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छिद्रयुक्त सिलिका कणों को सोल-जेल विधि में कुछ संशोधनों के साथ तैयार किया गया ताकि चौड़े छिद्र वाले कण प्राप्त हो सकें। इन कणों को एन-फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइल आइसोसाइनेट (पीएमआई) और स्टाइरीन के साथ रिवर्स चेन ट्रांसफर-फ्रैगमेंटेशन (आरएएफटी) पॉलीमराइजेशन द्वारा व्युत्पन्न किया गया ताकि एन-फेनिलमेलिमाइड इंटरकैलेटेड पॉलीएमाइड्स का उत्पादन हो सके। स्टाइरीन (पीएमपी) स्थिर चरण था। संकीर्ण बोर वाले स्टेनलेस स्टील कॉलम (100 × 1.8 मिमी आंतरिक व्यास) को स्लरी पैकिंग से भरा गया था। पीएमपी कॉलम के क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन का मूल्यांकन पांच पेप्टाइड्स (ग्लाइ-टाइरीन, ग्लाइ-ल्यू-टाइरीन, ग्लाइ-ग्लाइ-टाइरीन-आर्जिनिन, टाइरीन-आइलीन-ग्लाइ-सेरीन-आर्जिनिन, ल्यू अमीनो एसिड एनकेफेलिन) से युक्त सिंथेटिक पेप्टाइड्स के मिश्रण और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएएस) के ट्रिप्टिक हाइड्रोलाइज़ेट को अलग करने के लिए किया गया था। इष्टतम इल्यूशन स्थितियों के तहत, पेप्टाइड के मिश्रण वाली प्लेटों की सैद्धांतिक संख्या 280,000 प्लेट/वर्ग मीटर तक पहुंच गई। विकसित कॉलम के पृथक्करण प्रदर्शन की तुलना व्यावसायिक एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम से करने पर यह पाया गया कि पृथक्करण दक्षता और रिज़ॉल्यूशन के मामले में पीएमपी कॉलम की पृथक्करण दक्षता व्यावसायिक कॉलम से बेहतर थी।
जैवऔषधीय उद्योग हाल के वर्षों में बाजार हिस्सेदारी में उल्लेखनीय वृद्धि के साथ एक विस्तारित वैश्विक बाजार बन गया है। जैवऔषधीय उद्योग की तीव्र वृद्धि1,2,3 के कारण पेप्टाइड और प्रोटीन विश्लेषण की अत्यधिक आवश्यकता है। लक्षित पेप्टाइड के अलावा, पेप्टाइड संश्लेषण के दौरान विभिन्न अशुद्धियाँ उत्पन्न होती हैं, इसलिए पेप्टाइड की वांछित शुद्धता प्राप्त करने के लिए क्रोमैटोग्राफिक शुद्धिकरण आवश्यक है। शरीर के तरल पदार्थों, ऊतकों और कोशिकाओं में प्रोटीन का विश्लेषण और लक्षण वर्णन एक अत्यंत चुनौतीपूर्ण कार्य है, क्योंकि एक ही नमूने में संभावित रूप से पता लगाने योग्य प्रजातियों की संख्या बहुत अधिक होती है। यद्यपि मास स्पेक्ट्रोमेट्री पेप्टाइड और प्रोटीन के अनुक्रमण के लिए एक प्रभावी उपकरण है, यदि ऐसे नमूनों को सीधे मास स्पेक्ट्रोमीटर में डाला जाता है, तो पृथक्करण संतोषजनक नहीं होगा। इस समस्या को एमएस विश्लेषण से पहले लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एलसी) करके हल किया जा सकता है, जिससे एक समय में मास स्पेक्ट्रोमीटर में प्रवेश करने वाले विश्लेषकों की मात्रा कम हो जाएगी4,5,6। इसके अतिरिक्त, तरल चरण पृथक्करण के दौरान विश्लेष्य पदार्थ एक संकीर्ण क्षेत्र में केंद्रित हो सकते हैं, जिससे इन विश्लेष्य पदार्थों की सांद्रता बढ़ जाती है और एमएस पहचान की संवेदनशीलता बढ़ जाती है। तरल क्रोमेटोग्राफी (एलसी) ने पिछले दशक में काफी प्रगति की है और प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि बन गई है7,8,9,10।
रिवर्स-फेज़ लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (आरपी-एलसी) का उपयोग ऑक्टाडेसिल-मॉडिफाइड सिलिका (ओडीएस) को स्थिर चरण के रूप में उपयोग करके पेप्टाइड के मिश्रण को शुद्ध करने और अलग करने के लिए व्यापक रूप से किया जाता है11,12,13। हालांकि, उनकी जटिल संरचना और उभयधर्मी प्रकृति के कारण,14,15 आरपी स्थिर चरण पेप्टाइड और प्रोटीन का संतोषजनक पृथक्करण प्रदान नहीं कर सकते हैं। इसलिए, ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय खंडों वाले पेप्टाइड और प्रोटीन के विश्लेषण के लिए इन विश्लेषकों के साथ परस्पर क्रिया करने और उन्हें बनाए रखने के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए स्थिर चरणों की आवश्यकता होती है16। मिश्रित क्रोमैटोग्राफी, जो बहुआयामी अंतःक्रियाएं प्रदान करती है, पेप्टाइड, प्रोटीन और अन्य जटिल मिश्रणों को अलग करने के लिए आरपी-एलसी का एक विकल्प हो सकती है। कई मिश्रित प्रकार के स्थिर चरण तैयार किए गए और इन स्थिर चरणों से भरे स्तंभों का उपयोग पेप्टाइड और प्रोटीन को अलग करने के लिए किया गया17,18,19,20,21। ध्रुवीय और अध्रुवीय समूहों की उपस्थिति के कारण, मिश्रित मोड स्थिर चरण (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, ध्रुवीय अंतर्विन्यास/RPLC) पेप्टाइड और प्रोटीन के पृथक्करण के लिए उपयुक्त हैं22,23,24,25,26,27,28। सहसंयोजक रूप से बंधे ध्रुवीय समूहों वाले ध्रुवीय अंतर्विन्यास स्थिर चरण ध्रुवीय और अध्रुवीय विश्लेषकों के लिए अच्छी पृथक्करण क्षमता और अद्वितीय चयनात्मकता दर्शाते हैं क्योंकि पृथक्करण विश्लेषक और स्थिर चरण के बीच बहुआयामी अंतःक्रियाओं पर निर्भर करता है29,30,31,32। हाल ही में, झांग एट अल.30 ने पॉलीएमाइन के बेहेनिल-समाप्त स्थिर चरण प्राप्त किए और हाइड्रोकार्बन, अवसादरोधी, फ्लेवोनोइड, न्यूक्लियोसाइड, एस्ट्रोजेन और कुछ अन्य विश्लेषकों को सफलतापूर्वक अलग किया। ध्रुवीय अंतर्निहित स्थिर सामग्री में ध्रुवीय और अध्रुवीय दोनों समूह होते हैं, इसलिए इसका उपयोग पेप्टाइड और प्रोटीन को जलभक्षी और जलभक्षी भागों में अलग करने के लिए किया जा सकता है। पोलर इनलाइन कॉलम (जैसे, एमाइड इनलाइन के साथ C18 कॉलम) एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम के व्यापार नाम के तहत उपलब्ध हैं, लेकिन इन कॉलमों का उपयोग केवल एमीन 33 के विश्लेषण के लिए किया गया है।
वर्तमान अध्ययन में, एक ध्रुवीय एम्बेडिंग स्थिर चरण (एन-फेनिलमेलिमाइड, एम्बेडिंग पॉलीस्टाइरीन) तैयार किया गया और पेप्टाइड पृथक्करण और ट्रिप्टिक एचएसए विखंडन के लिए इसका मूल्यांकन किया गया। स्थिर चरण तैयार करने के लिए निम्नलिखित रणनीति का उपयोग किया गया। छिद्रयुक्त सिलिका कणों को हमारे पिछले प्रकाशनों में वर्णित प्रक्रियाओं के अनुसार तैयार किया गया, जिसमें तैयारी योजनाओं में कुछ परिवर्तन किए गए थे 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39। यूरिया, पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल (पीईजी), टीएमओएस और जलीय-एसिटिक एसिड के अनुपात को बड़े छिद्र आकार वाले सिलिका कण प्राप्त करने के लिए समायोजित किया गया। दूसरे, एक नए फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइल आइसोसाइनेट लिगैंड को संश्लेषित किया गया और इसके व्युत्पन्न सिलिका कणों का उपयोग ध्रुवीय एम्बेडेड स्थिर चरणों को तैयार करने के लिए किया गया। प्राप्त स्थिर चरण को एक अनुकूलित पैकिंग योजना के अनुसार स्टेनलेस स्टील कॉलम (आंतरिक व्यास 100 × 1.8 मिमी) में पैक किया गया। कॉलम की पैकिंग में यांत्रिक कंपन की सहायता ली जाती है ताकि कॉलम के भीतर एक समान परत सुनिश्चित हो सके। पैक किए गए कॉलम का मूल्यांकन पाँच पेप्टाइडों (ग्लाइ-टाइर, ग्लाइ-ल्यू-टाइर, ग्लाइ-ग्लाइ-टाइर-आर्जिनिन, टाइर-आइल-ग्लाइ-सेर-आर्जिनिन, ल्यूसीन-एनकेफेलिन पेप्टाइड) के मिश्रण और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएसए) के ट्रिप्टिक हाइड्रोलाइज़ेट्स के पृथक्करण के लिए किया गया। यह देखा गया कि पेप्टाइड मिश्रण और एचएसए ट्रिप्टिक डाइजेस्ट अच्छे रिज़ॉल्यूशन और दक्षता के साथ अलग हो गए। पीएमपी कॉलम की पृथक्करण दक्षता की तुलना एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम से की गई। यह देखा गया कि पीएमपी कॉलम पर पेप्टाइड और प्रोटीन का रिज़ॉल्यूशन अच्छा है और पृथक्करण दक्षता उच्च है, और पीएमपी कॉलम की पृथक्करण दक्षता एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम की तुलना में अधिक है।
पीईजी (पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल), यूरिया, एसिटिक एसिड, ट्राइमेथॉक्सीऑर्थोसिलिकेट (टीएमओएस), ट्राइमेथिलक्लोरोसिलान (टीएमसीएस), ट्रिप्सिन, ह्यूमन सीरम एल्ब्यूमिन (एचएसए), अमोनियम क्लोराइड, यूरिया, हेक्सामेथिलमेथैक्रिलोयल्डिसिलाज़ेन (एचएमडीएस), मेथैक्रिलोयल क्लोराइड (एमसी), स्टाइरीन, 4-हाइड्रॉक्सी- टेम्पो, बेंजोयल पेरोक्साइड (बीपीओ), एसीटोनिट्राइल (एसीएन) एचपीएलसी के लिए, मेथनॉल, 2-प्रोपेनॉल और एसीटोन। सिग्मा-एल्ड्रिच कंपनी (सेंट लुइस, मिसौरी, यूएसए)।
यूरिया (8 ग्राम), पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल (8 ग्राम) और 0.01 एन एसिटिक एसिड के 8 मिलीलीटर के मिश्रण को 10 मिनट तक हिलाया गया, और फिर बर्फ की ठंडक में 24 मिलीलीटर टीएमओएस मिलाया गया। इस अभिक्रिया मिश्रण को स्टेनलेस स्टील ऑटोक्लेव में 40°C पर 6 घंटे और फिर 120°C पर 8 घंटे तक गर्म किया गया। पानी को अलग कर दिया गया और अवशेष को 70°C पर 12 घंटे तक सुखाया गया। सूखे हुए नरम ब्लॉकों को बारीक पीसकर 550°C पर 12 घंटे तक ओवन में गर्म किया गया। कणों के आकार, छिद्र के आकार और सतह क्षेत्र की पुनरुत्पादकता की जांच के लिए तीन बैच तैयार किए गए और उनका विश्लेषण किया गया।
पॉलीस्टाइरीन श्रृंखलाओं के लिए ध्रुवीय समूह और स्थिर अवस्था। तैयारी की प्रक्रिया नीचे वर्णित है।
एन-फेनिलमेलिमाइड (200 मिलीग्राम) और मेथिल विनाइल आइसोसाइनेट (100 मिलीग्राम) को निर्जल टोल्यून में घोला गया, और फिर अभिक्रिया फ्लास्क में 0.1 मिलीलीटर 2,2′-एज़ोइसोब्यूटीरोनिट्राइल (AIBN) मिलाया गया, जिससे फेनिलमेलिमाइड और मेथिल विनाइल आइसोसाइनेट (PMCP) का एक सह-पॉलिमर प्राप्त हुआ। मिश्रण को 60°C पर 3 घंटे तक गर्म किया गया, छान लिया गया और 40°C पर 3 घंटे के लिए ओवन में सुखाया गया।
शुष्क सिलिका कणों (2 ग्राम) को शुष्क टोल्यून (100 मिली) में फैलाया गया, 500 मिली के गोल पेंदे वाले फ्लास्क में 10 मिनट तक हिलाया और ध्वनि उत्पन्न की गई। PMCP (10 मिलीग्राम) को टोल्यून में घोला गया और एक फ़नल के माध्यम से बूंद-बूंद करके अभिक्रिया फ्लास्क में डाला गया। मिश्रण को 100°C पर 8 घंटे तक रिफ्लक्स किया गया, छान लिया गया, एसीटोन से धोया गया और 60°C पर 3 घंटे तक सुखाया गया। फिर, PMCP से जुड़े सिलिका कणों (100 ग्राम) को टोल्यून (200 मिली) में घोला गया, और उत्प्रेरक के रूप में 100 माइक्रोलीटर डाइब्यूटिलटिन डिलाउरेट की उपस्थिति में 4-हाइड्रॉक्सी-TEMPO (2 मिली) मिलाया गया। मिश्रण को 50°C पर 8 घंटे तक हिलाया गया, छान लिया गया और 50°C पर 3 घंटे तक सुखाया गया।
स्टाइरीन (1 मिली), बेंज़ॉयल पेरोक्साइड बीपीओ (0.5 मिली) और टेम्पो-पीएमसीपी से जुड़े सिलिका कण (1.5 ग्राम) को टोल्यून में फैलाया गया और नाइट्रोजन गैस प्रवाहित की गई। स्टाइरीन का बहुलकीकरण 100°C पर 12 घंटे तक किया गया। प्राप्त उत्पाद को मेथनॉल से धोया गया और 60°C पर रात भर सुखाया गया। अभिक्रिया की सामान्य योजना चित्र एक में दर्शाई गई है।
नमूनों को 393 K पर 1 घंटे के लिए तब तक डीगैस किया गया जब तक कि अवशिष्ट दाब 10–3 टॉर से कम न हो जाए। सापेक्ष दाब ​​P/P0 = 0.99 पर अवशोषित N2 की मात्रा का उपयोग कुल छिद्र आयतन निर्धारित करने के लिए किया गया था। शुद्ध और लिगैंड-बद्ध सिलिका कणों की आकृति विज्ञान का अध्ययन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (हिताची हाई टेक्नोलॉजीज, टोक्यो, जापान) का उपयोग करके किया गया। सूखे नमूनों (शुद्ध सिलिका और लिगैंड-बद्ध सिलिका कणों) को कार्बन टेप का उपयोग करके एल्यूमीनियम की छड़ों पर रखा गया। Q150T स्पटरिंग उपकरण का उपयोग करके नमूने पर सोना जमा किया गया, और नमूने पर 5 nm मोटी Au परत जमा की गई। इससे कम वोल्टेज प्रक्रिया की दक्षता में सुधार होता है और महीन कोल्ड स्प्रेइंग प्राप्त होती है। थर्मो इलेक्ट्रॉन (वाल्थम, एमए, यूएसए) फ्लैश EA1112 मौलिक संघटन विश्लेषक का उपयोग करके मौलिक विश्लेषण किया गया। कण आकार वितरण प्राप्त करने के लिए मालवर्न कण आकार विश्लेषक (वॉर्सेस्टरशायर, यूके) मास्टरसाइज़र 2000 का उपयोग किया गया। बिना लेपित सिलिका कण और लिगैंड-बद्ध सिलिका कण (प्रत्येक 5 मिलीग्राम) को 5 मिलीलीटर आइसोप्रोपेनॉल में फैलाया गया, 10 मिनट तक ध्वनिक उपचार किया गया, 5 मिनट तक हिलाया गया और मास्टरसाइज़र ऑप्टिकल बेंच पर रखा गया। थर्मोग्रैविमेट्रिक विश्लेषण 30 से 800 डिग्री सेल्सियस के तापमान सीमा में 5 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट की दर से किया गया।
ग्लास फाइबर से लेपित संकीर्ण बोर वाले स्टेनलेस स्टील कॉलम (100 × 1.8 मिमी) को संदर्भ 31 में वर्णित प्रक्रिया के अनुसार स्लरी फिलिंग विधि द्वारा पैक किया गया। स्टेनलेस स्टील कॉलम (ग्लास से लेपित, 100 × 1.8 मिमी) और 1 µm फ्रिट युक्त आउटलेट को स्लरी पैकेजिंग मशीन (ऑलटेक, डियरफील्ड, इलिनोइस, यूएसए) से जोड़ा गया। स्थिर चरण के 150 मिलीग्राम को 1.2 मिलीलीटर मेथनॉल में घोलकर स्थिर चरण का सस्पेंशन तैयार किया गया और इसे जलाशय कॉलम में डाला गया। मेथनॉल का उपयोग स्लरी विलायक और नियंत्रण विलायक के रूप में किया गया। कॉलम को 10 मिनट के लिए 100 MP, 15 मिनट के लिए 80 MP और 30 मिनट के लिए 60 MP के दबाव अनुक्रम को लागू करके पैक किया गया। पैकिंग प्रक्रिया में एकसमान कॉलम पैकिंग सुनिश्चित करने के लिए यांत्रिक कंपन हेतु दो गैस क्रोमेटोग्राफी कॉलम वाइब्रेटर (ऑलटेक, डियरफील्ड, इलिनोइस, यूएसए) का उपयोग किया गया। स्लरी पैकर को बंद करें और स्ट्रिंग को नुकसान से बचाने के लिए धीरे-धीरे दबाव छोड़ें। कॉलम को स्लरी नोजल से अलग कर दिया गया और इनलेट पर एक और फिटिंग लगाकर उसे एलसी सिस्टम से जोड़ा गया ताकि उसके संचालन का परीक्षण किया जा सके।
एक अनुकूलित एमएलसी का निर्माण एलसी पंप (10AD शिमाद्ज़ू, जापान), 50 एनएमएल इंजेक्शन लूप वाले सैम्पलर (वाल्को (यूएसए) C14 W.05), मेम्ब्रेन डिगैसर (शिमाद्ज़ू DGU-14A), और यूवी-विज़ कैपिलरी विंडो का उपयोग करके किया गया था। इसमें डिटेक्टर डिवाइस (UV-2075) और एनामेल्ड माइक्रो कॉलम का उपयोग किया गया था। अतिरिक्त कॉलम विस्तार के प्रभाव को कम करने के लिए बहुत पतली और छोटी कनेक्टिंग ट्यूबों का उपयोग किया गया। कॉलम भरने के बाद, 1/16″ रिड्यूसिंग जंक्शन के आउटलेट पर एक कैपिलरी (50 µm id 365) और रिड्यूसिंग जंक्शन पर एक कैपिलरी (50 µm) स्थापित की गई। डेटा संग्रह और क्रोमैटोग्राम प्रोसेसिंग मल्टीक्रो 2000 सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके की गई। 254 एनएम पर, विषयों के विश्लेषकों के यूवी अवशोषण की निगरानी की गई। क्रोमैटोग्राफिक डेटा का विश्लेषण ओरिजिनप्रो8 (नॉर्थम्प्टन, एमए) का उपयोग करके किया गया।
मानव सीरम एल्ब्यूमिन, लाइयोफिलाइज्ड पाउडर, ≥ 96% (एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस) 3 मिलीग्राम को ट्रिप्सिन (1.5 मिलीग्राम), 4.0 M यूरिया (1 मिलीलीटर) और 0.2 M अमोनियम बाइकार्बोनेट (1 मिलीलीटर) के साथ मिलाया गया। घोल को 10 मिनट तक हिलाया गया और 37°C पर 6 घंटे के लिए जल स्नान में रखा गया, फिर 1 मिलीलीटर 0.1% TFA से अभिक्रिया को रोक दिया गया। घोल को छान लें और 4°C से नीचे संग्रहित करें।
पेप्टाइड और ट्रिप्टिक डाइजेस्ट एचएसए के मिश्रण के PMP कॉलम पर पृथक्करण का अलग-अलग मूल्यांकन किया गया। PMP कॉलम द्वारा पृथक किए गए पेप्टाइड और एचएसए के मिश्रण के ट्रिप्टिक हाइड्रोलिसिस की जाँच करें और परिणामों की तुलना एसेन्टिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम के परिणामों से करें। सैद्धांतिक प्लेटों की संख्या की गणना निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके की जाती है:
चित्र 2 में शुद्ध सिलिका कणों और लिगैंड से बंधे सिलिका कणों की SEM छवियां दिखाई गई हैं। शुद्ध सिलिका कणों (A, B) की SEM छवियों में गोलाकार आकृति दिखाई देती है, जिसमें कण हमारे पिछले अध्ययनों की तुलना में लंबे या अनियमित समरूपता वाले हैं। लिगैंड से बंधे सिलिका कणों (C, D) की सतह शुद्ध सिलिका कणों की तुलना में अधिक चिकनी है, जिसका कारण सिलिका कणों की सतह को ढकने वाली पॉलीस्टाइरीन श्रृंखलाएं हो सकती हैं।
शुद्ध सिलिका कणों (A, B) और लिगैंड से बंधे सिलिका कणों (C, D) के स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ।
शुद्ध सिलिका कणों और लिगैंड-बद्ध सिलिका कणों का कण आकार वितरण चित्र 2.3(A) में दर्शाया गया है। आयतनिक कण आकार वितरण वक्रों से पता चलता है कि रासायनिक संशोधन के बाद सिलिका कणों का आकार बढ़ गया (चित्र 3A)। वर्तमान अध्ययन और पिछले अध्ययन से प्राप्त सिलिका कण आकार वितरण डेटा की तुलना तालिका 1(A) में की गई है। PMP का आयतनिक कण आकार d(0.5) 3.36 µm था, जबकि हमारे पिछले अध्ययन (पॉलीस्टाइरीन बंधित सिलिका कण)34 में ad(0.5) का मान 3.05 µm था। अभिक्रिया मिश्रण में PEG, यूरिया, TMOS और एसिटिक अम्ल के अनुपात में परिवर्तन के कारण, इस बैच का कण आकार वितरण हमारे पिछले अध्ययन की तुलना में संकरा था। PMP चरण का कण आकार हमारे द्वारा पहले अध्ययन किए गए पॉलीस्टाइरीन बंधित सिलिका कण चरण की तुलना में थोड़ा बड़ा है। इसका अर्थ यह है कि स्टाइरीन के साथ सिलिका कणों के सतही कार्यात्मककरण ने सिलिका सतह पर केवल एक पॉलीस्टाइरीन परत (0.97 µm) जमा की, जबकि PMP चरण में परत की मोटाई 1.38 µm थी।
शुद्ध सिलिका कणों और लिगैंड-बद्ध सिलिका कणों का कण आकार वितरण (A) और छिद्र आकार वितरण (B)।
इस अध्ययन में प्रयुक्त सिलिका कणों के छिद्र आकार, छिद्र आयतन और सतह क्षेत्र को तालिका 1 (B) में दर्शाया गया है। शुद्ध सिलिका कणों और लिगैंड-बद्ध सिलिका कणों के PSD प्रोफाइल चित्र 3 (B) में दर्शाए गए हैं। परिणाम हमारे पिछले अध्ययन34 के समान थे। शुद्ध और लिगैंड-बद्ध सिलिका कणों के छिद्र आकार क्रमशः 310 Å और 241 Å थे, जो दर्शाता है कि रासायनिक संशोधन के बाद छिद्र आकार 69 Å कम हो गया, जैसा कि तालिका 1 (B) में दर्शाया गया है, और शिफ्ट वक्र चित्र में दिखाया गया है। वर्तमान अध्ययन में सिलिका कणों का विशिष्ट सतह क्षेत्र 116 m2/g है, जो हमारे पिछले अध्ययन (124 m2/g) के समान है। जैसा कि तालिका 1 (B) में दर्शाया गया है, रासायनिक संशोधन के बाद सिलिका कणों का सतह क्षेत्र (m2/g) भी 116 m2/g से घटकर 105 m2/g हो गया।
स्थिर चरण के मौलिक विश्लेषण के परिणाम तालिका 2 में प्रस्तुत किए गए हैं। वर्तमान स्थिर चरण में कार्बन की मात्रा 6.35% है, जो हमारे पिछले अध्ययन (पॉलीस्टाइरीन से जुड़े सिलिका कण, क्रमशः 7.93%35 और 10.21%)42 की तुलना में कम है। वर्तमान स्थिर चरण में कार्बन की मात्रा कम है, क्योंकि एसपी के निर्माण में स्टाइरीन के अतिरिक्त कुछ ध्रुवीय लिगेंड जैसे फेनिलमेलिमाइड मिथाइल विनाइल आइसोसाइनेट (पीसीएमपी) और 4-हाइड्रॉक्सी-टीईएमपीओ का उपयोग किया गया है। वर्तमान स्थिर चरण में नाइट्रोजन का भार प्रतिशत 2.21% है, जबकि पिछले अध्ययनों42 में यह 0.1735 और 0.85% था। इसका अर्थ है कि फेनिलमेलिमाइड के कारण वर्तमान स्थिर चरण में नाइट्रोजन का भार प्रतिशत अधिक है। इसी प्रकार, उत्पाद (4) और (5) में कार्बन की मात्रा क्रमशः 2.7% और 2.9% है, जबकि अंतिम उत्पाद (6) में कार्बन की मात्रा 6.35% है, जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है। भार में कमी का परीक्षण करने के लिए PMP के स्थिर चरण पर थर्मोग्रैविमेट्रिक विश्लेषण (TGA) का उपयोग किया गया था, और TGA वक्र चित्र 4 में दिखाया गया है। TGA वक्र 8.6% भार में कमी दर्शाता है, जो कार्बन की मात्रा (6.35%) के साथ अच्छी तरह से मेल खाता है, क्योंकि लिगेंड में न केवल C, बल्कि N, O और H भी होते हैं।
सिलिका कणों की सतह को संशोधित करने के लिए लिगैंड फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइल आइसोसाइनेट को चुना गया, क्योंकि इसमें ध्रुवीय फेनिलमेलिमाइड और विनाइल आइसोसाइनेट समूह होते हैं। विनाइल आइसोसाइनेट समूह जीवित मूलक बहुलकीकरण द्वारा स्टाइरीन के साथ आगे अभिक्रिया कर सकते हैं। दूसरा कारण यह है कि एक ऐसा समूह डाला जाए जिसकी विश्लेष्य पदार्थ के साथ मध्यम अंतःक्रिया हो और विश्लेष्य पदार्थ तथा स्थिर अवस्था के बीच कोई प्रबल विद्युतस्थैतिक अंतःक्रिया न हो, क्योंकि सामान्य pH पर फेनिलमेलिमाइड अंश पर कोई आभासी आवेश नहीं होता है। स्थिर अवस्था की ध्रुवीयता को स्टाइरीन की इष्टतम मात्रा और मुक्त मूलक बहुलकीकरण के अभिक्रिया समय द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। अभिक्रिया का अंतिम चरण (मुक्त मूलक बहुलकीकरण) महत्वपूर्ण है क्योंकि यह स्थिर अवस्था की ध्रुवीयता को बदल देता है। इन स्थिर अवस्थाओं में कार्बन की मात्रा की जाँच के लिए मौलिक विश्लेषण किया गया। यह देखा गया है कि स्टाइरीन की मात्रा और अभिक्रिया समय बढ़ाने से स्थिर अवस्था में कार्बन की मात्रा बढ़ जाती है और इसके विपरीत भी होता है। स्टाइरीन की विभिन्न सांद्रताओं से तैयार किए गए एसपी में कार्बन की मात्रा भिन्न-भिन्न होती है। इसी प्रकार, इन स्थिर अवस्थाओं को स्टेनलेस स्टील के स्तंभों पर रखकर उनकी क्रोमैटोग्राफिक विशेषताओं (चयनात्मकता, विभेदन, एन मान आदि) की जाँच की गई। इन प्रयोगों के आधार पर, पीएमपी स्थिर अवस्था के निर्माण के लिए एक अनुकूलित संरचना का चयन किया गया ताकि नियंत्रित ध्रुवीयता और विश्लेष्य पदार्थ का अच्छा प्रतिधारण सुनिश्चित हो सके।
मोबाइल फेज की क्षमता 60/40 (v/v) ACN/जल (0.1% TFA) का उपयोग करते हुए, 80 µl/min की प्रवाह दर पर, PMP कॉलम का मूल्यांकन पाँच पेप्टाइड मिश्रणों (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, ल्यूसीन-एनकेफेलिन) के विश्लेषण के लिए भी किया गया। इष्टतम इल्यूशन स्थितियों (200,000 प्लेट/मीटर) के तहत, प्रति कॉलम (100 × 1.8 मिमी) सैद्धांतिक प्लेटों (N) की संख्या 20,000 ± 100 है। तीनों PMP कॉलम के लिए N मान तालिका 3 में दर्शाए गए हैं और क्रोमैटोग्राम चित्र 5A में दिखाए गए हैं। PMP कॉलम पर उच्च प्रवाह दर (700 µl/min) पर तीव्र विश्लेषण में, पाँच पेप्टाइड एक मिनट के भीतर एल्यूट हो गए, प्रति कॉलम (100 x 1.8 mm व्यास) 13,500 ± 330 का उत्कृष्ट N मान प्राप्त हुआ, जो 135,000 प्लेट/मीटर के समतुल्य है (चित्र 5B)। पुनरुत्पादकता का परीक्षण करने के लिए समान आकार (आंतरिक व्यास 100 x 1.8 mm) के तीन कॉलमों को PMP स्थिर चरण के तीन अलग-अलग बैचों से भरा गया। प्रत्येक कॉलम के लिए विश्लेषकों को इष्टतम एल्यूशन स्थितियों, सैद्धांतिक प्लेटों की संख्या N और प्रतिधारण समय का उपयोग करके समान परीक्षण मिश्रण को प्रत्येक कॉलम पर पृथक करके रिकॉर्ड किया गया। PMP कॉलम के लिए पुनरुत्पादकता डेटा तालिका 4 में दिखाया गया है। PMP कॉलम की पुनरुत्पादकता बहुत कम %RSD मानों के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित है, जैसा कि तालिका 3 में दिखाया गया है।
पीएमपी कॉलम (बी) और एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम (ए) पर पेप्टाइड मिश्रणों का पृथक्करण, मोबाइल चरण 60/40 एसीएन/एच2ओ (टीएफए 0.1%), पीएमपी कॉलम आयाम (100 x 1.8 मिमी आईडी), यौगिकों का विश्लेषण इल्यूशन क्रम: 1 (ग्लाइ-टायर), 2 (ग्लाइ-ल्यू-टायर), 3 (ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्जिनिन), 4 (टायरिनिन-आइल-ग्लाइ-सेरीन-आर्जिनिन) और 5 (ल्यूसिक एसिड एनकेफेलिन)।
मानव सीरम एल्ब्यूमिन के ट्रिप्टिक हाइड्रोलाइज़ेट के पृथक्करण के लिए एचपीएलसी द्वारा एक पीएमपी कॉलम (आंतरिक व्यास 100 x 1.8 मिमी) का मूल्यांकन किया गया। चित्र 6 में क्रोमैटोग्राम दर्शाता है कि नमूने बहुत अच्छे रिज़ॉल्यूशन के साथ अच्छी तरह से अलग हो गए हैं। एचएसए विलयनों का विश्लेषण 100 μl/min की प्रवाह दर, 70/30 एसीटोनिट्राइल/जल के मोबाइल चरण और 0.1% टीएफए का उपयोग करके किया गया। एचएसए का विखंडन 17 चोटियों में विभाजित किया गया, जैसा कि क्रोमैटोग्राम (चित्र 6) में दिखाया गया है, जो 17 पेप्टाइड के अनुरूप हैं। एचएसए हाइड्रोलाइज़ेट से अलग-अलग चोटियों की पृथक्करण दक्षता की गणना की गई और मान तालिका 5 में दिखाए गए हैं।
एचएसए ट्रिप्टिक हाइड्रोलाइज़ेट्स को पीएमपी कॉलम (आंतरिक व्यास 100 x 1.8 मिमी), प्रवाह दर (100 μl/min), मोबाइल चरण 60/40 एसीटोनिट्राइल/पानी और 0.1% टीएफए पर अलग किया गया था।
जहां L स्तंभ की लंबाई है, η गतिशील चरण की श्यानता है, ΔP स्तंभ का पश्च दाब है, और u गतिशील चरण का रेखीय वेग है। PMP स्तंभ की पारगम्यता 2.5 × 10–14 m2 थी, प्रवाह दर 25 µl/min थी, और 60/40 v/v ACN/जल का प्रयोग किया गया था। PMP स्तंभ (ID 100 × 1.8 mm) की पारगम्यता हमारे पिछले संदर्भ34 अध्ययन के समान थी। सतही छिद्रयुक्त कणों से भरे स्तंभ की पारगम्यता 1.7×10 .6 µm है, जबकि 5 µm कणों के लिए यह 2.5×10-14 m2 है43। इसलिए, PMP चरण की पारगम्यता 5 µm आकार के कोर-शेल कणों की पारगम्यता के समान है।
जहां Wx क्लोरोफॉर्म से भरे कॉलम का द्रव्यमान है, Wy मेथनॉल से भरे कॉलम का द्रव्यमान है, और ρ विलायक का घनत्व है। मेथनॉल का घनत्व (ρ = 0.7866) और क्लोरोफॉर्म का घनत्व (ρ = 1.484) है। सिलिका-C18 कण कॉलम (100 × 1.8 मिमी आंतरिक व्यास)34 और हमारे पहले अध्ययन किए गए C18-यूरिया31 कॉलम की कुल सरंध्रता क्रमशः 0.63 और 0.55 थी। इसका अर्थ है कि यूरिया लिगेंड की उपस्थिति स्थिर चरण की पारगम्यता को कम करती है। दूसरी ओर, PMP कॉलम (आंतरिक व्यास 100 × 1.8 मिमी) की कुल सरंध्रता 0.60 है। PMP कॉलम, C18 से बंधे सिलिका कणों से भरे कॉलम की तुलना में कम पारगम्य होते हैं क्योंकि C18 प्रकार के स्थिर चरणों में C18 लिगैंड सिलिका कणों से रैखिक श्रृंखलाओं में जुड़े होते हैं, जबकि पॉलीस्टाइरीन प्रकार के स्थिर चरणों में कणों के चारों ओर एक अपेक्षाकृत मोटी बहुलक परत A बनती है। एक विशिष्ट प्रयोग में, कॉलम की सरंध्रता की गणना इस प्रकार की जाती है:
चित्र 7A और 7B में, समान इल्यूशन स्थितियों (60/40 ACN/H2O और 0.1% TFA, 20 µl/min से 800 µl/min) के तहत PMP कॉलम (100 x 1.8 mm आंतरिक व्यास) और Ascentis Express RP-Amide कॉलम (100 x 1.8 mm आंतरिक व्यास) के लिए वैन डीमटर प्लॉट दिखाए गए हैं। इष्टतम प्रवाह दर (80 µl/min) पर न्यूनतम HETP मान PMP कॉलम के लिए 2.6 µm और Ascentis Express RP-Amide कॉलम के लिए 3.9 µm थे। HETP मान दर्शाते हैं कि PMP कॉलम (100 x 1.8 mm आंतरिक व्यास) की पृथक्करण दक्षता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Ascentis Express RP-Amide कॉलम (100 x 1.8 mm आंतरिक व्यास) की तुलना में कहीं अधिक है। चित्र 7(A) में वैन डीमटर ग्राफ दर्शाता है कि प्रवाह बढ़ने के साथ N मान में कमी हमारे पिछले अध्ययन की तुलना में उल्लेखनीय रूप से अधिक नहीं है। एसेन्टिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम की तुलना में PMP कॉलम (आईडी 100 × 1.8 मिमी) की उच्च पृथक्करण दक्षता, वर्तमान कार्य में उपयोग किए गए बेहतर कण आकार और परिष्कृत कॉलम पैकिंग प्रक्रिया पर आधारित है।34
(A) 0.1% TFA युक्त 60/40 ACN/H2O में PMP कॉलम (आईडी 100 x 1.8 मिमी) पर प्राप्त वैन डीमटर प्लॉट (HETP बनाम मोबाइल फेज लीनियर वेलोसिटी)। (B) 0.1% TFA युक्त 60/40 ACN/H2O में एसेंटिस एक्सप्रेस RP-Amide कॉलम (आईडी 100 x 1.8 मिमी) पर प्राप्त वैन डीमटर प्लॉट (HETP बनाम मोबाइल फेज लीनियर वेलोसिटी)।
इंटरकैलेटेड पॉलीस्टाइरीन के एक ध्रुवीय स्थिर चरण को तैयार किया गया और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (PMP) में सिंथेटिक पेप्टाइड और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (HSA) के ट्रिप्टिक हाइड्रोलाइज़ेट के मिश्रण के पृथक्करण के लिए इसका मूल्यांकन किया गया। पेप्टाइड मिश्रणों के लिए PMP कॉलम का क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन पृथक्करण दक्षता और रिज़ॉल्यूशन के मामले में उत्कृष्ट है। PMP कॉलम की बेहतर पृथक्करण दक्षता कई कारणों से है, जैसे कि सिलिका कणों का आकार और छिद्र का आकार, स्थिर चरणों का नियंत्रित संश्लेषण और जटिल कॉलम पैकिंग सामग्री। उच्च पृथक्करण दक्षता के अलावा, इस स्थिर चरण का एक और लाभ उच्च प्रवाह दरों पर कम कॉलम बैक प्रेशर है। PMP कॉलम अत्यधिक पुनरुत्पादनीय हैं और इनका उपयोग पेप्टाइड के मिश्रण और विभिन्न प्रोटीनों के ट्रिप्टिक पाचन के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। हम तरल क्रोमैटोग्राफी में प्राकृतिक उत्पादों, औषधीय पौधों और मशरूम के अर्क से जैवसक्रिय यौगिकों के पृथक्करण के लिए इस कॉलम का उपयोग करने का इरादा रखते हैं। भविष्य में, प्रोटीन और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के पृथक्करण के लिए भी PMP कॉलम का मूल्यांकन किया जाएगा।
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