Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używasz przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS. Aby zapewnić najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Ponadto, aby zapewnić ciągłą obsługę, wyświetlamy witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Wyświetla karuzelę trzech slajdów jednocześnie. Użyj przycisków Poprzedni i Następny, aby przewijać trzy slajdy naraz, lub przycisków suwaka na końcu, aby przewijać trzy slajdy naraz.
Porowate cząstki krzemionki przygotowano metodą sol-żel z pewnymi modyfikacjami w celu uzyskania cząstek o szerokich porach. Cząstki te poddano derywatyzacji z N-fenylomaleimidem-metylowinyloizocyjanianem (PMI) i styrenem poprzez polimeryzację z odwrotnym przeniesieniem łańcucha i fragmentacją (RAFT), w celu wytworzenia poliamidów interkalowanych N-fenylomaleimidem. Faza stacjonarna styrenu (PMP). Wąskie kolumny ze stali nierdzewnej (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) wypełniono zawiesiną. Wydajność chromatograficzną kolumny PMP oceniono w celu rozdzielenia mieszaniny peptydów syntetycznych składającej się z pięciu peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminokwas enkefalina) i tryptycznego hydrolizatu albuminy surowicy ludzkiej (HAS). W optymalnych warunkach elucji teoretyczna liczba płytek z mieszaniną peptydów osiągnęła 280 000 płytek/m2. Porównując wydajność separacji opracowanej kolumny z komercyjną kolumną Ascentis Express RP-Amide, zaobserwowano, że wydajność separacji kolumny PMP była wyższa niż kolumny komercyjnej pod względem wydajności separacji i rozdzielczości.
Przemysł biofarmaceutyczny stał się rozwijającym się rynkiem globalnym, notując w ostatnich latach znaczny wzrost udziału w rynku. Wraz z gwałtownym rozwojem przemysłu biofarmaceutycznego1,2,3 istnieje ogromne zapotrzebowanie na analizę peptydów i białek. Oprócz peptydu docelowego, podczas syntezy peptydu powstają różne zanieczyszczenia, dlatego w celu uzyskania pożądanej czystości peptydu wymagane jest oczyszczanie chromatograficzne. Analiza i charakterystyka białek w płynach ustrojowych, tkankach i komórkach jest niezwykle trudnym zadaniem ze względu na dużą liczbę potencjalnie wykrywalnych substancji obecnych w jednej próbce. Chociaż spektrometria mas jest skutecznym narzędziem do sekwencjonowania peptydów i białek, jeśli takie próbki zostaną wprowadzone bezpośrednio do spektrometru mas, separacja będzie niezadowalająca. Problem ten można rozwiązać, wykonując chromatografię cieczową (LC) przed analizą MS, co zmniejszy ilość analitów wprowadzanych do spektrometru mas w danym momencie4,5,6. Ponadto, podczas rozdziału fazy ciekłej, anality mogą gromadzić się w wąskim obszarze, zwiększając w ten sposób ich koncentrację i czułość detekcji MS. Chromatografia cieczowa (LC) znacznie rozwinęła się w ciągu ostatniej dekady i stała się szeroko stosowaną metodą analizy proteomicznej7,8,9,10.
Chromatografia cieczowa w fazie odwróconej (RP-LC) jest szeroko stosowana do oczyszczania i rozdzielania mieszanin peptydów z wykorzystaniem oktadecylo-modyfikowanej krzemionki (ODS) jako fazy stacjonarnej11,12,13. Jednakże, ze względu na złożoną strukturę i amfoteryczny charakter14,15, fazy stacjonarne RP nie zapewniają satysfakcjonującego rozdziału peptydów i białek. Dlatego analiza peptydów i białek z fragmentami polarnymi i niepolarnymi wymaga specjalnie zaprojektowanych faz stacjonarnych, które będą oddziaływać i zatrzymywać te anality16. Chromatografia mieszana, oferująca interakcje multimodalne, może być alternatywą dla RP-LC w rozdzielaniu peptydów, białek i innych złożonych mieszanin. Przygotowano kilka faz stacjonarnych typu mieszanego, a kolumny wypełnione tymi fazami stacjonarnymi wykorzystano do rozdziału peptydów i białek17,18,19,20,21. Ze względu na obecność grup polarnych i niepolarnych, fazy stacjonarne o mieszanym trybie (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalacja polarna/RPLC) nadają się do rozdziału peptydów i białek22,23,24,25,26,27,28. , polarne interkalowane fazy stacjonarne z kowalencyjnie związanymi grupami polarnymi wykazują dobre zdolności rozdzielcze i wyjątkową selektywność dla analitów polarnych i niepolarnych, ponieważ rozdział zależy od interakcji między analitem a fazą stacjonarną Oddziaływania multimodalne 29,30,31,32. Niedawno Zhang i in. 30 otrzymali fazy stacjonarne zakończone behenylem z poliamin i z powodzeniem rozdzielili węglowodory, leki przeciwdepresyjne, flawonoidy, nukleozydy, estrogeny i niektóre inne anality. Polarny osadzony materiał stacjonarny ma zarówno grupy polarne, jak i niepolarne, więc może być stosowany do rozdzielania peptydów i białek na części hydrofobowe i hydrofilowe. Kolumny polarne typu inline (np. kolumny C18 z amidem typu inline) są dostępne pod nazwą handlową Ascentis Express RP-Amide columns, ale kolumny te były używane wyłącznie do analizy aminy 33.
W niniejszym badaniu przygotowano polarną fazę stacjonarną (N-fenylomaleimid, polistyren) i oceniono jej przydatność do rozdziału peptydów i rozszczepiania tryptycznego HSA. Do przygotowania fazy stacjonarnej zastosowano następującą strategię. Porowate cząstki krzemionki przygotowano zgodnie z procedurami opisanymi w naszych poprzednich publikacjach, z pewnymi zmianami w schematach przygotowania 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Dostosowano proporcje mocznika, glikolu polietylenowego (PEG), TMOS i wodnego roztworu kwasu octowego, aby uzyskać cząstki krzemionki o dużych porach. Następnie zsyntetyzowano nowy ligand fenylomaleimid-metylowinyloizocyjanian, a jego pochodne cząstki krzemionki wykorzystano do przygotowania polarnych, osadzonych faz stacjonarnych. Otrzymaną fazę stacjonarną umieszczono w kolumnie ze stali nierdzewnej (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) zgodnie ze zoptymalizowanym schematem pakowania. Wypełnienie kolumny wspomagane jest wibracjami mechanicznymi, aby zapewnić jednorodną warstwę w obrębie kolumny. Wypełnioną kolumnę oceniano pod kątem rozdziału mieszaniny peptydów składającej się z pięciu peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptyd leucyna-enkefalina) oraz tryptycznych hydrolizatów albuminy surowicy ludzkiej (HSA). Zaobserwowano, że mieszanina peptydów i tryptyczny produkt trawienia HSA rozdzieliły się z dobrą rozdzielczością i wydajnością. Wydajność rozdziału kolumny PMP porównano z wydajnością kolumny Ascentis Express RP-Amide. Zaobserwowano, że peptydy i białka mają dobrą rozdzielczość i wysoką wydajność rozdziału na kolumnie PMP, a wydajność rozdziału kolumny PMP jest wyższa niż kolumny Ascentis Express RP-Amide.
PEG (glikol polietylenowy), mocznik, kwas octowy, trimetoksyortokrzemian (TMOS), trimetylochlorosilan (TMCS), trypsyna, albumina surowicy ludzkiej (HSA), chlorek amonu, mocznik, heksametylometakryloyldisilazan (HMDS), chlorek metakryloilu (MC), styren, 4-hydroksy-TEMPO, nadtlenek benzoilu (BPO), acetonitryl (ACN) do chromatografii cieczowej (HPLC), metanol, 2-propanol i aceton. Firma Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).
Mieszaninę mocznika (8 g), glikolu polietylenowego (8 g) i 8 ml 0,01 N kwasu octowego mieszano przez 10 minut, a następnie dodano 24 ml TMOS, chłodząc lodem. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 40°C przez 6 godzin, a następnie w temperaturze 120°C przez 8 godzin w autoklawie ze stali nierdzewnej. Wodę zdekantowano, a pozostałość suszono w temperaturze 70°C przez 12 godzin. Wysuszone miękkie bloki zmielono na gładko i kalcynowano w piecu w temperaturze 550°C przez 12 godzin. Przygotowano i scharakteryzowano trzy partie w celu sprawdzenia powtarzalności wielkości cząstek, wielkości porów i powierzchni właściwej.
Grupa polarna i faza stacjonarna dla łańcuchów polistyrenowych. Procedura przygotowania opisana jest poniżej.
N-fenylomaleimid (200 mg) i izocyjanian metylowinylu (100 mg) rozpuszczono w bezwodnym toluenie, a następnie do kolby reakcyjnej dodano 0,1 ml 2,2′-azoizobutyronitrylu (AIBN) w celu uzyskania kopolimeru fenylomaleimidu i izocyjanianu metylowinylu (PMCP). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 60°C przez 3 godziny, przefiltrowano i wysuszono w piecu w temperaturze 40°C przez 3 godziny.
Wysuszone cząstki krzemionki (2 g) rozproszono w suchym toluenie (100 ml), mieszano i poddawano działaniu ultradźwięków przez 10 minut w kolbie okrągłodennej o pojemności 500 ml. PMCP (10 mg) rozpuszczono w toluenie i dodawano kroplami do kolby reakcyjnej za pomocą wkraplacza. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w 100°C przez 8 godzin, przefiltrowano, przemyto acetonem i suszono w temperaturze 60°C przez 3 godziny. Następnie cząstki krzemionki związane z PMCP (100 g) rozpuszczono w toluenie (200 ml) i dodano do niej 4-hydroksy-TEMPO (2 ml) w obecności 100 μl dilaurynianu dibutylocyny jako katalizatora. Mieszaninę mieszano w temperaturze 50°C przez 8 godzin, filtrowano i suszono w temperaturze 50°C przez 3 godziny.
Styren (1 ml), nadtlenek benzoilu BPO (0,5 ml) oraz cząstki krzemionki przyłączone do TEMPO-PMCP (1,5 g) zdyspergowano w toluenie i przedmuchano azotem. Polimeryzację styrenu prowadzono w temperaturze 100°C przez 12 godzin. Otrzymany produkt przemyto metanolem i suszono przez noc w temperaturze 60°C. Ogólny schemat reakcji przedstawiono na rys. 1.
Próbki odgazowywano w temperaturze 393 K przez 1 h, aż do uzyskania ciśnienia resztkowego mniejszego niż 10–3 Torr. Ilość N2 zaadsorbowanego przy ciśnieniu względnym P/P0 = 0,99 została użyta do określenia całkowitej objętości porów. Morfologię czystych i związanych z ligandem cząstek krzemionki zbadano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonia). Suche próbki (czysta krzemionka i cząstki krzemionki związane z ligandem) umieszczono na prętach aluminiowych za pomocą taśmy węglowej. Złoto osadzano na próbce za pomocą urządzenia do rozpylania Q150T, a na próbce osadzono warstwę Au o grubości 5 nm. Poprawia to wydajność procesu niskonapięciowego i zapewnia drobne natryskiwanie na zimno. Analizę elementarną przeprowadzono za pomocą analizatora składu pierwiastkowego Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Do uzyskania rozkładu wielkości cząstek użyto analizatora wielkości cząstek Malvern (Worcestershire, Wielka Brytania) Mastersizer 2000. Niepowlekane cząstki krzemionki i cząstki krzemionki związane z ligandem (po 5 mg) rozproszono w 5 ml izopropanolu, poddano działaniu ultradźwięków przez 10 minut, mieszano przez 5 minut i umieszczono na stole optycznym Mastersizer. Analizę termograwimetryczną przeprowadzono z szybkością 5°C na minutę w zakresie temperatur od 30 do 800°C.
Kolumny ze stali nierdzewnej o wąskim otworze, wyłożone włóknem szklanym, o wymiarach (ID 100 × 1,8 mm), zostały wypełnione metodą napełniania zawiesiną, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co w odniesieniu 31. Kolumna ze stali nierdzewnej (wyłożona szkłem, ID 100 × 1,8 mm) i wylot zawierający 1 µm frytę zostały podłączone do maszyny pakującej zawiesinę (Alltech Deerfield, IL, USA). Przygotować zawiesinę fazy stacjonarnej, zawieszając 150 mg fazy stacjonarnej w 1,2 ml metanolu i podając ją do kolumny zbiorczej. Metanol został użyty jako rozpuszczalnik zawiesiny i rozpuszczalnik kontrolny. Wypełnić kolumnę, stosując sekwencję ciśnień 100 MP przez 10 min, 80 MP przez 15 min i 60 MP przez 30 min. W procesie pakowania wykorzystano dwa wibratory kolumn chromatografii gazowej (Alltech, Deerfield, IL, USA) do wibracji mechanicznych, aby zapewnić równomierne wypełnienie kolumny. Zamknąć komorę ubijania szlamu i powoli wypuścić ciśnienie, aby zapobiec uszkodzeniu przewodu. Kolumnę odłączono od dyszy szlamu, a do wlotu podłączono inną złączkę i podłączono ją do układu LC, aby przetestować jego działanie.
Kolumnę MLC skonstruowano na zamówienie, wykorzystując pompę LC (10AD Shimadzu, Japonia), próbnik z pętlą wtryskową 50 nl (Valco (USA) C14 W.05), odgazowywacz membranowy (Shimadzu DGU-14A) oraz okienko kapilarne UV-VIS. Zastosowano detektor (UV-2075) i emaliowaną mikrokolumnę. Zastosowano bardzo wąskie i krótkie rurki łączące, aby zminimalizować wpływ dodatkowej ekspansji kolumny. Po napełnieniu kolumny, zainstaluj kapilarę (50 µm, średnica wewnętrzna 365) na wylocie złącza redukcyjnego 1/16″ i zainstaluj kapilarę (50 µm) złącza redukcyjnego. Zbieranie danych i przetwarzanie chromatogramów odbywa się za pomocą oprogramowania Multichro 2000. Przy 254 nm absorbancję UV badanych substancji monitorowano przy 0. Dane chromatograficzne analizowano przy użyciu OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina surowicy ludzkiej, liofilizowany proszek, ≥ 96% (elektroforeza w żelu agarozowym) 3 mg zmieszane z trypsyną (1,5 mg), 4,0 M mocznikiem (1 ml) i 0,2 M wodorowęglanem amonu (1 ml). Roztwór mieszano przez 10 min i przechowywano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 6 h, a następnie schłodzono 1 ml 0,1% TFA. Przefiltrować roztwór i przechowywać w temperaturze poniżej 4°C.
Rozdział mieszaniny peptydów i HSA trawionej trypsyną na kolumnie PMP oceniano oddzielnie. Sprawdź hydrolizę trypsyną mieszaniny peptydów i HSA rozdzielonej na kolumnie PMP i porównaj wyniki z kolumną Ascentis Express RP-Amide. Liczbę półek teoretycznych oblicza się, korzystając z następującego równania:
Obrazy SEM czystych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem przedstawiono na rysunku 2. Obrazy SEM czystych cząstek krzemionki (A, B) pokazują kulisty kształt, w którym cząstki są wydłużone lub mają nieregularną symetrię w porównaniu z naszymi poprzednimi badaniami. Powierzchnia cząstek krzemionki związanych z ligandem (C, D) jest gładsza niż powierzchnia cząstek czystej krzemionki, co może wynikać z obecności łańcuchów polistyrenowych pokrywających powierzchnię cząstek krzemionki.
Mikrofotografie skaningowe cząstek krzemionki czystej (A, B) i cząstek krzemionki związanej z ligandem (C, D).
Rozkład wielkości cząstek czystej krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem pokazano na rys. 2.3(A). Krzywe rozkładu wielkości cząstek objętościowych wykazały, że wielkość cząstek krzemionki wzrosła po modyfikacji chemicznej (rys. 3A). Dane dotyczące rozkładu wielkości cząstek krzemionki z bieżącego badania i poprzedniego badania porównano w tabeli 1(A). Objętościowy rozmiar cząstek d(0,5) PMP wynosił 3,36 µm, w porównaniu do wartości d(0,5) wynoszącej 3,05 µm w naszym poprzednim badaniu (cząstki krzemionki związane z polistyrenem)34. Ze względu na zmianę stosunku PEG, mocznika, TMOS i kwasu octowego w mieszaninie reakcyjnej, rozkład wielkości cząstek tej partii był węższy w porównaniu z naszym poprzednim badaniem. Rozmiar cząstek fazy PMP jest nieco większy niż rozmiar cząstek fazy krzemionki związanej z polistyrenem, którą badaliśmy wcześniej. Oznacza to, że funkcjonalizacja powierzchni cząstek krzemionki styrenem spowodowała osadzenie się na powierzchni krzemionki jedynie warstwy polistyrenu (0,97 µm), podczas gdy w fazie PMP grubość warstwy wynosiła 1,38 µm.
Rozkład wielkości cząstek (A) i rozkład wielkości porów (B) czystych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem.
Wielkość porów, objętość porów i powierzchnia cząstek krzemionki użytych w tym badaniu przedstawiono w Tabeli 1 (B). Profile PSD czystych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem przedstawiono na Rys. 3 (B). Wyniki były porównywalne z naszymi poprzednimi badaniami34. Wielkość porów czystych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem wynosiła odpowiednio 310 Å i 241 Å, co wskazuje, że po modyfikacji chemicznej wielkość porów zmniejszyła się o 69 Å, jak pokazano w Tabeli 1 (B), a krzywa przesunięcia jest pokazana na Rys. Powierzchnia właściwa cząstek krzemionki w bieżącym badaniu wynosi 116 m2/g, co jest porównywalne z naszymi poprzednimi badaniami (124 m2/g). Jak pokazano w Tabeli 1 (B), powierzchnia (m2/g) cząstek krzemionki po modyfikacji chemicznej również zmniejszyła się ze 116 m2/g do 105 m2/g.
Wyniki analizy pierwiastkowej fazy stacjonarnej przedstawiono w tabeli 2. Zawartość węgla w obecnej fazie stacjonarnej wynosi 6,35%, co jest wartością niższą niż w poprzednich badaniach (cząstki krzemionki związane z polistyrenem, odpowiednio 7,93%35 i 10,21%)42. Zawartość węgla w obecnej fazie stacjonarnej podano poniżej, ponieważ w przygotowaniu SP oprócz styrenu zastosowano również inne ligandy polarne, takie jak izocyjanian metylowinylu fenylomaleimid (PCMP) i 4-hydroksy-TEMPO. Procentowa zawartość azotu w obecnej fazie stacjonarnej wynosi 2,21% w porównaniu z 0,1735 i 0,85% w poprzednich badaniach42. Oznacza to, że obecna faza stacjonarna ma wysoką procentową zawartość azotu ze względu na fenylomaleimid. Podobnie produkty (4) i (5) mają zawartość węgla wynoszącą odpowiednio 2,7% i 2,9%, podczas gdy produkt końcowy (6) ma zawartość węgla wynoszącą 6,35%, jak pokazano w tabeli 2. Analizę termograwimetryczną (TGA) zastosowano w fazie stacjonarnej PMP do sprawdzenia utraty masy, a krzywa TGA jest pokazana na rysunku 4. Krzywa TGA pokazuje utratę masy wynoszącą 8,6%, co dobrze zgadza się z zawartością węgla (6,35%), ponieważ ligandy zawierają nie tylko C, ale także N, O i H.
Ligand fenylomaleimid-metylowinyloizocyjanian został wybrany do modyfikacji powierzchni cząstek krzemionki ze względu na jego polarne grupy fenylomaleimidowe i winyloizocyjanianowe. Grupy winyloizocyjanianowe mogą dalej reagować ze styrenem poprzez polimeryzację rodnikową żyjącą. Drugim powodem jest wprowadzenie grupy, która ma umiarkowane oddziaływania z analitem i nie wykazuje silnych oddziaływań elektrostatycznych między analitem a fazą stacjonarną, ponieważ ugrupowanie fenylomaleimidu nie ma ładunku wirtualnego w normalnym pH. Polarność fazy stacjonarnej można kontrolować poprzez optymalną ilość styrenu i czas reakcji polimeryzacji rodnikowej. Ostatni etap reakcji (polimeryzacja rodnikowa) jest krytyczny, ponieważ zmienia polarność fazy stacjonarnej. Przeprowadzono analizę elementarną w celu sprawdzenia zawartości węgla w tych fazach stacjonarnych. Zaobserwowano, że zwiększenie ilości styrenu i czasu reakcji zwiększa zawartość węgla w fazie stacjonarnej i odwrotnie. Próbki SP przygotowane z różnymi stężeniami styrenu charakteryzują się różną zawartością węgla. Podobnie, te fazy stacjonarne umieszczono na kolumnach ze stali nierdzewnej i sprawdzono ich charakterystykę chromatograficzną (selektywność, rozdzielczość, wartość N itp.). Na podstawie tych eksperymentów wybrano zoptymalizowany skład do przygotowania fazy stacjonarnej PMP, aby zapewnić kontrolowaną polarność i dobrą retencję analitu.
Kolumnę PMP oceniono również pod kątem analizy pięciu mieszanin peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucyna-enkefalina) z wykorzystaniem pojemności fazy ruchomej. 60/40 (v/v) ACN/woda (0,1% TFA) przy szybkości przepływu 80 µl/min. W optymalnych warunkach elucji (200 000 płytek/m), liczba teoretycznych płytek (N) na kolumnę (100 × 1,8 mm) wynosi 20 000 ± 100. Wartości N dla trzech kolumn PMP przedstawiono w tabeli 3, a chromatogramy na rysunku 5A. Szybka analiza przy dużej szybkości przepływu (700 µl/min) na kolumnie PMP, pięć peptydów eluowanych w ciągu jednej minuty, doskonała wartość N wynosząca 13 500 ± 330 na kolumnę (100 x 1,8 mm średnicy), co odpowiada 135 000 płytek/m (rys. 5B). Trzy kolumny o tym samym rozmiarze (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm) wypełniono trzema różnymi partiami fazy stacjonarnej PMP w celu sprawdzenia powtarzalności. Anality rejestrowano dla każdej kolumny, rozdzielając tę ​​samą mieszaninę testową na każdej kolumnie, stosując optymalne warunki elucji, liczbę teoretycznych płytek N i czas retencji. Dane dotyczące powtarzalności dla kolumn PMP przedstawiono w tabeli 4. Powtarzalność kolumny PMP dobrze korelowała z bardzo niskimi wartościami %RSD, jak pokazano w tabeli 3.
Rozdział mieszanin peptydów na kolumnie PMP (B) i kolumnie Ascentis Express RP-Amide (A), faza ruchoma 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), wymiary kolumny PMP (100 x 1,8 mm), analiza Kolejność elucji związków: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (enkefalina kwasu leukowego).
Kolumnę PMP (o średnicy wewnętrznej 100 x 1,8 mm) poddano ocenie pod kątem rozdziału hydrolizatu tryptycznego albuminy surowicy ludzkiej metodą HPLC. Chromatogram na rysunku 6 pokazuje, że próbki są dobrze rozdzielone z bardzo dobrą rozdzielczością. Roztwory HSA analizowano przy przepływie 100 μl/min, stosując fazę ruchomą w proporcji 70/30 acetonitryl/woda i 0,1% TFA. Rozpad HSA podzielono na 17 pików, jak pokazano na chromatogramie (rys. 6), odpowiadających 17 peptydom. Obliczono wydajności rozdziału poszczególnych pików z hydrolizatu HSA, a ich wartości przedstawiono w tabeli 5.
Hydrolizaty tryptyczne HSA rozdzielono na kolumnie PMP (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm), przy szybkości przepływu 100 μl/min, przy fazie ruchomej 60/40 acetonitryl/woda i 0,1% TFA.
gdzie L jest długością kolumny, η jest lepkością fazy ruchomej, ΔP jest ciśnieniem wstecznym kolumny, a u jest prędkością liniową fazy ruchomej. Przepuszczalność kolumny PMP wynosiła 2,5 × 10–14 m2, szybkość przepływu wynosiła 25 µl/min, użyto 60/40 v/v. ACN/woda. Przepuszczalność kolumny PMP (ID 100 × 1,8 mm) była podobna do przepuszczalności naszych poprzednich badań Ref.34. Przepuszczalność kolumny wypełnionej cząstkami porowatymi powierzchniowo wynosi 1,7 × 10 ,6 µm, 2,5 × 10-14 m2 dla cząstek 5 µm43. Dlatego przepuszczalność fazy PMP jest podobna do przepuszczalności cząstek rdzeń-powłoka o rozmiarze 5 µm.
gdzie Wx to masa kolumny wypełnionej chloroformem, Wy to masa kolumny wypełnionej metanolem, a ρ to gęstość rozpuszczalnika. Gęstość metanolu (ρ = 0,7866) i chloroformu (ρ = 1,484). Całkowita porowatość kolumny z cząstkami krzemionki i C18 (100 × 1,8 mm ID)34 i naszej wcześniej badanej kolumny z cząstkami mocznika C1831 wynosiła odpowiednio 0,63 i 0,55. Oznacza to, że obecność ligandów mocznika zmniejsza przepuszczalność fazy stacjonarnej. Z drugiej strony, całkowita porowatość kolumny PMP (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) wynosi 0,60. Kolumny PMP są mniej przepuszczalne niż kolumny wypełnione cząstkami krzemionki związanymi C18, ponieważ w fazach stacjonarnych typu C18 ligandy C18 są przyłączone do cząstek krzemionki w łańcuchach liniowych, podczas gdy w fazach stacjonarnych typu polistyrenowego wokół cząstek tworzy się stosunkowo gruba warstwa polimeru. Warstwa A. W typowym eksperymencie porowatość kolumny oblicza się w następujący sposób:
Na rys. 7A i B przedstawiono wykresy Van Deemtera dla kolumny PMP (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm) i kolumny Ascentis Express RP-Amide (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm) w tych samych warunkach elucji, 60/40 ACN/H2O i 0,1% TFA 20 µl/min do 800 µl/min na obu kolumnach. Minimalne wartości HETP przy optymalnej szybkości przepływu (80 µl/min) wynosiły 2,6 µm i 3,9 µm odpowiednio dla kolumny PMP i kolumny Ascentis Express RP-Amide. Wartości HETP pokazują, że wydajność rozdziału kolumny PMP (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm) jest znacznie wyższa niż dostępnej komercyjnie kolumny Ascentis Express RP-Amide (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm). Wykres van Deemtera na rys. 7(A) pokazuje, że spadek wartości N nie jest znacząco wyższy wraz ze wzrostem przepływu w porównaniu z naszymi poprzednimi badaniami. Wyższa wydajność separacji kolumny PMP (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) w porównaniu z kolumną Ascentis Express RP-Amide wynika z ulepszonego kształtu i rozmiaru cząstek oraz zaawansowanej procedury wypełniania kolumny stosowanej w obecnych badaniach34.
(A) Wykres Van Deemtera (HETP w funkcji prędkości liniowej fazy ruchomej) uzyskany na kolumnie PMP (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm) w 60/40 ACN/H2O z 0,1% TFA. (B) Wykres Van Deemtera (HETP w funkcji prędkości liniowej fazy ruchomej) uzyskany na kolumnie Ascentis Express RP-Amide (średnica wewnętrzna 100 x 1,8 mm) w 60/40 ACN/H2O z 0,1% TFA.
Przygotowano polarną fazę stacjonarną z interkalowanego polistyrenu i poddano ją ocenie pod kątem rozdziału mieszaniny syntetycznych peptydów i trypsynowego hydrolizatu albuminy surowicy ludzkiej (HSA) w wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Wydajność chromatograficzna kolumn PMP dla mieszanin peptydów jest doskonała pod względem wydajności i rozdzielczości rozdziału. Poprawa wydajności rozdziału kolumn PMP wynika z kilku czynników, takich jak rozmiar cząstek krzemionki i wielkość porów, kontrolowana synteza faz stacjonarnych oraz złożone materiały wypełniające kolumny. Oprócz wysokiej wydajności rozdziału, kolejną zaletą tej fazy stacjonarnej jest niskie ciśnienie wsteczne w kolumnie przy wysokich natężeniach przepływu. Kolumny PMP charakteryzują się wysoką powtarzalnością i mogą być stosowane do analizy mieszanin peptydów oraz trawienia trypsynowego różnych białek. Zamierzamy wykorzystać tę kolumnę do rozdziału związków bioaktywnych z produktów naturalnych, ekstraktów roślin leczniczych i grzybów w chromatografii cieczowej. W przyszłości kolumny PMP będą również oceniane pod kątem rozdziału białek i przeciwciał monoklonalnych.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Badania nad systemami rozdziału peptydów za pomocą chromatografii faz odwróconych, część I: Opracowanie protokołu do charakteryzacji kolumn. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Badania nad systemami rozdziału peptydów za pomocą chromatografii faz odwróconych, część I: Opracowanie protokołu do charakteryzacji kolumn.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. i Petersson, P. Badanie układów rozdziału peptydów metodą chromatografii w odwróconym układzie faz, część I: Opracowanie protokołu do charakteryzacji kolumnowej. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Badania nad systemami rozdzielania peptydów za pomocą chromatografii faz odwróconych, część I: Opracowanie protokołu dla charakterystyki kolumn. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Badania nad systemami rozdzielania peptydów za pomocą chromatografii faz odwróconych, część I: Opracowanie protokołu dla charakterystyki kolumn.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. i Petersson, P. Badanie układów rozdziału peptydów metodą chromatografii w odwróconym układzie faz, część I: Opracowanie protokołu do charakteryzacji kolumnowej.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. i in. Metody tworzenia ulepszonych aktywnych peptydów do leczenia chorób zakaźnych. Biotechnologia. Osiągnięcia 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetyczne peptydy terapeutyczne: nauka i rynek. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetyczne peptydy terapeutyczne: nauka i rynek.Vliege P, Lisowski V, Martinez J i Chreschatyski M. Syntetyczne peptydy terapeutyczne: nauka i rynek.Vliege P, Lisowski V, Martinez J i Khreschatsky M. Syntetyczne peptydy terapeutyczne: nauka i rynek. Odkrywanie leków. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Zaawansowana proteomiczna chromatografia cieczowa. Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Zaawansowana proteomiczna chromatografia cieczowa.Zobacz F., Smith RD i Shen Yu. Zaawansowana chromatografia cieczowa proteomiczna. Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Zaawansowana kompozycja białek.Zobacz F., Smith RD i Shen Yu. Zaawansowana chromatografia cieczowa proteomiczna.J. Chromatografia. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. i in. Zaawansowana chromatografia cieczowa połączona ze spektrometrią mas łączy w sobie szeroko pojętą metabolomikę i proteomikę. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM i Salisbury, JJ Rola UHPLC w rozwoju farmaceutycznym. Chesnut, SM i Salisbury, JJ Rola UHPLC w rozwoju farmaceutycznym.Chesnut, SM i Salisbury, JJ Rola UHPLC w rozwoju farmaceutycznym.Chesnut, SM i Salisbury, JJ Rola UHPLC w rozwoju leków. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. i Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty chromatografii cieczowej ultrawysokiego ciśnienia do szybkich rozdziałów. Wu, N. i Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty chromatografii cieczowej ultrawysokiego ciśnienia do szybkich rozdziałów.Wu, N. i Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty chromatografii cieczowej wysokociśnieniowej do szybkiej separacji. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面. Wu, N. & Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty chromatografii cieczowej pod ultrawysokim ciśnieniem do szybkiej separacji.Wu, N. i Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty chromatografii cieczowej wysokociśnieniowej do szybkiej separacji.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA i Tchelitcheff, P. Zastosowanie chromatografii cieczowej ultrasprawnej w rozwoju farmaceutycznym. Wren, SA i Tchelitcheff, P. Zastosowanie chromatografii cieczowej ultrasprawnej w rozwoju farmaceutycznym.Ren, SA i Chelischeff, P. Zastosowanie chromatografii cieczowej ultrawysokowydajnej w rozwoju farmaceutycznym. Wren, SA i Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用. Wren, SA i Tchelitcheff, P.Ren, SA i Chelischeff, P. Zastosowanie chromatografii cieczowej o ultrawydajności w rozwoju leków.J. Chromatografia. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. i in. Monolityczny makroporowaty hydrożel uzyskany z emulsji typu olej w wodzie z dużą fazą wewnętrzną do wydajnego oczyszczania enterowirusa 71. Projekt chemiczny. Czasopismo 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Rola chromatografii cieczowej w proteomice. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Rola chromatografii cieczowej w proteomice.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. i Wilkins, JA Rola chromatografii cieczowej w proteomice. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. i Wilkins, JA Rola chromatografii cieczowej w proteomice.J. Chromatografia. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nowe trendy w rozdzielaniu terapeutycznych peptydów i białek metodą chromatografii cieczowej w fazie odwróconej: teoria i zastosowania. & Guillarme, D. Nowe trendy w rozdzielaniu terapeutycznych peptydów i białek metodą chromatografii cieczowej w fazie odwróconej: teoria i zastosowania. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Nowe trendy w rozdzielaniu peptydów terapeutycznych i białek metodą chromatografii cieczowej w fazie odwróconej: teoria i zastosowania. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势:理论和应用. & Guillarme, D.i Guillarmé, D. Nowe trendy w rozdzielaniu peptydów terapeutycznych i białek metodą chromatografii cieczowej w fazie odwróconej: teoria i zastosowania.J. Pharm. Biomedical Science. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC Dwuwymiarowy rozdział peptydów z wykorzystaniem układu RP-RP-HPLC przy różnym pH w pierwszym i drugim wymiarze rozdziału. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC Dwuwymiarowy rozdział peptydów z wykorzystaniem układu RP-RP-HPLC przy różnym pH w pierwszym i drugim wymiarze rozdziału.Gilar M., Olivova P., Dali AE i Gebler JK Dwuwymiarowy rozdział peptydów z wykorzystaniem układu RP-RP-HPLC przy różnym pH w pierwszym i drugim wymiarze rozdziału.Gilar M., Olivova P., Dali AE i Gebler JK Dwuwymiarowe rozdzielanie peptydów przy użyciu różnych wartości pH w pierwszym i drugim wymiarze rozdzielania z wykorzystaniem układu RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. i in. Badanie przenoszenia masy i charakterystyk kinetycznych kolumn chromatografii wysokosprawnej wypełnionych cząstkami C18 o średnicy mniejszej niż 2 µm, całkowicie porowatymi i powierzchniowo porowatymi. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. i in. Najnowsze trendy i wyzwania analityczne w izolacji, identyfikacji i walidacji bioaktywnych peptydów roślinnych. Odbyt. Odbyt stworzeń. Chemiczny. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB i in. Krajobraz proteomiczny królestwa życia. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. i in. Leczenie peptydów terapeutycznych metodą preparatywnej chromatografii cieczowej. Molecules (Bazylea, Szwajcaria) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. i Geng, X. Chromatografia mieszana i jej zastosowanie w biopolimerach. Yang, Y. i Geng, X. Chromatografia mieszana i jej zastosowanie w biopolimerach.Yang, Yu. i Geng, X. Chromatografia w trybie mieszanym i jej zastosowanie do biopolimerów. Yang, Y. i Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Yang, Y. i Geng, X. Chromatografia w trybie mieszanym i jej zastosowanie w biopolimerach.Yang, Yu. i Gene, X. Chromatografia w trybie mieszanym i jej zastosowanie do biopolimerów.J. Chromatografia. A 1218(49), 8813–8825 (2011).