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Se prepararon partículas de sílice porosas mediante el método sol-gel con algunas modificaciones para obtener partículas de poro ancho. Estas partículas se derivatizaron con isocianato de metilvinilo de N-fenilmaleimida (PMI) y estireno mediante polimerización por transferencia de cadena inversa-fragmentación (RAFT) para producir poliamidas intercaladas con N-fenilmaleimida. Fase estacionaria de estireno (PMP). Se empacaron columnas de acero inoxidable de diámetro interno estrecho (100 × 1,8 mm) con un empaque de suspensión. Se evaluó el rendimiento cromatográfico de la columna PMP para separar una mezcla de péptidos sintéticos que consta de cinco péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, encefalina de aminoácido Leu) e hidrolizado tríptico de albúmina sérica humana (HAS). En condiciones óptimas de elución, el número teórico de platos con una mezcla de péptidos alcanzó los 280.000 platos/m². Al comparar el rendimiento de separación de la columna desarrollada con la columna comercial Ascentis Express RP-Amide, se observó que la eficiencia de separación de la columna PMP era superior a la de la columna comercial en términos de eficiencia de separación y resolución.
La industria biofarmacéutica se ha convertido en un mercado global en expansión, con un aumento significativo de su cuota de mercado en los últimos años. Debido al crecimiento explosivo de esta industria1,2,3, existe una gran necesidad de análisis de péptidos y proteínas. Además del péptido objetivo, durante la síntesis de péptidos se forman diversas impurezas, por lo que se requiere una purificación cromatográfica para obtener la pureza deseada. El análisis y la caracterización de proteínas en fluidos corporales, tejidos y células es una tarea extremadamente compleja debido a la gran cantidad de especies potencialmente detectables presentes en una sola muestra. Si bien la espectrometría de masas es una herramienta eficaz para la secuenciación de péptidos y proteínas, si dichas muestras se introducen directamente en el espectrómetro de masas, la separación será insatisfactoria. Este problema se puede solucionar realizando una cromatografía líquida (LC) antes del análisis por espectrometría de masas (MS), lo que reducirá la cantidad de analitos que ingresan al espectrómetro de masas en un momento dado4,5,6. Además, los analitos pueden concentrarse en una región estrecha durante la separación en fase líquida, lo que permite concentrarlos y aumentar la sensibilidad de la detección por MS. La cromatografía líquida (LC) ha avanzado significativamente en la última década y se ha convertido en un método ampliamente utilizado para el análisis proteómico7,8,9,10.
La cromatografía líquida de fase inversa (RP-LC) se utiliza ampliamente para purificar y separar mezclas de péptidos utilizando sílice modificada con octadecilo (ODS) como fase estacionaria11,12,13. Sin embargo, debido a su estructura compleja y naturaleza anfótera,14,15 las fases estacionarias de RP no pueden proporcionar una separación satisfactoria de péptidos y proteínas. Por lo tanto, el análisis de péptidos y proteínas con fragmentos polares y no polares requiere fases estacionarias especialmente diseñadas para interactuar y retener estos analitos16. La cromatografía mixta, que ofrece interacciones multimodales, puede ser una alternativa a la RP-LC para separar péptidos, proteínas y otras mezclas complejas. Se prepararon varias fases estacionarias de tipo mixto y se utilizaron columnas rellenas con estas fases estacionarias para separar péptidos y proteínas17,18,19,20,21. Debido a la presencia de grupos polares y no polares, las fases estacionarias de modo mixto (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalación polar/RPLC) son adecuadas para la separación de péptidos y proteínas22,23,24,25,26,27,28. , las fases estacionarias intercaladas polares con grupos polares unidos covalentemente muestran buenas capacidades de separación y selectividad única para analitos polares y no polares porque la separación depende de la interacción entre el analito y la fase estacionaria Interacciones multimodales 29,30,31,32. Recientemente, Zhang et al. 30 obtuvieron fases estacionarias terminadas en behenilo de poliaminas y separaron con éxito hidrocarburos, antidepresivos, flavonoides, nucleósidos, estrógenos y algunos otros analitos. El material estacionario incorporado polar tiene grupos polares y no polares, por lo que puede usarse para separar péptidos y proteínas en partes hidrofóbicas e hidrofílicas. Las columnas polares en línea (por ejemplo, columnas C18 con amida en línea) están disponibles bajo el nombre comercial Ascentis Express RP-Amide columns, pero estas columnas solo se han utilizado para el análisis de la amina 33.
En el presente estudio, se preparó una fase estacionaria de inclusión polar (N-fenilmaleimida, poliestireno de inclusión) y se evaluó para la separación de péptidos y la escisión tríptica de HSA. Se utilizó la siguiente estrategia para preparar la fase estacionaria. Se prepararon partículas de sílice porosas de acuerdo con los procedimientos descritos en nuestras publicaciones anteriores, con algunos cambios en los esquemas de preparación 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Las proporciones de urea, polietilenglicol (PEG), TMOS y ácido acético acuoso se ajustaron para obtener partículas de sílice con tamaños de poro grandes. En segundo lugar, se sintetizó un nuevo ligando de fenilmaleimida-metilvinil isocianato y sus partículas de sílice derivatizadas se utilizaron para preparar fases estacionarias de inclusión polar. La fase estacionaria obtenida se empaquetó en una columna de acero inoxidable (diámetro interno 100 × 1,8 mm) de acuerdo con un esquema de empaquetamiento optimizado. El empaquetamiento de la columna se facilitó mediante vibración mecánica para asegurar una capa uniforme dentro de la columna. Se evaluó la columna empaquetada para la separación de una mezcla de péptidos compuesta por cinco péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, péptido leucina-encefalina) e hidrolizados trípticos de albúmina sérica humana (HSA). Se observó que la mezcla de péptidos y el hidrolizado tríptico de HSA se separaron con buena resolución y eficiencia. La eficiencia de separación de la columna PMP se comparó con la de la columna Ascentis Express RP-Amide. Se observó que los péptidos y las proteínas presentan buena resolución y alta eficiencia de separación en la columna PMP, y que la eficiencia de separación de la columna PMP es superior a la de la columna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicol), urea, ácido acético, trimetoxiorthosilicato (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albúmina sérica humana (HSA), cloruro de amonio, urea, hexametilmetacriloildisilazano (HMDS), cloruro de metacriloilo (MC), estireno, 4-hidroxi-TEMPO, peróxido de benzoilo (BPO), acetonitrilo (ACN) para HPLC, metanol, 2-propanol y acetona. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, EE. UU.).
Se agitó una mezcla de urea (8 g), polietilenglicol (8 g) y 8 ml de ácido acético 0,01 N durante 10 minutos, y se añadieron 24 ml de TMOS bajo enfriamiento con hielo. La mezcla de reacción se calentó a 40 °C durante 6 horas y luego a 120 °C durante 8 horas en un autoclave de acero inoxidable. Se decantó el agua y el residuo se secó a 70 °C durante 12 horas. Los bloques blandos secos se molieron finamente y se calcinaron en un horno a 550 °C durante 12 horas. Se prepararon y caracterizaron tres lotes para comprobar la reproducibilidad del tamaño de partícula, el tamaño de poro y el área superficial.
Grupo polar y fase estacionaria para cadenas de poliestireno. El procedimiento de preparación se describe a continuación.
Se disolvieron 200 mg de N-fenilmaleimida y 100 mg de isocianato de metilvinilo en tolueno anhidro, y luego se añadieron 0,1 ml de 2,2′-azoisobutironitrilo (AIBN) al matraz de reacción para obtener un copolímero de fenilmaleimida e isocianato de metilvinilo (PMCP). La mezcla se calentó a 60 °C durante 3 horas, se filtró y se secó en un horno a 40 °C durante 3 horas.
Se dispersaron partículas de sílice secas (2 g) en tolueno seco (100 ml), se agitaron y se sonicaron durante 10 min en un matraz de fondo redondo de 500 ml. Se disolvió PMCP (10 mg) en tolueno y se añadió gota a gota al matraz de reacción mediante un embudo de adición. La mezcla se sometió a reflujo a 100 °C durante 8 horas, se filtró, se lavó con acetona y se secó a 60 °C durante 3 horas. A continuación, las partículas de sílice asociadas con PMCP (100 g) se disolvieron en tolueno (200 ml), y se añadió 4-hidroxi-TEMPO (2 ml) en presencia de 100 μl de dilaurato de dibutilestaño como catalizador. La mezcla se agitó a 50 °C durante 8 horas, se filtró y se secó a 50 °C durante 3 horas.
Se dispersaron 1 ml de estireno, 0,5 ml de peróxido de benzoílo (BPO) y 1,5 g de partículas de sílice unidas a TEMPO-PMCP en tolueno y se burbujeó nitrógeno. La polimerización del estireno se llevó a cabo a 100 °C durante 12 horas. El producto resultante se lavó con metanol y se secó durante la noche a 60 °C. El esquema general de la reacción se muestra en la figura 1.
Las muestras se desgasificaron a 393 K durante 1 h hasta obtener una presión residual inferior a 10–3 Torr. La cantidad de N2 adsorbida a una presión relativa P/P0 = 0,99 se utilizó para determinar el volumen total de poros. La morfología de las partículas de sílice puras y unidas a ligandos se examinó mediante un microscopio electrónico de barrido (Hitachi High Technologies, Tokio, Japón). Las muestras secas (partículas de sílice pura y unidas a ligandos) se colocaron sobre varillas de aluminio utilizando cinta de carbono. Se depositó oro sobre la muestra utilizando un dispositivo de pulverización catódica Q150T, y se depositó una capa de Au de 5 nm de espesor sobre la muestra. Esto mejora la eficiencia del proceso de bajo voltaje y proporciona una fina pulverización en frío. El análisis elemental se realizó utilizando un analizador de composición elemental Thermo Electron (Waltham, MA, EE. UU.) Flash EA1112. Se utilizó un analizador de tamaño de partículas Malvern (Worcestershire, Reino Unido) Mastersizer 2000 para obtener la distribución del tamaño de partícula. Se dispersaron partículas de sílice sin recubrimiento y partículas de sílice unidas a ligando (5 mg cada una) en 5 ml de isopropanol, se sometieron a sonicación durante 10 minutos, se agitaron durante 5 minutos y se colocaron en una mesa óptica Mastersizer. El análisis termogravimétrico se realizó a una velocidad de 5 °C por minuto en el rango de temperatura de 30 a 800 °C.
Columnas de acero inoxidable de diámetro estrecho revestidas con fibra de vidrio con dimensiones (DI 100 × 1,8 mm) se llenaron mediante el método de llenado de lodo siguiendo el mismo procedimiento que en la referencia 31. La columna de acero inoxidable (revestida de vidrio, DI 100 × 1,8 mm) y una salida que contenía una frita de 1 µm se conectaron a una máquina de envasado de lodo (Alltech Deerfield, IL, EE. UU.). Prepare una suspensión de la fase estacionaria suspendiendo 150 mg de la fase estacionaria en 1,2 ml de metanol y alimentándola a una columna de depósito. El metanol se usó como disolvente de lodo y disolvente de control. Empaque la columna aplicando una secuencia de presión de 100 MPa durante 10 min, 80 MPa durante 15 min y 60 MPa durante 30 min. El proceso de empaque usó dos vibradores de columna de cromatografía de gases (Alltech, Deerfield, IL, EE. UU.) para vibración mecánica para asegurar un empaque uniforme de la columna. Cierre el obturador de lodo y libere la presión lentamente para evitar daños en la columna. Se desconectó la columna de la boquilla de lodo y se conectó otro accesorio a la entrada, conectándolo al sistema LC para probar su funcionamiento.
Se construyó un MLC personalizado utilizando una bomba LC (10AD Shimadzu, Japón), un muestreador con un bucle de inyección de 50 nL (Valco (EE. UU.) C14 W.05), un desgasificador de membrana (Shimadzu DGU-14A) y una ventana capilar UV-VIS. Dispositivo detector (UV-2075) y microcolumna esmaltada. Utilice tubos de conexión muy estrechos y cortos para minimizar el efecto de la expansión adicional de la columna. Después de llenar la columna, instale un capilar (50 µm id 365) en la salida de la unión reductora de 1/16″ e instale un capilar (50 µm) de la unión reductora. La recolección de datos y el procesamiento del cromatograma se realizan utilizando el software Multichro 2000. A 254 nm, la absorbancia UV de los analitos de los sujetos se monitorizó en 0. Los datos cromatográficos se analizaron utilizando OriginPro8 (Northampton, MA).
Albúmina sérica humana, polvo liofilizado, ≥ 96% (electroforesis en gel de agarosa) 3 mg mezclados con tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 ml) y bicarbonato de amonio 0,2 M (1 ml). La solución se agitó durante 10 min y se mantuvo en un baño de agua a 37 °C durante 6 h, luego se neutralizó con 1 ml de TFA al 0,1%. Filtrar la solución y almacenar por debajo de 4 °C.
Se evaluó por separado la separación de una mezcla de péptidos y HSA digerida con tripsina en una columna PMP. Verifique la hidrólisis tríptica de una mezcla de péptidos y HSA separada por una columna PMP y compare los resultados con una columna Ascentis Express RP-Amide. El número de platos teóricos se calcula mediante la siguiente ecuación:
En la Figura 2 se muestran imágenes SEM de partículas de sílice pura y de partículas de sílice unidas a ligando. Las imágenes SEM de las partículas de sílice pura (A, B) muestran una forma esférica en la que las partículas están alargadas o presentan una simetría irregular en comparación con nuestros estudios previos. La superficie de las partículas de sílice unidas al ligando (C, D) es más lisa que la de las partículas de sílice pura, lo que podría deberse a las cadenas de poliestireno que recubren la superficie de las partículas de sílice.
Micrografías electrónicas de barrido de partículas de sílice pura (A, B) y partículas de sílice unidas a ligandos (C, D).
La distribución del tamaño de partícula de partículas de sílice pura y partículas de sílice unidas a ligando se muestra en la Fig. 2. 3(A). Las curvas de distribución volumétrica del tamaño de partícula mostraron que el tamaño de partícula de sílice aumentó después de la modificación química (Fig. 3A). Los datos de distribución del tamaño de partícula de sílice del estudio actual y del estudio anterior se comparan en la Tabla 1(A). El tamaño de partícula volumétrico d(0.5) de PMP fue de 3.36 µm, en comparación con el valor ad(0.5) de 3.05 µm en nuestro estudio anterior (partículas de sílice unidas a poliestireno)34. Debido al cambio en la proporción de PEG, urea, TMOS y ácido acético en la mezcla de reacción, la distribución del tamaño de partícula de este lote fue más estrecha en comparación con nuestro estudio anterior. El tamaño de partícula de la fase PMP es ligeramente mayor que el de la fase de partículas de sílice unidas a poliestireno que estudiamos anteriormente. Esto significa que la funcionalización de la superficie de las partículas de sílice con estireno depositó únicamente una capa de poliestireno (0,97 µm) sobre la superficie de la sílice, mientras que en la fase PMP el espesor de la capa fue de 1,38 µm.
Distribución del tamaño de partícula (A) y distribución del tamaño de poro (B) de partículas de sílice pura y partículas de sílice unidas a ligando.
El tamaño de poro, el volumen de poro y el área superficial de las partículas de sílice utilizadas en este estudio se muestran en la Tabla 1 (B). Los perfiles PSD de partículas de sílice puras y partículas de sílice unidas a ligandos se muestran en las Figs. 3(B). Los resultados fueron comparables a nuestro estudio anterior34. Los tamaños de poro de partículas de sílice puras y unidas a ligandos fueron 310 Å y 241 Å, respectivamente, lo que indica que después de la modificación química, el tamaño de poro disminuyó en 69 Å, como se muestra en la Tabla 1 (B), y la curva de desplazamiento se muestra en la Fig. El área superficial específica de partículas de sílice en el presente estudio es 116 m2/g, que es comparable a nuestro estudio anterior (124 m2/g). Como se muestra en la Tabla 1(B), el área superficial (m2/g) de partículas de sílice después de la modificación química también disminuyó de 116 m2/g a 105 m2/g.
Los resultados del análisis elemental de la fase estacionaria se presentan en la Tabla 2. El contenido de carbono de la fase estacionaria actual es 6,35%, que es menor que en nuestro estudio anterior (partículas de sílice asociadas con poliestireno, 7,93%35 y 10,21%, respectivamente) 42. El contenido de carbono de la fase estacionaria actual a continuación, ya que algunos ligandos polares como fenilmaleimida metil vinil isocianato (PCMP) y 4-hidroxi-TEMPO se han utilizado además de estireno en la preparación de SP. El porcentaje en peso de nitrógeno en la fase estacionaria actual es 2,21% comparado con 0,1735 y 0,85% en estudios anteriores42. Esto significa que la fase estacionaria actual tiene un alto porcentaje en peso de nitrógeno debido a la fenilmaleimida. De manera similar, los productos (4) y (5) tienen un contenido de carbono de 2,7% y 2,9%, respectivamente, mientras que el producto final (6) tiene un contenido de carbono de 6,35%, como se muestra en la Tabla 2. Se utilizó el análisis termogravimétrico (TGA) en la fase estacionaria de PMP para comprobar la pérdida de peso, y la curva TGA se muestra en la Figura 4. La curva TGA muestra una pérdida de peso del 8,6%, lo que concuerda bien con el contenido de carbono (6,35%), ya que los ligandos contienen no solo C, sino también N, O e H.
Se eligió el ligando fenilmaleimida-metilvinil isocianato para modificar la superficie de las partículas de sílice debido a sus grupos polares fenilmaleimida y vinil isocianato. Los grupos vinil isocianato pueden reaccionar con estireno mediante polimerización radical viva. La segunda razón es insertar un grupo que tenga interacciones moderadas con el analito y no interacciones electrostáticas fuertes entre el analito y la fase estacionaria, ya que la fracción fenilmaleimida no tiene carga virtual a pH normal. La polaridad de la fase estacionaria se puede controlar mediante la cantidad óptima de estireno y el tiempo de reacción de la polimerización radical libre. El paso final de la reacción (polimerización radical libre) es crítico, ya que cambia la polaridad de la fase estacionaria. Se realizó un análisis elemental para verificar el contenido de carbono en estas fases estacionarias. Se ha observado que aumentar la cantidad de estireno y el tiempo de reacción aumenta el contenido de carbono de la fase estacionaria y viceversa. Las fases estacionarias preparadas con diferentes concentraciones de estireno tienen diferentes cargas de carbono. De forma similar, estas fases estacionarias se colocaron en columnas de acero inoxidable y se verificaron sus características cromatográficas (selectividad, resolución, valor N, etc.). A partir de estos experimentos, se seleccionó una composición optimizada para la preparación de la fase estacionaria PMP que proporcionara una polaridad controlada y una buena retención del analito.
La columna PMP también se evaluó para el análisis de cinco mezclas de péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina-encefalina) utilizando la capacidad de la fase móvil. 60/40 (v/v) ACN/agua (0,1% TFA) a un caudal de 80 µl/min. En condiciones de elución óptimas (200.000 platos/m), el número de platos teóricos (N) por columna (100 × 1,8 mm) es 20.000 ± 100. Los valores de N para las tres columnas PMP se muestran en la Tabla 3 y los cromatogramas se muestran en la Figura 5A. Análisis rápido a alta velocidad de flujo (700 µl/min) en una columna PMP, cinco péptidos eluidos en un minuto, excelente valor N de 13,500 ± 330 por columna (100 x 1.8 mm de diámetro), equivalente a 135,000 platos/m (Fig. 5B). Tres columnas del mismo tamaño (diámetro interno 100 x 1.8 mm) se llenaron con tres lotes diferentes de fase estacionaria PMP para probar la reproducibilidad. Los analitos se registraron para cada columna separando la misma mezcla de prueba en cada columna usando condiciones de elución óptimas, número de platos teóricos N y tiempo de retención. Los datos de reproducibilidad para las columnas PMP se muestran en la Tabla 4. La reproducibilidad de la columna PMP se correlacionó bien con valores %RSD muy bajos como se muestra en la Tabla 3.
Separación de mezclas de péptidos en una columna PMP (B) y una columna Ascentis Express RP-Amide (A), fase móvil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensiones de la columna PMP (100 x 1,8 mm id), orden de elución de los compuestos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) y 5 (encefalina de ácido leucícico).
Se evaluó una columna PMP (diámetro interno 100 x 1,8 mm) para la separación del hidrolizado tríptico de albúmina sérica humana mediante HPLC. El cromatograma de la Figura 6 muestra que las muestras se separan bien con una resolución muy buena. Las soluciones de HSA se analizaron con un flujo de 100 μl/min, una fase móvil de acetonitrilo/agua 70/30 y 0,1 % de TFA. La escisión de HSA se dividió en 17 picos, como se muestra en el cromatograma (Fig. 6), correspondientes a 17 péptidos. Se calcularon las eficiencias de separación de los picos individuales del hidrolizado de HSA y los valores se muestran en la Tabla 5.
Los hidrolizados trípticos de HSA se separaron en una columna PMP (diámetro interno de 100 x 1,8 mm), con un caudal de 100 μl/min, una fase móvil de acetonitrilo/agua 60/40 y 0,1 % de TFA.
donde L es la longitud de la columna, η es la viscosidad de la fase móvil, ΔP es la contrapresión de la columna y u es la velocidad lineal de la fase móvil. La permeabilidad de la columna PMP fue de 2,5 × 10–14 m2, el caudal fue de 25 µl/min, se utilizó 60/40 v/v. ACN/agua. La permeabilidad de la columna PMP (ID 100 × 1,8 mm) fue similar a la de nuestro estudio anterior Ref.34. La permeabilidad de una columna llena de partículas superficialmente porosas es de 1,7×10 .6 µm, 2,5×10-14 m2 para partículas de 5 µm43. Por lo tanto, la permeabilidad de la fase PMP es similar a la permeabilidad de partículas de núcleo-corteza con un tamaño de 5 μm.
donde Wx es la masa de la columna llena de cloroformo, Wy es la masa de la columna llena de metanol y ρ es la densidad del disolvente. Densidad del metanol (ρ = 0,7866) y del cloroformo (ρ = 1,484). La porosidad total de la columna de partículas de sílice-C18 (100 × 1,8 mm DI)34 y nuestra columna C18-urea estudiada previamente31 fue de 0,63 y 0,55, respectivamente. Esto significa que la presencia de ligandos de urea reduce la permeabilidad de la fase estacionaria. Por otro lado, la porosidad total de la columna PMP (diámetro interno 100 × 1,8 mm) es de 0,60. Las columnas PMP son menos permeables que las columnas rellenas con partículas de sílice unidas a C18 porque en las fases estacionarias de tipo C18 los ligandos C18 se unen a las partículas de sílice en cadenas lineales, mientras que en las fases estacionarias de tipo poliestireno se forma un polímero relativamente grueso alrededor de las partículas. capa A. En un experimento típico, la porosidad de la columna se calcula de la siguiente manera:
En la figura 7A y B se muestran los gráficos de Van Deemter para una columna PMP (100 x 1,8 mm de diámetro interno) y una columna Ascentis Express RP-Amide (100 x 1,8 mm de diámetro interno) bajo las mismas condiciones de elución: 60/40 ACN/H2O y 0,1 % TFA, con un flujo de 20 µl/min a 800 µl/min en ambas columnas. Los valores mínimos de HETP al caudal óptimo (80 µl/min) fueron de 2,6 µm y 3,9 µm para la columna PMP y la columna Ascentis Express RP-Amide, respectivamente. Los valores de HETP demuestran que la eficiencia de separación de la columna PMP (100 x 1,8 mm de diámetro interno) es mucho mayor que la de la columna Ascentis Express RP-Amide (100 x 1,8 mm de diámetro interno) disponible comercialmente. El gráfico de van Deemter en la Fig. 7(A) muestra que la disminución del valor de N no es significativamente mayor con el aumento del flujo en comparación con nuestro estudio anterior. La mayor eficiencia de separación de la columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interno) en comparación con la columna Ascentis Express RP-Amide se basa en la forma y el tamaño mejorados de las partículas y en el sofisticado procedimiento de empaquetamiento de la columna utilizado en el presente trabajo34.
(A) Gráfico de Van Deemter (HETP frente a velocidad lineal de la fase móvil) obtenido en una columna PMP (100 x 1,8 mm de diámetro interno) en una mezcla 60/40 de ACN/H2O con 0,1 % de TFA. (B) Gráfico de Van Deemter (HETP frente a velocidad lineal de la fase móvil) obtenido en una columna Ascentis Express RP-Amide (100 x 1,8 mm de diámetro interno) en una mezcla 60/40 de ACN/H2O con 0,1 % de TFA.
Se preparó una fase estacionaria polar de poliestireno intercalado y se evaluó para la separación de una mezcla de péptidos sintéticos e hidrolizado tríptico de albúmina sérica humana (HSA) mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El rendimiento cromatográfico de las columnas PMP para mezclas de péptidos es excelente en términos de eficiencia de separación y resolución. La mayor eficiencia de separación de las columnas PMP se debe a varios factores, como el tamaño de partícula y el tamaño de poro de la sílice, la síntesis controlada de las fases estacionarias y los complejos materiales de empaquetamiento de la columna. Además de la alta eficiencia de separación, otra ventaja de esta fase estacionaria es la baja contrapresión de la columna a altas velocidades de flujo. Las columnas PMP son altamente reproducibles y pueden utilizarse para analizar mezclas de péptidos y digestión tríptica de diversas proteínas. Pretendemos utilizar esta columna para la separación de compuestos bioactivos de productos naturales, extractos de plantas medicinales y hongos mediante cromatografía líquida. En el futuro, las columnas PMP también se evaluarán para la separación de proteínas y anticuerpos monoclonales.
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