Dėkojame, kad apsilankėte Nature.com. Naudojate naršyklės versiją su ribotu CSS palaikymu. Norėdami gauti geriausią patirtį, rekomenduojame naudoti atnaujintą naršyklę (arba išjungti suderinamumo režimą „Internet Explorer“). Be to, siekdami užtikrinti nuolatinį palaikymą, svetainę rodome be stilių ir „JavaScript“.
Rodo trijų skaidrių karuselę vienu metu. Naudokite mygtukus „Ankstesnis“ ir „Kitas“, kad vienu metu pereitumėte per tris skaidres, arba naudokite slankiklio mygtukus gale, kad vienu metu pereitumėte per tris skaidres.
Porėtos silicio dioksido dalelės buvo paruoštos zolio-gelio metodu su tam tikrais pakeitimais, siekiant gauti plačiapores daleles. Šios dalelės buvo derivatizuotos su N-fenilmaleimido-metilvinilo izocianatu (PMI) ir stirenu atvirkštinės grandinės pernešimo-fragmentacijos (RAFT) polimerizacijos būdu, siekiant gauti N-fenilmaleimido interkaliuotus poliamidus. Stireno (PMP) stacionari fazė. Siauro skersmens nerūdijančio plieno kolonėlės (vidinis skersmuo 100 × 1,8 mm) buvo užpildytos srutų užpildu. PMP kolonėlės chromatografinis veikimas buvo įvertintas siekiant atskirti sintetinių peptidų mišinį, sudarytą iš penkių peptidų (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminorūgšties enkefalino) ir žmogaus serumo albumino (HAS) triptinės hidrolizato. Optimaliomis eliucijos sąlygomis teorinis plokštelių su peptidų mišiniu skaičius siekė 280 000 plokštelių/kv. m. Lyginant sukurtos kolonėlės atskyrimo efektyvumą su komercine „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėle, pastebėta, kad PMP kolonėlės atskyrimo efektyvumas buvo pranašesnis už komercinę kolonėlę pagal atskyrimo efektyvumą ir skiriamąją gebą.
Biofarmacijos pramonė tapo besiplečiančia pasauline rinka, kurios rinkos dalis pastaraisiais metais ženkliai išaugo. Dėl sprogstamojo biofarmacijos pramonės augimo1,2,3 labai išaugo peptidų ir baltymų analizės poreikis. Be tikslinio peptido, peptidų sintezės metu susidaro įvairios priemaišos, todėl norint gauti norimą peptido grynumą, reikalingas chromatografinis valymas. Baltymų analizė ir apibūdinimas kūno skysčiuose, audiniuose ir ląstelėse yra itin sudėtinga užduotis dėl didelio skaičiaus potencialiai aptinkamų rūšių, esančių viename mėginyje. Nors masių spektrometrija yra veiksminga priemonė peptidams ir baltymams sekvenuoti, jei tokie mėginiai tiesiogiai įvedami į masių spektrometrą, atskyrimas bus nepatenkinamas. Šią problemą galima išspręsti atliekant skysčių chromatografiją (LC) prieš MS analizę, kuri sumažins analitų, patenkančių į masių spektrometrą per tam tikrą laiką, kiekį4,5,6. Be to, analitai gali susikaupti siaurame regione skystosios fazės atskyrimo metu, taip sukoncentruodami šiuos analitus ir padidindami MS aptikimo jautrumą. Skysčių chromatografija (LC) per pastarąjį dešimtmetį gerokai patobulėjo ir tapo plačiai naudojamu proteominės analizės metodu .
Atvirkštinės fazės skysčių chromatografija (RP-LC) plačiai naudojama peptidų mišiniams gryninti ir atskirti, naudojant oktadecilo modifikuotą silicio dioksidą (ODS) kaip stacionariąją fazę11,12,13. Tačiau dėl savo sudėtingos struktūros ir amfoterinio pobūdžio14,15 RP stacionariosios fazės negali užtikrinti patenkinamo peptidų ir baltymų atskyrimo. Todėl peptidų ir baltymų su poliniais ir nepoliniais fragmentais analizei reikalingos specialiai sukurtos stacionariosios fazės, kurios sąveikautų ir išlaikytų šiuos analitus16. Mišri chromatografija, siūlanti daugiamodalinę sąveiką, gali būti alternatyva RP-LC peptidų, baltymų ir kitų sudėtingų mišinių atskyrimui. Buvo paruoštos kelios mišraus tipo stacionariosios fazės ir šiomis stacionariosiomis fazėmis užpildytos kolonėlės buvo naudojamos peptidams ir baltymams atskirti17,18,19,20,21. Dėl polinių ir nepolinių grupių buvimo mišraus režimo stacionariosios fazės (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polinė interkaliacija/RPLC) tinka peptidų ir baltymų atskyrimui22,23,24,25,26,27,28. Poliarinės įterptosios stacionariosios fazės su kovalentiškai sujungtomis polinėmis grupėmis pasižymi geromis atskyrimo galimybėmis ir unikaliu selektyvumu poliariniams ir nepoliariniams analitams, nes atskyrimas priklauso nuo analitės ir stacionariosios fazės sąveikos. Multimodalinės sąveikos 29,30,31,32. Neseniai Zhang ir kt. 30 gavo behenilo grupe užbaigtas poliaminų stacionarias fazes ir sėkmingai atskyrė angliavandenilius, antidepresantus, flavonoidus, nukleozidus, estrogenus ir kai kuriuos kitus analitus. Poliarinė įterptoji stacionarioji medžiaga turi ir poliarinių, ir nepoliarinių grupių, todėl ją galima naudoti peptidams ir baltymams atskirti į hidrofobines ir hidrofilines dalis. Poliarinės įterptosios kolonėlės (pvz., C18 kolonėlės su įterptu amidu) yra prieinamos prekiniu pavadinimu „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlės, tačiau šios kolonėlės buvo naudojamos tik amino 33 analizei.
Šiame tyrime buvo paruošta ir įvertintas poliarinė įterptinė stacionari fazė (N-fenilmaleimidas, įterptinis polistirenas) peptidų atskyrimo ir tripsino HSA skaidymo efektyvumas. Stacionari fazė buvo paruošta pagal šią strategiją. Porėtos silicio dioksido dalelės buvo paruoštos pagal ankstesniuose leidiniuose aprašytas procedūras, su tam tikrais pakeitimais 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 paruošimo schemose. Karbamido, polietilenglikolio (PEG), TMOS ir vandeninio acto rūgšties santykiai buvo pakoreguoti, siekiant gauti silicio dioksido daleles su dideliais porų dydžiais. Antra, buvo susintetintas naujas fenilmaleimido-metilvinilo izocianato ligandas, o jo išvestinės silicio dioksido dalelės buvo panaudotos poliarinėms įterptosioms stacionarioms fazėms paruošti. Gauta stacionari fazė buvo supakuota į nerūdijančio plieno kolonėlę (vidinis skersmuo 100 × 1,8 mm) pagal optimizuotą pakavimo schemą. Kolonėlės pakavimui naudojama mechaninė vibracija, siekiant užtikrinti vienodą sluoksnį kolonėlėje. Įkrauta kolonėlė buvo įvertinta dėl peptidų mišinio, sudaryto iš penkių peptidų (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucino-enkefalino peptidas), ir žmogaus serumo albumino (HSA) triptinių hidrolizatų atskyrimo. Pastebėta, kad peptidų mišinys ir HSA triptinis hidrolizatas atsiskyrė gera skiriamąja geba ir efektyvumu. PMP kolonėlės atskyrimo efektyvumas buvo palygintas su „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlės atskyrimo efektyvumu. Pastebėta, kad peptidai ir baltymai pasižymi gera skiriamąja geba ir dideliu atskyrimo efektyvumu PMP kolonėlėje, o PMP kolonėlės atskyrimo efektyvumas yra didesnis nei „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlės.
PEG (polietilenglikolis), karbamidas, acto rūgštis, trimetoksiortosilikatas (TMOS), trimetilchlorosilanas (TMCS), tripsinas, žmogaus serumo albuminas (HSA), amonio chloridas, karbamidas, heksametilmetakriloildisilazanas (HMDS), metakriloilchloridas (MC), stirenas, 4-hidroksi-TEMPO, benzoilo peroksidas (BPO), acetonitrilas (ACN) HPLC, metanolis, 2-propanolis ir acetonas. „Sigma-Aldrich“ kompanija (Sent Luisas, Misūris, JAV).
Karbamido (8 g), polietilenglikolio (8 g) ir 8 ml 0,01 N acto rūgšties mišinys buvo maišomas 10 minučių, po to, aušinant ledu, į jį buvo įpilta 24 ml TMOS. Reakcijos mišinys buvo kaitinamas 40 °C temperatūroje 6 valandas, o po to 120 °C temperatūroje 8 valandas nerūdijančio plieno autoklave. Vanduo buvo dekantuojamas, o liekana džiovinama 70 °C temperatūroje 12 valandų. Išdžiovinti minkšti blokeliai buvo glotniai sumalti ir kalcinuoti krosnyje 550 °C temperatūroje 12 valandų. Buvo paruoštos ir apibūdintos trys partijos, siekiant patikrinti dalelių dydžių, porų dydžio ir paviršiaus ploto atkuriamumą.
Poliarinė grupė ir stacionarioji fazė polistireno grandinėms. Paruošimo procedūra aprašyta toliau.
N-fenilmaleimidas (200 mg) ir metilvinilizocianatas (100 mg) buvo ištirpinti bevandeniame toluene, o po to į reakcijos kolbą įpilta 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitrilo (AIBN), kad būtų gautas fenilmaleimido ir metilvinilizocianato kopolimeras (PMCP). Mišinys buvo kaitinamas 60 °C temperatūroje 3 valandas, filtruojamas ir džiovinamas orkaitėje 40 °C temperatūroje 3 valandas.
Džiovintos silicio dioksido dalelės (2 g) buvo disperguotos sausame toluene (100 ml), maišomos ir sonikuojamos 10 min. 500 ml talpos apvaliadugnėje kolboje. PMCP (10 mg) buvo ištirpintas toluene ir lašinamas į reakcijos kolbą per lašinimo piltuvą. Mišinys buvo virinamas su grįžtamuoju šaldytuvu 100 °C temperatūroje 8 valandas, filtruojamas, plaunamas acetonu ir džiovinamas 60 °C temperatūroje 3 valandas. Tada su PMCP (100 g) susijusios silicio dioksido dalelės buvo ištirpintos toluene (200 ml) ir įpilta 4-hidroksi-TEMPO (2 ml), esant 100 μl dibutilalavo dilaurato kaip katalizatoriaus. Mišinys buvo maišomas 50 °C temperatūroje 8 valandas, filtruojamas ir džiovinamas 50 °C temperatūroje 3 valandas.
Stirenas (1 ml), benzoilo peroksidas BPO (0,5 ml) ir prie TEMPO-PMCP (1,5 g) prijungtos silicio dioksido dalelės buvo disperguotos toluene ir prapūstos azotu. Stireno polimerizacija buvo vykdoma 100 °C temperatūroje 12 valandų. Gautas produktas buvo plaunamas metanoliu ir džiovinamas per naktį 60 °C temperatūroje. Bendra reakcijos schema parodyta 1 paveiksle.
Mėginiai buvo degazuojami 393 K temperatūroje 1 val., kol buvo gautas mažesnis nei 10–3 Torr liekamasis slėgis. Bendram porų tūriui nustatyti buvo naudojamas adsorbuoto N2 kiekis, esant santykiniam slėgiui P/P0 = 0,99. Grynų ir ligandų surištų silicio dioksido dalelių morfologija buvo tirta skenuojančiu elektroniniu mikroskopu („Hitachi High Technologies“, Tokijas, Japonija). Sausi mėginiai (grynas silicio dioksidas ir ligandų surištos silicio dioksido dalelės) buvo dedami ant aliuminio strypų, naudojant anglies juostą. Auksas ant mėginio buvo nusodinamas naudojant Q150T purškimo įrenginį, o ant mėginio nusodinamas 5 nm storio Au sluoksnis. Tai pagerina žemos įtampos proceso efektyvumą ir užtikrina smulkų šaltąjį purškimą. Elementinė analizė atlikta naudojant „Thermo Electron“ (Waltham, MA, JAV) „Flash EA1112“ elementinės sudėties analizatorių. Dalelių dydžio pasiskirstymui nustatyti buvo naudojamas „Malvern“ dalelių dydžio analizatorius (Worcestershire, JK) „Mastersizer 2000“. Nepadengtos silicio dioksido dalelės ir ligandu surištos silicio dioksido dalelės (po 5 mg) buvo disperguotos 5 ml izopropanolio, 10 minučių sonikuotos, 5 minutes maišytos ir dedamos ant „Mastersizer“ optinio stalo. Termogravimetrinė analizė atliekama 5 °C per minutę greičiu, 30–800 °C temperatūros intervale.
Stiklo pluoštu dengtos siauro skersmens nerūdijančio plieno kolonėlės, kurių matmenys (ID 100 × 1,8 mm), buvo užpildytos suspensijos užpildymo metodu, laikantis tos pačios procedūros, kaip ir 31 nuorodoje. Nerūdijančio plieno kolonėlė (stiklu dengta, ID 100 × 1,8 mm) ir išleidimo anga su 1 µm fritu buvo prijungta prie suspensijos pakavimo mašinos („Alltech Deerfield“, IL, JAV). Paruoškite stacionarios fazės suspensiją suspenduodami 150 mg stacionarios fazės 1,2 ml metanolio ir tiekdami ją į rezervuarinę kolonėlę. Metanolis buvo naudojamas kaip suspensijos tirpiklis ir kontrolinis tirpiklis. Užpildykite kolonėlę taikydami slėgio seką: 100 MP 10 min., 80 MP 15 min. ir 60 MP 30 min. Užpildymo procese buvo naudojami du dujų chromatografijos kolonėlių vibratoriai („Alltech“, Deerfieldas, IL, JAV) mechaniniam vibravimui, siekiant užtikrinti tolygų kolonėlės užpildymą. Uždarykite suspensijos pakuotę ir lėtai išleiskite slėgį, kad nepažeistumėte virvelės. Kolona buvo atjungta nuo suspensijos antgalio, o prie įleidimo angos pritvirtinta kita jungtis ir prijungta prie LC sistemos, kad būtų patikrintas jos veikimas.
Sukonstruotas specialus daugiasluoksnis chromatografas (MLC), naudojant LC siurblį („10AD Shimadzu“, Japonija), mėginių ėmiklį su 50 nL įpurškimo kilpa („Valco“ (JAV) C14 W.05), membraninį degazatorių („Shimadzu DGU-14A“) ir UV-VIS kapiliarinį langą. Detektorius (UV-2075) ir emaliuota mikrokolonėlė. Naudokite labai siaurus ir trumpus jungiamuosius vamzdelius, kad sumažintumėte papildomo kolonėlės išsiplėtimo poveikį. Užpildžius kolonėlę, prie 1/16 colio redukcinės jungties išleidimo angos įstatykite kapiliarą (50 µm vidinis skersmuo 365) ir įstatykite redukcinės jungties kapiliarą (50 µm). Duomenų rinkimas ir chromatogramų apdorojimas atliekamas naudojant „Multichro 2000“ programinę įrangą. Esant 254 nm bangos ilgiui, tiriamųjų analitų UV absorbcija buvo stebima ties 0. Chromatografiniai duomenys buvo analizuojami naudojant „OriginPro8“ (Northamptonas, MA).
Žmogaus serumo albuminas, liofilizuoti milteliai, ≥ 96 % (agarozės gelio elektroforezė), 3 mg, sumaišyti su tripsinu (1,5 mg), 4,0 M karbamidu (1 ml) ir 0,2 M amonio bikarbonatu (1 ml). Tirpalas buvo maišomas 10 min. ir laikomas vandens vonioje 37 °C temperatūroje 6 val., po to užgesinamas 1 ml 0,1 % TFA. Tirpalas filtruojamas ir laikomas žemesnėje nei 4 °C temperatūroje.
Peptidų ir tripsine rūgštimi apdoroto HSA mišinio atskyrimas PMP kolonėlėje buvo įvertintas atskirai. Patikrinkite PMP kolonėle atskirto peptidų ir HSA mišinio tripsine hidrolize ir palyginkite rezultatus su „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėle. Teorinių lėkščių skaičius apskaičiuojamas pagal šią lygtį:
Gryno silicio dioksido dalelių ir ligandu surištų silicio dioksido dalelių SEM vaizdai parodyti 2 paveiksle. Gryno silicio dioksido dalelių (A, B) SEM vaizduose matyti sferinė forma, kurioje dalelės yra pailgos arba turi netaisyklingą simetriją, palyginti su ankstesniais mūsų tyrimais. Ligandu surištų silicio dioksido dalelių (C, D) paviršius yra lygesnis nei gryno silicio dioksido dalelių, o tai gali būti dėl polistireno grandinių, dengiančių silicio dioksido dalelių paviršių.
Gryno silicio dioksido dalelių (A, B) ir ligandu surištų silicio dioksido dalelių (C, D) skenuojančių elektronų mikrografijos.
Gryno silicio dioksido dalelių ir ligandu surišto silicio dioksido dalelių dydžio pasiskirstymas parodytas 2.3(A) paveiksle. Tūrinės dalelių dydžio pasiskirstymo kreivės parodė, kad silicio dioksido dalelių dydis padidėjo po cheminės modifikacijos (3A pav.). Dabartinio ir ankstesnio tyrimų silicio dioksido dalelių dydžio pasiskirstymo duomenys palyginti 1(A) lentelėje. PMP tūrinis dalelių dydis d(0,5) buvo 3,36 µm, palyginti su ad(0,5) verte, kuri buvo 3,05 µm ankstesniame mūsų tyrime (polistirenu surištos silicio dioksido dalelės)34. Dėl PEG, karbamido, TMOS ir acto rūgšties santykio reakcijos mišinyje pasikeitimo šios partijos dalelių dydžio pasiskirstymas buvo siauresnis, palyginti su ankstesniu mūsų tyrimu. PMP fazės dalelių dydis yra šiek tiek didesnis nei polistirenu surištos silicio dioksido dalelių fazės, kurią tyrėme anksčiau. Tai reiškia, kad silicio dioksido dalelių paviršiaus funkcionalizavimas stirenu nusodino tik polistireno sluoksnį (0,97 µm) ant silicio dioksido paviršiaus, o PMP fazėje sluoksnio storis buvo 1,38 µm.
Gryno silicio dioksido dalelių ir ligandu surištų silicio dioksido dalelių dalelių dydžio pasiskirstymas (A) ir porų dydžio pasiskirstymas (B).
Šiame tyrime naudotų silicio dioksido dalelių porų dydis, porų tūris ir paviršiaus plotas pateikti 1 lentelėje (B). Grynų silicio dioksido dalelių ir ligandų surištų silicio dioksido dalelių PSD profiliai pateikti 3 paveiksle (B). Rezultatai buvo palyginami su ankstesniu mūsų tyrimu34. Grynų ir ligandų surištų silicio dioksido dalelių porų dydžiai buvo atitinkamai 310 Å ir 241 Å, o tai rodo, kad po cheminės modifikacijos porų dydis sumažėjo 69 Å, kaip parodyta 1 lentelėje (B), o poslinkio kreivė parodyta paveiksle. Šiame tyrime silicio dioksido dalelių savitasis paviršiaus plotas yra 116 m2/g, o tai yra panašu į mūsų ankstesnį tyrimą (124 m2/g). Kaip parodyta 1 lentelėje (B), silicio dioksido dalelių paviršiaus plotas (m2/g) po cheminės modifikacijos taip pat sumažėjo nuo 116 m2/g iki 105 m2/g.
Stacionariosios fazės elementinės analizės rezultatai pateikti 2 lentelėje. Dabartinės stacionariosios fazės anglies kiekis yra 6,35 %, tai yra mažiau nei ankstesniame mūsų tyrime (su polistirenu susijusios silicio dioksido dalelės atitinkamai 7,93 %35 ir 10,21 %)42. Žemiau pateikiamas dabartinės stacionariosios fazės anglies kiekis, nes SP gamyboje be stireno buvo naudojami ir kai kurie poliniai ligandai, tokie kaip fenilmaleimido metilvinilizocianatas (PCMP) ir 4-hidroksi-TEMPO. Azoto masės procentas dabartinėje stacionariojoje fazėje yra 2,21 %, palyginti su 0,1735 ir 0,85 % ankstesniuose tyrimuose42. Tai reiškia, kad dabartinėje stacionariojoje fazėje yra didelis azoto masės procentas dėl fenilmaleimido. Panašiai, produktuose (4) ir (5) yra atitinkamai 2,7 % ir 2,9 % anglies, o galutiniame produkte (6) – 6,35 %, kaip parodyta 2 lentelėje. PMP stacionariosios fazės svorio kritimui nustatyti buvo taikyta termogravimetrinė analizė (TGA), o TGA kreivė parodyta 4 paveiksle. TGA kreivė rodo 8,6 % svorio kritimą, kuris gerai atitinka anglies kiekį (6,35 %), nes liganduose yra ne tik C, bet ir N, O bei H.
Dėl poliarinių fenilmaleimido ir vinilizocianato grupių silicio dioksido dalelių paviršiui modifikuoti buvo pasirinktas ligandas fenilmaleimido-metilvinilizocianatas. Vinilo izocianato grupės gali toliau reaguoti su stirenu gyvosios radikalinės polimerizacijos būdu. Antra priežastis – įterpti grupę, kuri vidutiniškai sąveikauja su analite ir neturi stiprios elektrostatinės sąveikos tarp analito ir stacionariosios fazės, nes fenilmaleimido fragmentas esant normaliam pH neturi virtualaus krūvio. Stacionariosios fazės poliškumą galima kontroliuoti optimaliu stireno kiekiu ir laisvųjų radikalų polimerizacijos reakcijos laiku. Paskutinis reakcijos etapas (laisvųjų radikalų polimerizacija) yra labai svarbus, nes jis keičia stacionariosios fazės poliškumą. Buvo atlikta elementų analizė, siekiant patikrinti anglies kiekį šiose stacionariosiose fazėse. Pastebėta, kad didinant stireno kiekį ir reakcijos laiką, didėja stacionariosios fazės anglies kiekis ir atvirkščiai. Su skirtingomis stireno koncentracijomis paruošti SP turi skirtingą anglies kiekį. Panašiai šios stacionariosios fazės buvo dedamos ant nerūdijančio plieno kolonėlių ir patikrintos jų chromatografinės charakteristikos (selektyvumas, skiriamoji geba, N vertė ir kt.). Remiantis šiais eksperimentais, buvo pasirinkta optimizuota PMP stacionariosios fazės paruošimo sudėtis, siekiant užtikrinti kontroliuojamą poliškumą ir gerą analitės sulaikymą.
PMP kolonėlė taip pat buvo įvertinta analizuojant penkis peptidų mišinius (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucinas-enkefalinas), naudojant mobiliosios fazės talpą. 60/40 (v/v) ACN/vanduo (0,1 % TFA) esant 80 µl/min. srautui. Optimaliomis eliucijos sąlygomis (200 000 plokštelių/m²) teorinių plokštelių (N) skaičius vienoje kolonėlėje (100 × 1,8 mm) yra 20 000 ± 100. Trijų PMP kolonėlių N vertės pateiktos 3 lentelėje, o chromatogramos – 5A paveiksle. Greita analizė dideliu srauto greičiu (700 µl/min.) PMP kolonėlėje, penki peptidai buvo eliuoti per vieną minutę, puiki N vertė – 13 500 ± 330 vienai kolonėlei (100 x 1,8 mm skersmuo), atitinkanti 135 000 lėkščių/m (5B pav.). Trys vienodo dydžio kolonėlės (vidinis skersmuo 100 x 1,8 mm) buvo užpildytos trimis skirtingomis PMP stacionariosios fazės partijomis, siekiant patikrinti pakartojamumą. Analitai kiekvienam stulpeliui buvo registruojami atskiriant tą patį tiriamąjį mišinį kiekvienoje kolonėlėje, naudojant optimalias eliuavimo sąlygas, teorinių lėkščių skaičių N ir sulaikymo laiką. PMP kolonėlių pakartojamumo duomenys pateikti 4 lentelėje. PMP kolonėlės pakartojamumas gerai koreliavo su labai mažomis %RSD vertėmis, kaip parodyta 3 lentelėje.
Peptidų mišinių atskyrimas PMP kolonėlėje (B) ir „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlėje (A), mobilioji fazė 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), PMP kolonėlės matmenys (100 x 1,8 mm vidinis skersmuo), analizė. Junginių eliucijos tvarka: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ir 5 (leucino rūgšties enkefalinas).
Žmogaus serumo albumino tripsino hidrolizato atskyrimui HPLC metodu buvo įvertintas PMP kolonėlės (vidinis skersmuo 100 x 1,8 mm) gebėjimas atskirti triptinę žmogaus serumo albumino hidrolizatą. 6 paveiksle pateiktoje chromatogramoje matyti, kad mėginiai gerai atskirti ir pasižymi labai gera skiriamąja geba. HSA tirpalai buvo analizuojami naudojant 100 μl/min srauto greitį, mobiliąją fazę – 70/30 acetonitrilo/vandens ir 0,1 % TFA. HSA skilimas buvo padalintas į 17 smailių, kaip parodyta chromatogramoje (6 pav.), atitinkančių 17 peptidų. Buvo apskaičiuotas atskirų smailių atskyrimo nuo HSA hidrolizato efektyvumas, o vertės pateiktos 5 lentelėje.
HSA tripsino hidrolizatai buvo atskirti PMP kolonėlėje (vidinis skersmuo 100 x 1,8 mm), srauto greitis (100 μl/min.), mobilioji fazė 60/40 acetonitrilas/vanduo ir 0,1 % TFA.
kur L yra kolonėlės ilgis, η yra mobiliosios fazės klampumas, ΔP yra kolonėlės priešslėgis, o u yra mobiliosios fazės linijinis greitis. PMP kolonėlės pralaidumas buvo 2,5 × 10–14 m2, srauto greitis – 25 µl/min., buvo naudojamas 60/40 v/v. ACN/vanduo. PMP kolonėlės (ID 100 × 1,8 mm) pralaidumas buvo panašus į ankstesnio mūsų tyrimo (Ref.34) pralaidumą. Paviršiškai porėtomis dalelėmis užpildytos kolonėlės pralaidumas yra 1,7 × 10⁻⁶ µm, 2,5 × 10⁻⁶ m2, jei dalelių dydis 5 µm43. Todėl PMP fazės pralaidumas yra panašus į 5 μm dydžio šerdies-apvalkalo dalelių pralaidumą.
kur Wx yra kolonėlės, užpildytos chloroformu, masė, Wy yra kolonėlės, užpildytos metanolio, masė, o ρ yra tirpiklio tankis. Metanolio (ρ = 0,7866) ir chloroformo (ρ = 1,484) tankis. Bendras silicio dioksido-C18 dalelių kolonėlės (100 × 1,8 mm ID)34 ir mūsų anksčiau tirtos C18-karbamido31 kolonėlės poringumas buvo atitinkamai 0,63 ir 0,55. Tai reiškia, kad karbamido ligandų buvimas sumažina stacionariosios fazės pralaidumą. Kita vertus, bendras PMP kolonėlės (vidinis skersmuo 100 × 1,8 mm) poringumas yra 0,60. PMP kolonėlės yra mažiau pralaidžios nei kolonėlės, pripildytos C18 surištomis silicio dioksido dalelėmis, nes C18 tipo stacionariosiose fazėse C18 ligandai yra prijungti prie silicio dioksido dalelių linijinėmis grandinėmis, o polistireno tipo stacionariosiose fazėse aplink daleles susidaro santykinai storas polimeras. Tipiškame eksperimente kolonėlės poringumas apskaičiuojamas taip:
7A ir 7B paveiksluose pateikti Van Deemterio grafikai PMP kolonėlėms (vidinis skersmuo 100 x 1,8 mm) ir „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlėms (vidinis skersmuo 100 x 1,8 mm), esant toms pačioms eliuavimo sąlygoms – 60/40 ACN/H2O ir 0,1 % TFA, nuo 20 µl/min. iki 800 µl/min. abiejose kolonėlėse. Minimalios HETP vertės esant optimaliam srauto greičiui (80 µl/min.) buvo atitinkamai 2,6 µm ir 3,9 µm PMP kolonėlėms ir „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlėms. HETP vertės rodo, kad PMP kolonėlės (100 x 1,8 mm vidinis skersmuo) atskyrimo efektyvumas yra daug didesnis nei komerciškai prieinamos „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėlės (100 x 1,8 mm vidinis skersmuo). 7(A) paveiksle pateiktame van Deemterio grafike matyti, kad N vertės sumažėjimas didėjant srautui nėra reikšmingai didesnis, palyginti su ankstesniu mūsų tyrimu. Didesnis PMP kolonėlės (vidinis skersmuo 100 × 1,8 mm) atskyrimo efektyvumas, palyginti su „Ascentis Express RP-Amide“ kolonėle, pagrįstas pagerinta dalelių forma ir dydžiu bei sudėtinga kolonėlės užpildymo procedūra, naudojama šiame darbe34.
(A) Van Deemterio grafikas (HETP ir mobiliosios fazės linijinis greitis), gautas PMP kolonėlėje (vidinis skersmuo 100 x 1,8 mm) 60/40 ACN/H2O su 0,1 % TFA. (B) Van Deemterio grafikas (HETP ir mobiliosios fazės linijinis greitis), gautas Ascentis Express RP-Amide kolonėlėje (vidinis skersmuo 100 x 1,8 mm) 60/40 ACN/H2O su 0,1 % TFA.
Poliarinė stacionari fazė iš interkaliuoto polistireno buvo paruošta ir įvertinta sintetinių peptidų ir žmogaus serumo albumino (HSA) triptino hidrolizato mišinio atskyrimui didelio efektyvumo skysčių chromatografijoje. PMP kolonėlių chromatografinis veikimas peptidų mišiniams yra puikus atskyrimo efektyvumo ir skiriamosios gebos požiūriu. Pagerėjęs PMP kolonėlių atskyrimo efektyvumas yra dėl kelių priežasčių, tokių kaip silicio dioksido dalelių dydis ir porų dydis, kontroliuojama stacionariųjų fazių sintezė ir sudėtingos kolonėlių įpakavimo medžiagos. Be didelio atskyrimo efektyvumo, kitas šios stacionariosios fazės privalumas yra mažas kolonėlės priešslėgis esant dideliems srautams. PMP kolonėlės yra labai gerai atkuriamos ir gali būti naudojamos peptidų mišiniams analizuoti ir įvairių baltymų triptinui virškinti. Ketiname naudoti šią kolonėlę bioaktyvių junginių atskyrimui iš natūralių produktų, vaistinių augalų ir grybų ekstraktų skysčių chromatografijoje. Ateityje PMP kolonėlės taip pat bus įvertintos baltymų ir monokloninių antikūnų atskyrimui.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. ir Petersson, P. Atvirkštinės fazės chromatografijos peptidų atskyrimo sistemų tyrimas, I dalis: kolonėlės charakterizavimo protokolo sukūrimas. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. ir Petersson, P. Atvirkštinės fazės chromatografijos peptidų atskyrimo sistemų tyrimas, I dalis: kolonėlės charakterizavimo protokolo sukūrimas.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. ir Petersson, P. Peptidų atskyrimo sistemų tyrimas atvirkštinės fazės chromatografija, I dalis: kolonėlės apibūdinimo protokolo parengimas. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. ir Petersson, P. Atvirkštinės fazės chromatografijos peptidų atskyrimo sistemų tyrimas, I dalis: kolonėlės charakteristikų protokolo sudarymas. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. ir Petersson, P. Atvirkštinės fazės chromatografijos peptidų atskyrimo sistemų tyrimas, I dalis: kolonėlės charakteristikų protokolo sudarymas.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. ir Petersson, P. Peptidų atskyrimo sistemų tyrimas atvirkštinės fazės chromatografija, I dalis: kolonėlės apibūdinimo protokolo parengimas.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. ir kt. Patobulintų aktyviųjų peptidų, skirtų infekcinių ligų gydymui, kūrimo metodai. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. ir Khrestchatisky, M. Sintetiniai terapiniai peptidai: mokslas ir rinka. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. ir Khrestchatisky, M. Sintetiniai terapiniai peptidai: mokslas ir rinka.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ir Chreschatyski M. Sintetiniai terapiniai peptidai: mokslas ir rinka.Vliege P., Lisowski V., Martinez J. ir Khreschatsky M. Sintetiniai terapiniai peptidai: mokslas ir rinka. Vaistų atradimas. Šiandien 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD ir Shen, Y. Pažangi proteominė skysčių chromatografija. Xie, F., Smith, RD ir Shen, Y. Pažangi proteominė skysčių chromatografija.Žr. F., Smith RD ir Shen Yu. Pažangi proteominė skysčių chromatografija. Xie, F., Smith, RD ir Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD ir Shen, Y. Išplėstinė baltymų sudėtis 液相色谱.Žr. F., Smith RD ir Shen Yu. Pažangi proteominė skysčių chromatografija.J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. ir kt. Pažangi skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos technologija gali derinti plataus masto metabolomiką ir proteomiką. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM ir Salisbury, JJ UHPLC vaidmuo vaistų kūrime. Chesnut, SM ir Salisbury, JJ UHPLC vaidmuo vaistų kūrime.Chesnut, SM ir Salisbury, JJ UHPLC vaidmuo farmacijos kūrime.Chesnut, SM ir Salisbury, JJ. UHPLC vaidmuo kuriant vaistus. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. ir Clausen, AM. Pagrindiniai ir praktiniai itin aukšto slėgio skysčių chromatografijos aspektai greitam atskyrimui. Wu, N. ir Clausen, AM. Pagrindiniai ir praktiniai itin aukšto slėgio skysčių chromatografijos aspektai greitam atskyrimui.Wu, N. ir Clausen, AM. Pagrindiniai ir praktiniai aukšto slėgio skysčių chromatografijos aspektai greitam atskyrimui. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面. Wu, N. ir Clausen, AM. Pagrindiniai ir praktiniai itin aukšto slėgio skysčių chromatografijos aspektai greitam atskyrimui.Wu, N. ir Clausen, AM. Pagrindiniai ir praktiniai aukšto slėgio skysčių chromatografijos aspektai greitam atskyrimui.„J. Sept. Science“. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA ir Tchelitcheff, P. Itin efektyviosios skysčių chromatografijos panaudojimas farmacijos produktų kūrime. Wren, SA ir Tchelitcheff, P. Itin efektyviosios skysčių chromatografijos panaudojimas farmacijos produktų kūrime.Ren, SA ir Chelischeff, P. Itin efektyviosios skysčių chromatografijos panaudojimas farmacijos produktų kūrime. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用. Wren, SA ir Tchelitcheff, P.Ren, SA ir Chelischeff, P. Itin efektyviosios skysčių chromatografijos taikymas vaistų kūrime.„J. Chromatography“. 1119(1–2), 140–146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. ir kt. Monolitinis makroporinis hidrogelis, gautas iš aliejaus vandenyje emulsijos su didele vidine faze, skirtas efektyviam enteroviruso 71 valymui. Cheminis projektas. Žurnalas 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. ir Wilkins, JA. Skysčių chromatografijos vaidmuo proteomikoje. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. ir Wilkins, JA. Skysčių chromatografijos vaidmuo proteomikoje.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. ir Wilkins, JA Skysčių chromatografijos vaidmuo proteomikoje. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. ir Wilkins, JA Skysčių chromatografijos vaidmuo proteomikoje.J. Chromatography. A 1053 (1–2), 27–36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Naujos atvirkštinės fazės skysčių chromatografijos terapinių peptidų ir baltymų atskyrimo tendencijos: teorija ir taikymas. & Guillarme, D. Naujos atvirkštinės fazės skysčių chromatografijos terapinių peptidų ir baltymų atskyrimo tendencijos: teorija ir taikymas. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хромофа фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Naujos terapinių peptidų ir baltymų atskyrimo atvirkštinės fazės skysčių chromatografijos metodu tendencijos: teorija ir taikymas. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 ir Guillarme, D.ir Guillarmé, D. Naujos terapinių peptidų ir baltymų atskyrimo atvirkštinės fazės skysčių chromatografijos metodu tendencijos: teorija ir taikymas.J. Pharm. Biomedicinos mokslas. išangė. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE ir Gebler, JC Dvimatis peptidų atskyrimas naudojant RP-RP-HPLC sistemą su skirtingu pH pirmajame ir antrajame atskyrimo matmenyse. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE ir Gebler, JC Dvimatis peptidų atskyrimas naudojant RP-RP-HPLC sistemą su skirtingu pH pirmajame ir antrajame atskyrimo matmenyse.Gilar M., Olivova P., Dali AE ir Gebler JK Dvimatis peptidų atskyrimas naudojant RP-RP-HPLC sistemą su skirtingu pH pirmajame ir antrajame atskyrimo matmenyse.Gilar M., Olivova P., Dali A. E. ir Gebler J. K. Dvimatis peptidų atskyrimas naudojant skirtingas pH vertes pirmoje ir antroje atskyrimo dimensijose, naudojant RP-RP-HPLC sistemą. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. ir kt. Didelio efektyvumo chromatografijos kolonėlių, pripildytų visiškai porėtomis ir paviršutiniškai porėtomis C18 dalelėmis, mažesnėmis nei 2 µm, masės pernašos ir kinetinių charakteristikų tyrimas. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. ir kt. Naujausios tendencijos ir analitiniai iššūkiai, susiję su augalų bioaktyviųjų peptidų išskyrimu, identifikavimu ir patvirtinimu. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB ir kt. Gyvybės karalystės proteominis kraštovaizdis. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. ir kt. Terapinių peptidų papildomas apdorojimas preparatyvine skysčių chromatografija. Molecules (Bazelis, Šveicarija) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. ir Geng, X. Mišraus režimo chromatografija ir jos taikymas biopolimerams. Yang, Y. ir Geng, X. Mišraus režimo chromatografija ir jos taikymas biopolimerams.Yang, Yu. ir Geng, X. Mišraus režimo chromatografija ir jos taikymas biopolimerams. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Yang, Y. ir Geng, X. Mišraus režimo chromatografija ir jos taikymas biopolimeruose.Yang, Yu. ir Gene, X. Mišraus režimo chromatografija ir jos taikymas biopolimerams.„J. Chromatography“. A 1218(49), 8813–8825 (2011).