Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz cheklangan CSS qo'llab-quvvatlashiga ega brauzer versiyasidan foydalanmoqdasiz. Eng yaxshi tajriba uchun sizga yangilangan brauzerdan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Bundan tashqari, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz va JavaScriptsiz ko'rsatamiz.
Bir vaqtning o'zida uchta slayddan iborat karuselini ko'rsatadi. Bir vaqtning o'zida uchta slayd bo'ylab harakatlanish uchun "Oldingi" va "Keyingi" tugmalaridan foydalaning yoki bir vaqtning o'zida uchta slayd bo'ylab harakatlanish uchun oxiridagi slayder tugmalaridan foydalaning.
Keng g'ovakli zarrachalarni olish uchun g'ovakli kremniy zarrachalari sol-gel usuli bilan ba'zi modifikatsiyalar bilan tayyorlandi. Bu zarrachalar N-fenilmaleimid interkalatsiyalangan poliamidlarni ishlab chiqarish uchun teskari zanjirli uzatish-fragmentatsiya (RAFT) polimerizatsiyasi orqali N-fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat (PMI) va stirol bilan hosil qilindi. Stirol (PMP) statsionar fazasi. Tor teshikli zanglamaydigan po'lat ustunlar (ichki diametri 100 × 1,8 mm) suspenziyali o'ram bilan o'ralgan. PMP ustunining xromatografik ko'rsatkichlari beshta peptiddan (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminokislotasi enkefalin) va inson zardobidagi albuminning (HAS) triptik gidrolizatidan iborat sintetik peptidlar aralashmasini ajratish uchun baholandi. Optimal elyutatsiya sharoitida peptidlar aralashmasi qo'shilgan plitalarning nazariy soni 280 000 plastinka/kvadrat metrga yetdi. Ishlab chiqilgan ustunning ajratish samaradorligini tijorat Ascentis Express RP-Amide ustuni bilan taqqoslaganda, PMP ustunining ajratish samaradorligi ajratish samaradorligi va aniqligi jihatidan tijorat ustunidan ustun ekanligi kuzatildi.
Biofarmatsevtika sanoati so'nggi yillarda bozor ulushi sezilarli darajada oshgan holda kengayib borayotgan global bozorga aylandi. Biofarmatsevtika sanoatining portlovchi o'sishi bilan1,2,3 peptid va oqsil tahliliga katta ehtiyoj mavjud. Maqsadli peptiddan tashqari, peptid sintezi paytida turli xil aralashmalar hosil bo'ladi, shuning uchun peptidning kerakli sofligini olish uchun xromatografik tozalash talab etiladi. Tana suyuqliklari, to'qimalari va hujayralaridagi oqsillarni tahlil qilish va tavsiflash bitta namunada mavjud bo'lgan ko'p sonli potentsial aniqlanadigan turlar tufayli juda qiyin vazifadir. Mass-spektrometriya peptidlar va oqsillarni ketma-ketlashtirish uchun samarali vosita bo'lsa-da, agar bunday namunalar to'g'ridan-to'g'ri mass-spektrometrga kiritilsa, ajratish qoniqarsiz bo'ladi. Bu muammoni MS tahlilidan oldin suyuq xromatografiya (LX) o'tkazish orqali hal qilish mumkin, bu ma'lum bir vaqtda mass-spektrometrga kiradigan analitlar miqdorini kamaytiradi4,5,6. Bundan tashqari, analitlar suyuq fazani ajratish paytida tor sohada to'planishi mumkin, shu bilan bu analitlarni to'playdi va MSni aniqlash sezgirligini oshiradi. Suyuq xromatografiya (SX) so'nggi o'n yillikda sezilarli darajada rivojlandi va proteomik tahlil uchun keng qo'llaniladigan usulga aylandi7,8,9,10.
Teskari fazali suyuqlik xromatografiyasi (RP-LC) statsionar faza sifatida oktadetsil-modifikatsiyalangan kremniy (ODS) yordamida peptidlar aralashmalarini tozalash va ajratish uchun keng qo'llaniladi11,12,13. Biroq, ularning murakkab tuzilishi va amfoter tabiati tufayli14,15 RP statsionar fazalari peptidlar va oqsillarni qoniqarli ajratishni ta'minlay olmaydi. Shuning uchun, qutbli va qutbsiz fragmentlarga ega peptidlar va oqsillarni tahlil qilish ushbu analitlar bilan o'zaro ta'sir qilish va ularni saqlab qolish uchun maxsus ishlab chiqilgan statsionar fazalarni talab qiladi16. Multimodal o'zaro ta'sirlarni taklif qiluvchi aralash xromatografiya peptidlar, oqsillar va boshqa murakkab aralashmalarni ajratish uchun RP-LC ga alternativa bo'lishi mumkin. Bir nechta aralash turdagi statsionar fazalar tayyorlandi va peptidlar va oqsillarni ajratish uchun ushbu statsionar fazalar bilan to'ldirilgan ustunlar ishlatildi17,18,19,20,21. Qutb va qutbsiz guruhlarning mavjudligi sababli, aralash rejimdagi statsionar fazalar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, qutb interkalatsiyasi/RPLC) peptidlar va oqsillarni ajratish uchun mos keladi22,23,24,25,26,27,28. , kovalent bog'langan qutb guruhlariga ega qutb interkalatsiyalangan statsionar fazalar qutb va qutbsiz analitlar uchun yaxshi ajratish imkoniyatlarini va noyob selektivlikni ko'rsatadi, chunki ajratish analit va statsionar faza o'rtasidagi o'zaro ta'sirga bog'liq. Multimodal o'zaro ta'sirlar 29,30,31,32. Yaqinda Zhang va boshqalar 30 poliaminlarning behenil bilan tugagan statsionar fazalarini olishdi va uglevodorodlar, antidepressantlar, flavonoidlar, nukleozidlar, estrogenlar va boshqa ba'zi analitlarni muvaffaqiyatli ajratishdi. Qutbga o'rnatilgan statsionar material ham qutb, ham qutbsiz guruhlarga ega, shuning uchun u peptidlar va oqsillarni gidrofob va gidrofil qismlarga ajratish uchun ishlatilishi mumkin. Qutb ichidagi ustunlar (masalan, amid ichidagi C18 ustunlari) Ascentis Express RP-Amide ustunlari savdo nomi ostida mavjud, ammo bu ustunlar faqat 33-aminni tahlil qilish uchun ishlatilgan.
Joriy tadqiqotda qutbli joylashtirish statsionar fazasi (N-fenilmaleimid, joylashtirish polistiroli) tayyorlandi va peptid ajratish va triptik HSA parchalanishi uchun baholandi. Statsionar fazani tayyorlash uchun quyidagi strategiya qo'llanildi. G'ovakli kremniy zarralari avvalgi nashrlarimizda tasvirlangan protseduralarga muvofiq tayyorlandi, tayyorlash sxemalarida 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ba'zi o'zgarishlar kiritildi. Katta g'ovak o'lchamlariga ega kremniy zarralarini olish uchun karbamid, polietilen glikol (PEG), TMOS va suvli-sirka kislotasining nisbatlari sozlandi. Ikkinchidan, yangi fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat ligandi sintez qilindi va uning hosilasidan olingan kremniy zarralari qutbli joylashtirish statsionar fazalarini tayyorlash uchun ishlatildi. Olingan statsionar faza optimallashtirilgan qadoqlash sxemasiga muvofiq zanglamaydigan po'latdan yasalgan ustunga (ichki diametri 100 × 1,8 mm) qadoqlandi. Ustunni qadoqlash mexanik tebranish orqali ustun ichida bir xil qatlamni ta'minlashga yordam beradi. Qadoqlangan ustun beshta peptiddan (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leysin-enkefalin peptidi) va inson zardobidagi albumin (HSA) ning triptik gidrolizatlaridan iborat peptidlar aralashmasini ajratish uchun baholandi. Peptid aralashmasi va HSA triptik hazmi yaxshi aniqlik va samaradorlik bilan ajralib chiqqanligi kuzatildi. PMP ustunining ajratish samaradorligi Ascentis Express RP-Amide ustunining ajratish samaradorligi bilan taqqoslandi. Peptidlar va oqsillar PMP ustunida yaxshi aniqlik va yuqori ajratish samaradorligiga ega ekanligi va PMP ustunining ajratish samaradorligi Ascentis Express RP-Amide ustuninikidan yuqori ekanligi kuzatildi.
PEG (polietilen glikol), karbamid, sirka kislotasi, trimetoksiorthosilikat (TMOS), trimetilxlorosilan (TMCS), tripsin, inson zardobidagi albumin (HSA), ammoniy xlorid, karbamid, geksametilmetakriloyldisilazan (HMDS), metakriloil xlorid (MC), stirol, 4-gidroksi-TEMPO, benzoil peroksid (BPO), HPLC uchun asetonitril (ACN), metanol, 2-propanol va aseton. Sigma-Aldrich kompaniyasi (Sent-Luis, Missuri, AQSh).
Karbamid (8 g), polietilen glikol (8 g) va 8 ml 0,01 N sirka kislotasi aralashmasi 10 daqiqa davomida aralashtirildi va muzlatgichda 24 ml TMOS qo'shildi. Reaksiya aralashmasi zanglamaydigan po'latdan yasalgan avtoklavda 40°C da 6 soat, keyin esa 120°C da 8 soat davomida qizdirildi. Suv süzüldü va qoldiq 70°C da 12 soat davomida quritildi. Quritilgan yumshoq bloklar silliq maydalandi va 550°C da pechda 12 soat davomida kaltsiylandi. Zarrachalar o'lchamlari, g'ovak o'lchami va sirt maydonining takrorlanuvchanligini tekshirish uchun uchta partiya tayyorlandi va tavsiflandi.
Polistirol zanjirlari uchun qutb guruhi va statsionar faza. Tayyorlash jarayoni quyida tavsiflangan.
N-fenilmaleimid (200 mg) va metil vinil izosiyanat (100 mg) suvsiz toluolda eritildi, so'ngra fenilmaleimid va metil vinil izosiyanat (PMCP) kopolimeri olish uchun reaksiya kolbasiga 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitril (AIBN) qo'shildi. ) Aralashma 60°C da 3 soat davomida qizdirildi, filtrlandi va 40°C da 3 soat davomida pechda quritildi.
Quritilgan kremniy zarralari (2 g) quruq toluolda (100 ml) eritib, aralashtirildi va 500 ml li dumaloq tubli kolbada 10 daqiqa davomida ultratovush bilan ishlandi. PMCP (10 mg) toluolda eritildi va qo'shimcha voronka orqali reaksiya kolbasiga tomchilab qo'shildi. Aralashma 100°C da 8 soat davomida qayta lyuks qilindi, filtrlandi, aseton bilan yuvildi va 60°C da 3 soat davomida quritildi. Keyin PMCP (100 g) bilan bog'liq kremniy zarralari toluolda (200 ml) eritildi va unga katalizator sifatida 100 mkl dibutiltin dilaurat ishtirokida 4-gidroksi-TEMPO (2 ml) qo'shildi. Aralashma 50°C da 8 soat davomida aralashtirildi, filtrlandi va 50°C da 3 soat davomida quritildi.
Stirol (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) va TEMPO-PMCP (1,5 g) ga biriktirilgan kremniy zarralari toluolda eritilgan va azot bilan purkalgan. Stirolning polimerizatsiyasi 100°C da 12 soat davomida amalga oshirildi. Olingan mahsulot metanol bilan yuvildi va 60°C da bir kechada quritildi. Reaksiyaning umumiy sxemasi 1-rasmda ko'rsatilgan.
Namunalar 10–3 Torr dan kam qoldiq bosim olinmaguncha 393 K da 1 soat davomida gazsizlantirildi. Umumiy g'ovak hajmini aniqlash uchun P/P0 = 0.99 nisbiy bosimda adsorbsiyalangan N2 miqdori ishlatilgan. Sof va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining morfologiyasi skanerlash elektron mikroskopi (Hitachi High Technologies, Tokio, Yaponiya) yordamida tekshirildi. Quruq namunalar (sof kremniy va ligand bilan bog'langan kremniy zarralari) uglerod lentasi yordamida alyuminiy tayoqchalarga joylashtirildi. Q150T purkash moslamasi yordamida namunaga oltin yotqizildi va namunaga 5 nm qalinlikdagi Au qatlami yotqizildi. Bu past kuchlanishli jarayonning samaradorligini oshiradi va nozik sovuq purkashni ta'minlaydi. Elementar tahlil Thermo Electron (Waltham, MA, AQSh) Flash EA1112 elementar tarkib analizatori yordamida amalga oshirildi. Zarrachalar hajmi taqsimotini olish uchun Malvern zarrachalar hajmi analizatori (Worcestershire, Buyuk Britaniya) Mastersizer 2000 ishlatilgan. Qoplanmagan kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan kremniy zarralari (har biri 5 mg) 5 ml izopropanolda eritilgan, 10 daqiqa davomida ultratovush bilan ishlov berilgan, 5 daqiqa davomida aralashtirilgan va Mastersizer optik skameykasiga joylashtirilgan. Termogravimetrik tahlil 30 dan 800 °C gacha bo'lgan harorat oralig'ida daqiqasiga 5 °C tezlikda amalga oshiriladi.
O'lchamlari (ID 100 × 1,8 mm) bo'lgan shisha tolali astarli tor teshikli zanglamaydigan po'lat ustunlar 31-havoladagi protseduraga muvofiq shlamni to'ldirish usuli bilan qadoqlandi. Zanglamaydigan po'lat ustun (shisha bilan qoplangan, ID 100 × 1,8 mm) va 1 µm fritni o'z ichiga olgan chiqish shlamni qadoqlash mashinasiga (Alltech Deerfield, IL, AQSh) ulandi. Statsionar fazaning suspenziyasini 1,2 ml metanolda 150 mg statsionar fazani suspenziyalash va uni rezervuar ustuniga quyish orqali tayyorlang. Metanol shlam erituvchisi va nazorat erituvchisi sifatida ishlatilgan. Ustunni 10 daqiqa davomida 100 MP, 15 daqiqa davomida 80 MP va 30 daqiqa davomida 60 MP bosim ketma-ketligini qo'llash orqali qadoqlang. Qadoqlash jarayonida ustunni bir xil qadoqlashni ta'minlash uchun mexanik tebranish uchun ikkita gaz xromatografiya ustuni vibratori (Alltech, Deerfield, IL, AQSh) ishlatilgan. Ipga shikast yetkazmaslik uchun shlamni yoping va bosimni sekin tushiring. Ustun shlam shlamining nasadkasidan uzildi va uning ishlashini sinab ko'rish uchun kirish joyiga yana bir armatura ulandi va LC tizimiga ulandi.
Maxsus MLC LC nasosi (10AD Shimadzu, Yaponiya), 50 nL in'ektsiya halqasiga ega namuna oluvchi (Valco (AQSh) C14 W.05), membrana degasseri (Shimadzu DGU-14A) va UV-VIS kapillyar oynasi yordamida qurildi. Detektor qurilmasi (UV-2075) va emallangan mikrokolonna. Qo'shimcha ustun kengayishining ta'sirini minimallashtirish uchun juda tor va qisqa ulash naychalaridan foydalaning. Kolonnani to'ldirgandan so'ng, 1/16 dyuymli qaytaruvchi birikmaning chiqish joyiga kapillyar (50 µm id 365) o'rnating va qaytaruvchi birikmaning kapillyarini (50 µm) o'rnating. Ma'lumotlarni yig'ish va xromatogrammani qayta ishlash Multichro 2000 dasturi yordamida amalga oshiriladi. 254 nm da sub'ektlarning analitlarining UV yutilishini 0 da kuzatildi. Xromatografik ma'lumotlar OriginPro8 (Northampton, MA) yordamida tahlil qilindi.
Inson zardobidagi albumin, liofilizatsiyalangan kukun, ≥ 96% (agaroza gel elektroforez) 3 mg tripsin (1,5 mg), 4,0 M karbamid (1 ml) va 0,2 M ammoniy bikarbonat (1 ml) bilan aralashtiriladi. Eritma 10 daqiqa davomida aralashtiriladi va 37°C da suv hammomida 6 soat davomida saqlanadi, so'ngra 1 ml 0,1% TFA bilan sovutiladi. Eritmani filtrlang va 4°C dan past haroratda saqlang.
PMP ustunida peptidlar va triptik digest HSA aralashmasining ajratilishi alohida baholandi. PMP ustuni bilan ajratilgan peptidlar va HSA aralashmasining triptik gidrolizini tekshiring va natijalarni Ascentis Express RP-Amide ustuni bilan taqqoslang. Nazariy plitalar soni quyidagi tenglama yordamida hisoblanadi:
Sof kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining SEM tasvirlari 2-rasmda ko'rsatilgan. Sof kremniy zarralarining (A, B) SEM tasvirlari oldingi tadqiqotlarimizga nisbatan zarralar cho'zilgan yoki tartibsiz simmetriyaga ega bo'lgan sharsimon shaklni ko'rsatadi. Ligand (C, D) bilan bog'langan kremniy zarralarining yuzasi sof kremniy zarralarinikiga qaraganda silliqroq, bu kremniy zarralari yuzasini qoplagan polistirol zanjirlari bilan bog'liq bo'lishi mumkin.
Sof kremniy zarrachalarining (A, B) va ligand bilan bog'langan kremniy zarrachalarining (C, D) skanerlovchi elektron mikrograflari.
Sof kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining zarracha kattaligi taqsimoti 2-rasm, 3(A) da ko'rsatilgan. Hajmli zarracha kattaligi taqsimoti egri chiziqlari kimyoviy modifikatsiyadan so'ng kremniy zarracha kattaligi oshganligini ko'rsatdi (3A-rasm). Joriy tadqiqot va oldingi tadqiqotdan olingan kremniy zarracha kattaligi taqsimoti ma'lumotlari 1(A) jadvalda taqqoslanadi. PMP ning hajmli zarracha kattaligi d(0.5) 3.36 µm ni tashkil etdi, bu bizning oldingi tadqiqotimizdagi ad(0.5) qiymati 3.05 µm ga nisbatan (polistirol bilan bog'langan kremniy zarralari)34. Reaksiya aralashmasida PEG, karbamid, TMOS va sirka kislotasi nisbatining o'zgarishi tufayli, bu partiyaning zarracha kattaligi taqsimoti avvalgi tadqiqotimizga nisbatan torroq edi. PMP fazasining zarracha kattaligi biz ilgari o'rgangan polistirol bilan bog'langan kremniy zarrachalari fazasining zarracha kattaligidan biroz kattaroq. Bu shuni anglatadiki, stirol bilan kremniy zarrachalarining sirt funksionalizatsiyasi kremniy yuzasiga faqat polistirol qatlamini (0,97 µm) qo'ygan, PMP fazasida esa qatlam qalinligi 1,38 µm bo'lgan.
Sof kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining zarrachalar hajmi taqsimoti (A) va g'ovak hajmi taqsimoti (B).
Ushbu tadqiqotda ishlatilgan kremniy zarralarining g'ovak hajmi, g'ovak hajmi va sirt maydoni 1-jadvalda (B) ko'rsatilgan. Sof kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining PSD profillari 3(B)-rasmda ko'rsatilgan. Natijalar avvalgi tadqiqotimizga o'xshash edi34. Sof va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining g'ovak o'lchamlari mos ravishda 310 Å va 241 Å ni tashkil etdi, bu kimyoviy modifikatsiyadan so'ng g'ovak hajmi 1-jadvalda (B) ko'rsatilgandek 69 Å ga kamayganligini va siljish egri chizig'i rasmda ko'rsatilganligini ko'rsatadi. Ushbu tadqiqotda kremniy zarralarining solishtirma sirt maydoni 116 m2/g ni tashkil qiladi, bu bizning oldingi tadqiqotimizga (124 m2/g) o'xshash. 1(B)-jadvalda ko'rsatilganidek, kimyoviy modifikatsiyadan so'ng kremniy zarralarining sirt maydoni (m2/g) ham 116 m2/g dan 105 m2/g gacha kamaydi.
Statsionar fazaning elementar tahlil natijalari 2-jadvalda keltirilgan. Hozirgi statsionar fazaning uglerod miqdori 6,35% ni tashkil qiladi, bu bizning oldingi tadqiqotimizga qaraganda pastroq (polistirol bilan bog'liq kremniy zarralari mos ravishda 7,93%35 va 10,21%) 42. Hozirgi statsionar fazaning uglerod miqdori quyida keltirilgan, chunki SP tayyorlashda stirolga qo'shimcha ravishda fenilmaleimid metil vinil izosiyanat (PCMP) va 4-gidroksi-TEMPO kabi ba'zi qutbli ligandlar ishlatilgan. Hozirgi statsionar fazadagi azotning og'irlik foizi oldingi tadqiqotlardagi 0,1735 va 0,85% ga nisbatan 2,21% ni tashkil qiladi42. Bu shuni anglatadiki, hozirgi statsionar fazada fenilmaleimid tufayli azotning yuqori og'irlik foizi mavjud. Xuddi shunday, (4) va (5) mahsulotlarda uglerod miqdori mos ravishda 2,7% va 2,9% ni tashkil qiladi, yakuniy mahsulotda (6) esa 2-jadvalda ko'rsatilganidek, 6,35% uglerod miqdoriga ega. Vazn yo'qotishni tekshirish uchun PMP ning statsionar fazasida termogravimetrik tahlil (TGA) qo'llanildi va TGA egri chizig'i 4-rasmda ko'rsatilgan. TGA egri chizig'i 8,6% vazn yo'qotishini ko'rsatadi, bu uglerod miqdori (6,35%) bilan yaxshi mos keladi, chunki ligandlar nafaqat C, balki N, O va H ni ham o'z ichiga oladi.
Ligand fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat kremniy zarralari yuzasini o'zgartirish uchun tanlangan, chunki uning qutbli fenilmaleimid va vinilizosiyanat guruhlari mavjud. Vinil izosiyanat guruhlari stirol bilan jonli radikal polimerizatsiya orqali reaksiyaga kirishishi mumkin. Ikkinchi sabab, analit bilan o'rtacha o'zaro ta'sirga ega bo'lgan va analit va statsionar faza o'rtasida kuchli elektrostatik o'zaro ta'sirga ega bo'lmagan guruhni kiritishdir, chunki fenilmaleimid qismi normal pH da virtual zaryadga ega emas. Statsionar fazaning qutblanishini optimal stirol miqdori va erkin radikal polimerizatsiya reaksiya vaqti bilan boshqarish mumkin. Reaksiyaning oxirgi bosqichi (erkin radikal polimerizatsiya) juda muhim, chunki u statsionar fazaning qutblanishini o'zgartiradi. Ushbu statsionar fazalardagi uglerod miqdorini tekshirish uchun elementar tahlil o'tkazildi. Stirol miqdori va reaksiya vaqtining ko'payishi statsionar fazaning uglerod miqdorini oshirishi va aksincha kuzatildi. Stirolning turli konsentratsiyalari bilan tayyorlangan SPlar turli xil uglerod yuklariga ega. Xuddi shunday, bu statsionar fazalar zanglamaydigan po'latdan yasalgan ustunlarga joylashtirildi va ularning xromatografik xususiyatlari (selektivlik, o'lcham, N qiymati va boshqalar) tekshirildi. Ushbu tajribalar asosida, nazorat qilinadigan qutblanish va analitning yaxshi saqlanishini ta'minlash uchun PMP statsionar fazasini tayyorlash uchun optimallashtirilgan tarkib tanlandi.
PMP ustuni shuningdek, mobil fazaning sig'imidan foydalangan holda beshta peptid aralashmasini (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leysin-enkefalin) tahlil qilish uchun baholandi. 60/40 (v/v) ACN/suv (0,1% TFA) 80 µl/min oqim tezligida. Optimal elyutatsiya sharoitida (200 000 plastinka/m) har bir ustun uchun nazariy plitalar soni (N) (100 × 1,8 mm) 20 000 ± 100 ni tashkil qiladi. Uchta PMP ustuni uchun N qiymatlari 3-jadvalda va xromatogrammalar 5A-rasmda ko'rsatilgan. PMP ustunida yuqori oqim tezligida (700 µl/min) tezkor tahlil, bir daqiqa ichida beshta peptid elusiya qilindi, har bir ustun uchun 13 500 ± 330 N qiymati (diametri 100 x 1,8 mm), bu 135 000 plastinka/m ga teng (5B-rasm). Qayta ishlab chiqarishni sinab ko'rish uchun bir xil o'lchamdagi uchta ustun (ichki diametri 100 x 1,8 mm) PMP statsionar fazasining uch xil partiyasi bilan to'ldirildi. Har bir ustun uchun optimal elusiya sharoitlari, nazariy plitalar soni N va saqlash vaqtidan foydalangan holda har bir ustunda bir xil sinov aralashmasini ajratish orqali analitiklar qayd etildi. PMP ustunlari uchun takrorlanuvchanlik ma'lumotlari 4-jadvalda keltirilgan. PMP ustunining takrorlanuvchanligi 3-jadvalda ko'rsatilganidek, juda past %RSD qiymatlari bilan yaxshi bog'liq edi.
PMP ustunida (B) va Ascentis Express RP-Amide ustunida (A) peptid aralashmalarini ajratish, mobil faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP ustunining o'lchamlari (100 x 1.8 mm id), tahlil. Birikmalarning elyutsiyasi tartibi: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) va 5 (leykin kislota enkefalin).
PMP ustuni (ichki diametri 100 x 1,8 mm) inson zardobidagi albuminning triptik gidrolizatini HPLC yordamida ajratish uchun baholandi. 6-rasmdagi xromatogramma namunalar juda yaxshi aniqlik bilan yaxshi ajratilganligini ko'rsatadi. HSA eritmalari 100 mkl/min oqim tezligi, 70/30 asetonitril/suvning harakatlanuvchi fazasi va 0,1% TFA yordamida tahlil qilindi. HSA ning parchalanishi xromatogrammada ko'rsatilganidek (6-rasm) 17 ta peptidga mos keladigan 17 ta cho'qqiga bo'lingan. HSA gidrolizatidan individual cho'qqilarni ajratish samaradorligi hisoblab chiqildi va qiymatlar 5-jadvalda ko'rsatilgan.
HSA triptik gidrolizatlari PMP ustunida (ichki diametri 100 x 1,8 mm), oqim tezligi (100 mkl/min), harakatlanuvchi faza 60/40 asetonitril/suv va 0,1% TFAda ajratildi.
bu yerda L - ustun uzunligi, η - harakatlanuvchi fazaning yopishqoqligi, ΔP - ustunning teskari bosimi va u - harakatlanuvchi fazaning chiziqli tezligi. PMP ustunining o'tkazuvchanligi 2,5 × 10–14 m2, oqim tezligi 25 µl/min, 60/40 v/v ishlatilgan. ACN/suv. PMP ustunining o'tkazuvchanligi (ID 100 × 1,8 mm) avvalgi 34-havola tadqiqotimizga o'xshash edi. Yuzaki g'ovakli zarrachalar bilan to'ldirilgan ustunning o'tkazuvchanligi 1,7 × 10 0,6 µm, 5 µm zarrachalar uchun 2,5 × 10-14 m2 ni tashkil qiladi43. Shuning uchun, PMP fazasining o'tkazuvchanligi 5 µm o'lchamdagi yadro-qobiq zarrachalarining o'tkazuvchanligiga o'xshaydi.
bu yerda Wx - xloroform bilan to'ldirilgan ustunning massasi, Wy - metanol bilan to'ldirilgan ustunning massasi va ρ - erituvchining zichligi. Metanol (ρ = 0.7866) va xloroform (ρ = 1.484) zichligi. Silika-C18 zarrachalar ustunining (100 × 1.8 mm ID)34 va biz ilgari o'rgangan C18-karbamid31 ustunining umumiy g'ovakliligi mos ravishda 0.63 va 0.55 ni tashkil etdi. Bu shuni anglatadiki, karbamid ligandlarining mavjudligi statsionar fazaning o'tkazuvchanligini pasaytiradi. Boshqa tomondan, PMP ustunining (ichki diametri 100 × 1.8 mm) umumiy g'ovakliligi 0.60 ga teng. PMP ustunlari C18 bilan bog'langan silika zarralari bilan to'ldirilgan ustunlarga qaraganda kamroq o'tkazuvchan, chunki C18 tipidagi statsionar fazalarda C18 ligandlari silika zarralariga chiziqli zanjirlar shaklida biriktirilgan, polistirol tipidagi statsionar fazalarda esa zarrachalar atrofida nisbatan qalin polimer hosil bo'ladi. A qatlami. Odatdagi tajribada ustun g'ovakliligi quyidagicha hisoblanadi:
7A va B-rasmlarda PMP ustuni (id 100 x 1,8 mm) va Ascentis Express RP-Amide ustuni (id 100 x 1,8 mm) uchun bir xil elyutsiya sharoitida, ikkala ustunda ham 60/40 ACN/H2O va 0,1% TFA 20 µl/min dan 800 µl/min gacha bo'lgan Van Deemter grafiklari ko'rsatilgan. Optimal oqim tezligida (80 µl/min) minimal HETP qiymatlari PMP ustuni va Ascentis Express RP-Amide ustuni uchun mos ravishda 2,6 µm va 3,9 µm ni tashkil etdi. HETP qiymatlari shuni ko'rsatadiki, PMP ustunining (100 x 1,8 mm id) ajratish samaradorligi tijoratda mavjud bo'lgan Ascentis Express RP-Amide ustuninikidan (100 x 1,8 mm id) ancha yuqori. 7(A)-rasmdagi van Deemter grafigi shuni ko'rsatadiki, N qiymatining pasayishi avvalgi tadqiqotimizga nisbatan oqimning oshishi bilan sezilarli darajada yuqori emas. Ascentis Express RP-Amide ustuniga nisbatan PMP ustunining yuqori ajratish samaradorligi (id 100 × 1,8 mm) zarrachalar shakli va o'lchamining yaxshilanishiga hamda joriy ishda qo'llanilgan murakkab ustunni qadoqlash protsedurasiga asoslangan34.
(A) 0,1% TFA bilan 60/40 ACN/H2O da PMP ustunida (id 100 x 1,8 mm) olingan Van Deemter grafigi (HETP va mobil faza chiziqli tezligi). (B) 0,1% TFA bilan 60/40 ACN/H2O da Ascentis Express RP-Amide ustunida (id 100 x 1,8 mm) olingan Van Deemter grafigi (HETP va mobil faza chiziqli tezligi).
Yuqori samarali suyuq xromatografiyada sintetik peptidlar va inson zardobi albuminining (HSA) triptik gidrolizati aralashmasini ajratish uchun interkalatsiyalangan polistirolning qutbli statsionar fazasi tayyorlandi va baholandi. Peptid aralashmalari uchun PMP ustunlarining xromatografik ko'rsatkichlari ajratish samaradorligi va aniqligi jihatidan juda yaxshi. PMP ustunlarining ajratish samaradorligining yaxshilanishi bir qancha sabablarga, masalan, kremniy zarrachalari hajmi va g'ovak hajmi, statsionar fazalarning boshqariladigan sintezi va murakkab ustun qadoqlash materiallari bilan bog'liq. Yuqori ajratish samaradorligidan tashqari, ushbu statsionar fazaning yana bir afzalligi yuqori oqim tezligida ustunning past orqa bosimidir. PMP ustunlari yuqori darajada takrorlanadi va peptidlar aralashmalarini tahlil qilish va turli oqsillarning triptik hazm bo'lishini tahlil qilish uchun ishlatilishi mumkin. Biz ushbu ustundan suyuq xromatografiyada tabiiy mahsulotlardan, dorivor o'simliklar ekstraktlari va qo'ziqorinlardan bioaktiv birikmalarni ajratish uchun foydalanishni rejalashtirmoqdamiz. Kelajakda PMP ustunlari oqsillarni ajratish va monoklonal antikorlar uchun ham baholanadi.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Teskari fazali xromatografiya peptid ajratish tizimlarini o'rganish I qism: Ustunlarni tavsiflash protokolini ishlab chiqish. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Teskari fazali xromatografiya peptid ajratish tizimlarini o'rganish I qism: Ustunlarni tavsiflash protokolini ishlab chiqish.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., va Petersson, P. Peptid ajratish tizimlarini teskari fazali xromatografiya yordamida o'rganish, I qism: Ustun xarakteristikasi uchun protokol ishlab chiqish. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Teskari fazali xromatografiya peptid ajratish tizimlarini o'rganish I qism: Ustun xususiyatlari uchun protokol ishlab chiqish. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Teskari fazali xromatografiya peptid ajratish tizimlarini o'rganish I qism: Ustun xususiyatlari uchun protokol ishlab chiqish.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., va Petersson, P. Peptid ajratish tizimlarini teskari fazali xromatografiya yordamida o'rganish, I qism: Ustun xarakteristikasi uchun protokol ishlab chiqish.1603， 113-129 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. va boshqalar. Yuqumli kasalliklarni davolash uchun takomillashtirilgan faol peptidlarni yaratish usullari. Biotexnologiya. Yutuqlar 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetik terapevtik peptidlar: Fan va bozor. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetik terapevtik peptidlar: Fan va bozor.Vliege P, Lisowski V, Martinez J va Chreschatyski M. Sintetik terapevtik peptidlar: fan va bozor.Vliege P, Lisowski V, Martinez J va Khreschatsky M. Sintetik terapevtik peptidlar: fan va bozor. Dori vositalarini kashf etish. Bugun 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kengaytirilgan proteomik suyuqlik xromatografiyasi. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kengaytirilgan proteomik suyuqlik xromatografiyasi.F., Smith RD va Shen Yu ga qarang. Kengaytirilgan proteomik suyuqlik xromatografiyasi. Xie, F., Smit, RD va Shen, Y. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kengaytirilgan protein tarkibiF., Smith RD va Shen Yu ga qarang. Kengaytirilgan proteomik suyuqlik xromatografiyasi.J. Xromatografiya. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. va boshqalar. Ilg'or suyuq xromatografiya-massa spektrometriyasi keng ko'lamli metabolomika va proteomikani birlashtirishga qodir. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM va Salisbury, JJ UHPLC ning farmatsevtika rivojlanishidagi roli. Chesnut, SM va Salisbury, JJ UHPLC ning farmatsevtika rivojlanishidagi roli.Chesnut, SM va Salisbury, JJ UHPLC ning farmatsevtika rivojlanishidagi roli.Chesnut, SM va Salisbury, JJ Dori vositalarini ishlab chiqishda UHPLC ning roli. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Tez ajratish uchun ultra yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasining asosiy va amaliy jihatlari. Wu, N. & Clausen, AM Tez ajratish uchun ultra yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasining asosiy va amaliy jihatlari.Wu, N. va Clausen, AM Tez ajratish uchun yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasining asosiy va amaliy jihatlari. Vu, N. va Klausen, AM Wu, N. & Clausen, AM Tez ajratish uchun ultra yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasining asosiy va amaliy jihatlari.Wu, N. va Clausen, AM Tez ajratish uchun yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasining asosiy va amaliy jihatlari.J. Sentyabr. Fan. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Farmatsevtika ishlab chiqishda ultra samarali suyuqlik xromatografiyasidan foydalanish. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Farmatsevtika ishlab chiqishda ultra samarali suyuqlik xromatografiyasidan foydalanish.Ren, SA va Chelisheff, P. Farmatsevtika ishlab chiqishda ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasidan foydalanish. Wren, SA & Tchelicheff, P. língíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngín. Wren, SA va Tchelitcheff, P.Ren, SA va Chelisheff, P. Dori vositalarini ishlab chiqishda ultra samarali suyuqlik xromatografiyasini qo'llash.J. Xromatografiya. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. va boshqalar. Enterovirus 71 ni samarali tozalash uchun yuqori ichki fazaga ega suvdagi moy emulsiyasidan olingan monolit makrogözenekli gidrogel. Kimyoviy loyiha. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. & Wilkins, JA Proteomikada suyuq xromatografiyaning roli. Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. & Wilkins, JA Proteomikada suyuq xromatografiyaning roli.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. va Wilkins, JA Proteomikada suyuq xromatografiyaning roli. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. va Wilkins, JA Proteomikada suyuq xromatografiyaning roli.J. Xromatografiya. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlar va oqsillarni teskari fazali suyuqlik xromatografik ajratishdagi yangi tendentsiyalar: Nazariya va qo'llanilishi. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlar va oqsillarni teskari fazali suyuqlik xromatografik ajratishdagi yangi tendentsiyalar: Nazariya va qo'llanilishi. & Guillarme, D. Novye tendentsii v razdelenii terapevticheskix peptidov va belkov s pomoshchyu jidkostnoy xromatografii obrashchennoy fazoy: nazariya va prilojeniya. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlar va oqsillarni teskari fazali suyuqlik xromatografiyasi yordamida ajratishning yangi tendentsiyalari: nazariya va qo'llanilishi. & Guillarme, D. língííííííííííííííííííííííííííííníngíngíngíngíngíníngíngíngíngíngíngíngíngíngínėngíngėngėngėngėngėngčičnė va Gilarme, D.va Guillarmé, D. Terapevtik peptidlar va oqsillarni teskari fazali suyuqlik xromatografiyasi orqali ajratishning yangi tendentsiyalari: nazariya va qo'llanilishi.J. Pharm. Biotibbiyot fanlari. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Birinchi va ikkinchi ajratish o'lchamlarida turli pH qiymatlariga ega RP-RP-HPLC tizimidan foydalangan holda peptidlarni ikki o'lchovli ajratish. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Birinchi va ikkinchi ajratish o'lchamlarida turli pH qiymatlariga ega RP-RP-HPLC tizimidan foydalangan holda peptidlarni ikki o'lchovli ajratish.Gilar M., Olivova P., Dali AE va Gebler JK Birinchi va ikkinchi ajratish o'lchamlarida turli pH qiymatlariga ega RP-RP-HPLC tizimidan foydalangan holda peptidlarni ikki o'lchovli ajratish.Gilar M., Olivova P., Dali AE va Gebler JK RP-RP-HPLC tizimidan foydalangan holda birinchi va ikkinchi ajratish o'lchamlarida turli pH qiymatlaridan foydalangan holda peptidlarni ikki o'lchovli ajratish. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. va boshqalar. 2 µm dan kichikroq to'liq g'ovakli va yuzaki g'ovakli C18 zarralari bilan to'ldirilgan yuqori samarali xromatografiya ustunlarining massa uzatish va kinetik xususiyatlarini o'rganish. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. va boshqalar. O'simlik bioaktiv peptidlarini ajratish, identifikatsiyalash va tasdiqlashdagi so'nggi tendentsiyalar va analitik muammolar. anus. Anal jonzot. Kimyoviy. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB va boshqalar. Hayot saltanatining proteomik manzarasi. Tabiat 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. va boshqalar. Terapevtik peptidlarni preparativ suyuqlik xromatografiyasi yordamida davolashdan keyingi davolash. Molecules (Bazel, Shveytsariya) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. va Geng, X. Aralash rejimli xromatografiya va uning biopolimerlarga qo'llanilishi. Yang, Y. va Geng, X. Aralash rejimli xromatografiya va uning biopolimerlarga qo'llanilishi.Yang, Yu. va Geng, X. Aralash rejimli xromatografiya va uni biopolimerlarga qo'llash. Yang, Y. va Geng, X. língíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíng. Yang, Y. va Geng, X. Aralash rejimli xromatografiya va uning biopolimerlarda qo'llanilishi.Yang, Yu. va Gene, X. Aralash rejimli xromatografiya va uning biopolimerlarga qo'llanilishi.J. Xromatografiya. A 1218(49), 8813–8825 (2011).