Дзякуй за наведванне сайта Nature.com. Вы карыстаецеся версіяй браўзера з абмежаванай падтрымкай CSS. Для найлепшага карыстання рэкамендуем выкарыстоўваць абноўлены браўзер (або адключыць рэжым сумяшчальнасці ў Internet Explorer). Акрамя таго, каб забяспечыць пастаянную падтрымку, мы паказваем сайт без стыляў і JavaScript.
Адлюстроўвае карусель з трох слайдаў адначасова. Выкарыстоўвайце кнопкі «Папярэдні» і «Наступны», каб перамяшчацца паміж трыма слайдамі адначасова, або выкарыстоўвайце кнопкі-паўзункі ў канцы, каб перамяшчацца паміж трыма слайдамі адначасова.
Сітаватыя часціцы крэмнезёму былі падрыхтаваны золь-гель метадам з некаторымі мадыфікацыямі для атрымання часціц з шырокімі порамі. Гэтыя часціцы былі дэрыватызаваны з дапамогай N-фенілмалеімід-метылвінілізацыяната (PMI) і стыролу шляхам палімерызацыі з зваротнай перадачай ланцуга-фрагментацыяй (RAFT) для атрымання поліамідаў, інтэркаляваных N-фенілмалеімідам. Стацыянарная фаза - стырол (PMP). Вузкія калоны з нержавеючай сталі (унутраны дыяметр 100 × 1,8 мм) былі запоўнены суспензійнай насадкай. Храматаграфічныя характарыстыкі калоны PMP былі ацэнены для падзелу сумесі сінтэтычных пептыдаў, якая складаецца з пяці пептыдаў (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu амінакіслата энкефалін) і трыпсінавага гідралізату сыроватачнага альбуміна чалавека (HAS). Пры аптымальных умовах элюцыі тэарэтычная колькасць пласцін са сумессю пептыдаў дасягнула 280 000 пласцін/кв.м. Параўноўваючы эфектыўнасць падзелу распрацаванай калоны з камерцыйнай калонай Ascentis Express RP-Amide, было заўважана, што эфектыўнасць падзелу калоны PMP пераўзыходзіла камерцыйную калону з пункту гледжання эфектыўнасці падзелу і раздзяляльнай здольнасці.
Біяфармацэўтычная прамысловасць стала глабальным рынкам, які пастаянна развіваецца, са значным павелічэннем долі рынку ў апошнія гады. З імклівым ростам біяфармацэўтычнай прамысловасці1,2,3 існуе вялікая патрэба ў аналізе пептыдаў і бялкоў. Акрамя мэтавага пептыда, падчас сінтэзу пептыдаў утвараюцца розныя прымешкі, таму для атрымання патрэбнай чысціні пептыда патрабуецца храматаграфічная ачыстка. Аналіз і характарыстыка бялкоў у біялагічных вадкасцях, тканінах і клетках з'яўляецца надзвычай складанай задачай з-за вялікай колькасці патэнцыйна выяўляемых відаў, якія прысутнічаюць у адным узоры. Нягледзячы на ​​тое, што мас-спектрометрыя з'яўляецца эфектыўным інструментам для секвенавання пептыдаў і бялкоў, калі такія ўзоры непасрэдна ўводзіць у мас-спектрометр, падзел будзе нездавальняючым. Гэтую праблему можна вырашыць, правёўшы вадкасную храматаграфію (ВХ) перад МС-аналізам, што дазволіць паменшыць колькасць аналітаў, якія паступаюць у мас-спектрометр у дадзены момант часу4,5,6. Акрамя таго, аналіты могуць канцэнтравацца ў вузкай вобласці падчас падзелу ў вадкай фазе, тым самым канцэнтруючы гэтыя аналіты і павялічваючы адчувальнасць МС-дэтэктара. Вадкасная храматаграфія (ВХ) значна прасунулася за апошняе дзесяцігоддзе і стала шырока выкарыстоўваным метадам пратэомнага аналізу7,8,9,10.
Абаронча-фазавая вадкасная храматаграфія (АФВХ) шырока выкарыстоўваецца для ачысткі і падзелу сумесяў пептыдаў з выкарыстаннем актадэцыл-мадыфікаванага дыяксіду крэмнію (ОДС) у якасці стацыянарнай фазы11,12,13. Аднак з-за сваёй складанай структуры і амфатэрнай прыроды14,15 стацыянарныя фазы АФХ не могуць забяспечыць здавальняючага падзелу пептыдаў і бялкоў. Такім чынам, аналіз пептыдаў і бялкоў з палярнымі і непалярнымі фрагментамі патрабуе спецыяльна распрацаваных стацыянарных фаз для ўзаемадзеяння і ўтрымання гэтых аналітаў16. Змяшаная храматаграфія, якая прапануе мультымадальныя ўзаемадзеянні, можа быць альтэрнатывай АФВХ для падзелу пептыдаў, бялкоў і іншых складаных сумесяў. Было падрыхтавана некалькі стацыянарных фаз змешанага тыпу, і калонкі, запоўненыя гэтымі стацыянарнымі фазамі, выкарыстоўваліся для падзелу пептыдаў і бялкоў17,18,19,20,21. З-за наяўнасці палярных і непалярных груп, стацыянарныя фазы змешанага рэжыму (WAX/АФВХ, HILIC/АФВХ, палярная інтэркаляцыя/АФВХ) падыходзяць для падзелу пептыдаў і бялкоў22,23,24,25,26,27,28. , палярныя інтэркаляваныя стацыянарныя фазы з кавалентна звязанымі палярнымі групамі дэманструюць добрыя магчымасці падзелу і ўнікальную селектыўнасць для палярных і непалярных аналітаў, паколькі падзел залежыць ад узаемадзеяння паміж аналітам і стацыянарнай фазай. Мультымадальныя ўзаемадзеянні 29,30,31,32. Нядаўна Чжан і інш. 30 атрымалі стацыянарныя фазы поліамінаў з бегеніл-тэрмінальнымі групамі і паспяхова аддзялілі вуглевадароды, антыдэпрэсанты, флаваноіды, нуклеазіды, эстрагены і некаторыя іншыя аналіты. Палярны ўбудаваны стацыянарны матэрыял мае як палярныя, так і непалярныя групы, таму яго можна выкарыстоўваць для падзелу пептыдаў і бялкоў на гідрафобныя і гідрафільныя часткі. Палярныя ўбудаваныя калонкі (напрыклад, калонкі C18 з амідным убудаваным злучэннем) даступныя пад гандлёвай назвай калонкі Ascentis Express RP-Amide, але гэтыя калонкі выкарыстоўваліся толькі для аналізу аміна 33.
У дадзеным даследаванні была падрыхтавана палярная ўбудаваная стацыянарная фаза (N-фенілмалеімід, убудаваны полістырол) і ацэнена для падзелу пептыдаў і трыптычнага расшчаплення HSA. Для падрыхтоўкі стацыянарнай фазы была выкарыстана наступная стратэгія. Сітаватыя часціцы крэмнезёму былі падрыхтаваны ў адпаведнасці з працэдурамі, апісанымі ў нашых папярэдніх публікацыях, з некаторымі зменамі ў схемах падрыхтоўкі 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Суадносіны мачавіны, поліэтыленгліколю (PEG), TMOS і водна-воцатнай кіслаты былі адрэгуляваны для атрымання часціц крэмнезёму з вялікімі памерамі пор. Па-другое, быў сінтэзаваны новы ліганд фенілмалеімід-метылвінілізацыянат, і яго дэрыватызаваныя часціцы крэмнезёму былі выкарыстаны для падрыхтоўкі палярных убудаваных стацыянарных фаз. Атрыманая стацыянарная фаза была ўпакавана ў калону з нержавеючай сталі (унутраны дыяметр 100 × 1,8 мм) у адпаведнасці з аптымізаванай схемай упакоўкі. Упакоўка калоны забяспечваецца механічнай вібрацыяй для забеспячэння аднастайнага пласта ўнутры калоны. Напаўняльная калона была ацэненая на падзел сумесі пептыдаў, якая складаецца з пяці пептыдаў (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцын-энкефалінавы пептыд) і трыптычных гідралізатаў сыроватачнага альбуміна чалавека (HSA). Было заўважана, што сумесь пептыдаў і трыптычны перавар HSA падзяліліся з добрым разрозненнем і эфектыўнасцю. Эфектыўнасць падзелу калоны PMP параўноўвалася з эфектыўнасцю калоны Ascentis Express RP-Amide. Было заўважана, што пептыды і бялкі маюць добрае разрозненне і высокую эфектыўнасць падзелу на калоне PMP, прычым эфектыўнасць падзелу калоны PMP вышэйшая, чым у калоны Ascentis Express RP-Amide.
ПЭГ (поліэтыленгліколь), мачавіна, воцатная кіслата, трыметоксіартасілікат (TMOS), трыметылхлорсілан (TMCS), трыпсін, сыроватачны альбумін чалавека (HSA), хларыд амонія, мачавіна, гексаметылметакрылаілдысілазан (HMDS), метакрылалхларыд (MC), стырол, 4-гідраксі-TEMPO, бензоілпераксід (BPO), ацэтанітрыл (ACN) для ВЭЖХ, метанол, 2-прапанол і ацэтон. Кампанія Sigma-Aldrich (Сэнт-Луіс, Місуры, ЗША).
Сумесь мачавіны (8 г), поліэтыленгліколю (8 г) і 8 мл 0,01 н. воцатнай кіслаты перамешвалі на працягу 10 хвілін, пасля чаго дадалі 24 мл TMOS пры астуджэнні лёдам. Рэакцыйную сумесь награвалі пры тэмпературы 40°C на працягу 6 гадзін, а затым пры тэмпературы 120°C на працягу 8 гадзін у аўтаклаве з нержавеючай сталі. Ваду дэкантавалі, а рэшту сушылі пры тэмпературы 70°C на працягу 12 гадзін. Высушаныя мяккія блокі гладка здрабнілі і пракалі ў печы пры тэмпературы 550°C на працягу 12 гадзін. Былі падрыхтаваны і ахарактарызаваны тры партыі для праверкі ўзнаўляльнасці памераў часціц, памеру пор і плошчы паверхні.
Палярная група і нерухомая фаза для ланцугоў полістыролу. Працэдура атрымання апісана ніжэй.
N-фенілмалеімід (200 мг) і метылвінілізацыянат (100 мг) растваралі ў бязводным талуоле, а затым у рэакцыйную колбу дадавалі 0,1 мл 2,2'-азаізабутыранітрылу (AIBN) для атрымання сапалімера фенілмалеіміду і метылвінілізацыяната (PMCP). Сумесь награвалі пры тэмпературы 60°C на працягу 3 гадзін, фільтравалі і сушылі ў духоўцы пры тэмпературы 40°C на працягу 3 гадзін.
Высушаныя часціцы дыяксіду крэмнію (2 г) дыспергавалі ў сухім талуоле (100 мл), перамешвалі і апрацоўвалі ультрагукам на працягу 10 хвілін у кругладоннай колбе аб'ёмам 500 мл. PMCP (10 мг) растваралі ў талуоле і дадавалі па кроплях у рэакцыйную колбу праз капільную варонку. Сумесь кіпяцілі з зваротным халадзільнікам пры тэмпературы 100°C на працягу 8 гадзін, фільтравалі, прамывалі ацэтонам і сушылі пры тэмпературы 60°C на працягу 3 гадзін. Затым часціцы дыяксіду крэмнію, звязаныя з PMCP (100 г), растваралі ў талуоле (200 мл) і дадавалі 4-гідраксі-TEMPO (2 мл) у прысутнасці 100 мкл дыбутылдылаўрата алавянага рэчыва ў якасці каталізатара. Сумесь перамешвалі пры тэмпературы 50°C на працягу 8 гадзін, фільтравалі і сушылі пры 50°C на працягу 3 гадзін.
Стырол (1 мл), бензоілпероксид BPO (0,5 мл) і часціцы дыяксіду крэмнію, прымацаваныя да TEMPO-PMCP (1,5 г), дыспергавалі ў талуоле і прамывалі азотам. Палімерызацыю стыролу праводзілі пры тэмпературы 100°C на працягу 12 гадзін. Атрыманы прадукт прамывалі метанолам і сушылі на працягу ночы пры тэмпературы 60°C. Агульная схема рэакцыі паказана на мал. 1.
Узоры дэгазавалі пры тэмпературы 393 К на працягу 1 гадзіны да дасягнення рэшткавага ціску менш за 10–3 Тор. Для вызначэння агульнага аб'ёму пор выкарыстоўвалі колькасць N2, адсарбаванага пры адносным ціску P/P0 = 0,99. Марфалогія чыстых і звязаных з лігандамі часціц крэмнезёму даследавалася з дапамогай сканіруючага электроннага мікраскопа (Hitachi High Technologies, Токіо, Японія). Сухія ўзоры (чысты крэмнезём і звязаныя з лігандамі часціцы крэмнезёму) размяшчалі на алюмініевых стрыжнях з дапамогай вугляроднай стужкі. Золата наносілі на ўзор з дапамогай распыляльнай прылады Q150T, а пласт Au таўшчынёй 5 нм. Гэта павышае эфектыўнасць нізкавольтнага працэсу і забяспечвае дробнае халоднае напыленне. Элементны аналіз праводзілі з выкарыстаннем аналізатара элементарнага складу Thermo Electron (Уолтэм, Масачусэтс, ЗША) Flash EA1112. Для атрымання размеркавання памераў часціц выкарыстоўвалі аналізатар памераў Malvern (Вустэршыр, Вялікабрытанія) Mastersizer 2000. Непакрытыя часціцы крэмнезёму і часціцы крэмнезёму, звязаныя з лігандамі (па 5 мг кожнай), дыспергавалі ў 5 мл ізапрапанолу, апрацоўвалі ультрагукам на працягу 10 хвілін, перамешвалі на працягу 5 хвілін і змяшчалі на аптычны стол Mastersizer. Тэрмагравіметрычны аналіз праводзіўся са хуткасцю 5 °C у хвіліну ў дыяпазоне тэмператур ад 30 да 800 °C.
Калоны з нержавеючай сталі з вузкім адтулінай і шкловалакном з памерамі (унутраны дыяметр 100 × 1,8 мм) былі загружаныя метадам запаўнення суспензіяй па той жа працэдуры, што і ў спасылцы 31. Калону з нержавеючай сталі (з эмалью шкловалакна, унутраны дыяметр 100 × 1,8 мм) і выхадную адтуліну, якая змяшчала фрыту памерам 1 мкм, падключылі да машыны для запаўнення суспензіі (Alltech Deerfield, IL, ЗША). Падрыхтуйце суспензію нерухомай фазы, суспендаваўшы 150 мг нерухомай фазы ў 1,2 мл метанолу і падаўшы яе ў калону з рэзервуарам. Метанол выкарыстоўваўся ў якасці растваральніка для суспензіі і кантрольнага растваральніка. Запоўніце калону, прымяняючы паслядоўнасць ціскаў 100 МП на працягу 10 хвілін, 80 МП на працягу 15 хвілін і 60 МП на працягу 30 хвілін. У працэсе запаўнення выкарыстоўваліся два вібратары калоны для газавай храматаграфіі (Alltech, Deerfield, IL, ЗША) для механічнай вібрацыі, каб забяспечыць раўнамерную запаўненне калоны. Зачыніце ўпакоўшчык суспензіі і павольна скіньце ціск, каб прадухіліць пашкоджанне калоны. Калону адлучылі ад шламавай фарсункі, а да ўваходу падключылі іншы фітынг і сістэму вадкаснага вадкага катран-крышталічнага раствора для праверкі яе працы.
Карыстальніцкі MLC быў пабудаваны з выкарыстаннем LC-помпы (10AD Shimadzu, Японія), пробоадборніка з ін'екцыяй у пятлі 50 нл (Valco (ЗША) C14 W.05), мембраннага дэгазатара (Shimadzu DGU-14A) і капілярнага акна УФ-ВІС. Дэтэктарная прылада (UV-2075) і эмаляваная мікракалонка. Выкарыстоўвайце вельмі вузкія і кароткія злучальныя трубкі, каб мінімізаваць эфект дадатковага пашырэння калонкі. Пасля запаўнення калонкі ўсталюйце капіляр (50 мкм унутраны дыяметр 365) на выхадзе з аднаўляльнага злучэння 1/16″ і ўсталюйце капіляр (50 мкм) аднаўляльнага злучэння. Збор дадзеных і апрацоўка храматаграмы праводзяцца з выкарыстаннем праграмнага забеспячэння Multichro 2000. Пры 254 нм УФ-паглынанне аналітаў кантралявалася на ўзроўні 0. Храматаграфічныя дадзеныя аналізаваліся з выкарыстаннем OriginPro8 (Нортгэмптан, Масачусэтс).
Сыроватачны альбумін чалавека, ліяфілізаваны парашок, ≥ 96% (электрафарэз у агарозным гелі) 3 мг, змяшаны з трыпсінам (1,5 мг), 4,0 М мачавінай (1 мл) і 0,2 М бікарбанатам амонія (1 мл). Раствор перамешвалі на працягу 10 хвілін і вытрымлівалі на вадзяной лазні пры тэмпературы 37°C на працягу 6 гадзін, затым гасілі 1 мл 0,1% TFA. Адфільтравалі раствор і захоўвалі пры тэмпературы ніжэй за 4°C.
Падзел сумесі пептыдаў і трыптычнага пераварвання HSA на калонцы PMP ацэньвалі асобна. Праверце трыптычны гідроліз сумесі пептыдаў і HSA, падзеленых калонкай PMP, і параўнайце вынікі з калонкай Ascentis Express RP-Amide. Колькасць тэарэтычных талерак разлічваецца з дапамогай наступнага ўраўнення:
На малюнку 2 паказаны SEM-выявы чыстых часціц крэмнезёму і часціц крэмнезёму, звязаных з лігандам. SEM-выявы чыстых часціц крэмнезёму (A, B) паказваюць сферычную форму, у якой часціцы выцягнуты або маюць няправільную сіметрыю ў параўнанні з нашымі папярэднімі даследаваннямі. Паверхня часціц крэмнезёму, звязаных з лігандам (C, D), больш гладкая, чым у чыстых часціц крэмнезёму, што можа быць звязана з ланцужкамі полістыролу, якія пакрываюць паверхню часціц крэмнезёму.
Мікрафатаграфіі чыстага крэмнезёму (A, B) і ліганд-звязанага крэмнезёму (C, D), атрыманыя з дапамогай сканіруючага электроннага мікраскопа.
Размеркаванне памераў часціц чыстага дыяксіду крэмнію і часціц дыяксіду крэмнію, звязаных з лігандамі, паказана на мал. 2.3(A). Крывыя аб'ёмнага размеркавання памераў часціц паказалі, што памер часціц дыяксіду крэмнію павялічыўся пасля хімічнай мадыфікацыі (мал. 3A). Дадзеныя аб размеркаванні памераў часціц дыяксіду крэмнію з бягучага і папярэдняга даследавання параўноўваюцца ў табліцы 1(A). Аб'ёмны памер часціц d(0,5) PMP склаў 3,36 мкм у параўнанні са значэннем ad(0,5) 3,05 мкм у нашым папярэднім даследаванні (часціцы дыяксіду крэмнію, звязаныя з полістыролам)34. З-за змены суадносін PEG, мачавіны, TMOS і воцатнай кіслаты ў рэакцыйнай сумесі размеркаванне памераў часціц гэтай партыі было вузейшым у параўнанні з нашым папярэднім даследаваннем. Памер часціц фазы PMP крыху большы, чым памер часціц фазы часціц дыяксіду крэмнію, звязанай з полістыролам, якую мы вывучалі раней. Гэта азначае, што ў выніку павярхоўнай функцыяналізацыі часціц крэмнезёму стыролам на паверхні крэмнезёму асадка ўтварылася толькі палістырольнага пласта (0,97 мкм), у той час як у фазе PMP таўшчыня пласта складала 1,38 мкм.
Размеркаванне памераў часціц (А) і размеркаванне памераў пор (В) чыстых часціц крэмнезёму і часціц крэмнезёму, звязаных з лігандамі.
Памер пор, аб'ём пор і плошча паверхні часціц крэмнезёму, выкарыстаных у гэтым даследаванні, паказаны ў Табліцы 1 (B). Профілі PSD чыстых часціц крэмнезёму і часціц крэмнезёму, звязаных з лігандамі, паказаны на Мал. 3 (B). Вынікі былі параўнальныя з нашым папярэднім даследаваннем34. Памеры пор чыстых і звязаных з лігандамі часціц крэмнезёму склалі 310 Å і 241 Å адпаведна, што сведчыць аб тым, што пасля хімічнай мадыфікацыі памер пор паменшыўся на 69 Å, як паказана ў Табліцы 1 (B), а крывая зрушэння паказана на Мал. Удзельная плошча паверхні часціц крэмнезёму ў бягучым даследаванні складае 116 м²/г, што параўнальна з нашым папярэднім даследаваннем (124 м²/г). Як паказана ў Табліцы 1 (B), плошча паверхні (м²/г) часціц крэмнезёму пасля хімічнай мадыфікацыі таксама паменшылася са 116 м²/г да 105 м²/г.
Вынікі элементнага аналізу стацыянарнай фазы прадстаўлены ў табліцы 2. Змест вугляроду ў бягучай стацыянарнай фазе складае 6,35%, што ніжэй, чым у нашым папярэднім даследаванні (часціцы крэмнезёму, звязаныя з полістыролам, 7,93%35 і 10,21% адпаведна)42. Змест вугляроду ў бягучай стацыянарнай фазе ніжэйшы, паколькі некаторыя палярныя ліганды, такія як фенілмалеімід метылвінілізацыянат (PCMP) і 4-гідраксі-TEMPO, выкарыстоўваліся ў дадатак да стыролу пры падрыхтоўцы SP. Масавы працэнт азоту ў бягучай стацыянарнай фазе складае 2,21% у параўнанні з 0,1735 і 0,85% у папярэдніх даследаваннях42. Гэта азначае, што бягучая стацыянарная фаза мае высокі масавы працэнт азоту з-за фенілмалеіміду. Падобным чынам, прадукты (4) і (5) маюць утрыманне вугляроду 2,7% і 2,9% адпаведна, у той час як канчатковы прадукт (6) мае ўтрыманне вугляроду 6,35%, як паказана ў Табліцы 2. Для праверкі страты вагі на стацыянарнай фазе PMP быў выкарыстаны тэрмагравіметрычны аналіз (ТГА), і крывая ТГА паказана на Малюнку 4. Крывая ТГА паказвае страту вагі на 8,6%, што добра адпавядае ўтрыманню вугляроду (6,35%), паколькі ліганды ўтрымліваюць не толькі C, але і N, O і H.
Ліганд фенілмалеімід-метылвінілізацыянат быў абраны для мадыфікацыі паверхні часціц крэмнезёму з-за яго палярных фенілмалеімідных і вінілізацыянатных груп. Вінілізацыянатныя групы могуць далей рэагаваць са стыролам шляхам жывой радыкальнай палімерызацыі. Другая прычына заключаецца ў тым, каб уставіць групу, якая мае ўмеранае ўзаемадзеянне з аналітам і не мае моцных электрастатычных узаемадзеянняў паміж аналітам і нерухомай фазай, паколькі фенілмалеімідны фрагмент не мае віртуальнага зарада пры нармальным pH. Палярнасць нерухомай фазы можна кантраляваць аптымальнай колькасцю стыролу і часам рэакцыі свабоднарадыкальнай палімерызацыі. Апошні этап рэакцыі (свабоднарадыкальная палімерызацыя) мае вырашальнае значэнне, паколькі ён змяняе палярнасць нерухомай фазы. Быў праведзены элементны аналіз для праверкі ўтрымання вугляроду ў гэтых нерухомых фазах. Было заўважана, што павелічэнне колькасці стыролу і часу рэакцыі павялічвае ўтрыманне вугляроду ў нерухомай фазе і наадварот. SP, падрыхтаваныя з рознымі канцэнтрацыямі стыролу, маюць розную нагрузку вугляроду. Аналагічна, гэтыя нерухомыя фазы былі змешчаны на калоны з нержавеючай сталі, і былі правераны іх храматаграфічныя характарыстыкі (селектыўнасць, раздзяляльная здольнасць, значэнне N і г.д.). На падставе гэтых эксперыментаў быў абраны аптымізаваны склад для падрыхтоўкі стацыянарнай фазы PMP, каб забяспечыць кантраляваную палярнасць і добрае ўтрыманне аналіту.
Калонка PMP таксама была ацэненая для аналізу пяці сумесяў пептыдаў (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцын-энкефалін) з выкарыстаннем ёмістасці рухомай фазы 60/40 (аб'ём/аб'ём) ACN/вада (0,1% TFA) пры хуткасці патоку 80 мкл/мін. Пры аптымальных умовах элюцыі (200 000 пласцін/м²) колькасць тэарэтычных пласцін (N) на калонку (100 × 1,8 мм) складае 20 000 ± 100. Значэнні N для трох калонак PMP паказаны ў табліцы 3, а храматаграмы - на малюнку 5A. Хуткі аналіз пры высокай хуткасці патоку (700 мкл/мін) на калонцы PMP, пяць пептыдаў элюіраваліся на працягу адной хвіліны, выдатнае значэнне N 13 500 ± 330 на калонку (дыяметр 100 х 1,8 мм), што эквівалентна 135 000 пласцінак/м² (мал. 5B). Тры калонкі аднолькавага памеру (унутраны дыяметр 100 х 1,8 мм) былі запоўнены трыма рознымі партыямі стацыянарнай фазы PMP для праверкі ўзнаўляльнасці. Аналіты рэгістраваліся для кожнай калонкі шляхам падзелу адной і той жа тэставай сумесі на кожнай калонцы з выкарыстаннем аптымальных умоў элюцыі, колькасці тэарэтычных пласцінак N і часу ўтрымання. Дадзеныя ўзнаўляльнасці для калонак PMP паказаны ў табліцы 4. Узнаўляльнасць калонкі PMP добра карэлявала з вельмі нізкімі значэннямі %RSD, як паказана ў табліцы 3.
Падзел пептыдных сумесяў на калонцы PMP (B) і калонцы Ascentis Express RP-Amide (A), рухомая фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), памеры калонкі PMP (100 x 1,8 мм унутраны дыяметр), аналіз. Парадак элюцыі злучэнняў: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) і 5 (энкефалін лейцынавай кіслаты).
Калонка PMP (унутраны дыяметр 100 х 1,8 мм) была ацэненая для падзелу трыпсінавага гідралізату сыроватачнага альбуміна чалавека з дапамогай ВЭЖХ. Храматаграма на малюнку 6 паказвае, што ўзоры добра падзеленыя з вельмі добрым разрозненнем. Растворы HSA аналізавалі з выкарыстаннем хуткасці патоку 100 мкл/мін, рухомай фазы ацэтанітрыл/вада 70/30 і 0,1% TFA. Расшчапленне HSA было падзелена на 17 пікаў, як паказана на храматаграме (мал. 6), што адпавядае 17 пептыдам. Эфектыўнасць падзелу асобных пікаў ад гідралізату HSA была разлічана, і значэнні паказаны ў табліцы 5.
Трыптычныя гідралізаты HSA падзялялі на калонцы PMP (унутраны дыяметр 100 х 1,8 мм), хуткасць патоку (100 мкл/мін), рухомая фаза 60/40 ацэтанітрыл/вада і 0,1% TFA.
дзе L — даўжыня калоны, η — глейкасць рухомай фазы, ΔP — супрацьціск калоны, а u — лінейная хуткасць рухомай фазы. Пранікальнасць калоны PMP складала 2,5 × 10–14 м2, хуткасць патоку — 25 мкл/мін, выкарыстоўвалася сумесі ACN/вада ў суадносінах 60/40 аб./аб. Пранікальнасць калоны PMP (ID 100 × 1,8 мм) была падобнай да пранікальнасці нашага папярэдняга даследавання, праведзенага ў спасылцы [34]. Пранікальнасць калоны, запоўненай павярхоўна-сітаватымі часціцамі, складае 1,7 × 10,6 мкм, а для часціц памерам 5 мкм — 2,5 × 10-14 м2 [43]. Такім чынам, пранікальнасць фазы PMP падобная да пранікальнасці часціц тыпу «ядро-абалонка» памерам 5 мкм.
дзе Wx — маса калонкі, запоўненай хлараформам, Wy — маса калонкі, запоўненай метанолам, а ρ — шчыльнасць растваральніка. Шчыльнасць метанолу (ρ = 0,7866) і хлараформу (ρ = 1,484). Агульная парыстасць калонкі з часціцамі дыяксіду крэмнію-C18 (100 × 1,8 мм унутраны дыяметр)34 і нашай раней даследаванай калонкі C18-мачавіна31 складала 0,63 і 0,55 адпаведна. Гэта азначае, што прысутнасць лігандаў мачавіны зніжае пранікальнасць стацыянарнай фазы. З іншага боку, агульная парыстасць калонкі PMP (унутраны дыяметр 100 × 1,8 мм) складае 0,60. Калонкі PMP менш пранікальныя, чым калонкі, запоўненыя звязанымі з C18 часціцамі дыяксіду крэмнію, таму што ў стацыянарных фазах тыпу C18 ліганды C18 прымацаваны да часціц дыяксіду крэмнію ў лінейных ланцугах, у той час як у стацыянарных фазах тыпу полістыролу вакол часціц утвараецца адносна тоўсты палімер. пласт А. У тыповым эксперыменце парыстасць калонкі разлічваецца наступным чынам:
На мал. 7А, B паказаны дыяграмы Ван-Дэемтэра для калонкі PMP (унутраны дыяметр 100 x 1,8 мм) і калонкі Ascentis Express RP-Amide (унутраны дыяметр 100 x 1,8 мм) пры аднолькавых умовах элюцыі, 60/40 ACN/H2O і 0,1% TFA ад 20 мкл/мін да 800 мкл/мін на абедзвюх калонках. Мінімальныя значэнні HETP пры аптымальнай хуткасці патоку (80 мкл/мін) склалі 2,6 мкм і 3,9 мкм для калонкі PMP і калонкі Ascentis Express RP-Amide адпаведна. Значэнні HETP паказваюць, што эфектыўнасць падзелу калонкі PMP (унутраны дыяметр 100 x 1,8 мм) значна вышэйшая, чым у камерцыйна даступнай калонкі Ascentis Express RP-Amide (унутраны дыяметр 100 x 1,8 мм). Графік Ван-Дэемтэра на мал. 7(A) паказвае, што зніжэнне значэння N не значна большае са павелічэннем патоку ў параўнанні з нашым папярэднім даследаваннем. Больш высокая эфектыўнасць падзелу калоны PMP (інтэрферэнцыйны дыяметр 100 × 1,8 мм) у параўнанні з калонай Ascentis Express RP-Amide заснавана на палепшанай форме і памеры часціц, а таксама на складанай працэдуры напаўнення калоны, якая выкарыстоўваецца ў бягучай працы34.
(A) Графік Ван-Дээмтэра (HETP у залежнасці ад лінейнай хуткасці рухомай фазы), атрыманы на калонцы PMP (унутраны дыяметр 100 x 1,8 мм) у канцэнтрацыі ACN/H2O 60/40 з 0,1% TFA. (B) Графік Ван-Дээмтэра (HETP у залежнасці ад лінейнай хуткасці рухомай фазы), атрыманы на калонцы Ascentis Express RP-Amide (унутраны дыяметр 100 x 1,8 мм) у канцэнтрацыі ACN/H2O 60/40 з 0,1% TFA.
Палярная стацыянарная фаза інтэркаляванага полістыролу была падрыхтавана і ацэнена для падзелу сумесі сінтэтычных пептыдаў і трыптычнага гідралізату сыроватачнага альбуміна чалавека (HSA) у высокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі. Храматаграфічныя характарыстыкі калонак PMP для сумесяў пептыдаў выдатныя з пункту гледжання эфектыўнасці падзелу і раздзяляльнай здольнасці. Палепшаная эфектыўнасць падзелу калонак PMP абумоўлена некалькімі прычынамі, такімі як памер часціц дыяксіду крэмнію і памер пор, кантраляваны сінтэз стацыянарных фаз і складаныя матэрыялы напаўнення калонак. Акрамя высокай эфектыўнасці падзелу, яшчэ адной перавагай гэтай стацыянарнай фазы з'яўляецца нізкі супрацьціск у калоне пры высокіх хуткасцях патоку. Калоны PMP маюць высокую рэпрадуктыўнасць і могуць быць выкарыстаны для аналізу сумесяў пептыдаў і трыптычнага пераварвання розных бялкоў. Мы маем намер выкарыстоўваць гэтую калону для падзелу біялагічна актыўных злучэнняў з натуральных прадуктаў, экстрактаў лекавых раслін і грыбоў у вадкаснай храматаграфіі. У будучыні калоны PMP таксама будуць ацэнены для падзелу бялкоў і моноклональных антыцелаў.
Філд, Дж. К., Эўэрбі, М. Р., Лау, Дж., Тэгерсен, Х. і Петэрсан, П. Даследаванне сістэм падзелу пептыдаў з дапамогай храматаграфіі з абаротнай фазай, частка I: Распрацоўка пратакола для характарыстыкі калонкі. Філд, Дж. К., Эўэрбі, М. Р., Лау, Дж., Тэгерсен, Х. і Петэрсан, П. Даследаванне сістэм падзелу пептыдаў з дапамогай храматаграфіі з абаротнай фазай, частка I: Распрацоўка пратакола для характарыстыкі калонкі.Філд, Дж. К., Овербі, М. Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х. і Петэрсан, П. Даследаванне сістэм падзелу пептыдаў метадам храматаграфіі з адваротнай фазай, частка I: Распрацоўка пратакола для характарыстыкі калонкі. Філд, Дж. К., Эўэрбі, М. Р., Лау, Дж., Тэгерсен, Х. і Петэрсан, П. Даследаванне сістэм падзелу пептыдаў з дапамогай храматаграфіі з абаротнай фазай, частка I: Распрацоўка пратакола для характарыстык калонкі. Філд, Дж. К., Эўэрбі, М. Р., Лау, Дж., Тэгерсен, Х. і Петэрсан, П. Даследаванне сістэм падзелу пептыдаў з дапамогай храматаграфіі з абаротнай фазай, частка I: Распрацоўка пратакола для характарыстык калонкі.Філд, Дж. К., Овербі, М. Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х. і Петэрсан, П. Даследаванне сістэм падзелу пептыдаў метадам храматаграфіі з адваротнай фазай, частка I: Распрацоўка пратакола для характарыстыкі калонкі.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Гомес, Б. і інш. Метады стварэння палепшаных актыўных пептыдаў для лячэння інфекцыйных захворванняў. Біятэхналогія. Дасягненні 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Вліге, П., Лісоўскі, В., Марцінес, Дж. і Хрэсчаціцкі, М. Сінтэтычныя тэрапеўтычныя пептыды: навука і рынак. Вліге, П., Лісоўскі, В., Марцінес, Дж. і Хрэсчаціцкі, М. Сінтэтычныя тэрапеўтычныя пептыды: навука і рынак.Вліге П., Лісоўскі В., Марцінес Дж. і Хрэшчаціскі М. Сінтэтычныя тэрапеўтычныя пептыды: навука і рынак.Вліге П., Лісоўскі В., Марцінес Дж. і Хрэшацкі М. Сінтэтычныя тэрапеўтычныя пептыды: навука і рынак. Адкрыццё лекаў. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Се, Ф., Сміт, Р. Д. і Шэн, Ю. Пашыраная пратэомная вадкасная храматаграфія. Се, Ф., Сміт, Р. Д. і Шэн, Ю. Пашыраная пратэомная вадкасная храматаграфія.Глядзіце F., Smith RD і Shen Yu. Пашыраная пратэомная вадкасная храматаграфія. Се, Ф., Сміт, Р. Д. і Шэнь, Ю. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Пашыраны склад бялку 液相色谱。Глядзіце F., Smith RD і Shen Yu. Пашыраная пратэомная вадкасная храматаграфія.Журнал храматаграфіі. А 1261, 78–90 (2012).
Лю, У. і інш. Пашыраная вадкасная храматаграфія-мас-спектрометрыя здольная спалучаць шырокую метабаломіку і пратэоміку. анус. Хім. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чэснат, С.М. і Солсберы, Дж.Дж. Роля звышвысокапрадукцыйнай вадкаснай тэхналогіі (UHPLC) у фармацэўтычнай распрацоўцы. Чэснат, С.М. і Солсберы, Дж.Дж. Роля звышвысокапрадукцыйнай вадкаснай тэхналогіі (UHPLC) у фармацэўтычнай распрацоўцы.Чэснат, С.М. і Солсберы, Дж.Дж. Роля звышвысокапрадукцыйнай вадкаснай тэхнікі (UHPLC) у фармацэўтычнай распрацоўцы.Чэснат, С.М. і Солсберы, Дж.Дж. Роля звышвысокапрадукцыйнай вадкаснай хроматографіі (UHPLC) у распрацоўцы лекаў. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Ву, Н. і Клаўзен, А. М. Фундаментальныя і практычныя аспекты вадкаснай храматаграфіі звышвысокага ціску для хуткага падзелу. Ву, Н. і Клаўзен, А. М. Фундаментальныя і практычныя аспекты вадкаснай храматаграфіі звышвысокага ціску для хуткага падзелу.Ву, Н. і Клаўзен, А. М. Фундаментальныя і практычныя аспекты вадкаснай храматаграфіі высокага ціску для хуткага падзелу. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Ву, Н. і Клаўзен, А. М. Асноўныя і практычныя аспекты вадкаснай храматаграфіі звышвысокага ціску для хуткага падзелу.Ву, Н. і Клаўзен, А. М. Фундаментальныя і практычныя аспекты вадкаснай храматаграфіі высокага ціску для хуткага падзелу.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рэн, С. А. і Чэлічэф, П. Выкарыстанне звышэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі ў фармацэўтычнай распрацоўцы. Рэн, С. А. і Чэлічэф, П. Выкарыстанне звышэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі ў фармацэўтычнай распрацоўцы.Рэн, С.А. і Чэлішэф, П. Выкарыстанне звышвысокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі ў фармацэўтычнай распрацоўцы. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Рэн, С. А. і Чэлічэў, П.Рэн, С.А. і Чэлішэф, П. Ужыванне звышэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі ў распрацоўцы лекаў.Журнал храматаграфіі. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. і інш. Маналітны макрапорысты гідрагель, атрыманы з эмульсіі алей-у-вадзе з высокай унутранай фазай, для эфектыўнай ачысткі энтэравіруса 71. Хімічны праект. Часопіс 401, 126051 (2020).
Шы, Ю., Сян, Р., Хорват, К. і Уілкінс, Дж. А. Роля вадкаснай храматаграфіі ў пратэоміцы. Шы, Ю., Сян, Р., Хорват, К. і Уілкінс, Дж. А. Роля вадкаснай храматаграфіі ў пратэоміцы.Шы, Ю., Сян, Р., Хорват, К. і Уілкінс, Дж. А. Роля вадкаснай храматаграфіі ў пратэоміцы. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Шы Ю., Сян Р., Горват К. і Уілкінс ДжаШы, Ю., Сян, Р., Хорват, К. і Уілкінс, Дж. А. Роля вадкаснай храматаграфіі ў пратэоміцы.Журнал храматаграфіі. А 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекетэ, С., Вутэй, Ж.-Л. & Гілармэ, Д. Новыя тэндэнцыі ў падзеле тэрапеўтычных пептыдаў і бялкоў з дапамогай вадкаснай храматаграфіі з абаротнай фазай: тэорыя і прымяненне. & Гілармэ, Д. Новыя тэндэнцыі ў падзеле тэрапеўтычных пептыдаў і бялкоў з дапамогай вадкаснай храматаграфіі з абаротнай фазай: тэорыя і прымяненне. & Guillarme, D. Новыя тэндэнцыі ў падзеле тэрапеўтычных пептыдаў і бялкоў з дапамогай вадкаснай храматаграфіі з зваротнай фазай: тэорыя і прымяненне. & Гілармэ, Д. Новыя тэндэнцыі ў падзеле тэрапеўтычных пептыдаў і бялкоў метадам вадкаснай храматаграфіі з адваротнай фазай: тэорыя і прымяненне. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Гілармэ, Д.і Гільярме, Д. Новыя тэндэнцыі ў падзеле тэрапеўтычных пептыдаў і бялкоў метадам вадкаснай храматаграфіі з адваротнай фазай: тэорыя і прымяненне.J. Pharm. Біямедыцынскія навукі. анус. 69, 9–27 (2012).
Гілар, М., Олівава, П., Дэйлі, А. Е. і Геблер, Дж. К. Двухмернае падзел пептыдаў з выкарыстаннем сістэмы RP-RP-HPLC з рознымі pH у першым і другім вымярэннях падзелу. Гілар, М., Олівава, П., Дэйлі, А. Е. і Геблер, Дж. К. Двухмернае падзел пептыдаў з выкарыстаннем сістэмы RP-RP-HPLC з рознымі pH у першым і другім вымярэннях падзелу.Гілар М., Олівава П., Далі А. Е. і Геблер Дж. К. Двухмернае падзел пептыдаў з выкарыстаннем сістэмы RP-RP-HPLC з рознымі pH у першым і другім вымярэннях падзелу.Гілар М., Олівава П., Далі А. Е. і Геблер Дж. К. Двухмернае падзел пептыдаў з выкарыстаннем розных значэнняў pH у першым і другім вымярэннях падзелу з выкарыстаннем сістэмы RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Феліці, С. і інш. Даследаванне масапераносу і кінетычных характарыстык высокаэфектыўных храматаграфічных калон, запоўненых цалкам порыстымі і павярхоўна порыстымі часціцамі C18 памерам менш за 2 мкм. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Піовесана, С. і інш. Апошнія тэндэнцыі і аналітычныя праблемы ў выдзяленні, ідэнтыфікацыі і валідацыі раслінных біялагічна актыўных пептыдаў. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюлер, Дж. Б. і інш. Пратэомны ландшафт царства жыцця. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
Дэ Лука, К. і інш. Пасляапрацоўка тэрапеўтычных пептыдаў прэпаратыўнай вадкаснай храматаграфіяй. Molecules (Базель, Швейцарыя) 26(15), 4688 (2021).
Ян, Ю. і Гэн, Х. Змяшаная храматаграфія і яе прымяненне да біяпалімераў. Ян, Ю. і Гэн, Х. Змяшаная храматаграфія і яе прымяненне да біяпалімераў.Ян, Ю. і Гэн, Х. Змяшаная храматаграфія і яе прымяненне да біяпалімераў. Ян, Ю. і Гэн, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Ян, Ю. і Гэн, Х. Змяшаная храматаграфія і яе прымяненне ў біяпалімерах.Ян, Ю. і Джын, Х. Змяшаная храматаграфія і яе прымяненне да біяпалімераў.Журнал храматаграфіі. А 1218(49), 8813–8825 (2011).