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Poröse Silicapartikel wurden mit dem Sol-Gel-Verfahren mit einigen Modifikationen hergestellt, um weitporige Partikel zu erhalten. Diese Partikel wurden mit N-Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PMI) und Styrol über eine umgekehrte Kettentransferfragmentierungspolymerisation (RAFT) derivatisiert, um Polyamide mit N-Phenylmaleimid-Interkalation zu erzeugen. Stationäre Phase aus Styrol (PMP). Edelstahlsäulen mit enger Bohrung (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) wurden mit einer Aufschlämmungspackung gepackt. Die chromatographische Leistung der PMP-Säule wurde bewertet, um ein Gemisch aus synthetischen Peptiden, bestehend aus fünf Peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu-Aminosäure-Enkephalin) und tryptischem Hydrolysat von menschlichem Serumalbumin (HAS), zu trennen. Unter optimalen Elutionsbedingungen erreichte die theoretische Plattenanzahl mit einem Peptidgemisch 280.000 Platten/m². Beim Vergleich der Trennleistung der entwickelten Säule mit der kommerziellen Ascentis Express RP-Amid-Säule wurde festgestellt, dass die Trennleistung der PMP-Säule der kommerziellen Säule hinsichtlich Trennleistung und Auflösung überlegen war.
Die biopharmazeutische Industrie hat sich zu einem expandierenden globalen Markt entwickelt, dessen Marktanteil in den letzten Jahren deutlich gestiegen ist. Mit dem explosionsartigen Wachstum der biopharmazeutischen Industrie1,2,3 besteht ein großer Bedarf an Peptid- und Proteinanalysen. Neben dem Zielpeptid entstehen bei der Peptidsynthese verschiedene Verunreinigungen, sodass eine chromatographische Reinigung erforderlich ist, um die gewünschte Reinheit des Peptids zu erreichen. Die Analyse und Charakterisierung von Proteinen in Körperflüssigkeiten, Geweben und Zellen ist aufgrund der großen Anzahl potenziell nachweisbarer Spezies in einer einzigen Probe eine äußerst anspruchsvolle Aufgabe. Obwohl die Massenspektrometrie ein effektives Instrument zur Sequenzierung von Peptiden und Proteinen ist, ist die Trennung unbefriedigend, wenn solche Proben direkt in das Massenspektrometer gegeben werden. Dieses Problem kann durch eine Flüssigkeitschromatographie (LC) vor der MS-Analyse gelöst werden, wodurch die Menge der Analyten, die gleichzeitig in das Massenspektrometer gelangen, reduziert wird4,5,6. Darüber hinaus können sich Analyten während der Flüssigphasentrennung in einem engen Bereich konzentrieren, wodurch diese Analyten konzentriert werden und die Empfindlichkeit der MS-Detektion erhöht wird. Die Flüssigkeitschromatographie (LC) hat im letzten Jahrzehnt erhebliche Fortschritte gemacht und ist zu einer weit verbreiteten Methode für die Proteomanalyse geworden7,8,9,10.
Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie (RP-LC) wird häufig verwendet, um Gemische von Peptiden unter Verwendung von Octadecyl-modifiziertem Silica (ODS) als stationärer Phase zu reinigen und zu trennen11,12,13. Aufgrund ihrer komplexen Struktur und amphoteren Natur14,15 können stationäre RP-Phasen Peptide und Proteine ​​jedoch nicht zufriedenstellend trennen. Deshalb erfordert die Analyse von Peptiden und Proteinen mit polaren und unpolaren Fragmenten speziell entwickelte stationäre Phasen, um mit diesen Analyten zu interagieren und sie zurückzuhalten16. Gemischte Chromatographie, die multimodale Interaktionen bietet, kann eine Alternative zur RP-LC zum Trennen von Peptiden, Proteinen und anderen komplexen Gemischen sein. Es wurden mehrere stationäre Phasen gemischten Typs hergestellt und mit diesen stationären Phasen gefüllte Säulen zum Trennen von Peptiden und Proteinen verwendet17,18,19,20,21. Aufgrund der Anwesenheit polarer und unpolarer Gruppen eignen sich stationäre Phasen mit gemischten Modi (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polare Interkalation/RPLC) zur Trennung von Peptiden und Proteinen22,23,24,25,26,27,28. Polar interkalierte stationäre Phasen mit kovalent gebundenen polaren Gruppen zeigen gute Trennfähigkeiten und einzigartige Selektivität für polare und unpolare Analyten, da die Trennung von der Interaktion zwischen dem Analyten und der stationären Phase abhängt. Multimodale Interaktionen29,30,31,32. Kürzlich erhielten Zhang et al. 30 Behenyl-terminierte stationäre Phasen von Polyaminen und trennten erfolgreich Kohlenwasserstoffe, Antidepressiva, Flavonoide, Nukleoside, Östrogene und einige andere Analyten. Das polar eingebettete stationäre Material hat sowohl polare als auch unpolare Gruppen und kann daher zur Trennung von Peptiden und Proteinen in hydrophobe und hydrophile Teile verwendet werden. Polare Inline-Säulen (z. B. C18-Säulen mit Inline-Amid) sind unter dem Handelsnamen Ascentis Express RP-Amid-Säulen erhältlich, diese Säulen wurden jedoch nur für die Analyse von Amin 33 verwendet.
In der vorliegenden Studie wurde eine polare einbettende stationäre Phase (N-Phenylmaleimid, einbettendes Polystyrol) hergestellt und auf ihre Peptidtrennung und tryptische HSA-Spaltung untersucht. Zur Herstellung der stationären Phase wurde die folgende Strategie verwendet. Poröse Silicapartikel wurden gemäß den in unseren früheren Veröffentlichungen beschriebenen Verfahren hergestellt, mit einigen Änderungen in den Herstellungsschemata 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Die Verhältnisse von Harnstoff, Polyethylenglykol (PEG), TMOS und wässriger Essigsäure wurden angepasst, um Silicapartikel mit großen Porengrößen zu erhalten. Zweitens wurde ein neuer Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat-Ligand synthetisiert und seine derivatisierten Silicapartikel wurden zur Herstellung polarer eingebetteter stationärer Phasen verwendet. Die erhaltene stationäre Phase wurde gemäß einem optimierten Packschema in eine Edelstahlsäule (Innendurchmesser 100 × 1,8 mm) gepackt. Das Packen der Säule wird durch mechanische Vibration unterstützt, um eine gleichmäßige Schicht innerhalb der Säule sicherzustellen. Die gepackte Säule wurde auf die Trennung eines Peptidgemisches bestehend aus fünf Peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin-Peptid) und tryptischen Hydrolysaten von Humanserumalbumin (HSA) untersucht. Es wurde beobachtet, dass das Peptidgemisch und der tryptische HSA-Verdau mit guter Auflösung und Effizienz getrennt wurden. Die Trenneffizienz der PMP-Säule wurde mit der der Ascentis Express RP-Amid-Säule verglichen. Es wurde beobachtet, dass Peptide und Proteine ​​auf der PMP-Säule eine gute Auflösung und hohe Trenneffizienz aufweisen und die Trenneffizienz der PMP-Säule höher ist als die der Ascentis Express RP-Amid-Säule.
PEG (Polyethylenglykol), Harnstoff, Essigsäure, Trimethoxyorthosilikat (TMOS), Trimethylchlorsilan (TMCS), Trypsin, Humanserumalbumin (HSA), Ammoniumchlorid, Harnstoff, Hexamethylmethacryloyldisilazan (HMDS), Methacryloylchlorid (MC), Styrol, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoylperoxid (BPO), Acetonitril (ACN) für HPLC, Methanol, 2-Propanol und Aceton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
Eine Mischung aus 8 g Harnstoff, 8 g Polyethylenglykol und 8 ml 0,01 N Essigsäure wurde 10 Minuten gerührt und unter Eiskühlung mit 24 ml TMOS versetzt. Die Reaktionsmischung wurde in einem Edelstahlautoklaven 6 Stunden auf 40 °C und anschließend 8 Stunden auf 120 °C erhitzt. Das Wasser wurde dekantiert und der Rückstand 12 Stunden bei 70 °C getrocknet. Die getrockneten Weichblöcke wurden glatt gemahlen und 12 Stunden bei 550 °C im Ofen kalziniert. Drei Chargen wurden hergestellt und charakterisiert, um die Reproduzierbarkeit von Partikelgröße, Porengröße und Oberfläche zu testen.
Polare Gruppe und stationäre Phase für Polystyrolketten. Das Herstellungsverfahren wird unten beschrieben.
N-Phenylmaleimid (200 mg) und Methylvinylisocyanat (100 mg) wurden in wasserfreiem Toluol gelöst und dann 0,1 ml 2,2′-Azoisobutyronitril (AIBN) in den Reaktionskolben gegeben, um ein Copolymer aus Phenylmaleimid und Methylvinylisocyanat (PMCP) zu erhalten.) Die Mischung wurde 3 Stunden lang auf 60 °C erhitzt, filtriert und 3 Stunden lang in einem Ofen bei 40 °C getrocknet.
Getrocknete Silicapartikel (2 g) wurden in trockenem Toluol (100 ml) dispergiert, gerührt und 10 Minuten lang in einem 500-ml-Rundkolben beschallt. PMCP (10 mg) wurde in Toluol gelöst und tropfenweise über einen Zugabetrichter in den Reaktionskolben gegeben. Die Mischung wurde 8 Stunden bei 100 °C unter Rückfluss erhitzt, filtriert, mit Aceton gewaschen und 3 Stunden bei 60 °C getrocknet. Anschließend wurden die mit PMCP assoziierten Silicapartikel (100 g) in Toluol (200 ml) gelöst und 4-Hydroxy-TEMPO (2 ml) in Gegenwart von 100 µl Dibutylzinndilaurat als Katalysator hinzugefügt. Die Mischung wurde 8 Stunden bei 50 °C gerührt, filtriert und 3 Stunden bei 50 °C getrocknet.
Styrol (1 ml), Benzoylperoxid (BPO) (0,5 ml) und an TEMPO-PMCP (1,5 g) gebundene Silicapartikel wurden in Toluol dispergiert und mit Stickstoff gespült. Die Styrolpolymerisation erfolgte 12 Stunden bei 100 °C. Das resultierende Produkt wurde mit Methanol gewaschen und über Nacht bei 60 °C getrocknet. Das allgemeine Reaktionsschema ist in Abb. 1 dargestellt.
Die Proben wurden 1 Stunde bei 393 K entgast, bis ein Restdruck von weniger als 10–3 Torr erreicht war. Die Menge des bei einem relativen Druck von P/P0 = 0,99 adsorbierten N2 wurde zur Bestimmung des Gesamtporenvolumens verwendet. Die Morphologie von reinen und ligandengebundenen Silicapartikeln wurde mit einem Rasterelektronenmikroskop (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan) untersucht. Trockene Proben (reines Silica und ligandengebundene Silicapartikel) wurden mithilfe von Kohlenstoffband auf Aluminiumstäbe gelegt. Mithilfe eines Q150T-Sputtergeräts wurde Gold auf die Probe aufgebracht und eine 5 nm dicke Au-Schicht wurde auf der Probe abgeschieden. Dies verbessert die Effizienz des Niederspannungsprozesses und ermöglicht feines Kaltgasspritzen. Die Elementaranalyse wurde mit einem Elementarzusammensetzungsanalysator Flash EA1112 von Thermo Electron (Waltham, MA, USA) durchgeführt. Zur Bestimmung der Partikelgrößenverteilung wurde ein Partikelgrößenanalysator Mastersizer 2000 von Malvern (Worcestershire, UK) verwendet. Unbeschichtete Silicapartikel und ligandengebundene Silicapartikel (je 5 mg) wurden in 5 ml Isopropanol dispergiert, 10 Minuten lang beschallt, 5 Minuten lang geschüttelt und auf eine Mastersizer-Lichtbank gelegt. Die thermogravimetrische Analyse erfolgte mit einer Geschwindigkeit von 5 °C pro Minute im Temperaturbereich von 30 bis 800 °C.
Mit Glasfaser ausgekleidete Edelstahlsäulen mit enger Bohrung und den Abmessungen (ID 100 × 1,8 mm) wurden durch die Schlammfüllmethode nach dem gleichen Verfahren wie in Referenz 31 gepackt. Die Edelstahlsäule (glasausgekleidet, ID 100 × 1,8 mm) und ein Auslass mit einer 1-µm-Fritte wurden an eine Schlammverpackungsmaschine (Alltech, Deerfield, IL, USA) angeschlossen. Bereiten Sie eine Suspension der stationären Phase vor, indem Sie 150 mg der stationären Phase in 1,2 ml Methanol suspendieren und in eine Reservoirsäule einspeisen. Methanol wurde als Schlammlösungsmittel und Kontrolllösungsmittel verwendet. Packen Sie die Säule, indem Sie eine Drucksequenz von 100 MP für 10 Min., 80 MP für 15 Min. und 60 MP für 30 Min. anwenden. Beim Packvorgang wurden zwei Gaschromatographie-Säulenvibratoren (Alltech, Deerfield, IL, USA) zur mechanischen Vibration verwendet, um eine gleichmäßige Säulenpackung sicherzustellen. Schließen Sie den Schlammpacker und lassen Sie den Druck langsam ab, um eine Beschädigung der Saite zu vermeiden. Die Säule wurde von der Schlammdüse getrennt und ein weiteres Anschlussstück wurde am Einlass angebracht und mit dem LC-System verbunden, um dessen Funktion zu testen.
Eine benutzerdefinierte MLC wurde unter Verwendung einer LC-Pumpe (10AD Shimadzu, Japan), eines Probenehmers mit einer 50-nl-Injektionsschleife (Valco (USA) C14 W.05), eines Membranentgasers (Shimadzu DGU-14A) und eines UV-VIS-Kapillarfensters, eines Detektorgeräts (UV-2075) und einer emaillierten Mikrosäule konstruiert. Verwenden Sie sehr schmale und kurze Verbindungsschläuche, um die Wirkung einer zusätzlichen Säulenausdehnung zu minimieren. Installieren Sie nach dem Befüllen der Säule eine Kapillare (50 µm ID 365) am Auslass der 1/16″-Reduktionsverbindung und installieren Sie eine Kapillare (50 µm) der Reduktionsverbindung. Datenerfassung und Chromatogrammverarbeitung werden mit der Software Multichro 2000 durchgeführt. Bei 254 nm wurde die UV-Absorption der untersuchten Analyten bei 0 überwacht. Chromatographische Daten wurden mit OriginPro8 (Northampton, MA) analysiert.
Humanes Serumalbumin, lyophilisiertes Pulver, ≥ 96 % (Agarose-Gelelektrophorese), 3 mg gemischt mit Trypsin (1,5 mg), 4,0 M Harnstoff (1 ml) und 0,2 M Ammoniumbicarbonat (1 ml). Die Lösung wurde 10 Minuten gerührt und 6 Stunden in einem Wasserbad bei 37 °C gehalten, anschließend mit 1 ml 0,1 % TFA abgeschreckt. Die Lösung filtrieren und unter 4 °C lagern.
Die Trennung eines Gemisches aus Peptiden und tryptisch verdautem HSA auf einer PMP-Säule wurde separat ausgewertet. Überprüfen Sie die tryptische Hydrolyse eines Gemisches aus Peptiden und HSA, getrennt durch eine PMP-Säule, und vergleichen Sie die Ergebnisse mit einer Ascentis Express RP-Amid-Säule. Die Anzahl der theoretischen Trennstufen wird mit der folgenden Gleichung berechnet:
Abbildung 2 zeigt REM-Aufnahmen von reinen Silicapartikeln und ligandengebundenen Silicapartikeln. REM-Aufnahmen von reinen Silicapartikeln (A, B) zeigen eine kugelförmige Gestalt, wobei die Partikel im Vergleich zu unseren früheren Untersuchungen länglich sind oder eine unregelmäßige Symmetrie aufweisen. Die Oberfläche der ligandengebundenen Silicapartikel (C, D) ist glatter als die von reinen Silicapartikeln, was möglicherweise auf die Polystyrolketten zurückzuführen ist, die die Oberfläche der Silicapartikel bedecken.
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von reinen Silicapartikeln (A, B) und ligandengebundenen Silicapartikeln (C, D).
Die Partikelgrößenverteilung von reinen Silica-Partikeln und ligandengebundenen Silica-Partikeln ist in Abb. 2. 3(A) dargestellt. Die Kurven der volumetrischen Partikelgrößenverteilung zeigten, dass die Silica-Partikelgröße nach der chemischen Modifikation zunahm (Abb. 3A). Die Daten zur Silica-Partikelgrößenverteilung aus dieser und der vorherigen Studie werden in Tabelle 1(A) verglichen. Die volumetrische Partikelgröße d(0,5) von PMP betrug 3,36 µm, verglichen mit einem d(0,5)-Wert von 3,05 µm in unserer vorherigen Studie (polystyrolgebundene Silica-Partikel)34. Aufgrund der Änderung des Verhältnisses von PEG, Harnstoff, TMOS und Essigsäure in der Reaktionsmischung war die Partikelgrößenverteilung dieser Charge enger als in unserer vorherigen Studie. Die Partikelgröße der PMP-Phase ist geringfügig größer als die der polystyrolgebundenen Silica-Partikelphase, die wir zuvor untersucht haben. Dies bedeutet, dass bei der Oberflächenfunktionalisierung von Silicapartikeln mit Styrol lediglich eine Polystyrolschicht (0,97 µm) auf der Silicaoberfläche abgeschieden wurde, während in der PMP-Phase die Schichtdicke 1,38 µm betrug.
Partikelgrößenverteilung (A) und Porengrößenverteilung (B) von reinen Silicapartikeln und ligandengebundenen Silicapartikeln.
Porengröße, Porenvolumen und Oberfläche der in dieser Studie verwendeten Silicapartikel sind in Tabelle 1 (B) dargestellt. Die PSD-Profile von reinen Silicapartikeln und ligandengebundenen Silicapartikeln sind in Abb. 3(B) dargestellt. Die Ergebnisse waren mit denen unserer vorherigen Studie vergleichbar34. Die Porengrößen der reinen und ligandengebundenen Silicapartikel betrugen 310 Å bzw. 241 Å, was darauf hindeutet, dass sich die Porengröße nach der chemischen Modifikation um 69 Å verringert hat, wie in Tabelle 1 (B) gezeigt, und die Verschiebungskurve ist in Abb. dargestellt. Die spezifische Oberfläche der Silicapartikel in der vorliegenden Studie beträgt 116 m2/g, was mit unserer vorherigen Studie (124 m2/g) vergleichbar ist. Wie in Tabelle 1(B) gezeigt, verringerte sich die Oberfläche (m2/g) der Silicapartikel nach der chemischen Modifikation ebenfalls von 116 m2/g auf 105 m2/g.
Die Ergebnisse der Elementaranalyse der stationären Phase sind in Tabelle 2 dargestellt. Der Kohlenstoffgehalt der aktuellen stationären Phase beträgt 6,35 % und ist damit niedriger als in unserer vorherigen Studie (mit Polystyrol assoziierte Silicapartikel 7,93 %35 bzw. 10,21 %)42. Der Kohlenstoffgehalt der aktuellen stationären Phase ist niedriger, da bei der Herstellung von SP neben Styrol auch einige polare Liganden wie Phenylmaleimidmethylvinylisocyanat (PCMP) und 4-Hydroxy-TEMPO verwendet wurden. Der Gewichtsanteil von Stickstoff in der aktuellen stationären Phase beträgt 2,21 % gegenüber 0,1735 und 0,85 % in vorherigen Studien42. Das bedeutet, dass die aktuelle stationäre Phase aufgrund des Phenylmaleimids einen hohen Gewichtsanteil an Stickstoff aufweist. In ähnlicher Weise haben die Produkte (4) und (5) einen Kohlenstoffgehalt von 2,7 % bzw. 2,9 %, während das Endprodukt (6) einen Kohlenstoffgehalt von 6,35 % hat, wie in Tabelle 2 gezeigt. Zur Prüfung auf Gewichtsverlust wurde die stationäre Phase von PMP mittels thermogravimetrischer Analyse (TGA) untersucht, die TGA-Kurve ist in Abbildung 4 dargestellt. Die TGA-Kurve zeigt einen Gewichtsverlust von 8,6 %, was gut mit dem Kohlenstoffgehalt (6,35 %) übereinstimmt, da die Liganden nicht nur C, sondern auch N, O und H enthalten.
Der Ligand Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat wurde aufgrund seiner polaren Phenylmaleimid- und Vinylisocyanatgruppen zur Modifizierung der Oberfläche der Silicapartikel gewählt. Vinylisocyanatgruppen können durch lebende radikalische Polymerisation weiter mit Styrol reagieren. Der zweite Grund ist die Einfügung einer Gruppe, die mäßige Wechselwirkungen mit dem Analyten, aber keine starken elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen dem Analyten und der stationären Phase aufweist, da der Phenylmaleimidrest bei normalem pH-Wert keine virtuelle Ladung besitzt. Die Polarität der stationären Phase lässt sich durch die optimale Styrolmenge und die Reaktionsdauer der radikalischen Polymerisation steuern. Der letzte Schritt der Reaktion (radikalische Polymerisation) ist entscheidend, da er die Polarität der stationären Phase ändert. Zur Überprüfung des Kohlenstoffgehalts in diesen stationären Phasen wurde eine Elementaranalyse durchgeführt. Es wurde beobachtet, dass eine Erhöhung der Styrolmenge und der Reaktionsdauer den Kohlenstoffgehalt der stationären Phase erhöht und umgekehrt. Mit unterschiedlichen Styrolkonzentrationen hergestellte SPs weisen unterschiedliche Kohlenstoffbeladungen auf. Ebenso wurden diese stationären Phasen auf Edelstahlsäulen platziert und ihre chromatographischen Eigenschaften (Selektivität, Auflösung, N-Wert usw.) überprüft. Basierend auf diesen Experimenten wurde eine optimierte Zusammensetzung für die Herstellung der stationären PMP-Phase gewählt, um eine kontrollierte Polarität und eine gute Retention des Analyten zu gewährleisten.
Die PMP-Säule wurde auch für die Analyse von fünf Peptidgemischen (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) unter Verwendung der Kapazität der mobilen Phase 60/40 (v/v) ACN/Wasser (0,1 % TFA) bei einer Flussrate von 80 µl/min evaluiert. Unter optimalen Elutionsbedingungen (200.000 Böden/m) beträgt die Anzahl der theoretischen Böden (N) pro Säule (100 × 1,8 mm) 20.000 ± 100. Die N-Werte für die drei PMP-Säulen sind in Tabelle 3 und die Chromatogramme in Abbildung 5A dargestellt. Schnelle Analyse bei hoher Flussrate (700 µl/min) auf einer PMP-Säule, fünf Peptide innerhalb einer Minute eluiert, hervorragender N-Wert von 13.500 ± 330 pro Säule (100 x 1,8 mm Durchmesser), entsprechend 135.000 Platten/m (Abb. 5B). Drei Säulen der gleichen Größe (Innendurchmesser 100 x 1,8 mm) wurden mit drei verschiedenen Chargen der stationären Phase von PMP gefüllt, um die Reproduzierbarkeit zu testen. Die Analyten wurden für jede Säule aufgezeichnet, indem dasselbe Testgemisch auf jeder Säule unter optimalen Elutionsbedingungen, Anzahl der theoretischen Platten N und Retentionszeit getrennt wurde. Die Reproduzierbarkeitsdaten für die PMP-Säulen sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Reproduzierbarkeit der PMP-Säule korrelierte gut mit sehr niedrigen %RSD-Werten, wie in Tabelle 3 gezeigt.
Trennung von Peptidgemischen auf einer PMP-Säule (B) und einer Ascentis Express RP-Amid-Säule (A), mobile Phase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), PMP-Säulenabmessungen (100 x 1,8 mm Innendurchmesser), Analyse. Elutionsreihenfolge der Verbindungen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) und 5 (Leucinsäure-Enkephalin).
Eine PMP-Säule (Innendurchmesser 100 x 1,8 mm) wurde für die Trennung des tryptischen Hydrolysats von Humanserumalbumin mittels HPLC evaluiert. Das Chromatogramm in Abbildung 6 zeigt eine gute Trennung der Proben mit sehr guter Auflösung. HSA-Lösungen wurden mit einer Flussrate von 100 μl/min, einer mobilen Phase aus 70/30 Acetonitril/Wasser und 0,1 % TFA analysiert. Die HSA-Spaltung wurde in 17 Peaks unterteilt, wie im Chromatogramm (Abb. 6) dargestellt, entsprechend 17 Peptiden. Die Trenneffizienzen der einzelnen Peaks des HSA-Hydrolysats wurden berechnet und sind in Tabelle 5 dargestellt.
Tryptophanhydrolysate von HSA wurden auf einer PMP-Säule (Innendurchmesser 100 x 1,8 mm), Flussrate (100 μl/min), mobile Phase 60/40 Acetonitril/Wasser und 0,1 % TFA getrennt.
wobei L die Säulenlänge ist, η die Viskosität der mobilen Phase, ΔP der Gegendruck der Säule und u die lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase. Die Permeabilität der PMP-Säule betrug 2,5 × 10–14 m2, die Flussrate betrug 25 µl/min, verwendet wurde 60/40 v/v. ACN/Wasser. Die Permeabilität der PMP-Säule (ID 100 × 1,8 mm) war ähnlich wie in unserer vorherigen Ref.34-Studie. Die Permeabilität einer mit oberflächlich porösen Partikeln gefüllten Säule beträgt 1,7 × 10,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 für 5-µm-Partikel43. Daher ist die Permeabilität der PMP-Phase ähnlich der Permeabilität von Kern-Schale-Partikeln mit einer Größe von 5 µm.
Dabei ist Wx die Masse der mit Chloroform gefüllten Säule, Wy die Masse der mit Methanol gefüllten Säule und ρ die Dichte des Lösungsmittels. Dichte von Methanol (ρ = 0,7866) und Chloroform (ρ = 1,484). Die Gesamtporosität der Silica-C18-Partikelsäule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser)34 und unserer zuvor untersuchten C18-Harnstoff31-Säule betrug 0,63 bzw. 0,55. Dies bedeutet, dass die Anwesenheit von Harnstoffliganden die Permeabilität der stationären Phase verringert. Andererseits beträgt die Gesamtporosität der PMP-Säule (Innendurchmesser 100 × 1,8 mm) 0,60. PMP-Säulen sind weniger durchlässig als Säulen, die mit C18-gebundenen Silicapartikeln gefüllt sind, da in stationären Phasen vom Typ C18 die C18-Liganden in linearen Ketten an die Silicapartikel gebunden sind, während in stationären Phasen vom Typ Polystyrol ein relativ dickes Polymer um die Partikel herum gebildet wird. Schicht A. In einem typischen Experiment wird die Säulenporosität wie folgt berechnet:
Abb. 7A, B zeigen Van-Deemter-Diagramme für eine PMP-Säule (ID 100 x 1,8 mm) und eine Ascentis Express RP-Amid-Säule (ID 100 x 1,8 mm) unter denselben Elutionsbedingungen, 60/40 ACN/H2O und 0,1 % TFA 20 µl/min bis 800 µl/min auf beiden Säulen. Die minimalen HETP-Werte bei der optimalen Flussrate (80 µl/min) betrugen 2,6 µm und 3,9 µm für die PMP-Säule bzw. die Ascentis Express RP-Amid-Säule. Die HETP-Werte zeigen, dass die Trennleistung der PMP-Säule (100 x 1,8 mm ID) viel höher ist als die der handelsüblichen Ascentis Express RP-Amid-Säule (100 x 1,8 mm ID). Das Van-Deemter-Diagramm in Abb. 7(A) zeigt, dass der N-Wert mit zunehmendem Durchfluss im Vergleich zu unserer vorherigen Studie nicht signifikant abnimmt. Die höhere Trennleistung der PMP-Säule (ID 100 × 1,8 mm) im Vergleich zur Ascentis Express RP-Amid-Säule basiert auf der verbesserten Partikelform und -größe sowie dem in dieser Arbeit verwendeten ausgeklügelten Säulenpackungsverfahren34.
(A) Van-Deemter-Diagramm (HETP vs. lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase), erhalten auf einer PMP-Säule (Innendurchmesser 100 x 1,8 mm) in 60/40 ACN/H2O mit 0,1 % TFA. (B) Van-Deemter-Diagramm (HETP vs. lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase), erhalten auf einer Ascentis Express RP-Amid-Säule (Innendurchmesser 100 x 1,8 mm) in 60/40 ACN/H2O mit 0,1 % TFA.
Eine polare stationäre Phase aus interkaliertem Polystyrol wurde hergestellt und für die Trennung eines Gemisches aus synthetischen Peptiden und tryptischem Hydrolysat von Humanserumalbumin (HSA) in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie evaluiert. Die chromatographische Leistung von PMP-Säulen für Peptidgemische ist hinsichtlich Trennleistung und Auflösung hervorragend. Die verbesserte Trennleistung von PMP-Säulen ist auf mehrere Gründe zurückzuführen, wie z. B. die Partikel- und Porengröße des Silicagels, die kontrollierte Synthese der stationären Phasen und komplexe Säulenpackungsmaterialien. Neben der hohen Trennleistung ist ein weiterer Vorteil dieser stationären Phase der niedrige Säulengegendruck bei hohen Flussraten. PMP-Säulen sind hochgradig reproduzierbar und können zur Analyse von Peptidgemischen und tryptischem Verdau verschiedener Proteine ​​verwendet werden. Wir beabsichtigen, diese Säule zur Trennung bioaktiver Verbindungen aus Naturprodukten, Heilpflanzenextrakten und Pilzen in der Flüssigkeitschromatographie einzusetzen. Zukünftig sollen PMP-Säulen auch zur Trennung von Proteinen und monoklonalen Antikörpern evaluiert werden.
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