oldatot szűrtük és 4°C alatt tároltuk.
A peptidek és a tripszinnel emésztett HSA keverékének PMP oszlopon történő elválasztását külön értékelték. Ellenőrizték a PMP oszloppal elválasztott peptidek és HSA keverék tripszinnel történő hidrolízisét, és összehasonlították az eredményeket egy Ascentis Express RP-Amide oszloppal. Az elméleti tányérok számát a következő egyenlettel számították ki:
A tiszta szilícium-dioxid-részecskék és a ligandhoz kötött szilícium-dioxid-részecskék pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képei a 2. ábrán láthatók. A tiszta szilícium-dioxid-részecskék (A, B) SEM-képei gömb alakúak, amelyekben a részecskék megnyúltak vagy szabálytalan szimmetriával rendelkeznek a korábbi vizsgálatainkhoz képest. A ligandhoz kötött szilícium-dioxid-részecskék (C, D) felülete simább, mint a tiszta szilícium-dioxid-részecskéké, ami a szilícium-dioxid-részecskék felületét borító polisztirol láncoknak tudható be.
Tiszta szilícium-dioxid-részecskék (A, B) és ligandhoz kötött szilícium-dioxid-részecskék (C, D) pásztázó elektronmikroszkópos felvételei.
A tiszta szilícium-dioxid részecskék és a ligandumhoz kötött szilícium-dioxid részecskék részecskeméret-eloszlását a 2.3(A) ábra mutatja. A térfogati részecskeméret-eloszlás görbék azt mutatták, hogy a szilícium-dioxid részecskemérete a kémiai módosítás után megnőtt (3A. ábra). A jelenlegi és az előző vizsgálatból származó szilícium-dioxid részecskeméret-eloszlási adatokat az 1.(A) táblázat hasonlítja össze. A PMP d(0,5) térfogati részecskemérete 3,36 µm volt, szemben az előző vizsgálatunkban (polisztirolhoz kötött szilícium-dioxid részecskék)34 szereplő 3,05 µm-es ad(0,5) értékkel. A reakcióelegyben a PEG, karbamid, TMOS és ecetsav arányának változása miatt a tétel részecskeméret-eloszlása ​​szűkebb volt az előző vizsgálatunkhoz képest. A PMP fázis részecskemérete valamivel nagyobb, mint a korábban vizsgált polisztirolhoz kötött szilícium-dioxid részecske fázisé. Ez azt jelenti, hogy a szilícium-dioxid részecskék sztirollal történő felületi funkcionalizálása csak egy polisztirol réteget (0,97 µm) rakott le a szilícium-dioxid felületére, míg a PMP fázisban a rétegvastagság 1,38 µm volt.
A tiszta szilícium-dioxid részecskék és a ligandumhoz kötött szilícium-dioxid részecskék részecskeméret-eloszlása ​​(A) és pórusméret-eloszlása ​​(B).
A vizsgálatban használt szilícium-dioxid-részecskék pórusméretét, pórustérfogatát és felületét az 1. táblázat (B) mutatja. A tiszta szilícium-dioxid-részecskék és a ligandumhoz kötött szilícium-dioxid-részecskék PSD-profiljait a 3. ábra (B) mutatja. Az eredmények összehasonlíthatók voltak korábbi tanulmányunkkal34. A tiszta és a ligandumhoz kötött szilícium-dioxid-részecskék pórusmérete 310 Å, illetve 241 Å volt, ami azt jelzi, hogy a kémiai módosítás után a pórusméret 69 Å-rel csökkent, amint az 1. táblázat (B) mutatja, az eltolódási görbét pedig az 1. ábra mutatja. A szilícium-dioxid-részecskék fajlagos felülete a jelenlegi vizsgálatban 116 m2/g, ami összehasonlítható korábbi tanulmányunkkal (124 m2/g). Amint az 1. táblázat (B) mutatja, a szilícium-dioxid-részecskék felülete (m2/g) a kémiai módosítás után szintén csökkent 116 m2/g-ról 105 m2/g-ra.
Az állófázis elemanalízisének eredményeit a 2. táblázat mutatja. A jelenlegi állófázis széntartalma 6,35%, ami alacsonyabb, mint korábbi tanulmányunkban (a polisztirolhoz kapcsolódó szilícium-dioxid részecskék 7,93%35, illetve 10,21%)42. A jelenlegi állófázis széntartalma alább látható, mivel az SP előállításában a sztirol mellett néhány poláris ligandumot, például fenilmaleimid-metil-vinil-izocianátot (PCMP) és 4-hidroxi-TEMPO-t is használtak. A jelenlegi állófázis nitrogéntartalma 2,21%, szemben a korábbi tanulmányokban megfigyelt 0,1735 és 0,85%-kal42. Ez azt jelenti, hogy a jelenlegi állófázis a fenilmaleimid miatt magas nitrogéntartalommal rendelkezik. Hasonlóképpen, a (4) és (5) termékek széntartalma 2,7%, illetve 2,9%, míg a (6) végtermék széntartalma 6,35%, amint az a 2. táblázatban látható. A PMP állófázisán termogravimetriás analízist (TGA) alkalmaztunk a tömegveszteség vizsgálatára, a TGA görbét a 4. ábra mutatja. A TGA görbe 8,6%-os tömegveszteséget mutat, ami jó egyezést mutat a széntartalommal (6,35%), mivel a ligandumok nemcsak C-t, hanem N-t, O-t és H-t is tartalmaznak.
A szilícium-dioxid-részecskék felületének módosítására a fenilmaleimid-metilvinil-izocianát ligandumot választottuk poláris fenilmaleimid és vinilizocianát csoportjai miatt. A vinil-izocianát csoportok élő gyökös polimerizációval reagálhatnak a sztirollal. A második ok egy olyan csoport beillesztése, amely mérsékelt kölcsönhatásba lép az analittal, és nincs erős elektrosztatikus kölcsönhatás az analit és az állófázis között, mivel a fenilmaleimid résznek nincs virtuális töltése normál pH-n. Az állófázis polaritása a sztirol optimális mennyiségével és a szabadgyökös polimerizáció reakcióidejével szabályozható. A reakció utolsó lépése (szabadgyökös polimerizáció) kritikus, mivel megváltoztatja az állófázis polaritását. Elemanalízist végeztünk ezen állófázisok széntartalmának ellenőrzésére. Megfigyeltük, hogy a sztirol mennyiségének és a reakcióidőnek a növelése növeli az állófázis széntartalmát, és fordítva. A különböző sztirolkoncentrációkkal előállított SP-k eltérő szénterheléssel rendelkeznek. Hasonlóképpen, ezeket az állófázisokat rozsdamentes acél oszlopokra helyeztük, és ellenőriztük kromatográfiás jellemzőiket (szelektivitás, felbontás, N-érték stb.). Ezen kísérletek alapján optimalizált összetételt választottak a PMP állófázis előállításához, hogy biztosítsák a szabályozott polaritást és az analit jó retencióját.
A PMP oszlopot öt peptidkeverék (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin) elemzéséhez is értékelték a mozgó fázis kapacitásának felhasználásával. 60/40 (v/v) ACN/víz (0,1% TFA) 80 µl/perc áramlási sebességgel. Optimális eluálási körülmények között (200 000 lemez/m²) az elméleti tányérok száma (N) oszloponként (100 × 1,8 mm) 20 000 ± 100. A három PMP oszlop N értékeit a 3. táblázat, a kromatogramokat pedig az 5A. ábra mutatja. Gyors analízis nagy áramlási sebességgel (700 µl/perc) PMP oszlopon, öt peptid eluálódott egy percen belül, kiváló N érték, 13 500 ± 330 oszloponként (100 x 1,8 mm átmérő), ami 135 000 tányér/m-nek felel meg (5B. ábra). Három azonos méretű oszlopot (belső átmérő 100 x 1,8 mm) töltöttünk meg három különböző PMP állófázissal az reprodukálhatóság teszteléséhez. Az analitokat minden oszlophoz úgy rögzítettük, hogy ugyanazt a tesztkeveréket választottuk szét minden oszlopon optimális eluálási körülmények, N elméleti tányérszám és retenciós idő mellett. A PMP oszlopok reprodukálhatósági adatait a 4. táblázat mutatja. A PMP oszlop reprodukálhatósága jól korrelált a nagyon alacsony %RSD értékekkel, amint azt a 3. táblázat mutatja.
Peptidkeverékek szétválasztása PMP oszlopon (B) és Ascentis Express RP-Amide oszlopon (A), mozgófázis 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP oszlop méretei (100 x 1,8 mm belső átmérő), analízis: A vegyületek eluálási sorrendje: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) és 5 (leucinsav-enkefalin).
Egy PMP oszlopot (100 x 1,8 mm belső átmérőjű) értékeltek ki a humán szérumalbumin tripszinsavas hidrolizátumának HPLC-vel történő elválasztására. A 6. ábrán látható kromatogram azt mutatja, hogy a minták jól elválnak, nagyon jó felbontással. A HSA oldatokat 100 μl/perc áramlási sebességgel, 70/30 acetonitril/víz és 0,1% TFA mozgófázissal elemezték. A HSA hasítását 17 csúcsra osztották, amint az a kromatogramon (6. ábra) látható, amelyek 17 peptidnek felelnek meg. Kiszámították az egyes csúcsok elválasztási hatékonyságát a HSA hidrolizátumtól, és az értékeket az 5. táblázat mutatja.
A HSA tripszinsavas hidrolizátumokat PMP oszlopon (belső átmérő 100 x 1,8 mm), áramlási sebességgel (100 μl/perc), 60/40 acetonitril/víz mozgófázissal és 0,1% TFA-val választottuk el.
ahol L az oszlop hossza, η a mozgófázis viszkozitása, ΔP az oszlop ellennyomása, u pedig a mozgófázis lineáris sebessége. A PMP oszlop permeabilitása 2,5 × 10–14 m2, az áramlási sebesség 25 µl/perc volt, 60/40 v/v arányban. ACN/víz. A PMP oszlop (ID 100 × 1,8 mm) permeabilitása hasonló volt a korábbi, 34. hivatkozásban szereplő tanulmányunkban szereplőhöz. Egy felületileg porózus részecskékkel töltött oszlop permeabilitása 1,7×10,6 µm, 2,5×10-14 m2 az 5 µm-es részecskék esetében43. Ezért a PMP fázis permeabilitása hasonló az 5 μm méretű mag-héj részecskék permeabilitásához.
ahol Wx a kloroformmal töltött oszlop tömege, Wy a metanollal töltött oszlop tömege, ρ pedig az oldószer sűrűsége. A metanol (ρ = 0,7866) és a kloroform (ρ = 1,484) sűrűsége. A szilícium-dioxid-C18 részecske oszlop (100 × 1,8 mm ID)34 és a korábban vizsgált C18-karbamid31 oszlop teljes porozitása 0,63, illetve 0,55 volt. Ez azt jelenti, hogy a karbamid ligandumok jelenléte csökkenti az állófázis permeabilitását. Másrészt a PMP oszlop (belső átmérő 100 × 1,8 mm) teljes porozitása 0,60. A PMP oszlopok kevésbé permeábilisek, mint a C18-hoz kötött szilícium-dioxid részecskékkel töltött oszlopok, mivel a C18 típusú állófázisokban a C18 ligandumok lineáris láncokban kapcsolódnak a szilícium-dioxid részecskékhez, míg a polisztirol típusú állófázisokban egy viszonylag vastag polimer képződik a részecskék körül. Egy tipikus kísérletben az oszlop porozitását a következőképpen számítjuk ki:
A 7A és 7B ábrán a PMP oszlop (belső átmérő 100 x 1,8 mm) és az Ascentis Express RP-Amide oszlop (belső átmérő 100 x 1,8 mm) Van Deemter-diagramjai láthatók azonos elúciós körülmények között, 60/40 ACN/H2O és 0,1% TFA mellett, 20 µl/perctől 800 µl/percig mindkét oszlopon. Az optimális áramlási sebességnél (80 µl/perc) a minimális HETP-értékek 2,6 µm, illetve 3,9 µm voltak a PMP oszlop, illetve az Ascentis Express RP-Amide oszlop esetében. A HETP-értékek azt mutatják, hogy a PMP oszlop (100 x 1,8 mm belső átmérő) elválasztási hatékonysága jóval magasabb, mint a kereskedelmi forgalomban kapható Ascentis Express RP-Amide oszlopé (100 x 1,8 mm belső átmérő). A 7(A) ábrán látható van Deemter-grafikon azt mutatja, hogy az N érték csökkenése nem szignifikánsan nagyobb az áramlás növekedésével a korábbi tanulmányunkhoz képest. A PMP oszlop (belső átmérő 100 × 1,8 mm) nagyobb elválasztási hatékonysága az Ascentis Express RP-Amide oszlophoz képest a jobb részecskealakon és -méreten, valamint a jelenlegi munkában alkalmazott kifinomult oszloptöltési eljáráson alapul34.
(A) Van Deemter-diagram (HETP vs. mozgófázis lineáris sebesség), PMP oszlopon (belső átmérő 100 x 1,8 mm) 60/40 ACN/H2O elegyben 0,1% TFA-val. (B) Van Deemter-diagram (HETP vs. mozgófázis lineáris sebesség), Ascentis Express RP-Amide oszlopon (belső átmérő 100 x 1,8 mm) 60/40 ACN/H2O elegyben 0,1% TFA-val.
Egy interkalált polisztirol poláris állófázist állítottunk elő és értékeltünk szintetikus peptidek és humán szérumalbumin (HSA) triptikus hidrolizátumának nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás elválasztására. A PMP oszlopok kromatográfiás teljesítménye peptidkeverékek esetében kiváló az elválasztási hatékonyság és a felbontás szempontjából. A PMP oszlopok jobb elválasztási hatékonysága számos oknak köszönhető, mint például a szilícium-dioxid részecskemérete és pórusmérete, az állófázisok szabályozott szintézise, ​​valamint az összetett oszloptöltőanyagok. A magas elválasztási hatékonyság mellett ennek az állófázisnak egy másik előnye az alacsony oszlop-ellennyomás nagy áramlási sebességeknél. A PMP oszlopok kiválóan reprodukálhatók, és felhasználhatók peptidkeverékek elemzésére és különféle fehérjék triptikus emésztésére. Ezt az oszlopot természetes termékekből, gyógynövénykivonatokból és gombákból származó bioaktív vegyületek folyadékkromatográfiás elválasztására tervezzük használni. A jövőben a PMP oszlopokat fehérjék és monoklonális antitestek elválasztására is értékeljük.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. és Petersson, P. Fordított fázisú kromatográfiás peptidelválasztó rendszerek vizsgálata I. rész: Protokoll kidolgozása az oszlop jellemzésére. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. és Petersson, P. Fordított fázisú kromatográfiás peptidelválasztó rendszerek vizsgálata I. rész: Protokoll kidolgozása az oszlop jellemzésére.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. és Petersson, P. Peptidszétválasztó rendszerek vizsgálata fordított fázisú kromatográfiával, I. rész: Protokoll kidolgozása az oszlop jellemzéséhez. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. és Petersson, P. Fordított fázisú kromatográfiás peptidelválasztó rendszerek vizsgálata I. rész: Protokoll kidolgozása az oszlop jellemzőihez. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. és Petersson, P. Fordított fázisú kromatográfiás peptidelválasztó rendszerek vizsgálata I. rész: Protokoll kidolgozása az oszlop jellemzőihez.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. és Petersson, P. Peptidszétválasztó rendszerek vizsgálata fordított fázisú kromatográfiával, I. rész: Protokoll kidolgozása az oszlop jellemzéséhez.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. és munkatársai. Módszerek fertőző betegségek kezelésére szolgáló továbbfejlesztett aktív peptidek előállítására. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. és Khrestchatisky, M. Szintetikus terápiás peptidek: Tudomány és piac. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. és Khrestchatisky, M. Szintetikus terápiás peptidek: Tudomány és piac.Vliege P, Lisowski V, Martinez J és Chreschatyski M. Szintetikus terápiás peptidek: tudomány és piac.Vliege P, Lisowski V, Martinez J és Khreschatsky M. Szintetikus terápiás peptidek: tudomány és piac. Gyógyszerkutatás. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD és Shen, Y. Fejlett proteomikai folyadékkromatográfia. Xie, F., Smith, RD és Shen, Y. Fejlett proteomikai folyadékkromatográfia.Lásd F., Smith RD és Shen Yu. Fejlett proteomikai folyadékkromatográfia. Xie, F., Smith, RD és Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD és Shen, Y. Advanced protein composition 液相色谱.Lásd F., Smith RD és Shen Yu. Fejlett proteomikai folyadékkromatográfia.J. Kromatográfia. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. és munkatársai: A fejlett folyadékkromatográfia-tömegspektrometria képes kombinálni a széles körű metabolomikát és a proteomikát. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM és Salisbury, JJ Az UHPLC szerepe a gyógyszerfejlesztésben. Chesnut, SM és Salisbury, JJ Az UHPLC szerepe a gyógyszerfejlesztésben.Chesnut, SM és Salisbury, JJ Az UHPLC szerepe a gyógyszerfejlesztésben.Chesnut, SM és Salisbury, JJ Az UHPLC szerepe a gyógyszerfejlesztésben. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. és Clausen, AM Az ultra nagynyomású folyadékkromatográfia alapvető és gyakorlati szempontjai gyors elválasztáshoz. Wu, N. és Clausen, AM Az ultra nagynyomású folyadékkromatográfia alapvető és gyakorlati szempontjai gyors elválasztáshoz.Wu, N. és Clausen, AM A nagynyomású folyadékkromatográfia alapvető és gyakorlati szempontjai gyors elválasztáshoz. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面. Wu, N. és Clausen, AM Az ultra nagynyomású folyadékkromatográfia alapvető és gyakorlati szempontjai a gyors elválasztáshoz.Wu, N. és Clausen, AM A nagynyomású folyadékkromatográfia alapvető és gyakorlati szempontjai gyors elválasztáshoz.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA és Tchelitcheff, P. Az ultrateljesítményű folyadékkromatográfia alkalmazása a gyógyszerfejlesztésben. Wren, SA és Tchelitcheff, P. Az ultrateljesítményű folyadékkromatográfia alkalmazása a gyógyszerfejlesztésben.Ren, SA és Chelischeff, P. Az ultra nagy teljesítményű folyadékkromatográfia alkalmazása a gyógyszerfejlesztésben. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用. Wren, SA és Tchelitcheff, P.Ren, SA és Chelischeff, P. Az ultrateljesítményű folyadékkromatográfia alkalmazása a gyógyszerfejlesztésben.J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. és munkatársai. Monolitikus makroporózus hidrogél, amely olaj-a-vízben emulzióból származik, magas belső fázissal az enterovírus 71 hatékony tisztítására. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. és Wilkins, JA A folyadékkromatográfia szerepe a proteomikában. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. és Wilkins, JA A folyadékkromatográfia szerepe a proteomikában.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. és Wilkins, JA A folyadékkromatográfia szerepe a proteomikában. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. és Wilkins, JA A folyadékkromatográfia szerepe a proteomikában.J. Kromatográfia. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Új trendek a terápiás peptidek és fehérjék fordított fázisú folyadékkromatográfiás elválasztásában: Elmélet és alkalmazások. & Guillarme, D. Új trendek a terápiás peptidek és fehérjék fordított fázisú folyadékkromatográfiás elválasztásában: Elmélet és alkalmazások. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хромофа фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Új trendek a terápiás peptidek és fehérjék fordított fázisú folyadékkromatográfiával történő elválasztásában: elmélet és alkalmazások. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.és Guillarmé, D. Új trendek a terápiás peptidek és fehérjék fordított fázisú folyadékkromatográfiával történő elválasztásában: elmélet és alkalmazások.J. Pharm. Biomedical Science. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE és Gebler, JC Peptidek kétdimenziós szétválasztása RP-RP-HPLC rendszerrel, eltérő pH-val az első és a második elválasztási dimenzióban. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE és Gebler, JC Peptidek kétdimenziós szétválasztása RP-RP-HPLC rendszerrel, eltérő pH-val az első és a második elválasztási dimenzióban.Gilar M., Olivova P., Dali AE és Gebler JK Peptidek kétdimenziós szétválasztása RP-RP-HPLC rendszerrel, eltérő pH-értékekkel az első és a második elválasztási dimenzióban.Gilar M., Olivova P., Dali AE és Gebler JK Peptidek kétdimenziós szétválasztása különböző pH-értékek alkalmazásával az első és a második elválasztási dimenzióban RP-RP-HPLC rendszerrel. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. és munkatársai. Teljesen porózus és felületileg porózus, 2 µm-nél kisebb C18 részecskékkel töltött nagy teljesítményű kromatográfiás oszlopok tömegátviteli és kinetikai jellemzőinek vizsgálata. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. A növényi bioaktív peptidek izolálásában, azonosításában és validálásában tapasztalható legújabb trendek és analitikai kihívások. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Az élet birodalmának proteomikai tájképe. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. és munkatársai. Terápiás peptidek utókezelése preparatív folyadékkromatográfiával. Molecules (Bázel, Svájc) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. és Geng, X. Vegyes módú kromatográfia és alkalmazásai biopolimerekre. Yang, Y. és Geng, X. Vegyes módú kromatográfia és alkalmazásai biopolimerekre.Yang, Yu. és Geng, X. Vegyes módú kromatográfia és alkalmazása biopolimerekre. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Yang, Y. és Geng, X. Vegyes módú kromatográfia és alkalmazása biopolimerekben.Yang, Yu. és Gene, X. Vegyes módú kromatográfia és alkalmazása biopolimereken.J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).