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Poröse Silicapartikel wurden mittels Sol-Gel-Verfahren mit einigen Modifikationen zur Herstellung von Partikeln mit großen Poren hergestellt. Diese Partikel wurden mit N-Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PMI) und Styrol über RAFT-Polymerisation (Reverse Chain Transfer Fragmentation) derivatisiert, um N-Phenylmaleimid-interkalierte Polyamide zu erzeugen. Als stationäre Phase diente Styrol (PMP). Edelstahlsäulen mit engem Innendurchmesser (100 × 1,8 mm) wurden mit einer Suspension gepackt. Die chromatographische Leistung der PMP-Säule wurde anhand der Trennung eines Gemisches synthetischer Peptide, bestehend aus fünf Peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu-Aminosäure-Enkephalin) und tryptischem Hydrolysat von humanem Serumalbumin (HAS), untersucht. Unter optimalen Elutionsbedingungen erreichte die theoretische Bodenzahl mit einem Peptidgemisch 280.000 Böden/m². Beim Vergleich der Trennleistung der entwickelten Säule mit der kommerziellen Ascentis Express RP-Amide-Säule zeigte sich, dass die Trenneffizienz der PMP-Säule hinsichtlich Trennleistung und Auflösung der kommerziellen Säule überlegen war.
Die biopharmazeutische Industrie hat sich in den letzten Jahren zu einem expandierenden globalen Markt mit signifikant gestiegenen Marktanteilen entwickelt. Mit dem rasanten Wachstum der biopharmazeutischen Industrie^1,2,3 besteht ein großer Bedarf an Peptid- und Proteinanalysen. Neben dem Zielpeptid entstehen während der Peptidsynthese verschiedene Verunreinigungen, weshalb eine chromatographische Reinigung erforderlich ist, um die gewünschte Peptidreinheit zu erreichen. Die Analyse und Charakterisierung von Proteinen in Körperflüssigkeiten, Geweben und Zellen stellt aufgrund der Vielzahl potenziell nachweisbarer Spezies in einer einzelnen Probe eine große Herausforderung dar. Obwohl die Massenspektrometrie ein effektives Werkzeug zur Sequenzierung von Peptiden und Proteinen ist, ist die Trennung unzureichend, wenn solche Proben direkt in das Massenspektrometer eingebracht werden. Dieses Problem lässt sich durch eine vorgeschaltete Flüssigkeitschromatographie (LC) lösen, wodurch die Menge der Analyten, die zu einem bestimmten Zeitpunkt in das Massenspektrometer gelangen, reduziert wird^4,5,6. Darüber hinaus können sich die Analyten während der Flüssigphasentrennung in einem engen Bereich konzentrieren, was zu einer höheren Konzentration und damit zu einer höheren Empfindlichkeit der MS-Detektion führt. Die Flüssigkeitschromatographie (LC) hat sich im letzten Jahrzehnt deutlich weiterentwickelt und ist zu einer weit verbreiteten Methode für die Proteomanalyse geworden7,8,9,10.
Die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (RP-LC) wird häufig zur Reinigung und Trennung von Peptidgemischen eingesetzt, wobei octadecylmodifiziertes Silicagel (ODS) als stationäre Phase dient^11,12,13. Aufgrund ihrer komplexen Struktur und amphoteren Natur^14,15 können RP-Phasen jedoch keine zufriedenstellende Trennung von Peptiden und Proteinen gewährleisten. Daher erfordert die Analyse von Peptiden und Proteinen mit polaren und unpolaren Fragmenten speziell entwickelte stationäre Phasen, die mit diesen Analyten interagieren und sie zurückhalten¹⁶. Die Mischchromatographie, die multimodale Interaktionen ermöglicht, kann eine Alternative zur RP-LC für die Trennung von Peptiden, Proteinen und anderen komplexen Gemischen darstellen. Verschiedene stationäre Phasen vom Mischtyp wurden hergestellt und mit diesen gefüllte Säulen zur Trennung von Peptiden und Proteinen verwendet^{17,18,19,20,21}. Aufgrund des Vorhandenseins polarer und unpolarer Gruppen eignen sich stationäre Phasen im Mischmodus (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polare Interkalation/RPLC) zur Trennung von Peptiden und Proteinen^{22,23,24,25,26,27,28}. Polar interkalierte stationäre Phasen mit kovalent gebundenen polaren Gruppen weisen gute Trenneigenschaften und eine einzigartige Selektivität für polare und unpolare Analyten auf, da die Trennung von der Wechselwirkung zwischen Analyt und stationärer Phase abhängt (multimodale Wechselwirkungen^29,30,31,32). Kürzlich synthetisierten Zhang et al.³⁰ Behenyl-terminierte stationäre Phasen aus Polyaminen und trennten damit erfolgreich Kohlenwasserstoffe, Antidepressiva, Flavonoide, Nukleoside, Östrogene und weitere Analyten. Das polar eingebettete stationäre Material besitzt sowohl polare als auch unpolare Gruppen und kann daher zur Trennung von Peptiden und Proteinen in hydrophobe und hydrophile Bereiche verwendet werden. Polare Inline-Säulen (z. B. C18-Säulen mit Amid-Inline) sind unter dem Handelsnamen Ascentis Express RP-Amide-Säulen erhältlich, diese Säulen wurden jedoch bisher nur für die Analyse von Amin 33 verwendet.
In der vorliegenden Studie wurde eine polare stationäre Phase (N-Phenylmaleimid, eingebettetes Polystyrol) hergestellt und hinsichtlich ihrer Eignung zur Peptidseparation und tryptischen HSA-Spaltung untersucht. Die stationäre Phase wurde nach folgendem Schema hergestellt: Poröse Silicapartikel wurden gemäß den in unseren früheren Publikationen beschriebenen Verfahren, jedoch mit einigen Modifikationen der Herstellungsschemata^{31, 34, 35, 36, 37, 38, 39}, präpariert. Die Verhältnisse von Harnstoff, Polyethylenglykol (PEG), TMOS und wässriger Essigsäure wurden so angepasst, dass Silicapartikel mit großen Porengrößen erhalten wurden. Anschließend wurde ein neuer Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat-Ligand synthetisiert und dessen derivatisierte Silicapartikel zur Herstellung polarer stationärer Phasen verwendet. Die erhaltene stationäre Phase wurde gemäß einem optimierten Packungsschema in eine Edelstahlsäule (Innendurchmesser 100 × 1,8 mm) gepackt. Die Packung der Säule wurde durch mechanische Vibration unterstützt, um eine gleichmäßige Schichtbildung zu gewährleisten. Die gepackte Säule wurde hinsichtlich der Trennung eines Peptidgemisches aus fünf Peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin-Peptid) und tryptischen Hydrolysaten von humanem Serumalbumin (HSA) untersucht. Es zeigte sich, dass das Peptidgemisch und das HSA-Tryptic-Digest mit guter Auflösung und hoher Effizienz getrennt werden konnten. Die Trenneffizienz der PMP-Säule wurde mit der der Ascentis Express RP-Amide-Säule verglichen. Dabei zeigte sich, dass Peptide und Proteine ​​auf der PMP-Säule eine gute Auflösung und hohe Trenneffizienz aufweisen, wobei die Trenneffizienz der PMP-Säule höher ist als die der Ascentis Express RP-Amide-Säule.
PEG (Polyethylenglykol), Harnstoff, Essigsäure, Trimethoxyorthosilikat (TMOS), Trimethylchlorsilan (TMCS), Trypsin, Humanserumalbumin (HSA), Ammoniumchlorid, Harnstoff, Hexamethylmethacryloyldisilazan (HMDS), Methacryloylchlorid (MC), Styrol, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoylperoxid (BPO), Acetonitril (ACN) für HPLC, Methanol, 2-Propanol und Aceton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
Eine Mischung aus Harnstoff (8 g), Polyethylenglykol (8 g) und 8 ml 0,01 N Essigsäure wurde 10 Minuten gerührt. Anschließend wurden unter Eiskühlung 24 ml TMOS zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde in einem Edelstahlautoklaven 6 Stunden bei 40 °C und danach 8 Stunden bei 120 °C erhitzt. Das Wasser wurde abdekantiert und der Rückstand 12 Stunden bei 70 °C getrocknet. Die getrockneten, weichen Blöcke wurden fein vermahlen und 12 Stunden bei 550 °C im Ofen kalziniert. Drei Chargen wurden hergestellt und charakterisiert, um die Reproduzierbarkeit von Partikelgröße, Porengröße und Oberfläche zu prüfen.
Polare Gruppe und stationäre Phase für Polystyrolketten. Das Herstellungsverfahren wird im Folgenden beschrieben.
N-Phenylmaleimid (200 mg) und Methylvinylisocyanat (100 mg) wurden in wasserfreiem Toluol gelöst. Anschließend wurden 0,1 ml 2,2′-Azoisobutyronitril (AIBN) zugegeben, um ein Copolymer aus Phenylmaleimid und Methylvinylisocyanat (PMCP) zu erhalten. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 60 °C erhitzt, filtriert und 3 Stunden bei 40 °C im Trockenschrank getrocknet.
Getrocknete Silicapartikel (2 g) wurden in trockenem Toluol (100 ml) dispergiert, gerührt und 10 min in einem 500-ml-Rundkolben ultraschallbehandelt. PMCP (10 mg) wurde in Toluol gelöst und tropfenweise über einen Tropftrichter in den Reaktionskolben gegeben. Das Gemisch wurde 8 Stunden bei 100 °C unter Rückfluss erhitzt, filtriert, mit Aceton gewaschen und 3 Stunden bei 60 °C getrocknet. Anschließend wurden die mit PMCP (100 g) assoziierten Silicapartikel in Toluol (200 ml) gelöst und 4-Hydroxy-TEMPO (2 ml) in Gegenwart von 100 μl Dibutylzinndilaurat als Katalysator zugegeben. Das Gemisch wurde 8 Stunden bei 50 °C gerührt, filtriert und 3 Stunden bei 50 °C getrocknet.
Styrol (1 ml), Benzoylperoxid (BPO, 0,5 ml) und an TEMPO-PMCP gebundene Silicapartikel (1,5 g) wurden in Toluol dispergiert und mit Stickstoff gespült. Die Polymerisation des Styrols erfolgte 12 Stunden lang bei 100 °C. Das resultierende Produkt wurde mit Methanol gewaschen und über Nacht bei 60 °C getrocknet. Das allgemeine Reaktionsschema ist in Abb. 1 dargestellt.
Die Proben wurden 1 h lang bei 393 K entgast, bis ein Restdruck von weniger als 10⁻³ Torr erreicht war. Die Menge des bei einem relativen Druck von P/P₀ = 0,99 adsorbierten N₂ wurde zur Bestimmung des Gesamtporenvolumens verwendet. Die Morphologie reiner und ligandengebundener Siliciumdioxidpartikel wurde mit einem Rasterelektronenmikroskop (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan) untersucht. Trockene Proben (reines Siliciumdioxid und ligandengebundene Siliciumdioxidpartikel) wurden mithilfe von Kohlenstoffklebeband auf Aluminiumstäben fixiert. Anschließend wurde mit einer Q150T-Sputteranlage Gold abgeschieden, wodurch eine 5 nm dicke Au-Schicht entstand. Dies verbessert die Effizienz des Niederspannungsprozesses und ermöglicht ein feines Kaltsprühen. Die Elementaranalyse erfolgte mit einem Elementaranalysator Flash EA1112 von Thermo Electron (Waltham, MA, USA). Die Partikelgrößenverteilung wurde mit einem Partikelgrößenanalysator Mastersizer 2000 von Malvern (Worcestershire, UK) bestimmt. Unbeschichtete und ligandengebundene Siliciumdioxidpartikel (jeweils 5 mg) wurden in 5 ml Isopropanol dispergiert, 10 Minuten lang ultraschallbehandelt, 5 Minuten lang gerührt und auf einen Mastersizer-Optiktisch platziert. Die thermogravimetrische Analyse wurde mit einer Heizrate von 5 °C pro Minute im Temperaturbereich von 30 bis 800 °C durchgeführt.
Glasfaserbeschichtete Edelstahlsäulen mit engem Innendurchmesser (100 × 1,8 mm) wurden nach dem gleichen Verfahren wie in Referenz 31 beschrieben mittels Slurry-Füllung gepackt. Die Edelstahlsäule (glasfaserbeschichtet, Innendurchmesser 100 × 1,8 mm) mit einem Auslass, der eine 1-µm-Fritte enthielt, wurde an eine Slurry-Packmaschine (Alltech, Deerfield, IL, USA) angeschlossen. Zur Herstellung einer Suspension der stationären Phase wurden 150 mg der stationären Phase in 1,2 ml Methanol suspendiert und in eine Vorratssäule gegeben. Methanol diente als Lösungsmittel für die Suspension und als Kontrolllösungsmittel. Die Säule wurde mit folgendem Druck gepackt: 10 min bei 100 MPa, 15 min bei 80 MPa und 30 min bei 60 MPa. Für die mechanische Vibration während des Packvorgangs wurden zwei Gaschromatographie-Säulenvibratoren (Alltech, Deerfield, IL, USA) eingesetzt, um eine gleichmäßige Packung der Säule zu gewährleisten. Schließen Sie den Schlammpacker und lassen Sie den Druck langsam ab, um Beschädigungen des Strangs zu vermeiden. Die Säule wurde von der Schlammdüse getrennt, und ein weiteres Verbindungsstück wurde am Einlass angebracht und mit dem LC-System verbunden, um dessen Funktion zu testen.
Eine kundenspezifische MLC wurde mit einer LC-Pumpe (10AD Shimadzu, Japan), einem Probengeber mit einer 50-nL-Injektionsschleife (Valco (USA) C14 W.05), einem Membranentgaser (Shimadzu DGU-14A), einem UV-VIS-Kapillarfenster, einem Detektor (UV-2075) und einer emaillierten Mikrosäule aufgebaut. Um den Einfluss einer zusätzlichen Säulenexpansion zu minimieren, wurden sehr enge und kurze Verbindungsschläuche verwendet. Nach dem Befüllen der Säule wurde eine Kapillare (50 µm, ID 365) am Auslass der 1/16″-Reduzierverbindung und eine weitere Kapillare (50 µm) an der Reduktionsverbindung installiert. Die Datenerfassung und Chromatogrammverarbeitung erfolgten mit der Software Multichro 2000. Die UV-Absorption der Analyten wurde bei 254 nm gemessen. Die chromatographischen Daten wurden mit OriginPro8 (Northampton, MA) analysiert.
3 mg humanes Serumalbumin, lyophilisiertes Pulver, ≥ 96 % (Agarose-Gelelektrophorese), wurden mit Trypsin (1,5 mg), 4,0 M Harnstoff (1 ml) und 0,2 M Ammoniumbicarbonat (1 ml) vermischt. Die Lösung wurde 10 min gerührt und 6 h in einem Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion mit 1 ml 0,1%iger Trifluoressigsäure (TFA) gestoppt. Die Lösung wurde filtriert und unter 4 °C gelagert.
Die Trennung eines Peptidgemisches und eines tryptischen HSA-Digests an einer PMP-Säule wurde separat evaluiert. Überprüfen Sie die tryptische Hydrolyse eines Peptidgemisches und HSA, das mittels einer PMP-Säule getrennt wurde, und vergleichen Sie die Ergebnisse mit denen einer Ascentis Express RP-Amide-Säule. Die Anzahl der theoretischen Böden wird anhand der folgenden Gleichung berechnet:
Abbildung 2 zeigt REM-Aufnahmen von reinen Siliciumdioxidpartikeln und Liganden-gebundenen Siliciumdioxidpartikeln. Die REM-Aufnahmen der reinen Siliciumdioxidpartikel (A, B) zeigen eine sphärische Form, wobei die Partikel im Vergleich zu unseren früheren Untersuchungen länglich erscheinen oder eine unregelmäßige Symmetrie aufweisen. Die Oberfläche der Liganden-gebundenen Siliciumdioxidpartikel (C, D) ist glatter als die der reinen Siliciumdioxidpartikel, was auf die Polystyrolketten zurückzuführen sein könnte, die die Oberfläche der Siliciumdioxidpartikel bedecken.
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von reinen Siliciumdioxidpartikeln (A, B) und Liganden-gebundenen Siliciumdioxidpartikeln (C, D).
Die Partikelgrößenverteilung von reinen und ligandengebundenen Siliciumdioxidpartikeln ist in Abb. 2.3(A) dargestellt. Die volumetrischen Partikelgrößenverteilungskurven zeigen, dass die Siliciumdioxidpartikelgröße nach der chemischen Modifizierung zunimmt (Abb. 3A). Die Daten zur Siliciumdioxidpartikelgrößenverteilung aus der vorliegenden und einer früheren Studie sind in Tabelle 1(A) verglichen. Die volumetrische Partikelgröße d(0,5) von PMP betrug 3,36 µm, verglichen mit einem ad(0,5)-Wert von 3,05 µm in unserer vorherigen Studie (Polystyrol-gebundene Siliciumdioxidpartikel)³⁴. Aufgrund der Änderung des Verhältnisses von PEG, Harnstoff, TMOS und Essigsäure im Reaktionsgemisch war die Partikelgrößenverteilung dieser Charge im Vergleich zu unserer vorherigen Studie enger. Die Partikelgröße der PMP-Phase ist etwas größer als die der Polystyrol-gebundenen Siliciumdioxidpartikelphase, die wir zuvor untersucht haben. Dies bedeutet, dass bei der Oberflächenfunktionalisierung von Silicapartikeln mit Styrol lediglich eine Polystyrolschicht (0,97 µm) auf der Silicaoberfläche abgeschieden wurde, während in der PMP-Phase die Schichtdicke 1,38 µm betrug.
Partikelgrößenverteilung (A) und Porengrößenverteilung (B) von reinen Silicapartikeln und Liganden-gebundenen Silicapartikeln.
Die Porengröße, das Porenvolumen und die Oberfläche der in dieser Studie verwendeten Siliciumdioxidpartikel sind in Tabelle 1 (B) dargestellt. Die Porengrößenverteilungsprofile (PSD) von reinen und ligandengebundenen Siliciumdioxidpartikeln sind in Abb. 3 (B) zu sehen. Die Ergebnisse sind mit unserer vorherigen Studie³⁴ vergleichbar. Die Porengrößen der reinen und ligandengebundenen Siliciumdioxidpartikel betrugen 310 Å bzw. 241 Å. Dies zeigt, dass sich die Porengröße nach der chemischen Modifizierung um 69 Å verringerte (siehe Tabelle 1 (B)). Die Verschiebungskurve ist in Abb. 3 dargestellt. Die spezifische Oberfläche der Siliciumdioxidpartikel in der vorliegenden Studie beträgt 116 m²/g und ist damit vergleichbar mit unserer vorherigen Studie (124 m²/g). Wie Tabelle 1 (B) zeigt, verringerte sich die Oberfläche (m²/g) der Siliciumdioxidpartikel nach der chemischen Modifizierung ebenfalls von 116 m²/g auf 105 m²/g.
Die Ergebnisse der Elementaranalyse der stationären Phase sind in Tabelle 2 dargestellt. Der Kohlenstoffgehalt der aktuellen stationären Phase beträgt 6,35 % und ist damit niedriger als in unserer vorherigen Studie (Silicapartikel in Verbindung mit Polystyrol: 7,93 %³⁵ bzw. 10,21 %)⁴². Der niedrigere Kohlenstoffgehalt der aktuellen stationären Phase ist darauf zurückzuführen, dass bei der Herstellung der stationären Phase neben Styrol auch polare Liganden wie Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PCMP) und 4-Hydroxy-TEMPO verwendet wurden. Der Stickstoffanteil in der aktuellen stationären Phase beträgt 2,21 Gew.-%, verglichen mit 0,1735 % und 0,85 % in früheren Studien⁴². Dies bedeutet, dass die aktuelle stationäre Phase aufgrund des Phenylmaleimids einen hohen Stickstoffanteil aufweist. Die Produkte (4) und (5) weisen analog dazu einen Kohlenstoffgehalt von 2,7 % bzw. 2,9 % auf, während das Endprodukt (6) einen Kohlenstoffgehalt von 6,35 % aufweist (siehe Tabelle 2). Die thermogravimetrische Analyse (TGA) der stationären Phase von PMP wurde zur Bestimmung des Gewichtsverlusts eingesetzt; die TGA-Kurve ist in Abbildung 4 dargestellt. Sie zeigt einen Gewichtsverlust von 8,6 %, was gut mit dem Kohlenstoffgehalt (6,35 %) übereinstimmt, da die Liganden neben Kohlenstoff auch Stickstoff, Sauerstoff und Wasserstoff enthalten.
Der Ligand Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat wurde aufgrund seiner polaren Phenylmaleimid- und Vinylisocyanatgruppen zur Modifizierung der Oberfläche der Silicapartikel ausgewählt. Vinylisocyanatgruppen können durch lebende radikalische Polymerisation mit Styrol weiterreagieren. Ein weiterer Grund für die Wahl des Liganden ist die Einführung einer Gruppe, die moderate Wechselwirkungen mit dem Analyten aufweist und keine starken elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem Analyten und der stationären Phase hervorruft, da die Phenylmaleimid-Gruppe bei normalem pH-Wert keine virtuelle Ladung besitzt. Die Polarität der stationären Phase lässt sich durch die optimale Styrolmenge und die Reaktionszeit der radikalischen Polymerisation steuern. Der letzte Reaktionsschritt (radikalische Polymerisation) ist kritisch, da er die Polarität der stationären Phase verändert. Zur Bestimmung des Kohlenstoffgehalts der stationären Phasen wurde eine Elementaranalyse durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass eine Erhöhung der Styrolmenge und der Reaktionszeit den Kohlenstoffgehalt der stationären Phase erhöht und umgekehrt. Stationäre Phasen, die mit unterschiedlichen Styrolkonzentrationen hergestellt wurden, weisen unterschiedliche Kohlenstoffbeladungen auf. Diese stationären Phasen wurden analog dazu auf Edelstahlsäulen aufgebracht und ihre chromatographischen Eigenschaften (Selektivität, Auflösung, N-Wert usw.) überprüft. Basierend auf diesen Experimenten wurde eine optimierte Zusammensetzung für die Herstellung der PMP-stationären Phase gewählt, um eine kontrollierte Polarität und eine gute Retention des Analyten zu gewährleisten.
Die PMP-Säule wurde auch für die Analyse von fünf Peptidgemischen (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) unter Verwendung der Kapazität der mobilen Phase (60/40 (v/v) ACN/Wasser (0,1 % TFA) bei einer Flussrate von 80 µl/min) evaluiert. Unter optimalen Elutionsbedingungen (200.000 Böden/m) beträgt die Anzahl der theoretischen Böden (N) pro Säule (100 × 1,8 mm) 20.000 ± 100. Die N-Werte für die drei PMP-Säulen sind in Tabelle 3 und die Chromatogramme in Abbildung 5A dargestellt. Schnelle Analyse bei hoher Flussrate (700 µl/min) auf einer PMP-Säule: Fünf Peptide eluierten innerhalb einer Minute. Ausgezeichneter N-Wert von 13.500 ± 330 pro Säule (100 × 1,8 mm Durchmesser), entsprechend 135.000 Böden/m (Abb. 5B). Drei Säulen gleicher Größe (Innendurchmesser 100 × 1,8 mm) wurden mit drei verschiedenen Chargen PMP-Stationärphase befüllt, um die Reproduzierbarkeit zu testen. Die Analyten wurden für jede Säule aufgezeichnet, indem dieselbe Testmischung unter optimalen Elutionsbedingungen, der Anzahl der theoretischen Böden N und der Retentionszeit auf jeder Säule getrennt wurde. Die Reproduzierbarkeitsdaten für die PMP-Säulen sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Reproduzierbarkeit der PMP-Säule korrelierte gut mit sehr niedrigen %RSD-Werten (siehe Tabelle 3).
Trennung von Peptidgemischen auf einer PMP-Säule (B) und einer Ascentis Express RP-Amide-Säule (A), mobile Phase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), Abmessungen der PMP-Säule (100 x 1,8 mm ID), Analyse Elutionsreihenfolge der Verbindungen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) und 5 (Leucinsäure-Enkephalin).
Eine PMP-Säule (Innendurchmesser 100 × 1,8 mm) wurde für die HPLC-Trennung des tryptischen Hydrolysats von humanem Serumalbumin (HSA) evaluiert. Das Chromatogramm in Abbildung 6 zeigt eine gute Trennung der Proben mit sehr hoher Auflösung. HSA-Lösungen wurden mit einer Flussrate von 100 μl/min und einer mobilen Phase aus 70/30 Acetonitril/Wasser und 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) analysiert. Die Spaltung von HSA ergab 17 Peaks (siehe Chromatogramm, Abb. 6), die 17 Peptiden entsprechen. Die Trenneffizienzen der einzelnen Peaks des HSA-Hydrolysats wurden berechnet und sind in Tabelle 5 dargestellt.
Die HSA-Tryptichydrolysate wurden auf einer PMP-Säule (Innendurchmesser 100 x 1,8 mm) bei einer Flussrate von 100 μl/min getrennt. Als mobile Phase diente ein Gemisch aus Acetonitril und Wasser (60/40) sowie 0,1 % TFA.
Dabei ist L die Säulenlänge, η die Viskosität der mobilen Phase, ΔP der Gegendruck der Säule und u die lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase. Die Permeabilität der PMP-Säule betrug 2,5 × 10⁻¹⁴ m², die Flussrate 25 µl/min und es wurde ein 60/40 v/v ACN/Wasser-Gemisch verwendet. Die Permeabilität der PMP-Säule (ID 100 × 1,8 mm) war vergleichbar mit der unserer vorherigen Studie (Ref. 34). Die Permeabilität einer mit oberflächlich porösen Partikeln gefüllten Säule beträgt 1,7 × 10⁻⁶ µm bzw. 2,5 × 10⁻¹⁴ m² für 5 µm große Partikel (Ref. 43). Daher ist die Permeabilität der PMP-Phase vergleichbar mit der Permeabilität von Kern-Schale-Partikeln mit einer Größe von 5 µm.
Dabei ist Wx die Masse der mit Chloroform gefüllten Säule, Wy die Masse der mit Methanol gefüllten Säule und ρ die Dichte des Lösungsmittels. Die Dichte von Methanol beträgt ρ = 0,7866 und die von Chloroform ρ = 1,484. Die Gesamtporosität der Silica-C18-Partikelsäule (100 × 1,8 mm ID)³⁴ und unserer zuvor untersuchten C18-Harnstoff-Säule³¹ betrug 0,63 bzw. 0,55. Dies bedeutet, dass die Anwesenheit von Harnstoffliganden die Permeabilität der stationären Phase verringert. Die Gesamtporosität der PMP-Säule (Innendurchmesser 100 × 1,8 mm) beträgt hingegen 0,60. PMP-Säulen sind weniger permeabel als Säulen, die mit C18-gebundenen Silicapartikeln gepackt sind, da bei stationären Phasen vom C18-Typ die C18-Liganden in linearen Ketten an die Silicapartikel gebunden sind, während sich bei stationären Phasen vom Polystyrol-Typ eine relativ dicke Polymerschicht um die Partikel bildet. In einem typischen Experiment wird die Säulenporosität wie folgt berechnet:
Abbildung 7A und 7B zeigen Van-Deemter-Diagramme für eine PMP-Säule (Innendurchmesser 100 mm, Außendurchmesser 1,8 mm) und eine Ascentis Express RP-Amid-Säule (Innendurchmesser 100 mm, Außendurchmesser 1,8 mm) unter gleichen Elutionsbedingungen (60/40 ACN/H₂O und 0,1 % TFA, Flussraten von 20 µl/min bis 800 µl/min). Die minimalen HETP-Werte bei der optimalen Flussrate (80 µl/min) betrugen 2,6 µm für die PMP-Säule und 3,9 µm für die Ascentis Express RP-Amid-Säule. Die HETP-Werte belegen, dass die Trennleistung der PMP-Säule (100 mm Innendurchmesser, Außendurchmesser 1,8 mm) deutlich höher ist als die der kommerziell erhältlichen Ascentis Express RP-Amid-Säule (100 mm Innendurchmesser, Außendurchmesser 1,8 mm). Das van-Deemter-Diagramm in Abb. 7(A) zeigt, dass die Abnahme des N-Wertes mit zunehmendem Fluss im Vergleich zu unserer vorherigen Studie nicht signifikant höher ist. Die höhere Trenneffizienz der PMP-Säule (Innendurchmesser 100 × 1,8 mm) im Vergleich zur Ascentis Express RP-Amid-Säule beruht auf der verbesserten Partikelform und -größe sowie dem in der vorliegenden Arbeit angewandten ausgefeilten Säulenpackungsverfahren³⁴.
(A) Van-Deemter-Diagramm (HETP vs. lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase), aufgenommen an einer PMP-Säule (Innendurchmesser 100 mm × 1,8 mm) in 60/40 ACN/H₂O mit 0,1 % TFA. (B) Van-Deemter-Diagramm (HETP vs. lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase), aufgenommen an einer Ascentis Express RP-Amid-Säule (Innendurchmesser 100 mm × 1,8 mm) in 60/40 ACN/H₂O mit 0,1 % TFA.
Eine polare stationäre Phase aus interkaliertem Polystyrol wurde hergestellt und hinsichtlich ihrer Eignung zur Trennung eines Gemisches aus synthetischen Peptiden und tryptischem Hydrolysat von humanem Serumalbumin (HSA) in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) evaluiert. Die chromatographische Leistung der PMP-Säulen für Peptidgemische ist hinsichtlich Trenneffizienz und Auflösung exzellent. Die verbesserte Trenneffizienz der PMP-Säulen ist auf verschiedene Faktoren zurückzuführen, wie z. B. die Partikel- und Porengröße des Silicagels, die kontrollierte Synthese der stationären Phasen und die Verwendung komplexer Säulenpackungsmaterialien. Neben der hohen Trenneffizienz ist ein weiterer Vorteil dieser stationären Phase der niedrige Säulengegendruck bei hohen Flussraten. PMP-Säulen sind hoch reproduzierbar und eignen sich zur Analyse von Peptidgemischen und der tryptischen Verdauung verschiedener Proteine. Wir beabsichtigen, diese Säule zur Trennung bioaktiver Verbindungen aus Naturprodukten, Extrakten aus Heilpflanzen und Pilzen in der Flüssigkeitschromatographie einzusetzen. Zukünftig sollen PMP-Säulen auch für die Trennung von Proteinen und monoklonalen Antikörpern evaluiert werden.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Untersuchung von Systemen zur Peptidtrennung mittels Umkehrphasenchromatographie Teil I: Entwicklung eines Protokolls zur Säulencharakterisierung. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Untersuchung von Systemen zur Peptidtrennung mittels Umkehrphasenchromatographie Teil I: Entwicklung eines Protokolls zur Säulencharakterisierung.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. und Petersson, P. Untersuchung von Peptidtrennsystemen mittels Umkehrphasenchromatographie, Teil I: Entwicklung eines Protokolls zur Säulencharakterisierung. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Untersuchung von Systemen zur Peptidtrennung mittels Umkehrphasenchromatographie Teil I: Entwicklung eines Protokolls für Säulencharakteristika. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Untersuchung von Systemen zur Peptidtrennung mittels Umkehrphasenchromatographie Teil I: Entwicklung eines Protokolls für Säulencharakteristika.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. und Petersson, P. Untersuchung von Peptidtrennsystemen mittels Umkehrphasenchromatographie, Teil I: Entwicklung eines Protokolls zur Säulencharakterisierung.J.色谱法。 1603, 113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
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