תודה שביקרתם באתר Nature.com. אתם משתמשים בגרסת דפדפן עם תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בנוסף, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, אנו מציגים את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
מציג קרוסלה של שלוש שקופיות בו זמנית. השתמשו בכפתורים הקודם והבא כדי לעבור בין שלוש שקופיות בו זמנית, או השתמשו בכפתורי המחוון בסוף כדי לעבור בין שלוש שקופיות בו זמנית.
חלקיקי סיליקה נקבוביים הוכנו בשיטת סול-ג'ל עם מספר שינויים כדי להשיג חלקיקים רחבי נקבוביות. חלקיקים אלה עברו עיבוד נקבוביות באמצעות N-פנילמלאימיד-מתילוויניל איזוציאנט (PMI) וסטירן באמצעות פולימריזציה של העברת שרשרת הפוכה (RAFT) כדי לייצר פוליאמידים משולבים ב-N-פנילמלאימיד. פאזה נייחת של סטירן (PMP). עמודות נירוסטה בעלות קוטר צר (קוטר פנימי 100 × 1.8 מ"מ) אוחסנו באריזת תרחיף. ביצועי הכרומטוגרפיה של עמודת ה-PMP הוערכו כדי להפריד תערובת של פפטידים סינתטיים המורכבת מחמישה פפטידים (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, חומצת אמינו Leu אנפקלין) והידרוליזה טריפטית של אלבומין בסרום אנושי (HAS). בתנאי אלוציה אופטימליים, המספר התאורטי של פלטות עם תערובת פפטידים הגיע ל-280,000 פלטות/מ"ר. בהשוואה בין ביצועי ההפרדה של העמודה שפותחה לעמודה המסחרית Ascentis Express RP-Amide, נצפה כי יעילות ההפרדה של עמודת PMP הייתה עדיפה על זו של העמודה המסחרית מבחינת יעילות ההפרדה והרזולוציה.
תעשיית הביו-פרמצבטיקה הפכה לשוק עולמי הולך וגדל עם עלייה משמעותית בנתח השוק בשנים האחרונות. עם הצמיחה המתפרצת של תעשיית הביו-פרמצבטיקה1,2,3 קיים צורך גדול בניתוח פפטידים וחלבונים. בנוסף לפפטיד המטרה, נוצרים זיהומים שונים במהלך סינתזת הפפטידים, ולכן נדרש טיהור כרומטוגרפי כדי להשיג את טוהר הפפטיד הרצוי. ניתוח ואפיון חלבונים בנוזלי גוף, ברקמות ובתאים הם משימה מאתגרת ביותר בשל המספר הרב של מינים הניתנים לזיהוי פוטנציאלי הקיימים בדגימה אחת. למרות שספקטרומטריית מסות היא כלי יעיל לריצוף פפטידים וחלבונים, אם דגימות כאלה מוכנסות ישירות לספקטרומטר המסות, ההפרדה לא תהיה מספקת. ניתן לפתור בעיה זו על ידי ביצוע כרומטוגרפיית נוזלים (LC) לפני ניתוח MS, אשר תפחית את כמות האנליטים הנכנסים לספקטרומטר המסות בזמן נתון4,5,6. בנוסף, אנליטים יכולים להתרכז באזור צר במהלך הפרדת פאזות נוזליות, ובכך לרכז את האנליטים הללו ולהגביר את הרגישות של גילוי MS. כרומטוגרפיית נוזלים (LC) התקדמה משמעותית בעשור האחרון והפכה לשיטה נפוצה לניתוח פרוטאומי 7,8,9,10.
כרומטוגרפיית נוזלים בפאזה הפוכה (RP-LC) נמצאת בשימוש נרחב לטיהור והפרדה של תערובות של פפטידים באמצעות סיליקה מעובדת באוקטדציל (ODS) כפאזה נייחת 11,12,13. עם זאת, בשל המבנה המורכב שלהם ואופיים האמפוטרי, 14,15 פאזות נייחות של RP אינן יכולות לספק הפרדה משביעת רצון של פפטידים וחלבונים. לכן, ניתוח פפטידים וחלבונים עם מקטעים פולריים ולא פולריים דורש פאזות נייחות שתוכננו במיוחד כדי לתקשר ולשמור על אנליטים אלה 16. כרומטוגרפיה מעורבת, המציעה אינטראקציות רב-מודאליות, יכולה להיות אלטרנטיבה ל-RP-LC להפרדת פפטידים, חלבונים ותערובות מורכבות אחרות. הוכנו מספר פאזות נייחות מסוג מעורב ועמודות מלאות בפאזות נייחות אלה שימשו להפרדת פפטידים וחלבונים 17,18,19,20,21. בשל נוכחותן של קבוצות פולריות ולא פולריות, פאזות סטציונריות במצב מעורב (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalation polar/RPLC) מתאימות להפרדת פפטידים וחלבונים22,23,24,25,26,27,28. , פאזות סטציונריות פולריות עם אינטרקלציה וקבוצות פולריות הקשורות קוולנטית מציגות יכולות הפרדה טובות וסלקטיביות ייחודית עבור אנליטים פולריים ולא פולריים מכיוון שההפרדה תלויה באינטראקציה בין האנליט לפאזה הסטציונרית. אינטראקציות רב-מודאליות29,30,31,32. לאחרונה, ג'אנג ועמיתיו30 השיגו פאזות סטציונריות עם סיום בהניל של פוליאמינים והפרידו בהצלחה פחמימנים, תרופות נוגדות דיכאון, פלבנואידים, נוקלאוזידים, אסטרוגנים ואנליטיים אחרים. החומר הסטציונרי המשובץ בקוטב מכיל קבוצות פולריות ולא פולריות כאחד, כך שניתן להשתמש בו להפרדת פפטידים וחלבונים לחלקים הידרופוביים והידרופיליים. עמודות קוטביות מוטבעות (למשל, עמודות C18 עם אמיד מוטבעות) זמינות תחת השם המסחרי עמודות Ascentis Express RP-Amide, אך עמודות אלו שימשו רק לניתוח של אמין 33.
במחקר הנוכחי, הוכנה פאזה נייחת מוטמעת קוטבית (N-פנילמלאימיד, פוליסטירן מוטמע) והוערכה לצורך הפרדת פפטידים וביקוע HSA טריפטי. האסטרטגיה הבאה שימשה להכנת הפאזה הנייחת. חלקיקי סיליקה נקבוביים הוכנו בהתאם לנהלים שתוארו בפרסומים קודמים שלנו, עם מספר שינויים בסכמות ההכנה 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. היחס בין אוריאה, פוליאתילן גליקול (PEG), TMOS וחומצה אצטית מימית הותאמו כדי להשיג חלקיקי סיליקה עם גודל נקבוביות גדול. שנית, סונתז ליגנד חדש של פנילמלאימיד-מתילוויניל איזוציאנט וחלקיקי הסיליקה המבוססים שלו שימשו להכנת פאזות נייחות מוטמעות פולריות. הפאזה הנייחת שהתקבלה נדחסה בעמודה מפלדת אל-חלד (קוטר פנימי 100 × 1.8 מ"מ) בהתאם לסכימת אריזה אופטימלית. אריזה של העמודה נעזרת ברטט מכני כדי להבטיח שכבה אחידה בתוך העמודה. העמודה הארוזה הוערכה לצורך הפרדת תערובת פפטידים המורכבת מחמישה פפטידים (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin peptide) והידרוליזטים טריפטיים של אלבומין בסרום אנושי (HSA). נצפה כי תערובת הפפטידים ועיכול הטריפטי של HSA מופרדים ברזולוציה וביעילות טובות. יעילות ההפרדה של עמודת ה-PMP הושוותה לזו של עמודת Ascentis Express RP-Amide. נצפה כי לפפטידים וחלבונים יש רזולוציה טובה ויעילות הפרדה גבוהה בעמודת ה-PMP, ויעילות ההפרדה של עמודת ה-PMP גבוהה מזו של עמודת Ascentis Express RP-Amide.
PEG (פוליאתילן גליקול), אוריאה, חומצה אצטית, טרימתוקסיאורתוסיליקט (TMOS), טרימתילכלורוסילאן (TMCS), טריפסין, אלבומין בסרום אנושי (HSA), אמוניום כלוריד, אוריאה, הקסמתילמתקרילוילדיסילאזאן (HMDS), מתקרילויל כלוריד (MC), סטירן, 4-הידרוקסי-TEMPO, בנזואיל פרוקסיד (BPO), אצטוניטריל (ACN) עבור HPLC, מתנול, 2-פרופנול ואצטון. חברת סיגמא-אלדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב).
תערובת של אוריאה (8 גרם), פוליאתילן גליקול (8 גרם) ו-8 מ"ל של חומצה אצטית 0.01 N עורבבה במשך 10 דקות, ו-24 מ"ל של TMOS נוספו אליה תחת קירור בקרח. תערובת התגובה חוממה ב-40 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות ולאחר מכן ב-120 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות באוטוקלב מפלדת אל-חלד. המים נשפכו והשאריות יובשו ב-70 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. הבלוקים הרכים היבשים נגרסו בצורה חלקה ועברו קלצינציה בתנור ב-550 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. שלוש מנות הוכנו ואופיינו כדי לבדוק את יכולת השחזור של גודל החלקיקים, גודל הנקבוביות ושטח הפנים.
קבוצה פולרית ופאזה נייחת עבור שרשראות פוליסטירן. תהליך ההכנה מתואר להלן.
N-פנילמלאימיד (200 מ"ג) ומתיל ויניל איזוציאנט (100 מ"ג) הומסו בטולואן נטול מים, ולאחר מכן נוספו 0.1 מ"ל של 2,2'-אזואיזובוטירוניטריל (AIBN) לבקבוק התגובה כדי לקבל קופולימר של פנילמלאימיד ומתיל ויניל איזוציאנט (PMCP). התערובת חוממה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות, סוננה ויובשה בתנור ב-40 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
חלקיקי סיליקה יבשים (2 גרם) פוזרו בטולואן יבש (100 מ"ל), עורבבו ועברו סוניקציה במשך 10 דקות בבקבוק עגול של 500 מ"ל. PMCP (10 מ"ג) הומס בטולואן והוסף טיפה אחר טיפה לבקבוק התגובה דרך משפך הוספה. התערובת חוממה ברפלוקס ב-100 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות, סוננה, נשטפה באצטון ויובשה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות. לאחר מכן, חלקיקי הסיליקה הקשורים ל-PMCP (100 גרם) הומסו בטולואן (200 מ"ל), ו-4-הידרוקסי-TEMPO (2 מ"ל) נוסף אליו בנוכחות 100 מיקרוליטר של דיבוטילטין דילאוראט כזרז. התערובת עורבבה ב-50 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות, סוננה ויובשה ב-50 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
סטירן (1 מ"ל), בנזואיל פרוקסיד BPO (0.5 מ"ל) וחלקיקי סיליקה המחוברים ל-TEMPO-PMCP (1.5 גרם) פוזרו בטולואן וטוהרו בחנקן. הפולימריזציה של הסטירן בוצעה ב-100 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. התוצר שנוצר נשטף עם מתנול ויובש למשך הלילה ב-60 מעלות צלזיוס. הסכימה הכללית של התגובה מוצגת באיור 1.
הדגימות נוקו מגזים בטמפרטורה של 393 קלווין למשך שעה אחת עד שהושג לחץ שיורי של פחות מ-10⁻³ טור. כמות ה-N2 שנספחה בלחץ יחסי P/P0 = 0.99 שימשה לקביעת נפח הנקבוביות הכולל. המורפולוגיה של חלקיקי סיליקה טהורים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד נבדקה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (Hitachi High Technologies, טוקיו, יפן). דגימות יבשות (סיליקה טהורה וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד) הונחו על מוטות אלומיניום באמצעות סרט פחמן. זהב הופקד על הדגימה באמצעות מכשיר התזה Q150T, ושכבת זהב בעובי 5 ננומטר הופקדה על הדגימה. זה משפר את יעילות תהליך המתח הנמוך ומספק ריסוס קר עדין. ניתוח אלמנטרי בוצע באמצעות מנתח הרכב אלמנטרי Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. מנתח גודל חלקיקים Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 שימש לקבלת התפלגות גודל החלקיקים. חלקיקי סיליקה לא מצופים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד (5 מ"ג כל אחד) פוזרו ב-5 מ"ל של איזופרופנול, עברו סוניקציה במשך 10 דקות, עורבבו במשך 5 דקות והונחו על ספסל אופטי Mastersizer. ניתוח תרמוגרווימטרי מתבצע בקצב של 5 מעלות צלזיוס לדקה בטווח טמפרטורות שבין 30 ל-800 מעלות צלזיוס.
עמודות נירוסטה צרות מצופות סיבי זכוכית במידות (קוטר פנימי 100 × 1.8 מ"מ) נארזו בשיטת מילוי תרחיף לפי אותו הליך כמו בהפניה 31. עמודה מפלדת אל-חלד (מצופה זכוכית, קוטר פנימי 100 × 1.8 מ"מ) ופתח מוצא המכיל פריט בקוטר 1 מיקרומטר חוברו למכונת אריזת תרחיף (Alltech Deerfield, IL, USA). הכינו תרחיף של הפאזה הנייחת על ידי השעיית 150 מ"ג של הפאזה הנייחת ב-1.2 מ"ל של מתנול והזנתה לעמודת מאגר. מתנול שימש כממס תרחיף וממס בקרה. ארזו את העמודה על ידי הפעלת רצף לחץ של 100 מגה-בייט למשך 10 דקות, 80 מגה-בייט למשך 15 דקות ו-60 מגה-בייט למשך 30 דקות. תהליך האריזה השתמש בשני ויברטורים לעמודות כרומטוגרפיית גז (Alltech, Deerfield, IL, USA) לרעידות מכניות על מנת להבטיח אריזה אחידה של העמודה. סגרו את מיכל אריזת התרחיף ושחררו את הלחץ באיטיות כדי למנוע נזק למחרוזת. העמודה נותקה מפיה של התרחיף ואביזר נוסף חובר לכניסה וחובר למערכת LC כדי לבדוק את פעולתו.
נבנה MLC מותאם אישית באמצעות משאבת LC (10AD Shimadzu, יפן), דוגם עם לולאת הזרקה של 50 nL (Valco (ארה"ב) C14 W.05), מסיר גזים ממברנלי (Shimadzu DGU-14A), וחלון נימי UV-VIS. מכשיר גלאי (UV-2075) ועמודת מיקרו מצופה אמייל. השתמשו בצינורות חיבור צרים וקצרים מאוד כדי למזער את ההשפעה של התרחבות נוספת של העמודה. לאחר מילוי העמודה, התקינו נימי (50 מיקרומטר בקוטר 365) ביציאה של צומת החיזור 1/16 אינץ' והתקינו נימי (50 מיקרומטר) של צומת החיזור. איסוף הנתונים ועיבוד הכרומטוגרמה בוצעו באמצעות תוכנת Multichro 2000. ב-254 ננומטר, ספיגת ה-UV של האנליטים הנבדקים נוטרה ב-0. נתונים כרומטוגרפיים נותחו באמצעות OriginPro8 (נורת'המפטון, מסצ'וסטס).
אלבומין בסרום אנושי, אבקה שעברה ליופיליזציה, ≥ 96% (אלקטרופורזה בג'ל אגרוז) 3 מ"ג מעורבב עם טריפסין (1.5 מ"ג), 4.0 M אוריאה (1 מ"ל) ו-0.2 M אמוניום ביקרבונט (1 מ"ל). התמיסה עורבבה במשך 10 דקות ונשמרה באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 6 שעות, ולאחר מכן דוממה עם 1 מ"ל של 0.1% TFA. סננו את התמיסה ואחסנו מתחת ל-4 מעלות צלזיוס.
הפרדת תערובת פפטידים ו-HSA מעיכול טריפטי על עמודת PMP הוערכה בנפרד. בדקו את ההידרוליזה הטריפטית של תערובת פפטידים ו-HSA המופרדים על ידי עמודת PMP והשוו את התוצאות עם עמודת Ascentis Express RP-Amide. מספר הלוחות התאורטיים מחושב באמצעות המשוואה הבאה:
תמונות SEM של חלקיקי סיליקה טהורים וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד מוצגות באיור 2. תמונות SEM של חלקיקי סיליקה טהורים (A, B) מראות צורה כדורית שבה החלקיקים מוארכים או בעלי סימטריה לא סדירה בהשוואה למחקרים קודמים שלנו. פני השטח של חלקיקי הסיליקה הקשורים לליגנד (C, D) חלקים יותר מאלה של חלקיקי סיליקה טהורים, דבר שייתכן שקורה עקב שרשראות הפוליסטירן המכסות את פני חלקיקי הסיליקה.
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של חלקיקי סיליקה טהורים (A, B) וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד (C, D).
פיזור גודל החלקיקים של חלקיקי סיליקה טהורה וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד מוצג באיור 2.3(A). עקומות פיזור גודל החלקיקים הנפחי הראו שגודל חלקיקי הסיליקה גדל לאחר שינוי כימי (איור 3A). נתוני פיזור גודל חלקיקי הסיליקה מהמחקר הנוכחי והמחקר הקודם מושווים בטבלה 1(A). גודל החלקיקים הנפחי d(0.5) של PMP היה 3.36 מיקרומטר, בהשוואה לערך ad(0.5) של 3.05 מיקרומטר במחקר הקודם שלנו (חלקיקי סיליקה קשורים בפוליסטירן)34. עקב השינוי ביחס בין PEG, אוריאה, TMOS וחומצה אצטית בתערובת התגובה, פיזור גודל החלקיקים של אצווה זו היה צר יותר בהשוואה למחקר הקודם שלנו. גודל החלקיקים של פאזת ה-PMP גדול מעט מזה של פאזת חלקיקי הסיליקה הקשורה בפוליסטירן שחקרנו קודם לכן. משמעות הדבר היא שפונקציונליזציה פני השטח של חלקיקי סיליקה עם סטירן השקיעה רק שכבת פוליסטירן (0.97 מיקרומטר) על פני הסיליקה, בעוד שבשלב ה-PMP עובי השכבה היה 1.38 מיקרומטר.
התפלגות גודל החלקיקים (A) והתפלגות גודל הנקבוביות (B) של חלקיקי סיליקה טהורה וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד.
גודל הנקבוביות, נפח הנקבוביות ושטח הפנים של חלקיקי הסיליקה ששימשו במחקר זה מוצגים בטבלה 1 (B). פרופילי ה-PSD של חלקיקי סיליקה טהורה וחלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד מוצגים באיורים 3 (B). התוצאות היו דומות למחקר הקודם שלנו34. גודל הנקבוביות של חלקיקי סיליקה טהורה ושל חלקיקי סיליקה הקשורים לליגנד היה 310Å ו-241Å, בהתאמה, דבר המצביע על כך שלאחר שינוי כימי, גודל הנקבוביות ירד ב-69Å, כפי שמוצג בטבלה 1 (B), ועקומת ההזזה מוצגת באיור. שטח הפנים הסגולי של חלקיקי סיליקה במחקר הנוכחי הוא 116 מ"ר/גרם, נתון דומה למחקר הקודם שלנו (124 מ"ר/גרם). כפי שמוצג בטבלה 1 (B), שטח הפנים (מ"ר/גרם) של חלקיקי סיליקה לאחר שינוי כימי ירד גם הוא מ-116 מ"ר/גרם ל-105 מ"ר/גרם.
תוצאות הניתוח האלמנטרי של הפאזה הנייחת מוצגות בטבלה 2. תכולת הפחמן של הפאזה הנייחת הנוכחית היא 6.35%, נתון נמוך יותר מאשר במחקר הקודם שלנו (חלקיקי סיליקה הקשורים לפוליסטירן, 7.93%35 ו-10.21%, בהתאמה)42. תכולת הפחמן של הפאזה הנייחת הנוכחית מופיעה למטה, מכיוון שכמה ליגנדים פולריים כגון פנילמלאימיד מתיל ויניל איזוציאנט (PCMP) ו-4-הידרוקסי-TEMPO שימשו בנוסף לסטירן בהכנת SP. אחוז המשקל של חנקן בפאזה הנייחת הנוכחית הוא 2.21% בהשוואה ל-0.1735 ו-0.85% במחקרים קודמים42. משמעות הדבר היא שלפאזה הנייחת הנוכחית יש אחוז משקל גבוה של חנקן עקב הפנילמלאימיד. באופן דומה, למוצרים (4) ו-(5) יש תכולת פחמן של 2.7% ו-2.9% בהתאמה, בעוד שלמוצר הסופי (6) יש תכולת פחמן של 6.35%, כפי שמוצג בטבלה 2. ניתוח תרמוגרווימטרי (TGA) שימש על הפאזה הנייחת של PMP כדי לבדוק ירידה במשקל, ועקומת ה-TGA מוצגת באיור 4. עקומת ה-TGA מראה ירידה במשקל של 8.6%, התואמת היטב את תכולת הפחמן (6.35%), מכיוון שהליגנדים מכילים לא רק C, אלא גם N, O ו-H.
הליגנד פנילמלאימיד-מתילוויניל איזוציאנט נבחר לשינוי פני השטח של חלקיקי הסיליקה בגלל קבוצות הפנילמלאימיד וויניליאיזוציאנט הקוטביות שלו. קבוצות ויניל איזוציאנט יכולות להגיב עוד יותר עם סטירן על ידי פולימריזציה רדיקלית חיה. הסיבה השנייה היא להכניס קבוצה שיש לה אינטראקציות מתונות עם האנליט ואין אינטראקציות אלקטרוסטטיות חזקות בין האנליט לפאזה הנייחת, מכיוון שלחלק הפנילמלאימיד אין מטען וירטואלי ב-pH רגיל. ניתן לשלוט בקוטביות של הפאזה הנייחת על ידי כמות הסטירן האופטימלית וזמן התגובה של פולימריזציה של רדיקלים חופשיים. השלב הסופי של התגובה (פולימריזציה של רדיקלים חופשיים) הוא קריטי מכיוון שהוא משנה את הקוטביות של הפאזה הנייחת. ניתוח אלמנטרי בוצע כדי לבדוק את תכולת הפחמן בפאזות נייחות אלו. נצפה כי הגדלת כמות הסטירן וזמן התגובה מגדילה את תכולת הפחמן של הפאזה הנייחת ולהיפך. ל-SPs שהוכנו עם ריכוזים שונים של סטירן יש עומסי פחמן שונים. באופן דומה, פאזות נייחות אלו הונחו על עמודות נירוסטה ונבדקו המאפיינים הכרומטוגרפיים שלהן (סלקטיביות, רזולוציה, ערך N וכו'). בהתבסס על ניסויים אלו, נבחרה הרכב אופטימלי להכנת הפאזה הנייחת PMP כדי לספק קוטביות מבוקרת ושמירה טובה של האנליט.
עמודת ה-PMP הוערכה גם לצורך ניתוח של חמש תערובות של פפטידים (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) תוך שימוש בקיבולת הפאזה הניידת. 60/40 (v/v) ACN/מים (0.1% TFA) בקצב זרימה של 80 מיקרוליטר/דקה. בתנאי אלוציה אופטימליים (200,000 פלטות/מ"ר), מספר הפלטות התאורטיות (N) לכל עמודה (100 × 1.8 מ"מ) הוא 20,000 ± 100. ערכי ה-N עבור שלוש עמודות ה-PMP מוצגים בטבלה 3 והכרומטוגרמות מוצגות באיור 5A. אנליזה מהירה בקצב זרימה גבוה (700 מיקרוליטר/דקה) על עמודת PMP, חמישה פפטידים עברו אלציה תוך דקה אחת, ערך N מצוין של 13,500 ± 330 לכל עמודה (קוטר 100 x 1.8 מ"מ), שווה ערך ל-135,000 פלטות/מ"ר (איור 5B). שלוש עמודות באותו גודל (קוטר פנימי 100 x 1.8 מ"מ) מולאו בשלוש קבוצות שונות של פאזה נייחת PMP לבדיקת שחזור. אנליטים נרשמו עבור כל עמודה על ידי הפרדת אותה תערובת בדיקה על כל עמודה תוך שימוש בתנאי אלציה אופטימליים, מספר פלטות תיאורטיות N וזמן שמירה. נתוני השחזור עבור עמודות ה-PMP מוצגים בטבלה 4. השחזור של עמודת ה-PMP תאם היטב עם ערכי %RSD נמוכים מאוד כפי שמוצג בטבלה 3.
הפרדת תערובות פפטידים על עמודת PMP (B) ועמודת Ascentis Express RP-Amide (A), פאזה ניידת 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), מידות עמודת PMP (100 x 1.8 מ"מ פנימי), ניתוח סדר אלוציה של תרכובות: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ו-5 (אנקפלין חומצה לאוצית).
עמודת PMP (קוטר פנימי 100 x 1.8 מ"מ) הוערכה לצורך הפרדת ההידרוליזה הטריפטית של אלבומין בסרום אנושי באמצעות HPLC. הכרומטוגרמה באיור 6 מראה שהדגימות מופרדות היטב עם רזולוציה טובה מאוד. תמיסות HSA נותחו באמצעות קצב זרימה של 100 מיקרוליטר/דקה, פאזה ניידת של 70/30 אצטוניטריל/מים ו-0.1% TFA. ביקוע ה-HSA חולק ל-17 פיקים, כפי שמוצג בכרומטוגרמה (איור 6), התואמים ל-17 פפטידים. יעילות ההפרדה של פיקים בודדים מההידרוליזה של HSA חושבה והערכים מוצגים בטבלה 5.
הידרוליזטים טריפטיים של HSA הופרדו על עמודת PMP (קוטר פנימי 100 x 1.8 מ"מ), קצב זרימה (100 מיקרוליטר/דקה), פאזה ניידת 60/40 אצטוניטריל/מים, ו-0.1% TFA.
כאשר L הוא אורך העמודה, η היא צמיגות הפאזה הניידת, ΔP הוא לחץ הגב של העמודה, ו-u היא המהירות הליניארית של הפאזה הניידת. החדירות של עמודת ה-PMP הייתה 2.5 × 10-14 מ"ר, קצב הזרימה היה 25 מיקרוליטר/דקה, נעשה שימוש ביחס של 60/40 v/v. ACN/מים. החדירות של עמודת ה-PMP (ID 100 × 1.8 מ"מ) הייתה דומה לזו של מחקר Ref.34 הקודם שלנו. החדירות של עמודה מלאה בחלקיקים נקבוביים שטחיים היא 1.7×10-0.6 מיקרומטר, 2.5×10-14 מ"ר עבור חלקיקים של 5 מיקרומטר. לכן, החדירות של פאזת ה-PMP דומה לחדירות של חלקיקי ליבה-קליפה בגודל של 5 מיקרומטר.
כאשר Wx היא מסת העמודה המלאה בכלורופורם, Wy היא מסת העמודה המלאה במתנול, ו-ρ היא צפיפות הממס. צפיפות המתנול (ρ = 0.7866) והכלורופורם (ρ = 1.484). הנקבוביות הכוללת של עמודת חלקיקי הסיליקה-C18 (קוטר פנימי של 100 × 1.8 מ"מ)34 ועמודת C18-אוריאה31 שנחקרה בעבר הייתה 0.63 ו-0.55, בהתאמה. משמעות הדבר היא שנוכחות ליגנדים של אוריאה מפחיתה את החדירות של הפאזה הנייחת. מצד שני, הנקבוביות הכוללת של עמודת PMP (קוטר פנימי 100 × 1.8 מ"מ) היא 0.60. עמודות PMP פחות חדירות מעמודות ארוזות בחלקיקי סיליקה הקשורים ל-C18 מכיוון שבפאזות נייחות מסוג C18 הליגנדים של C18 מחוברים לחלקיקי הסיליקה בשרשראות ליניאריות, בעוד שבפאזות נייחות מסוג פוליסטירן נוצר פולימר עבה יחסית סביב החלקיקים. שכבה A. בניסוי טיפוסי, נקבוביות העמודה מחושבת באופן הבא:
איור 7א' ו-7ב' מציגים דיאגרמות Van Deemter עבור עמודת PMP (קוטר פנימי 100 x 1.8 מ"מ) ועמודת Ascentis Express RP-Amide (קוטר פנימי 100 x 1.8 מ"מ) תחת אותם תנאי אלוציה, 60/40 ACN/H2O ו-0.1% TFA 20 מיקרוליטר/דקה עד 800 מיקרוליטר/דקה בשתי העמודות. ערכי ה-HETP המינימליים בקצב הזרימה האופטימלי (80 מיקרוליטר/דקה) היו 2.6 מיקרומטר ו-3.9 מיקרומטר עבור עמודת PMP ועמודת Ascentis Express RP-Amide, בהתאמה. ערכי ה-HETP מראים כי יעילות ההפרדה של עמודת PMP (קוטר פנימי 100 x 1.8 מ"מ) גבוהה בהרבה מזו של עמודת Ascentis Express RP-Amide הזמינה מסחרית (קוטר פנימי 100 x 1.8 מ"מ). גרף ואן דמטר באיור 7(א) מראה כי הירידה בערך החנקן אינה גבוהה משמעותית עם עלייה בזרימה בהשוואה למחקר הקודם שלנו. יעילות ההפרדה הגבוהה יותר של עמודת ה-PMP (קוטר פנימי 100 × 1.8 מ"מ) בהשוואה לעמודת Ascentis Express RP-Amide מבוססת על צורת וגודל החלקיקים המשופרים ועל הליך האריזה המתוחכם של העמודה המשמש בעבודה הנוכחית.
(א) דיאגרמה של ואן דמטר (HETP לעומת מהירות ליניארית של פאזה ניידת) שהתקבלה על עמודת PMP (קוטר פנימי 100 x 1.8 מ"מ) ב-60/40 ACN/H2O עם 0.1% TFA. (ב) דיאגרמה של ואן דמטר (HETP לעומת מהירות ליניארית של פאזה ניידת) שהתקבלה על עמודת Ascentis Express RP-Amide (קוטר פנימי 100 x 1.8 מ"מ) ב-60/40 ACN/H2O עם 0.1% TFA.
פאזה נייחת פולארית של פוליסטירן אינטרקלציה הוכנה והוערכה לצורך הפרדת תערובת של פפטידים סינתטיים והידרוליזה טריפטית של אלבומין בסרום אנושי (HSA) בכרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים. ביצועי הכרומטוגרפיה של עמודות PMP לתערובות פפטידים מצוינים מבחינת יעילות ההפרדה והרזולוציה. יעילות ההפרדה המשופרת של עמודות PMP נובעת ממספר סיבות כגון גודל חלקיקי סיליקה וגודל הנקבוביות, סינתזה מבוקרת של פאזות נייחות וחומרי אריזה מורכבים של העמודות. בנוסף ליעילות ההפרדה הגבוהה, יתרון נוסף של פאזה נייחת זו הוא לחץ גב נמוך של העמודה בקצבי זרימה גבוהים. עמודות PMP ניתנות לשחזור בקלות וניתן להשתמש בהן לניתוח תערובות של פפטידים ועיכול טריפטי של חלבונים שונים. אנו מתכוונים להשתמש בעמודה זו לצורך הפרדת תרכובות ביו-אקטיביות ממוצרים טבעיים, תמציות של צמחי מרפא ופטריות בכרומטוגרפיית נוזלים. בעתיד, עמודות PMP יוערכו גם לצורך הפרדת חלבונים ונוגדנים חד שבטיים.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. חקירה של מערכות הפרדת פפטידים בכרומטוגרפיית פאזה הפוכה חלק א': פיתוח פרוטוקול לאפיון עמודות. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. חקירה של מערכות הפרדת פפטידים באמצעות כרומטוגרפיית פאזה הפוכה חלק א': פיתוח פרוטוקול לאפיון עמודות.פילד, ג'יי.קיי., אוורבי, מ.ר., לאו, ג'., טוגרסן, ה'., ופטרסון, פ. חקירת מערכות הפרדת פפטידים על ידי כרומטוגרפיה בפאזה הפוכה, חלק א': פיתוח פרוטוקול לאפיון עמודות. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. חקירה של מערכות הפרדת פפטידים בכרומטוגרפיית פאזה הפוכה חלק א': פיתוח פרוטוקול למאפייני עמודה. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. חקירה של מערכות הפרדת פפטידים בכרומטוגרפיית פאזה הפוכה חלק א': פיתוח פרוטוקול למאפייני עמודה.פילד, ג'יי.קיי., אוורבי, מ.ר., לאו, ג'., טוגרסן, ה'., ופטרסון, פ. חקירת מערכות הפרדת פפטידים על ידי כרומטוגרפיה בפאזה הפוכה, חלק א': פיתוח פרוטוקול לאפיון עמודות.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
גומז, ב' ואחרים. שיטות ליצירת פפטידים פעילים משופרים לטיפול במחלות זיהומיות. ביוטכנולוגיה. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. פפטידים טיפוליים סינתטיים: מדע ושוק. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. פפטידים טיפוליים סינתטיים: מדע ושוק.Vliege P, Lisowski V, Martinez J and Chreschatyski M. פפטידים טיפוליים סינתטיים: מדע ושוק.Vliege P, Lisowski V, Martinez J and Khreschatsky M. פפטידים טיפוליים סינתטיים: מדע ושוק. גילוי תרופות. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. כרומטוגרפיית נוזלים פרוטאומית מתקדמת. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. כרומטוגרפיית נוזלים פרוטאומית מתקדמת.ראו F., Smith RD ו-Shen Yu. כרומטוגרפיית נוזלים פרוטאומית מתקדמת. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. הרכב חלבון מתקדם 液相色谱.ראו F., Smith RD ו-Shen Yu. כרומטוגרפיית נוזלים פרוטאומית מתקדמת.J. כרומטוגרפיה. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. כרומטוגרפיית נוזלים-ספקטרומטריית מסות מתקדמת מסוגלת לשלב מטבולומיקה רחבת היקף ופרוטאומיקה. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ תפקידו של UHPLC בפיתוח תרופות. Chesnut, SM & Salisbury, JJ תפקידו של UHPLC בפיתוח תרופות.Chesnut, SM ו-Salisbury, JJ תפקידו של UHPLC בפיתוח תרופות.Chesnut, SM ו-Salisbury, JJ תפקידו של UHPLC בפיתוח תרופות. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
וו, נ. וקלאוזן, AM היבטים יסודיים ומעשיים של כרומטוגרפיית נוזלים בלחץ גבוה במיוחד להפרדות מהירות. וו, נ. וקלאוזן, AM היבטים יסודיים ומעשיים של כרומטוגרפיית נוזלים בלחץ גבוה במיוחד להפרדות מהירות.וו, נ. וקלאוזן, AM היבטים יסודיים ומעשיים של כרומטוגרפיית נוזלים בלחץ גבוה להפרדה מהירה. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 וו, נ. וקלאוזן, AM היבטים בסיסיים ומעשיים של כרומטוגרפיית נוזלים בלחץ גבוה במיוחד להפרדה מהירה.וו, נ. וקלאוזן, AM היבטים יסודיים ומעשיים של כרומטוגרפיית נוזלים בלחץ גבוה להפרדה מהירה.J. ספטמבר. מדע. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
רן, ס.א. וצ'ליטשף, פ. שימוש בכרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בפיתוח תרופות. רן, ס.א. וצ'ליטשף, פ. שימוש בכרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בפיתוח תרופות.רן, ס.א. וצ'לישף, פ. השימוש בכרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בפיתוח תרופות. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用. רן, ס.א. וצ'ליטשף, פ.רן, ס.א. וצ'לישף, פ. יישום כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בפיתוח תרופות.J. כרומטוגרפיה. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
גו, ה. ואחרים. הידרוג'ל מקרופורוסי מונוליטי שמקורו באמולסיה של שמן-במים עם פאזה פנימית גבוהה לטיהור יעיל של אנטרווירוס 71. פרויקט כימי. כתב עת 401, 126051 (2020).
שי, י., שיאנג, ר., הורוואת, ק. ווילקינס, ג'א. תפקידה של כרומטוגרפיית נוזלים בפרוטאומיקס. שי, י., שיאנג, ר., הורוואת, ק. ווילקינס, ג'א. תפקידה של כרומטוגרפיית נוזלים בפרוטאומיקס.שי, י., שיאנג, ר., הורוואת, ק. ווילקינס, ג'א. תפקידה של כרומטוגרפיית נוזלים בפרוטאומיקס. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAשי, י., שיאנג, ר., הורוואת, ק. ווילקינס, ג'א. תפקידה של כרומטוגרפיית נוזלים בפרוטאומיקס.J. כרומטוגרפיה. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
פקטה, ש., ווטי, ג'.-ל. וגילרמה, ד. מגמות חדשות בהפרדות כרומטוגרפיות נוזליות בפאזה הפוכה של פפטידים וחלבונים טיפוליים: תיאוריה ויישומים. וגילרמה, ד. מגמות חדשות בהפרדות כרומטוגרפיות נוזליות בפאזה הפוכה של פפטידים וחלבונים טיפוליים: תיאוריה ויישומים. & Guillarme, D. фазой: теория и приложения. וגילרמה, ד. מגמות חדשות בהפרדת פפטידים וחלבונים טיפוליים על ידי כרומטוגרפיית נוזלים בפאזה הפוכה: תיאוריה ויישומים. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 וגילרמה, ד.וגילרמה, ד. מגמות חדשות בהפרדת פפטידים וחלבונים טיפוליים על ידי כרומטוגרפיית נוזלים בפאזה הפוכה: תיאוריה ויישומים.J. Pharm. Biomedical Science. אנוס. 69, 9–27 (2012).
גילאר, מ., אוליבובה, פ., דיילי, AE וגבר, ג'יי.סי. הפרדה דו-ממדית של פפטידים באמצעות מערכת RP-RP-HPLC עם pH שונה בממדי ההפרדה הראשון והשני. גילאר, מ., אוליבובה, פ., דיילי, AE וגבר, ג'יי.סי. הפרדה דו-ממדית של פפטידים באמצעות מערכת RP-RP-HPLC עם pH שונה בממדי ההפרדה הראשון והשני.Gilar M., Olivova P., Dali AE and Gebler JK הפרדה דו-ממדית של פפטידים באמצעות מערכת RP-RP-HPLC עם pH שונה במימד ההפרדה הראשון והשני.גילאר מ., אוליבובה פ., דאלי א.א. וגבר ג'.ק. הפרדה דו-ממדית של פפטידים באמצעות ערכי pH שונים בממד ההפרדה הראשון והשני באמצעות מערכת RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
פליטי, ש. ואחרים. חקירת מאפייני העברת המסה והקינטיות של עמודות כרומטוגרפיה בעלות ביצועים גבוהים ארוזות בחלקיקי C18 נקבוביים לחלוטין ונקבוביים שטחית קטנים מ-2 מיקרומטר. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
פיובסנה, ש. ואחרים. מגמות אחרונות ואתגרים אנליטיים בבידוד, זיהוי ותיקוף של פפטידים ביו-אקטיביים צמחיים. פי הטבעת. יצור אנלי. כימיקלים. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
מולר, ג'יי.בי ואחרים. נוף פרוטאומי של ממלכת החיים. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
דה לוקה, ק. ואחרים. טיפול לאחר ניתוח של פפטידים טיפוליים באמצעות כרומטוגרפיית נוזלים פרפרטיבית. מולקולות (באזל, שוויץ) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. כרומטוגרפיה במצב מעורב ויישומיה בביופולימרים. Yang, Y. & Geng, X. כרומטוגרפיה במצב מעורב ויישומיה בביופולימרים.יאנג, יו. וגנג, X. כרומטוגרפיה במצב מעורב ויישומה בביופולימרים. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. כרומטוגרפיה במצב מעורב ויישומה בביופולימרים.יאנג, יו. וג'ין, X. כרומטוגרפיה במצב מעורב ויישומה בביופולימרים.J. כרומטוגרפיה. A 1218(49), 8813–8825 (2011).