Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Anda menggunakan versi peramban dengan dukungan CSS terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang diperbarui (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Selain itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Menampilkan carousel berisi tiga slide sekaligus. Gunakan tombol Sebelumnya dan Berikutnya untuk berpindah antar tiga slide sekaligus, atau gunakan tombol penggeser di bagian akhir untuk berpindah antar tiga slide sekaligus.
Partikel silika berpori disiapkan dengan metode sol-gel dengan beberapa modifikasi untuk mendapatkan partikel berpori lebar. Partikel-partikel ini didervatisasi dengan N-fenilmaleimida-metilvinil isosianat (PMI) dan stirena melalui polimerisasi transfer rantai terbalik-fragmentasi (RAFT) untuk menghasilkan poliamida terinterkalasi N-fenilmaleimida. Fase diam stirena (PMP). Kolom baja tahan karat berdiameter dalam 100 × 1,8 mm diisi dengan kemasan bubur. Kinerja kromatografi kolom PMP dievaluasi untuk memisahkan campuran peptida sintetik yang terdiri dari lima peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, asam amino Leu enkefalin) dan hidrolisat tripsin albumin serum manusia (HAS). Dalam kondisi elusi optimal, jumlah pelat teoritis dengan campuran peptida mencapai 280.000 pelat/m². Membandingkan kinerja pemisahan kolom yang dikembangkan dengan kolom komersial Ascentis Express RP-Amide, diamati bahwa efisiensi pemisahan kolom PMP lebih unggul daripada kolom komersial dalam hal efisiensi pemisahan dan resolusi.
Industri biofarmasi telah menjadi pasar global yang berkembang pesat dengan peningkatan pangsa pasar yang signifikan dalam beberapa tahun terakhir. Dengan pertumbuhan industri biofarmasi yang eksplosif1,2,3, terdapat kebutuhan besar akan analisis peptida dan protein. Selain peptida target, berbagai pengotor terbentuk selama sintesis peptida, sehingga diperlukan pemurnian kromatografi untuk mendapatkan kemurnian peptida yang diinginkan. Analisis dan karakterisasi protein dalam cairan tubuh, jaringan, dan sel merupakan tugas yang sangat menantang karena banyaknya spesies yang berpotensi terdeteksi dalam satu sampel. Meskipun spektrometri massa merupakan alat yang efektif untuk mengurutkan peptida dan protein, jika sampel tersebut langsung dimasukkan ke dalam spektrometer massa, pemisahannya akan tidak memuaskan. Masalah ini dapat diatasi dengan melakukan kromatografi cair (LC) sebelum analisis MS, yang akan mengurangi jumlah analit yang masuk ke spektrometer massa pada waktu tertentu4,5,6. Selain itu, analit dapat terkonsentrasi di daerah yang sempit selama pemisahan fase cair, sehingga memusatkan analit ini dan meningkatkan sensitivitas deteksi MS. Kromatografi cair (LC) telah mengalami kemajuan signifikan dalam dekade terakhir dan telah menjadi metode yang banyak digunakan untuk analisis proteomik7,8,9,10.
Kromatografi cair fase terbalik (RP-LC) banyak digunakan untuk memurnikan dan memisahkan campuran peptida menggunakan silika yang dimodifikasi oktadesil (ODS) sebagai fase diam11,12,13. Namun, karena strukturnya yang kompleks dan sifat amfoternya,14,15 fase diam RP tidak dapat memberikan pemisahan peptida dan protein yang memuaskan. Oleh karena itu, analisis peptida dan protein dengan fragmen polar dan non-polar memerlukan fase diam yang dirancang khusus untuk berinteraksi dan menahan analit ini16. Kromatografi campuran, yang menawarkan interaksi multimodal, dapat menjadi alternatif untuk RP-LC untuk memisahkan peptida, protein, dan campuran kompleks lainnya. Beberapa fase diam tipe campuran telah disiapkan dan kolom yang diisi dengan fase diam ini digunakan untuk memisahkan peptida dan protein17,18,19,20,21. Karena adanya gugus polar dan non-polar, fase diam mode campuran (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalasi polar/RPLC) cocok untuk pemisahan peptida dan protein22,23,24,25,26,27,28. Fase diam terinterkalasi polar dengan gugus polar yang terikat secara kovalen menunjukkan kemampuan pemisahan yang baik dan selektivitas unik untuk analit polar dan non-polar karena pemisahan bergantung pada interaksi antara analit dan fase diam (interaksi multimodal)29,30,31,32. Baru-baru ini, Zhang dkk.30 memperoleh fase diam poliamina berujung behenil dan berhasil memisahkan hidrokarbon, antidepresan, flavonoid, nukleosida, estrogen, dan beberapa analit lainnya. Material diam tertanam polar memiliki gugus polar dan non-polar, sehingga dapat digunakan untuk memisahkan peptida dan protein menjadi bagian hidrofobik dan hidrofilik. Kolom polar inline (misalnya, kolom C18 dengan amida inline) tersedia dengan nama dagang kolom Ascentis Express RP-Amide, tetapi kolom ini hanya digunakan untuk analisis amina 33.
Dalam penelitian ini, fase diam polar (N-fenilmaleimida, polistirena tertanam) disiapkan dan dievaluasi untuk pemisahan peptida dan pemecahan HSA triptik. Strategi berikut digunakan untuk menyiapkan fase diam. Partikel silika berpori disiapkan sesuai dengan prosedur yang dijelaskan dalam publikasi kami sebelumnya, dengan beberapa perubahan dalam skema persiapan 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Rasio urea, polietilen glikol (PEG), TMOS, dan asam asetat berair disesuaikan untuk mendapatkan partikel silika dengan ukuran pori yang besar. Kedua, ligan fenilmaleimida-metilvinil isosianat baru disintesis dan partikel silika yang telah didervatisasi digunakan untuk menyiapkan fase diam polar tertanam. Fase diam yang diperoleh dikemas ke dalam kolom baja tahan karat (diameter dalam 100 × 1,8 mm) sesuai dengan skema pengemasan yang dioptimalkan. Pengemasan kolom dibantu oleh getaran mekanis untuk memastikan lapisan yang seragam di dalam kolom. Kolom isian dievaluasi untuk pemisahan campuran peptida yang terdiri dari lima peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptida leusin-enkefalin) dan hidrolisat tripsin albumin serum manusia (HSA). Diamati bahwa campuran peptida dan hasil digesti tripsin HSA terpisah dengan resolusi dan efisiensi yang baik. Efisiensi pemisahan kolom PMP dibandingkan dengan kolom Ascentis Express RP-Amide. Diamati bahwa peptida dan protein memiliki resolusi yang baik dan efisiensi pemisahan yang tinggi pada kolom PMP, dan efisiensi pemisahan kolom PMP lebih tinggi daripada kolom Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilen glikol), urea, asam asetat, trimetoksiortosilikat (TMOS), trimetilklorosilan (TMCS), tripsin, albumin serum manusia (HSA), amonium klorida, urea, heksametilmetakriloildisilazana (HMDS), metakriloil klorida (MC), stirena, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksida (BPO), asetonitril (ACN) untuk HPLC, metanol, 2-propanol dan aseton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, AS).
Campuran urea (8 g), polietilen glikol (8 g), dan 8 ml asam asetat 0,01 N diaduk selama 10 menit, kemudian ditambahkan 24 ml TMOS sambil didinginkan dengan es. Campuran reaksi dipanaskan pada suhu 40°C selama 6 jam dan kemudian pada suhu 120°C selama 8 jam dalam autoklaf baja tahan karat. Air didekantasi dan residu dikeringkan pada suhu 70°C selama 12 jam. Balok lunak yang telah kering digiling halus dan dikalsinasi dalam oven pada suhu 550°C selama 12 jam. Tiga batch disiapkan dan dikarakterisasi untuk menguji reproduktivitas ukuran partikel, ukuran pori, dan luas permukaan.
Gugus polar dan fase diam untuk rantai polistirena. Prosedur persiapannya dijelaskan di bawah ini.
N-fenilmaleimida (200 mg) dan metil vinil isosianat (100 mg) dilarutkan dalam toluena anhidrat, kemudian 0,1 ml 2,2′-azoisobutironitril (AIBN) ditambahkan ke dalam labu reaksi untuk mendapatkan kopolimer fenilmaleimida dan metil vinil isosianat (PMCP). Campuran dipanaskan pada suhu 60°C selama 3 jam, disaring, dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40°C selama 3 jam.
Partikel silika kering (2 g) didispersikan dalam toluena kering (100 ml), diaduk dan disonikasi selama 10 menit dalam labu bulat 500 ml. PMCP (10 mg) dilarutkan dalam toluena dan ditambahkan tetes demi tetes ke dalam labu reaksi melalui corong penambah. Campuran tersebut direfluks pada suhu 100°C selama 8 jam, disaring, dicuci dengan aseton, dan dikeringkan pada suhu 60°C selama 3 jam. Kemudian, partikel silika yang berikatan dengan PMCP (100 g) dilarutkan dalam toluena (200 ml), dan 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) ditambahkan ke dalamnya dengan adanya 100 μl dibutiltin dilaurat sebagai katalis. Campuran tersebut diaduk pada suhu 50°C selama 8 jam, disaring, dan dikeringkan pada suhu 50°C selama 3 jam.
Stirena (1 ml), benzoil peroksida BPO (0,5 ml) dan partikel silika yang terikat pada TEMPO-PMCP (1,5 g) didispersikan dalam toluena dan dialiri gas nitrogen. Polimerisasi stirena dilakukan pada suhu 100°C selama 12 jam. Produk yang dihasilkan dicuci dengan metanol dan dikeringkan semalaman pada suhu 60°C. Skema umum reaksi ditunjukkan pada gambar satu.
Sampel dihilangkan gasnya pada suhu 393 K selama 1 jam hingga diperoleh tekanan sisa kurang dari 10–3 Torr. Jumlah N2 yang teradsorpsi pada tekanan relatif P/P0 = 0,99 digunakan untuk menentukan volume pori total. Morfologi partikel silika murni dan terikat ligan diperiksa menggunakan mikroskop elektron pemindai (Hitachi High Technologies, Tokyo, Jepang). Sampel kering (partikel silika murni dan partikel silika terikat ligan) ditempatkan pada batang aluminium menggunakan pita karbon. Emas diendapkan pada sampel menggunakan perangkat sputtering Q150T, dan lapisan Au setebal 5 nm diendapkan pada sampel. Hal ini meningkatkan efisiensi proses tegangan rendah dan memberikan penyemprotan dingin yang halus. Analisis unsur dilakukan menggunakan penganalisis komposisi unsur Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Penganalisis ukuran partikel Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 digunakan untuk mendapatkan distribusi ukuran partikel. Partikel silika tanpa lapisan dan partikel silika terikat ligan (masing-masing 5 mg) didispersikan dalam 5 ml isopropanol, disonikasi selama 10 menit, diaduk selama 5 menit, dan ditempatkan pada bangku optik Mastersizer. Analisis termogravimetri dilakukan dengan laju 5 °C per menit dalam rentang suhu 30 hingga 800 °C.
Kolom baja tahan karat berdiameter sempit berlapis serat kaca dengan dimensi (ID 100 × 1,8 mm) diisi dengan metode pengisian bubur mengikuti prosedur yang sama seperti pada referensi 31. Kolom baja tahan karat (berlapis kaca, ID 100 × 1,8 mm) dan saluran keluar yang berisi frit 1 µm dihubungkan ke mesin pengemas bubur (Alltech Deerfield, IL, USA). Siapkan suspensi fase diam dengan menangguhkan 150 mg fase diam dalam 1,2 ml metanol dan memasukkannya ke dalam kolom reservoir. Metanol digunakan sebagai pelarut bubur dan pelarut kontrol. Isi kolom dengan menerapkan urutan tekanan 100 MP selama 10 menit, 80 MP selama 15 menit, dan 60 MP selama 30 menit. Proses pengisian menggunakan dua vibrator kolom kromatografi gas (Alltech, Deerfield, IL, USA) untuk getaran mekanis guna memastikan pengisian kolom yang seragam. Tutup packer bubur dan lepaskan tekanan secara perlahan untuk mencegah kerusakan pada rangkaian. Kolom dilepas dari nosel bubur dan fitting lain dipasang ke saluran masuk dan dihubungkan ke sistem LC untuk menguji operasinya.
Sebuah MLC kustom dibuat menggunakan pompa LC (10AD Shimadzu, Jepang), sampler dengan loop injeksi 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), degasser membran (Shimadzu DGU-14A), dan jendela kapiler UV-VIS. Perangkat detektor (UV-2075) dan mikrokolom berenamel. Gunakan tabung penghubung yang sangat sempit dan pendek untuk meminimalkan efek ekspansi kolom tambahan. Setelah mengisi kolom, pasang kapiler (50 µm id 365) di outlet sambungan reduksi 1/16″ dan pasang kapiler (50 µm) pada sambungan reduksi. Pengumpulan data dan pemrosesan kromatogram dilakukan menggunakan perangkat lunak Multichro 2000. Pada 254 nm, absorbansi UV analit subjek dipantau pada 0. Data kromatografi dianalisis menggunakan OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin serum manusia, bubuk liofilisasi, ≥ 96% (elektroforesis gel agarosa) 3 mg dicampur dengan tripsin (1,5 mg), urea 4,0 M (1 ml) dan amonium bikarbonat 0,2 M (1 ml). Larutan diaduk selama 10 menit dan disimpan dalam penangas air pada suhu 37°C selama 6 jam, kemudian dihentikan reaksinya dengan 1 ml TFA 0,1%. Saring larutan dan simpan di bawah suhu 4°C.
Pemisahan campuran peptida dan hasil digesti tripsin HSA pada kolom PMP dievaluasi secara terpisah. Periksa hidrolisis tripsin dari campuran peptida dan HSA yang dipisahkan oleh kolom PMP dan bandingkan hasilnya dengan kolom Ascentis Express RP-Amide. Jumlah pelat teoritis dihitung menggunakan persamaan berikut:
Gambar SEM partikel silika murni dan partikel silika yang terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 2. Gambar SEM partikel silika murni (A, B) menunjukkan bentuk bulat di mana partikel memanjang atau memiliki simetri tidak beraturan dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya. Permukaan partikel silika yang terikat ligan (C, D) lebih halus daripada partikel silika murni, yang mungkin disebabkan oleh rantai polistirena yang menutupi permukaan partikel silika.
Mikrograf elektron pemindaian partikel silika murni (A, B) dan partikel silika terikat ligan (C, D).
Distribusi ukuran partikel silika murni dan partikel silika terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 2. 3(A). Kurva distribusi ukuran partikel volumetrik menunjukkan bahwa ukuran partikel silika meningkat setelah modifikasi kimia (Gambar 3A). Data distribusi ukuran partikel silika dari penelitian saat ini dan penelitian sebelumnya dibandingkan pada Tabel 1(A). Ukuran partikel volumetrik d(0,5) PMP adalah 3,36 µm, dibandingkan dengan nilai ad(0,5) sebesar 3,05 µm dalam penelitian kami sebelumnya (partikel silika terikat polistirena)34. Karena perubahan rasio PEG, urea, TMOS, dan asam asetat dalam campuran reaksi, distribusi ukuran partikel batch ini lebih sempit dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya. Ukuran partikel fase PMP sedikit lebih besar daripada fase partikel silika terikat polistirena yang kami teliti sebelumnya. Ini berarti bahwa fungsionalisasi permukaan partikel silika dengan stirena hanya mengendapkan lapisan polistirena (0,97 µm) pada permukaan silika, sedangkan pada fase PMP ketebalan lapisannya adalah 1,38 µm.
Distribusi ukuran partikel (A) dan distribusi ukuran pori (B) partikel silika murni dan partikel silika terikat ligan.
Ukuran pori, volume pori, dan luas permukaan partikel silika yang digunakan dalam penelitian ini ditunjukkan pada Tabel 1 (B). Profil PSD partikel silika murni dan partikel silika terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 3(B). Hasilnya sebanding dengan penelitian kami sebelumnya34. Ukuran pori partikel silika murni dan terikat ligan masing-masing adalah 310 Å dan 241 Å, menunjukkan bahwa setelah modifikasi kimia, ukuran pori berkurang sebesar 69 Å, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1 (B), dan kurva pergeserannya ditunjukkan pada Gambar. Luas permukaan spesifik partikel silika dalam penelitian ini adalah 116 m2/g, yang sebanding dengan penelitian kami sebelumnya (124 m2/g). Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1(B), luas permukaan (m2/g) partikel silika setelah modifikasi kimia juga menurun dari 116 m2/g menjadi 105 m2/g.
Hasil analisis unsur fase diam disajikan pada Tabel 2. Kandungan karbon fase diam saat ini adalah 6,35%, yang lebih rendah dibandingkan penelitian kami sebelumnya (partikel silika yang terkait dengan polistirena, masing-masing 7,93%35 dan 10,21%) 42. Kandungan karbon fase diam saat ini lebih rendah karena beberapa ligan polar seperti fenilmaleimida metil vinil isosianat (PCMP) dan 4-hidroksi-TEMPO telah digunakan selain stirena dalam pembuatan SP. Persentase berat nitrogen dalam fase diam saat ini adalah 2,21% dibandingkan dengan 0,1735 dan 0,85% pada penelitian sebelumnya42. Ini berarti bahwa fase diam saat ini memiliki persentase berat nitrogen yang tinggi karena adanya fenilmaleimida. Demikian pula, produk (4) dan (5) masing-masing memiliki kandungan karbon sebesar 2,7% dan 2,9%, sedangkan produk akhir (6) memiliki kandungan karbon sebesar 6,35%, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2. Analisis termogravimetri (TGA) digunakan pada fase diam PMP untuk menguji penurunan berat, dan kurva TGA ditunjukkan pada Gambar 4. Kurva TGA menunjukkan penurunan berat sebesar 8,6%, yang sesuai dengan kandungan karbon (6,35%), karena ligan tidak hanya mengandung C, tetapi juga N, O dan H.
Ligand fenilmaleimida-metilvinil isosianat dipilih untuk memodifikasi permukaan partikel silika karena gugus fenilmaleimida dan vinilisosianatnya yang polar. Gugus vinil isosianat dapat bereaksi lebih lanjut dengan stirena melalui polimerisasi radikal hidup. Alasan kedua adalah untuk memasukkan gugus yang memiliki interaksi sedang dengan analit dan tidak ada interaksi elektrostatik yang kuat antara analit dan fase diam, karena gugus fenilmaleimida tidak memiliki muatan virtual pada pH normal. Polaritas fase diam dapat dikontrol oleh jumlah stirena yang optimal dan waktu reaksi polimerisasi radikal bebas. Langkah terakhir reaksi (polimerisasi radikal bebas) sangat penting karena mengubah polaritas fase diam. Analisis unsur dilakukan untuk memeriksa kandungan karbon dalam fase diam ini. Telah diamati bahwa peningkatan jumlah stirena dan waktu reaksi meningkatkan kandungan karbon fase diam dan sebaliknya. SP yang disiapkan dengan konsentrasi stirena yang berbeda memiliki muatan karbon yang berbeda. Demikian pula, fase diam ini ditempatkan pada kolom baja tahan karat dan karakteristik kromatografinya (selektivitas, resolusi, nilai N, dll.) diperiksa. Berdasarkan percobaan ini, komposisi yang dioptimalkan untuk pembuatan fase diam PMP dipilih untuk memberikan polaritas terkontrol dan retensi analit yang baik.
Kolom PMP juga dievaluasi untuk analisis lima campuran peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusin-enkefalin) menggunakan kapasitas fase gerak 60/40 (v/v) ACN/air (0,1% TFA) pada laju alir 80 µl/min. Di bawah kondisi elusi optimal (200.000 pelat/m), jumlah pelat teoritis (N) per kolom (100 × 1,8 mm) adalah 20.000 ± 100. Nilai N untuk ketiga kolom PMP ditunjukkan pada Tabel 3 dan kromatogramnya ditunjukkan pada Gambar 5A. Analisis cepat pada laju aliran tinggi (700 µl/min) pada kolom PMP, lima peptida terelusi dalam satu menit, nilai N yang sangat baik sebesar 13.500 ± 330 per kolom (diameter 100 x 1,8 mm), setara dengan 135.000 pelat/m (Gambar 5B). Tiga kolom dengan ukuran yang sama (diameter dalam 100 x 1,8 mm) diisi dengan tiga batch fase diam PMP yang berbeda untuk menguji reprodusibilitas. Analit dicatat untuk setiap kolom dengan memisahkan campuran uji yang sama pada setiap kolom menggunakan kondisi elusi optimal, jumlah pelat teoritis N, dan waktu retensi. Data reprodusibilitas untuk kolom PMP ditunjukkan pada Tabel 4. Reprodusibilitas kolom PMP berkorelasi baik dengan nilai %RSD yang sangat rendah seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3.
Pemisahan campuran peptida pada kolom PMP (B) dan kolom Ascentis Express RP-Amide (A), fase gerak 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensi kolom PMP (100 x 1,8 mm id), analisis Urutan elusi senyawa: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) dan 5 (asam leusin enkephalin).
Kolom PMP (diameter dalam 100 x 1,8 mm) dievaluasi untuk pemisahan hidrolisat tripsin albumin serum manusia dengan HPLC. Kromatogram pada Gambar 6 menunjukkan bahwa sampel terpisah dengan baik dengan resolusi yang sangat baik. Larutan HSA dianalisis menggunakan laju alir 100 μl/min, fase gerak 70/30 asetonitril/air dan 0,1% TFA. Pemecahan HSA terbagi menjadi 17 puncak, seperti yang ditunjukkan pada kromatogram (Gambar 6), yang sesuai dengan 17 peptida. Efisiensi pemisahan masing-masing puncak dari hidrolisat HSA dihitung dan nilainya ditunjukkan pada Tabel 5.
Hidrolisat triptik HSA dipisahkan pada kolom PMP (diameter dalam 100 x 1,8 mm), laju alir (100 μl/min), fase gerak 60/40 asetonitril/air, dan 0,1% TFA.
di mana L adalah panjang kolom, η adalah viskositas fase gerak, ΔP adalah tekanan balik kolom, dan u adalah kecepatan linier fase gerak. Permeabilitas kolom PMP adalah 2,5 × 10–14 m2, laju alir 25 µl/min, digunakan 60/40 v/v ACN/air. Permeabilitas kolom PMP (ID 100 × 1,8 mm) serupa dengan penelitian kami sebelumnya Ref.34. Permeabilitas kolom yang diisi dengan partikel berpori permukaan adalah 1,7×10 µm, 2,5×10-14 m2 untuk partikel 5 µm43. Oleh karena itu, permeabilitas fase PMP serupa dengan permeabilitas partikel inti-cangkang dengan ukuran 5 μm.
di mana Wx adalah massa kolom yang diisi dengan kloroform, Wy adalah massa kolom yang diisi dengan metanol, dan ρ adalah densitas pelarut. Densitas metanol (ρ = 0,7866) dan kloroform (ρ = 1,484). Porositas total kolom partikel silika-C18 (100 × 1,8 mm ID)34 dan kolom C18-urea31 yang telah kami teliti sebelumnya masing-masing adalah 0,63 dan 0,55. Ini berarti bahwa keberadaan ligan urea mengurangi permeabilitas fase diam. Di sisi lain, porositas total kolom PMP (diameter dalam 100 × 1,8 mm) adalah 0,60. Kolom PMP memiliki permeabilitas yang lebih rendah daripada kolom yang diisi dengan partikel silika terikat C18 karena pada fase diam tipe C18, ligan C18 terikat pada partikel silika dalam rantai linier, sedangkan pada fase diam tipe polistirena, polimer yang relatif tebal terbentuk di sekitar partikel. Lapisan A. Dalam percobaan tipikal, porositas kolom dihitung sebagai berikut:
Pada Gambar 7A dan 7B, ditunjukkan plot Van Deemter untuk kolom PMP (id 100 x 1,8 mm) dan kolom Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) dengan kondisi elusi yang sama, 60/40 ACN/H2O dan 0,1% TFA 20 µl/min hingga 800 µl/min pada kedua kolom. Nilai HETP minimum pada laju aliran optimal (80 µl/min) adalah 2,6 µm dan 3,9 µm untuk kolom PMP dan kolom Ascentis Express RP-Amide, masing-masing. Nilai HETP menunjukkan bahwa efisiensi pemisahan kolom PMP (id 100 x 1,8 mm) jauh lebih tinggi daripada kolom Ascentis Express RP-Amide yang tersedia secara komersial (id 100 x 1,8 mm). Grafik van Deemter pada Gambar 7(A) menunjukkan bahwa penurunan nilai N tidak secara signifikan lebih tinggi dengan peningkatan aliran dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya. Efisiensi pemisahan yang lebih tinggi dari kolom PMP (id 100 × 1,8 mm) dibandingkan dengan kolom Ascentis Express RP-Amide didasarkan pada peningkatan bentuk dan ukuran partikel serta prosedur pengemasan kolom yang canggih yang digunakan dalam penelitian ini34.
(A) Grafik Van Deemter (HETP vs. kecepatan linier fase gerak) yang diperoleh pada kolom PMP (id 100 x 1,8 mm) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0,1% TFA. (B) Grafik Van Deemter (HETP versus kecepatan linier fase gerak) yang diperoleh pada kolom Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1,8 mm) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0,1% TFA.
Fase diam polar berupa polistirena terinterkalasi disiapkan dan dievaluasi untuk pemisahan campuran peptida sintetik dan hidrolisat tripsin albumin serum manusia (HSA) dalam kromatografi cair kinerja tinggi. Kinerja kromatografi kolom PMP untuk campuran peptida sangat baik dalam hal efisiensi pemisahan dan resolusi. Peningkatan efisiensi pemisahan kolom PMP disebabkan oleh beberapa alasan seperti ukuran partikel silika dan ukuran pori, sintesis fase diam yang terkontrol, dan bahan pengemas kolom yang kompleks. Selain efisiensi pemisahan yang tinggi, keuntungan lain dari fase diam ini adalah tekanan balik kolom yang rendah pada laju aliran tinggi. Kolom PMP sangat reprodusibel dan dapat digunakan untuk menganalisis campuran peptida dan pencernaan tripsin dari berbagai protein. Kami bermaksud menggunakan kolom ini untuk pemisahan senyawa bioaktif dari produk alami, ekstrak tanaman obat dan jamur dalam kromatografi cair. Di masa mendatang, kolom PMP juga akan dievaluasi untuk pemisahan protein dan antibodi monoklonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigasi sistem pemisahan peptida kromatografi fase terbalik bagian I: Pengembangan protokol untuk karakterisasi kolom. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigasi terhadap sistem pemisahan peptida kromatografi fase terbalik bagian I: Pengembangan protokol untuk karakterisasi kolom.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., dan Petersson, P. Investigasi Sistem Pemisahan Peptida dengan Kromatografi Fase Terbalik, Bagian I: Mengembangkan Protokol untuk Karakterisasi Kolom. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigasi sistem pemisahan peptida kromatografi fase terbalik bagian I: Pengembangan protokol untuk karakteristik kolom. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigasi sistem pemisahan peptida kromatografi fase terbalik bagian I: Pengembangan protokol untuk karakteristik kolom.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., dan Petersson, P. Investigasi Sistem Pemisahan Peptida dengan Kromatografi Fase Terbalik, Bagian I: Mengembangkan Protokol untuk Karakterisasi Kolom.J.色谱法。 1603,113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. dkk. Metode untuk menciptakan peptida aktif yang lebih baik untuk pengobatan penyakit menular. Bioteknologi. Prestasi 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptida terapeutik sintetis: Sains dan pasar. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptida terapeutik sintetis: Sains dan pasar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J dan Chreschatyski M. Peptida terapeutik sintetis: sains dan pasar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J dan Khreschatsky M. Peptida terapeutik sintetis: sains dan pasar. penemuan obat. Hari ini 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi cair proteomik tingkat lanjut. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi cair proteomik tingkat lanjut.Lihat F., Smith RD dan Shen Yu. Kromatografi cair proteomik tingkat lanjut. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Komposisi protein tingkat lanjut 液相色谱。Lihat F., Smith RD dan Shen Yu. Kromatografi cair proteomik tingkat lanjut.J. Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. dkk. Kromatografi cair-spektrometri massa tingkat lanjut mampu menggabungkan metabolomik dan proteomik berbasis luas. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peran UHPLC dalam pengembangan farmasi. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peran UHPLC dalam pengembangan farmasi.Chesnut, SM dan Salisbury, JJ Peran UHPLC dalam pengembangan farmasi.Chesnut, SM dan Salisbury, JJ Peran UHPLC dalam pengembangan obat. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspek fundamental dan praktis kromatografi cair bertekanan ultra tinggi untuk pemisahan cepat. Wu, N. & Clausen, AM Aspek fundamental dan praktis kromatografi cair bertekanan ultra tinggi untuk pemisahan cepat.Wu, N. dan Clausen, AM. Aspek fundamental dan praktis kromatografi cair bertekanan tinggi untuk pemisahan cepat. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Aspek dasar dan praktis kromatografi cair bertekanan ultra tinggi untuk pemisahan cepat.Wu, N. dan Clausen, AM. Aspek fundamental dan praktis kromatografi cair bertekanan tinggi untuk pemisahan cepat.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Penggunaan kromatografi cair ultra-kinerja dalam pengembangan farmasi. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Penggunaan kromatografi cair ultra-kinerja dalam pengembangan farmasi.Ren, SA dan Chelischeff, P. Penggunaan kromatografi cair kinerja ultra tinggi dalam pengembangan farmasi. Gelatik, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA dan Chelischeff, P. Aplikasi kromatografi cair ultra-kinerja dalam pengembangan obat.J. Kromatografi. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. dkk. Hidrogel makropori monolitik yang berasal dari emulsi minyak dalam air dengan fase internal tinggi untuk pemurnian enterovirus 71 yang efisien. Proyek Kimia. Jurnal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peran kromatografi cair dalam proteomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peran kromatografi cair dalam proteomik.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. dan Wilkins, JA. Peran kromatografi cair dalam proteomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. dan Wilkins, JA. Peran kromatografi cair dalam proteomik.J. Kromatografi. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Tren baru dalam pemisahan kromatografi cair fase terbalik peptida dan protein terapeutik: Teori dan aplikasi. & Guillarme, D. Tren baru dalam pemisahan kromatografi cair fase terbalik peptida dan protein terapeutik: Teori dan aplikasi. & Guillarme, D. Teknik-teknik lain yang terkait dengan perawatan dan perawatan kesehatan хроматографии с обращенной фазой: teori dan приложения. & Guillarme, D. Tren baru dalam pemisahan peptida dan protein terapeutik dengan kromatografi cair fase terbalik: teori dan aplikasi. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.dan Guillarmé, D. Tren baru dalam pemisahan peptida dan protein terapeutik dengan kromatografi cair fase terbalik: teori dan aplikasi.J. Pharm. Ilmu Biomedis. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan sistem RP-RP-HPLC dengan pH berbeda pada dimensi pemisahan pertama dan kedua. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan sistem RP-RP-HPLC dengan pH berbeda pada dimensi pemisahan pertama dan kedua.Gilar M., Olivova P., Dali AE dan Gebler JK Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan sistem RP-RP-HPLC dengan pH berbeda pada dimensi pemisahan pertama dan kedua.Gilar M., Olivova P., Dali AE dan Gebler JK Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan nilai pH berbeda pada dimensi pemisahan pertama dan kedua menggunakan sistem RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Investigasi perpindahan massa dan karakteristik kinetik kolom kromatografi kinerja tinggi yang diisi dengan partikel C18 berpori penuh dan berpori permukaan yang lebih kecil dari 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tren terkini dan tantangan analitis dalam isolasi, identifikasi, dan validasi peptida bioaktif tumbuhan. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB dkk. Lanskap proteomik kerajaan kehidupan. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Pasca-perlakuan peptida terapeutik dengan kromatografi cair preparatif. Molecules (Basel, Swiss) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran dan aplikasinya pada biopolimer. Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran dan aplikasinya pada biopolimer.Yang, Yu. dan Geng, X. Kromatografi mode campuran dan aplikasinya pada biopolimer. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran dan aplikasinya dalam biopolimer.Yang, Yu. dan Gene, X. Kromatografi mode campuran dan aplikasinya pada biopolimer.J. Kromatografi. A 1218(49), 8813–8825 (2011).