Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydigan brauzer versiyasidan foydalanmoqdasiz. Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying). Bundan tashqari, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptlarsiz ko'rsatamiz.
Bir vaqtning o'zida uchta slayddan iborat karuselni ko'rsatadi. Bir vaqtning o'zida uchta slayd bo'ylab harakatlanish uchun "Oldingi" va "Keyingi" tugmalaridan foydalaning yoki bir vaqtning o'zida uchta slayd bo'ylab harakatlanish uchun oxiridagi slayder tugmalaridan foydalaning.
G'ovak kremniy zarralari keng gözenekli zarrachalarni olish uchun ba'zi o'zgartirishlar bilan sol-gel usuli bilan tayyorlangan. Ushbu zarralar N-fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat (PMI) va stirol bilan teskari zanjir o'tkazish-parchalanish (RAFT) polimerizatsiyasi orqali N-fenilmaleimid interkalatsiyalangan poliamidlarni hosil qilish uchun hosil qilingan. Stirol (PMP) statsionar fazasi. Tor teshikli zanglamaydigan po'latdan yasalgan ustunlar (ichki diametri 100 × 1,8 mm) atala bilan o'ralgan edi. PMP ustunining xromatografik ishlashi besh peptiddan (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminokislota enkefalinati) va triptik serum HA albuminidan tashkil topgan sintetik peptidlar aralashmasini ajratish uchun baholandi. Optimal elutsiya sharoitida peptidlar aralashmasi bo'lgan plitalarning nazariy soni 280 000 plastinka / kv.m ga yetdi. Ishlab chiqilgan ustunning ajratish ko'rsatkichlarini tijorat Ascentis Express RP-Amide ustuni bilan solishtirganda, PMP ustunining ajratish samaradorligi ajratish samaradorligi va o'lchamlari bo'yicha tijorat ustunidan ustun ekanligi kuzatildi.
Biofarmatsevtika sanoati so'nggi yillarda bozor ulushi sezilarli darajada ortib borayotgan global bozorga aylandi. Biofarmatsevtika sanoatining portlovchi o'sishi bilan1,2,3 peptid va oqsil tahliliga katta ehtiyoj bor. Peptid sintezi jarayonida maqsadli peptidga qo'shimcha ravishda turli xil aralashmalar hosil bo'ladi, shuning uchun peptidning kerakli tozaligini olish uchun xromatografik tozalash talab qilinadi. Tana suyuqliklari, to'qimalari va hujayralaridagi oqsillarni tahlil qilish va tavsiflash bitta namunada mavjud bo'lgan potentsial aniqlanishi mumkin bo'lgan turlarning ko'pligi sababli juda qiyin vazifadir. Mass-spektrometriya peptidlar va oqsillarni sekvensiyalash uchun samarali vosita bo'lsa-da, agar bunday namunalar to'g'ridan-to'g'ri massa spektrometriga kiritilsa, ajratish qoniqarsiz bo'ladi. Ushbu muammoni MS tahlilidan oldin suyuq xromatografiya (LC) o'tkazish orqali hal qilish mumkin, bu ma'lum bir vaqtda massa spektrometriga kiruvchi tahlil qiluvchi moddalar miqdorini kamaytiradi4,5,6. Bundan tashqari, suyuq fazalarni ajratish jarayonida tahlil qiluvchi moddalar tor hududda konsentratsiyalanishi mumkin, shu bilan bu tahlilchilarni konsentratsiya qiladi va MSni aniqlashning sezgirligini oshiradi. Suyuq xromatografiya (LC) so'nggi o'n yil ichida sezilarli darajada rivojlangan va proteomik tahlil uchun keng qo'llaniladigan usulga aylandi7,8,9,10.
Teskari fazali suyuqlik xromatografiyasi (RP-LC) statsionar faza sifatida oktadesil-modifikatsiyalangan silika (ODS) yordamida peptidlarning aralashmalarini tozalash va ajratish uchun keng qo'llaniladi11,12,13. Biroq, ularning murakkab tuzilishi va amfoter tabiati tufayli 14,15 RP statsionar fazalari peptidlar va oqsillarni qoniqarli ajratishni ta'minlay olmaydi. Shuning uchun, qutbli va qutbsiz bo'laklarga ega peptidlar va oqsillarni tahlil qilish, bu analitlarni o'zaro ta'sir qilish va ushlab turish uchun maxsus ishlab chiqilgan statsionar fazalarni talab qiladi16. Multimodal shovqinlarni taklif qiluvchi aralash xromatografiya peptidlar, oqsillar va boshqa murakkab aralashmalarni ajratish uchun RP-LC ga muqobil bo'lishi mumkin. Bir nechta aralash turdagi statsionar fazalar tayyorlandi va bu statsionar fazalar bilan to'ldirilgan ustunlar peptidlar va oqsillarni ajratish uchun ishlatilgan17,18,19,20,21. Polar va qutbsiz guruhlar mavjudligi sababli aralash rejimli statsionar fazalar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, qutbli interkalatsiya/RPLC) peptidlar va oqsillarni ajratish uchun mos keladi22,23,24,25,26,27,28. , Kovalent bog'langan qutbli guruhlarga ega qutbli interkalatsiyalangan statsionar fazalar qutbli va qutbsiz analitlar uchun yaxshi ajratish qobiliyatini va noyob selektivligini ko'rsatadi, chunki ajratish analit va statsionar faza o'rtasidagi o'zaro ta'sirga bog'liq Multimodal o'zaro ta'sirlar 29,30,31,32. Yaqinda Zhang va boshqalar. 30 ta poliaminlarning behenil bilan yakunlangan statsionar fazalari olindi va uglevodorodlar, antidepressantlar, flavonoidlar, nukleozidlar, estrogenlar va boshqa ba'zi analitlar muvaffaqiyatli ajratildi. Polar o'rnatilgan statsionar material ham qutbli, ham qutbsiz guruhlarga ega, shuning uchun u peptidlar va oqsillarni hidrofobik va hidrofilik qismlarga ajratish uchun ishlatilishi mumkin. Polar qatorli ustunlar (masalan, amid qatorli C18 ustunlari) Ascentis Express RP-Amide ustunlari savdo nomi ostida mavjud, ammo bu ustunlar faqat amin 33 tahlili uchun ishlatilgan.
Joriy tadqiqotda peptidlarni ajratish va triptik HSA bo'linishi uchun qutbli statsionar faza (N-fenilmaleimid, ko'milgan polistirol) tayyorlandi va baholandi. Statsionar bosqichni tayyorlash uchun quyidagi strategiyadan foydalanilgan. Gözenekli kremniy zarralari oldingi nashrlarimizda tasvirlangan protseduralar bo'yicha tayyorlangan, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 tayyorlash sxemalarida ba'zi o'zgarishlar kiritilgan. Karbamid, polietilen glikol (PEG), TMOS va suvli-sirka kislotasi nisbati katta kremniy zarrachalarini olish uchun o'rnatildi. Ikkinchidan, yangi fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat ligand sintez qilindi va uning hosil bo'lgan silika zarralari qutbga o'rnatilgan statsionar fazalarni tayyorlash uchun ishlatilgan. Olingan statsionar faza optimallashtirilgan qadoqlash sxemasiga muvofiq zanglamaydigan po'latdan yasalgan ustunga (ichki diametri 100 × 1,8 mm) qadoqlangan. Ustunning qadoqlanishi, ustun ichida bir xil qatlamni ta'minlash uchun mexanik tebranish bilan yordam beradi. Paketlangan ustun besh peptiddan (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leysin-enkefalin peptid) iborat peptidlar aralashmasini ajratish uchun baholandi. va inson sarum albuminining (HSA) triptik gidrolizatlari. Peptid aralashmasi va HSA triptik hazm qilish yaxshi aniqlik va samaradorlik bilan ajralib turishi kuzatildi. PMP ustunining ajratish samaradorligi Ascentis Express RP-Amide ustuni bilan taqqoslandi. Peptidlar va oqsillar PMP ustunida yaxshi rezolyutsiyaga va yuqori ajratish samaradorligiga ega ekanligi va PMP ustunining ajratish samaradorligi Ascentis Express RP-Amide ustunidan yuqori ekanligi kuzatildi.
PEG (polietilen glikol), karbamid, sirka kislotasi, trimetoksiortosilikat (TMOS), trimetilxlorosilan (TMCS), tripsin, inson zardobidagi albumini (HSA), ammoniy xlorid, karbamid, geksametilmetakriloildisilazan (HMDS, methlor, methyl), 4-gidroksi- TEMPO, benzoil peroksid (BPO), HPLC uchun asetonitril (ACN), metanol, 2-propanol va aseton. Sigma-Aldrich kompaniyasi (Sent-Luis, Missuri, AQSh).
Karbamid (8 g), polietilen glikol (8 g) va 8 ml 0,01 N. sirka kislotasi aralashmasi 10 daqiqa davomida aralashtiriladi va muz bilan sovutish ostida unga 24 ml TMOS qo'shiladi. Reaksiya aralashmasi zanglamaydigan po'latdan yasalgan avtoklavda 6 soat davomida 40 ° C da, keyin esa 8 soat davomida 120 ° C da isitiladi. Suv to'kib tashlangan va qoldiq 12 soat davomida 70 ° C da quritilgan. Quritilgan yumshoq bloklar silliq maydalangan va pechda 550 ° C da 12 soat davomida kaltsiylangan. Zarrachalar o'lchamlari, g'ovak o'lchamlari va sirt maydonining takrorlanishini sinash uchun uchta partiya tayyorlandi va tavsiflandi.
Polistirolli zanjirlar uchun polar guruh va statsionar faza. Tayyorgarlik jarayoni quyida tavsiflanadi.
N-fenilmaleimid (200 mg) va metil vinil izosiyanat (100 mg) suvsiz toluolda eritildi, so'ngra fenilmaleimid va metil PM isopolimerini olish uchun reaksiya kolbasiga 0,1 ml 2,2'-azoizobutironitril (AIBN) qo'shildi. ) Aralash 3 soat davomida 60 ° C da isitiladi, filtrlanadi va pechda 3 soat davomida 40 ° C da quritiladi.
Quritilgan silika zarralari (2 g) quruq toluolda (100 ml) tarqaldi, aralashtiriladi va 500 ml dumaloq pastki kolbada 10 daqiqa davomida sonikatsiya qilinadi. PMCP (10 mg) toluolda eritildi va qo'shimcha voronka orqali reaksiya kolbasiga tomchilab qo'shildi. Aralash 100 ° C da 8 soat davomida qaytarildi, filtrlanadi, aseton bilan yuviladi va 3 soat davomida 60 ° C da quritiladi. Keyin PMCP (100 g) bilan bog'langan silika zarralari toluolda (200 ml) eritildi va katalizator sifatida 100 mkl dibutiltin dilaurat ishtirokida 4-gidroksi-TEMPO (2 ml) qo'shildi. Aralash 50 ° C da 8 soat davomida aralashtiriladi, filtrlanadi va 3 soat davomida 50 ° C da quritiladi.
Stirol (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) va TEMPO-PMCP (1,5 g) ga biriktirilgan silika zarralari toluolda tarqaldi va azot bilan tozalandi. Stirolning polimerizatsiyasi 100 ° C da 12 soat davomida amalga oshirildi. Olingan mahsulot metanol bilan yuvilgan va kechasi 60 ° C da quritilgan. Reaksiyaning umumiy sxemasi rasmda ko'rsatilgan. bitta.
Namunalar 10-3 Torr dan kam qoldiq bosim olinmaguncha 1 soat davomida 393 K da gazsizlandi. P/P0 = 0,99 nisbiy bosimda adsorbsiyalangan N2 miqdori umumiy gözenek hajmini aniqlash uchun ishlatilgan. Sof va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining morfologiyasi skanerlash elektron mikroskopi (Hitachi High Technologies, Tokio, Yaponiya) yordamida o'rganildi. Quruq namunalar (sof kremniy va ligand bilan bog'langan silika zarralari) uglerod lentasi yordamida alyuminiy novdalarga joylashtirildi. Oltin namunaga Q150T purkash moslamasi yordamida yotqizildi va namunaga 5 nm qalinlikdagi Au qatlami yotqizildi. Bu past kuchlanish jarayonining samaradorligini oshiradi va nozik sovuq püskürtmeyi ta'minlaydi. Elemental tahlil Thermo Electron (Waltham, MA, AQSH) Flash EA1112 elementar tarkibi analizatori yordamida amalga oshirildi. Zarrachalar hajmini taqsimlash uchun Malvern zarracha o'lchami analizatori (Worcestershire, Buyuk Britaniya) Mastersizer 2000 ishlatilgan. Qoplanmagan kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan silika zarralari (har biri 5 mg) 5 ml izopropanolda tarqatildi, 10 daqiqa davomida sonikatsiya qilindi, 5 daqiqa davomida aralashtirildi va Mastersizer optik dastgohiga joylashtirildi. Termogravimetrik tahlil 30 dan 800 ° S gacha bo'lgan harorat oralig'ida daqiqada 5 ° C tezlikda amalga oshiriladi.
O'lchamlari (ID 100 × 1,8 mm) bo'lgan shisha tolali astarli tor teshikli zanglamas po'latdan yasalgan ustunlar 31-ma'lumotnomada bo'lgani kabi, atala bilan to'ldirish usuli bilan qadoqlangan. Zanglamas po'latdan yasalgan ustun (shisha bilan qoplangan, ID 100 × 1,8 mm) va 1 mkm fritni o'z ichiga olgan rozetka (ILA, apackaging mashinasiga ulangan. AQSh). 150 mg statsionar fazani 1,2 ml metanolda to'xtatib, uni rezervuar ustuniga berish orqali statsionar fazaning suspenziyasini tayyorlang. Metanol atala erituvchi va nazorat qiluvchi erituvchi sifatida ishlatilgan. 10 daqiqa davomida 100 MP, 15 daqiqa davomida 80 MP va 30 daqiqa davomida 60 MP bosim ketma-ketligini qo'llash orqali ustunni to'plang. Qadoqlash jarayonida bir xil ustun qadoqlanishini ta'minlash uchun mexanik tebranish uchun ikkita gazli xromatografiya ustunli vibrator (Alltech, Deerfield, IL, AQSh) ishlatilgan. Ipni shikastlamaslik uchun atala qadoqlagichni yoping va bosimni sekin bo'shating. Ustun atala ko'krakdan uzildi va uning ishlashini tekshirish uchun kirish joyiga boshqa fitting ulandi va LC tizimiga ulandi.
Maxsus MLC LC nasosi (10AD Shimadzu, Yaponiya), 50 nL inyeksiya halqali namuna oluvchi (Valco (AQSh) C14 W.05), membrana degasser (Shimadzu DGU-14A) va UV-VIS kapillyar oynasi yordamida qurilgan. Detektor qurilmasi (UV-2075) va emallangan mikrokolonka. Qo'shimcha ustun kengayishining ta'sirini kamaytirish uchun juda tor va qisqa tutashtiruvchi quvurlardan foydalaning. Ustunni to'ldirgandan so'ng, kapillyarni (50 mkm id 365) 1/16 ″ reduktsiyali birikmaning chiqishiga o'rnating va reduksiyali birikmaning kapillyarini (50 mkm) o'rnating. Ma'lumotlarni yig'ish va xromatogrammani qayta ishlash Multichro 2000 dasturi yordamida amalga oshiriladi. 254 nm da, sub'ektlarning analitiklarning UV absorbsiyasi 0 da kuzatildi. Xromatografik ma'lumotlar OriginPro8 (Northampton, MA) yordamida tahlil qilindi.
Inson zardobidagi albumin, liyofillangan kukun, ≥ 96% (agaroz gel elektroforezi) 3 mg tripsin (1,5 mg), 4,0 M karbamid (1 ml) va 0,2 M ammoniy bikarbonat (1 ml) bilan aralashtiriladi. Eritma 10 daqiqa davomida aralashtiriladi va suv hammomida 37 ° C haroratda 6 soat ushlab turiladi, so'ngra 1 ml 0,1% TFA bilan so'ndiriladi. Eritmani filtrlang va 4 ° C dan past haroratda saqlang.
PMP ustunida peptidlar va triptik hazm qilish HSA aralashmasini ajratish alohida baholandi. PMP ustuni bilan ajratilgan peptidlar va HSA aralashmasining triptik gidrolizini tekshiring va natijalarni Ascentis Express RP-Amide ustuni bilan solishtiring. Nazariy plitalar soni quyidagi tenglama yordamida hisoblanadi:
Sof kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan silika zarralarining SEM tasvirlari 2-rasmda ko'rsatilgan. Sof kremniy zarralarining (A, B) SEM tasvirlari zarrachalar cho'zilgan yoki avvalgi tadqiqotlarimizga nisbatan tartibsiz simmetriyaga ega bo'lgan sharsimon shaklni ko'rsatadi. Ligand (C, D) bilan bog'langan kremniy zarralarining yuzasi sof kremniy zarralariga qaraganda silliqroq bo'ladi, bu silika zarralari yuzasini qoplagan polistirol zanjirlari bilan bog'liq bo'lishi mumkin.
Sof kremniy zarralari (A, B) va ligand bilan bog'langan silika zarralari (C, D) ning elektron mikrografiyalarini skanerlash.
Sof kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan kremniy zarrachalarining zarracha kattaligi taqsimoti 2-rasmda ko'rsatilgan. 3(A). Volumetrik zarracha hajmi taqsimot egri silika zarracha hajmi kimyoviy modifikatsiyadan keyin oshganligini ko'rsatdi (3A-rasm). Joriy tadqiqot va oldingi tadqiqotdan olingan kremniy zarralari hajmining taqsimoti ma'lumotlari 1-jadvalda (A) solishtirilgan. PMP ning hajmli zarracha o'lchami d(0,5) 3,36 mkm, oldingi tadqiqotimizdagi 3,05 mkm bo'lgan ad(0,5) qiymatiga nisbatan (polistirol bilan bog'langan silika zarralari)34. Reaksiya aralashmasidagi PEG, karbamid, TMOS va sirka kislotasi nisbati o'zgarganligi sababli, ushbu partiyaning zarracha o'lchamlari bo'yicha taqsimoti avvalgi tadqiqotimizga nisbatan torroq edi. PMP fazasining zarracha hajmi biz ilgari o'rgangan polistirol bilan bog'langan silika zarracha fazasidan biroz kattaroqdir. Bu shuni anglatadiki, stirol bilan kremniy zarralarining sirt funktsionalizatsiyasi kremniy yuzasida faqat polistirol qatlamini (0,97 mkm) yotqizdi, PMP bosqichida qatlam qalinligi 1,38 mkm edi.
Sof kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining zarracha kattaligi taqsimoti (A) va gözenek hajmi taqsimoti (B).
Ushbu tadqiqotda ishlatiladigan kremniy zarralarining gözenek hajmi, g'ovak hajmi va sirt maydoni 1-jadvalda (B) ko'rsatilgan. Sof kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan silika zarralarining PSD profillari 2-rasmda ko'rsatilgan. 3(B). Natijalar bizning oldingi tadqiqotimiz bilan solishtirish mumkin edi34. Sof va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining g'ovak o'lchamlari mos ravishda 310 Å va 241 Å edi, bu kimyoviy modifikatsiyadan so'ng, 1-jadvalda (B) ko'rsatilganidek, g'ovak o'lchami 69 Å ga qisqarganligini ko'rsatadi va egri siljish shaklda ko'rsatilgan. Hozirgi o'rganilayotgan silika zarralarining o'ziga xos sirt maydoni 1/2 g ga teng. oldingi tadqiqotimiz bilan solishtirish mumkin (124 m2 / g). 1(B)-jadvalda ko'rsatilganidek, kimyoviy modifikatsiyadan keyin kremniy zarralarining sirt maydoni (m2/g) ham 116 m2/g dan 105 m2/g gacha kamaydi.
Statsionar fazaning elementar tahlili natijalari Jadvalda keltirilgan. 2. Hozirgi statsionar fazaning uglerod miqdori 6,35% ni tashkil etadi, bu bizning oldingi tadqiqotimizga qaraganda past (polistirol bilan bog'langan kremniy zarralari, mos ravishda 7,93%35 va 10,21%) 42. Hozirgi statsionar fazaning uglerod tarkibi, chunki ba'zi qutbli ligandlar, masalan, fenilmaleimid (metilmaleimid) MP va MP. SP ni tayyorlashda stirolga qo'shimcha ravishda 4-gidroksi-TEMPO ishlatilgan. Hozirgi statsionar fazada azotning vazn ulushi oldingi tadqiqotlardagi 0,1735 va 0,85% ga nisbatan 2,21% ni tashkil qiladi42. Bu shuni anglatadiki, hozirgi statsionar faza fenilmaleimid tufayli azotning yuqori og'irlik foiziga ega. Xuddi shunday, (4) va (5) mahsulotlarda uglerod miqdori mos ravishda 2,7% va 2,9% ni tashkil qiladi, yakuniy mahsulot (6) esa 2-jadvalda ko'rsatilganidek, uglerod miqdori 6,35% ni tashkil qiladi. Termogravimetrik tahlil (TGA) PMP ning statsionar bosqichida vazn yo'qotish uchun sinovdan o'tkazildi va TGA egri chizig'i 4-rasmda vazn yo'qotishini ko'rsatadi. 8,6%, bu uglerod miqdori (6,35%) bilan yaxshi mos keladi, chunki ligandlarda nafaqat C, balki N, O va H ham mavjud.
Ligand fenilmaleimid-metilvinil izosiyanat, uning qutbli fenilmaleimid va vinilizosiyanat guruhlari tufayli silika zarralari sirtini o'zgartirish uchun tanlangan. Vinil izosiyanat guruhlari tirik radikal polimerizatsiya orqali stirol bilan reaksiyaga kirishishi mumkin. Ikkinchi sabab, analit bilan o'rtacha darajada o'zaro ta'sirga ega bo'lgan va tahlil qiluvchi va statsionar faza o'rtasida kuchli elektrostatik o'zaro ta'sirga ega bo'lmagan guruhni kiritishdir, chunki fenilmaleimid qismi normal pHda virtual zaryadga ega emas. Statsionar fazaning polaritesini stirolning optimal miqdori va erkin radikal polimerizatsiyasining reaktsiya vaqti bilan nazorat qilish mumkin. Reaksiyaning oxirgi bosqichi (erkin radikal polimerizatsiya) juda muhim, chunki u statsionar fazaning polaritesini o'zgartiradi. Ushbu statsionar fazalardagi uglerod tarkibini tekshirish uchun elementar tahlil o'tkazildi. Stirol miqdorini va reaksiya vaqtini oshirish statsionar fazadagi uglerod miqdorini oshirishi va aksincha. Stirolning turli konsentratsiyasi bilan tayyorlangan SPlar turli xil uglerod yuklariga ega. Xuddi shunday, bu statsionar fazalar zanglamaydigan po'latdan yasalgan ustunlarga joylashtirildi va ularning xromatografik xususiyatlari (selektivlik, ruxsat, N qiymati va boshqalar) tekshirildi. Ushbu tajribalar asosida PMP statsionar fazasini tayyorlash uchun optimallashtirilgan kompozitsiya boshqariladigan polaritni va tahlil qiluvchi moddaning yaxshi saqlanishini ta'minlash uchun tanlangan.
PMP ustuni, shuningdek, mobil fazaning imkoniyatlaridan foydalangan holda peptidlarning beshta aralashmasini (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leysin-enkefalin) tahlil qilish uchun baholandi. 60/40 (v/v) ACN/suv (0,1% TFA) 80 µl/min oqim tezligida. Optimal elutsiya sharoitida (200 000 plastinka / m), har bir ustun uchun (100 × 1,8 mm) nazariy plitalar soni (N) 20 000 ± 100 ni tashkil qiladi. Uchta PMP ustuni uchun N qiymatlari 3-jadvalda va xromatogrammalar 5A-rasmda ko'rsatilgan. PMP ustunida yuqori oqim tezligida (700 µl/min) tez tahlil qilish, bir daqiqa ichida elutsiya qilingan besh peptid, har bir ustun uchun 13500 ± 330 a'lo N qiymati (diametri 100 x 1,8 mm), 135 000 plastinka/m ga teng (5B-rasm). Reproduktivlikni tekshirish uchun bir xil o'lchamdagi uchta ustun (ichki diametri 100 x 1,8 mm) PMP statsionar fazasining uch xil partiyasi bilan to'ldirildi. Optimal elutsiya sharoitlari, N nazariy plitalar soni va ushlab turish vaqti yordamida har bir ustunda bir xil sinov aralashmasini ajratish yo'li bilan har bir ustun uchun tahliliy moddalar qayd etildi. PMP ustunlari uchun takrorlanuvchanlik ma'lumotlari 4-jadvalda ko'rsatilgan. PMP ustunining takrorlanishi 3-jadvalda ko'rsatilganidek, juda past% RSD qiymatlari bilan yaxshi bog'langan.
Peptid aralashmalarini PMP ustunida (B) va Ascentis Express RP-Amid ustunida (A) ajratish, mobil faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP ustun o'lchamlari (100 x 1,8 mm id), tahlil Aralashmalarning elutsiya tartibi: 1 (Gly-Tyr), 2Tyr (Gly-Tyr), 2-G (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) va 5 (leyksin kislotasi enkefalin).
PMP ustuni (ichki diametri 100 x 1,8 mm) HPLC orqali inson sarum albuminining triptik gidrolizatini ajratish uchun baholandi. 6-rasmdagi xromatogramma namunalar juda yaxshi ruxsat bilan yaxshi ajratilganligini ko'rsatadi. HSA eritmalari 100 mkl/min oqim tezligi, 70/30 asetonitril/suv mobil fazasi va 0,1% TFA yordamida tahlil qilindi. HSA ning bo'linishi 17 peptidga mos keladigan xromatogrammada (6-rasm) ko'rsatilganidek, 17 tepalikka bo'lingan. HSA gidrolizatidan individual cho'qqilarni ajratish samaradorligi hisoblab chiqilgan va qiymatlar 5-jadvalda keltirilgan.
HSA triptik gidrolizatlari PMP ustunida (ichki diametri 100 x 1,8 mm), oqim tezligi (100 mkl / min), mobil faza 60/40 asetonitril / suv va 0,1% TFAda ajratilgan.
Bu erda L - ustun uzunligi, ē - mobil fazaning yopishqoqligi, DP - ustunning orqa bosimi va u - mobil fazaning chiziqli tezligi. PMP ustunining o'tkazuvchanligi 2,5 × 10-14 m2, oqim tezligi 25 µl / min, 60/40 v/v ishlatilgan. ACN/suv. PMP ustunining o'tkazuvchanligi (ID 100 × 1,8 mm) avvalgi Ref.34 tadqiqotimizga o'xshash edi. Yuzaki g'ovak zarrachalar bilan to'ldirilgan ustunning o'tkazuvchanligi 1,7×10,6 mkm, 5 mkm zarrachalar uchun 2,5×10-14 m2 ni tashkil qiladi43. Shuning uchun PMP fazasining o'tkazuvchanligi 5 mkm o'lchamdagi yadro-qobiq zarrachalarining o'tkazuvchanligiga o'xshaydi.
Bu yerda Wx - xloroform bilan to'ldirilgan ustunning massasi, Wy - metanol bilan to'ldirilgan ustunning massasi, r - erituvchining zichligi. Metanol (r = 0,7866) va xloroform (r = 1,484) zichligi. Silika-C18 zarracha ustunining (100 × 1,8 mm ID) 34 va bizning ilgari o'rganilgan C18-karbamid31 ustunining umumiy g'ovakliligi mos ravishda 0,63 va 0,55 edi. Bu karbamid ligandlarining mavjudligi statsionar fazaning o'tkazuvchanligini kamaytiradi. Boshqa tomondan, PMP ustunining umumiy porozligi (ichki diametri 100 × 1,8 mm) 0,60 ni tashkil qiladi. PMP ustunlari C18 bilan bog'langan silika zarralari bilan o'ralgan ustunlarga qaraganda kamroq o'tkazuvchandir, chunki C18 tipidagi statsionar fazalarda C18 ligandlari silika zarrachalariga chiziqli zanjirlarda biriktiriladi, polistirol tipidagi statsionar fazalarda esa zarrachalar atrofida nisbatan qalin polimer hosil bo'ladi. A qatlami. Odatdagi tajribada ustun g'ovakligi quyidagicha hisoblanadi:
Shaklda. 7A, B PMP ustuni (id 100 x 1,8 mm) va Ascentis Express RP-Amide ustuni (id 100 x 1,8 mm) uchun Van Deemter chizmalarini bir xil elutsiya sharoitida, 60/40 ACN/H2O va 0,1% TFA 20 µl/min dan 80 µl/min gacha ko‘rsatadi. Optimal oqim tezligida (80 µl/min) minimal HETP qiymatlari PMP ustuni va Ascentis Express RP-Amide ustuni uchun mos ravishda 2,6 mkm va 3,9 mkm edi. HETP qiymatlari PMP ustunining (100 x 1,8 mm id) ajratish samaradorligi sotuvda mavjud bo'lgan Ascentis Express RP-Amide ustuniga (100 x 1,8 mm id) qaraganda ancha yuqori ekanligini ko'rsatadi. 7(A)-rasmdagi van Deemter grafigi shuni ko'rsatadiki, N qiymatining pasayishi oldingi tadqiqotimiz bilan solishtirganda oqimning oshishi bilan sezilarli darajada yuqori emas. Ascentis Express RP-Amide ustuni bilan solishtirganda PMP ustunining (id 100 × 1,8 mm) yuqori ajratish samaradorligi zarrachalar shakli va o'lchamining yaxshilanganligi va joriy ishda qo'llaniladigan murakkab ustunlarni qadoqlash tartibiga asoslanadi34.
(A) 0,1% TFA bilan 60/40 ACN/H2O da PMP ustunida (id 100 x 1,8 mm) olingan Van Deemter grafigi (HETP va mobil fazaning chiziqli tezligi). (B) 0,1% TFA bilan 60/40 ACN/H2O da Ascentis Express RP-Amide ustunida (id 100 x 1,8 mm) olingan Van Deemter grafigi (HETP va mobil fazaning chiziqli tezligi).
Interkalatsiyalangan polistirolning qutbli statsionar fazasi yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasida sintetik peptidlar va inson sarum albuminining (HSA) triptik gidrolizat aralashmasini ajratish uchun tayyorlandi va baholandi. Peptid aralashmalari uchun PMP ustunlarining xromatografik ishlashi ajratish samaradorligi va ruxsati jihatidan juda yaxshi. PMP ustunlarining yaxshilangan ajratish samaradorligi kremniy zarralari va gözenek hajmi, statsionar fazalarning boshqariladigan sintezi va murakkab ustunli qadoqlash materiallari kabi bir necha sabablarga bog'liq. Yuqori ajratish samaradorligiga qo'shimcha ravishda, ushbu statsionar fazaning yana bir afzalligi yuqori oqim tezligida past ustunli orqa bosimdir. PMP ustunlari yuqori darajada takrorlanadi va peptidlar aralashmalarini va turli oqsillarning triptik hazm bo'lishini tahlil qilish uchun ishlatilishi mumkin. Biz ushbu ustunni suyuq xromatografiyada tabiiy mahsulotlardan, dorivor o‘simliklar ekstrakti va qo‘ziqorinlardan bioaktiv birikmalarni ajratish uchun foydalanish niyatidamiz. Kelajakda PMP ustunlari oqsillarni va monoklonal antikorlarni ajratish uchun ham baholanadi.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Teskari fazali xromatografiya peptidlarni ajratish tizimlarini tekshirish I qism: Ustunni tavsiflash uchun protokolni ishlab chiqish. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Teskari fazali xromatografiya peptidlarni ajratish tizimlarini tekshirish I qism: Ustun tavsifi uchun protokolni ishlab chiqish.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Peptid ajratish tizimlarini teskari fazali xromatografiya orqali tekshirish, I qism: Ustunni xarakterlash uchun protokolni ishlab chiqish. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Teskari fazali xromatografiya peptidlarni ajratish tizimlarini tekshirish I qism: Ustun xarakteristikalari uchun protokolni ishlab chiqish. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Teskari fazali xromatografiya peptidlarni ajratish tizimlarini tekshirish I qism: Ustun xarakteristikalari uchun protokolni ishlab chiqish.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Peptid ajratish tizimlarini teskari fazali xromatografiya orqali tekshirish, I qism: Ustunni xarakterlash uchun protokolni ishlab chiqish.1603， 113-129 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. va boshqalar. Yuqumli kasalliklarni davolash uchun takomillashtirilgan faol peptidlarni yaratish usullari. Biotexnologiya. Yutuqlar 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetik terapevtik peptidlar: Fan va bozor. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetik terapevtik peptidlar: Fan va bozor.Vliege P, Lisowski V, Martinez J va Chreschatyski M. Sintetik terapevtik peptidlar: fan va bozor.Vliege P, Lisowski V, Martinez J va Khreschatsky M. Sintetik terapevtik peptidlar: fan va bozor. dori kashfiyoti. Bugun 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smit, RD & Shen, Y. Kengaytirilgan proteomik suyuqlik xromatografiyasi. Xie, F., Smit, RD & Shen, Y. Kengaytirilgan proteomik suyuqlik xromatografiyasi.Qarang: F., Smit RD va Shen Yu. Murakkab proteomik suyuqlik xromatografiyasi. Xie, F., Smit, RD va Shen, Y. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kengaytirilgan protein tarkibiQarang: F., Smit RD va Shen Yu. Murakkab proteomik suyuqlik xromatografiyasi.J. Xromatografiya. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. va boshqalar. Ilg'or suyuqlik xromatografiyasi-mass-spektrometriya keng miqyosli metabolomikani va proteomikani birlashtirishga qodir. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC ning farmatsevtika rivojlanishidagi roli. Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC ning farmatsevtika rivojlanishidagi roli.Chesnut, SM va Salisbury, JJ UHPLC ning farmatsevtika rivojlanishidagi roli.Chesnut, SM va Salisbury, JJ UHPLC ning dori vositalarini ishlab chiqishdagi roli. J. Sentyabr Fan. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Tez ajralish uchun ultra yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasining asosiy va amaliy jihatlari. Wu, N. & Clausen, AM Tez ajralish uchun ultra yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasining asosiy va amaliy jihatlari.Wu, N. va Clausen, AM Tez ajratish uchun yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasining asosiy va amaliy jihatlari. Vu, N. va Klausen, AM Wu, N. & Clausen, AM Tez ajratish uchun ultra yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasining asosiy va amaliy jihatlari.Wu, N. va Clausen, AM Tez ajratish uchun yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasining asosiy va amaliy jihatlari.J. Sentabr fani. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelicheff, P. Farmatsevtika rivojlanishida ultra samarali suyuqlik xromatografiyasidan foydalanish. Wren, SA & Tchelicheff, P. Farmatsevtika rivojlanishida ultra samarali suyuqlik xromatografiyasidan foydalanish.Ren, SA va Chelischeff, P. Farmatsevtika rivojlanishida ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasidan foydalanish. Wren, SA & Tchelicheff, P. língíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngín. Wren, SA va Tchelicheff, P.Ren, SA va Chelischeff, P. Preparatni ishlab chiqishda ultra samarali suyuqlik xromatografiyasini qo'llash.J. Xromatografiya. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. va boshqalar. Enterovirusni samarali tozalash uchun yuqori ichki fazaga ega bo'lgan suvdagi moyli emulsiyadan olingan monolitik makroporoz gidrogel 71. Kimyoviy. loyiha. Jurnal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Proteomikada suyuq xromatografiyaning roli. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Proteomikada suyuq xromatografiyaning roli.Shi, Y., Xiang, R., Horvat, C. va Wilkins, J.A. Proteomikada suyuq xromatografiyaning roli. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvat, C. va Wilkins, J.A. Proteomikada suyuq xromatografiyaning roli.J. Xromatografiya. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlar va oqsillarni teskari fazali suyuq xromatografik ajratishning yangi tendentsiyalari: nazariya va ilovalar. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlar va oqsillarni teskari fazali suyuq xromatografik ajratishning yangi tendentsiyalari: nazariya va ilovalar. & Guillarme, D. Novye tendentsii v razdelenii terapevticheskix peptidov va belkov s pomoshchyu jidkostnoy xromatografii obrashchennoy fazoy: nazariya va prilojeniya. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlar va oqsillarni teskari fazali suyuqlik xromatografiyasi bilan ajratishning yangi tendentsiyalari: nazariya va ilovalar. & Guillarme, D. língííííííííííííííííííííííííííííníngíngíngíngíngíníngíngíngíngíngíngíngíngíngínėngíngėngėngėngėngėngčičnė & Gilarme, D.va Guillarmé, D. Terapevtik peptidlar va oqsillarni teskari fazali suyuqlik xromatografiyasi bilan ajratishning yangi tendentsiyalari: nazariya va ilovalar.J. Pharm. Biotibbiyot fanlari. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Birinchi va ikkinchi ajratish o'lchovlarida turli pH bilan RP-RP-HPLC tizimi yordamida peptidlarni ikki o'lchovli ajratish. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Birinchi va ikkinchi ajratish o'lchovlarida turli pH bilan RP-RP-HPLC tizimi yordamida peptidlarni ikki o'lchovli ajratish.Gilar M., Olivova P., Dali AE va Gebler JK. Birinchi va ikkinchi ajratish o'lchovlarida turli pH bilan RP-RP-HPLC tizimi yordamida peptidlarni ikki o'lchovli ajratish.Gilar M., Olivova P., Dali AE va Gebler JK RP-RP-HPLC tizimidan foydalangan holda birinchi va ikkinchi ajratish o'lchovlarida turli pH qiymatlari yordamida peptidlarni ikki o'lchovli ajratish. J. Sentyabr Fan. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. va boshqalar. To'liq gözenekli va yuzaki gözenekli C18 zarralari 2 mkm dan kichik bo'lgan yuqori samarali xromatografiya ustunlarining massa o'tkazuvchanligi va kinetik xususiyatlarini o'rganish. J. Sentyabr Fan. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. va boshqalar. O'simlik bioaktiv peptidlarini izolyatsiya qilish, identifikatsiya qilish va tasdiqlashdagi so'nggi tendentsiyalar va analitik muammolar. anus. Anal mavjudot. Kimyoviy. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB va boshqalar. Hayot shohligining proteomik landshafti. Tabiat 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luka, K. va boshqalar. Preparativ suyuqlik xromatografiyasi yordamida terapevtik peptidlarni davolashdan keyingi davolash. Molekulalar (Bazel, Shveytsariya) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Aralash rejimli xromatografiya va uning biopolimerlarga qo'llanilishi. Yang, Y. & Geng, X. Aralash rejimli xromatografiya va uning biopolimerlarga qo'llanilishi.Yang, Yu. va Geng, X. Aralash rejimli xromatografiya va uning biopolimerlarga qo'llanilishi. Yang, Y. va Geng, X. língíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíngíng. Yang, Y. & Geng, X. Aralash rejimli xromatografiya va uning biopolimerlarda qo'llanilishi.Yang, Yu. va Gen, X. Aralash rejimli xromatografiya va uning biopolimerlarga qo'llanilishi.J. Xromatografiya. A 1218(49), 8813–8825 (2011).