Благодарим вас за посещение сайта Nature.com. Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновленную версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Кроме того, для обеспечения постоянной поддержки мы отображаем сайт без стилей и JavaScript.
Отображает карусель из трех слайдов одновременно. Используйте кнопки «Предыдущий» и «Следующий», чтобы переключаться между тремя слайдами за раз, или используйте ползунки в конце, чтобы переключаться между тремя слайдами за раз.
Пористые частицы диоксида кремния были получены золь-гель методом с некоторыми модификациями для получения частиц с широкими порами. Эти частицы были модифицированы N-фенилмалеимидом-метилвинилизоцианатом (PMI) и стиролом посредством полимеризации с обратной цепной передачей-фрагментацией (RAFT) для получения интеркалированных полиамидов N-фенилмалеимида. В качестве стационарной фазы использовался стирол (PMP). Узкостенные колонки из нержавеющей стали (100 × 1,8 мм внутренний диаметр) были заполнены суспензией. Хроматографические характеристики колонки с PMP оценивались для разделения смеси синтетических пептидов, состоящей из пяти пептидов (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu аминокислота энкефалин) и триптического гидролизата человеческого сывороточного альбумина (HAS). При оптимальных условиях элюирования теоретическое число тарелок со смесью пептидов достигло 280 000 тарелок/кв.м. Сравнивая разделительные характеристики разработанной колонки с коммерческой колонкой Ascentis Express RP-Amide, было установлено, что эффективность разделения колонки PMP превосходит эффективность разделения и разрешение коммерческой колонки.
Биофармацевтическая промышленность превратилась в расширяющийся глобальный рынок со значительным увеличением рыночной доли в последние годы. В связи с взрывным ростом биофармацевтической промышленности1,2,3 возникает большая потребность в анализе пептидов и белков. Помимо целевого пептида, в процессе синтеза пептидов образуются различные примеси, поэтому для получения пептида необходимо хроматографическое очищение. Анализ и характеристика белков в биологических жидкостях, тканях и клетках представляют собой чрезвычайно сложную задачу из-за большого количества потенциально обнаруживаемых веществ, присутствующих в одном образце. Хотя масс-спектрометрия является эффективным инструментом для секвенирования пептидов и белков, если такие образцы вводятся непосредственно в масс-спектрометр, разделение будет неудовлетворительным. Эту проблему можно решить, проведя жидкостную хроматографию (ЖХ) перед масс-спектрометрическим анализом, что уменьшит количество аналитов, поступающих в масс-спектрометр в заданный момент времени4,5,6. Кроме того, аналиты могут концентрироваться в узкой области во время жидкофазного разделения, тем самым концентрируя эти аналиты и повышая чувствительность масс-спектрометрического обнаружения. Жидкостная хроматография (ЖХ) значительно продвинулась за последнее десятилетие и стала широко используемым методом протеомного анализа7,8,9,10.
Обратнофазовая жидкостная хроматография (ОФЖХ) широко используется для очистки и разделения смесей пептидов с использованием модифицированного октадецилсиликагеля (ОДС) в качестве стационарной фазы11,12,13. Однако из-за их сложной структуры и амфотерной природы14,15 стационарные фазы ОФЖХ не могут обеспечить удовлетворительное разделение пептидов и белков. Поэтому анализ пептидов и белков с полярными и неполярными фрагментами требует специально разработанных стационарных фаз для взаимодействия и удержания этих аналитов16. Смешанная хроматография, обеспечивающая многомодальное взаимодействие, может стать альтернативой ОФЖХ для разделения пептидов, белков и других сложных смесей. Было приготовлено несколько стационарных фаз смешанного типа, и колонки, заполненные этими стационарными фазами, использовались для разделения пептидов и белков17,18,19,20,21. Благодаря наличию полярных и неполярных групп, стационарные фазы смешанного типа (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярная интеркаляция/RPLC) подходят для разделения пептидов и белков22,23,24,25,26,27,28. Полярные интеркалированные стационарные фазы с ковалентно связанными полярными группами демонстрируют хорошие разделительные способности и уникальную селективность по отношению к полярным и неполярным аналитам, поскольку разделение зависит от взаимодействия между аналитом и стационарной фазой (мультимодальные взаимодействия29,30,31,32). Недавно Чжан и др.30 получили бегенилсодержащие стационарные фазы полиаминов и успешно разделили углеводороды, антидепрессанты, флавоноиды, нуклеозиды, эстрогены и некоторые другие аналиты. Полярный внедренный стационарный материал содержит как полярные, так и неполярные группы, поэтому его можно использовать для разделения пептидов и белков на гидрофобные и гидрофильные части. Полярные колонки для внутрипоточного анализа (например, колонки C18 с амидным сорбентом) доступны под торговой маркой Ascentis Express RP-Amide columns, но эти колонки использовались только для анализа амина 33.
В данном исследовании была приготовлена ​​и оценена полярная иммобилизованная стационарная фаза (N-фенилмалеимид, иммобилизованный полистирол) для разделения пептидов и расщепления триптического HSA. Для приготовления стационарной фазы использовалась следующая стратегия. Пористые частицы диоксида кремния были приготовлены в соответствии с процедурами, описанными в наших предыдущих публикациях, с некоторыми изменениями в схемах приготовления 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Соотношения мочевины, полиэтиленгликоля (ПЭГ), ТМОС и водно-уксусной кислоты были скорректированы для получения частиц диоксида кремния с большими размерами пор. Во-вторых, был синтезирован новый лиганд фенилмалеимид-метилвинилизоцианат, и его производные частицы диоксида кремния были использованы для приготовления полярных иммобилизованных стационарных фаз. Полученная стационарная фаза была упакована в колонку из нержавеющей стали (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) в соответствии с оптимизированной схемой упаковки. Упаковка колонки облегчается механической вибрацией для обеспечения равномерного слоя внутри колонки. Была проведена оценка набивной колонки для разделения смеси пептидов, состоящей из пяти пептидов (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, пептид лейцин-энкефалин), и триптических гидролизатов человеческого сывороточного альбумина (HSA). Было установлено, что смесь пептидов и триптический гидролизат HSA разделяются с хорошим разрешением и эффективностью. Эффективность разделения колонки PMP сравнивалась с эффективностью колонки Ascentis Express RP-Amide. Было установлено, что пептиды и белки имеют хорошее разрешение и высокую эффективность разделения на колонке PMP, причем эффективность разделения колонки PMP выше, чем у колонки Ascentis Express RP-Amide.
ПЭГ (полиэтиленгликоль), мочевина, уксусная кислота, триметоксиортосиликат (ТМОС), триметилхлорсилан (ТМКС), трипсин, человеческий сывороточный альбумин (HSA), хлорид аммония, мочевина, гексаметилметакрилоилдисилазан (HMDS), метакрилоилхлорид (MC), стирол, 4-гидрокси-ТЕМПО, пероксид бензоила (BPO), ацетонитрил (ACN) для ВЭЖХ, метанол, 2-пропанол и ацетон. Компания Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США).
Смесь мочевины (8 г), полиэтиленгликоля (8 г) и 8 мл 0,01 N уксусной кислоты перемешивали в течение 10 минут, затем добавляли 24 мл ТМОС при охлаждении льдом. Реакционную смесь нагревали при 40°C в течение 6 часов, а затем при 120°C в течение 8 часов в автоклаве из нержавеющей стали. Воду сливали, а остаток сушили при 70°C в течение 12 часов. Высушенные мягкие блоки измельчали ​​до однородной массы и прокаливали в печи при 550°C в течение 12 часов. Было приготовлено и охарактеризовано три партии для проверки воспроизводимости размеров частиц, размера пор и площади поверхности.
Полярная группа и стационарная фаза для полистирольных цепей. Процедура приготовления описана ниже.
N-фенилмалеимид (200 мг) и метилвинилизоцианат (100 мг) растворили в безводном толуоле, затем в реакционную колбу добавили 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрила (АИБН) для получения сополимера фенилмалеимида и метилвинилизоцианата (ПМЦП). Смесь нагревали при 60°C в течение 3 часов, фильтровали и сушили в печи при 40°C в течение 3 часов.
Высушенные частицы диоксида кремния (2 г) диспергировали в сухом толуоле (100 мл), перемешивали и подвергали ультразвуковой обработке в течение 10 мин в круглодонной колбе объемом 500 мл. PMCP (10 мг) растворяли в толуоле и добавляли по каплям в реакционную колбу через капельную воронку. Смесь кипятили при 100°C в течение 8 часов, фильтровали, промывали ацетоном и сушили при 60°C в течение 3 часов. Затем частицы диоксида кремния, связанные с PMCP (100 г), растворяли в толуоле (200 мл), и к ним добавляли 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) в присутствии 100 мкл дибутилоловодилаурата в качестве катализатора. Смесь перемешивали при 50°C в течение 8 часов, фильтровали и сушили при 50°C в течение 3 часов.
Стирол (1 мл), пероксид бензоила (BPO) (0,5 мл) и частицы диоксида кремния, прикрепленные к TEMPO-PMCP (1,5 г), диспергировали в толуоле и продували азотом. Полимеризацию стирола проводили при 100°C в течение 12 часов. Полученный продукт промывали метанолом и сушили в течение ночи при 60°C. Общая схема реакции показана на рис. 1.
Образцы дегазировали при 393 К в течение 1 часа до достижения остаточного давления менее 10–3 Торр. Количество адсорбированного N2 при относительном давлении P/P0 = 0,99 использовали для определения общего объема пор. Морфологию чистых и связанных с лигандами частиц диоксида кремния исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа (Hitachi High Technologies, Токио, Япония). Сухие образцы (чистый диоксид кремния и связанные с лигандами частицы диоксида кремния) помещали на алюминиевые стержни с помощью углеродной ленты. Золото наносили на образец с помощью магнетронного распылителя Q150T, и на образец наносили слой золота толщиной 5 нм. Это повышает эффективность низковольтного процесса и обеспечивает тонкое холодное напыление. Элементный анализ проводили с помощью анализатора элементного состава Thermo Electron (Waltham, MA, США) Flash EA1112. Для определения распределения частиц по размерам использовали анализатор размера частиц Malvern (Worcestershire, Великобритания) Mastersizer 2000. Непокрытые частицы диоксида кремния и частицы диоксида кремния, связанные с лигандами (по 5 мг каждая), диспергировали в 5 мл изопропанола, подвергали ультразвуковой обработке в течение 10 минут, перемешивали в течение 5 минут и помещали на оптический стенд Mastersizer. Термогравиметрический анализ проводили со скоростью 5 °C в минуту в диапазоне температур от 30 до 800 °C.
Узкостенные колонки из нержавеющей стали с футеровкой из стекловолокна размерами (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) заполнялись методом суспензионного наполнения по той же процедуре, что и в ссылке 31. Колонка из нержавеющей стали (с футеровкой из стекловолокна, внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) и выходное отверстие с фриттой 1 мкм были соединены с машиной для суспензионного наполнения (Alltech, Дирфилд, Иллинойс, США). Суспензию стационарной фазы готовили путем суспендирования 150 мг стационарной фазы в 1,2 мл метанола и подачи ее в резервуарную колонку. Метанол использовался в качестве растворителя суспензии и контрольного растворителя. Колонку заполняли, применяя последовательность давлений: 100 МПа в течение 10 мин, 80 МПа в течение 15 мин и 60 МПа в течение 30 мин. Для обеспечения равномерного заполнения колонки использовали два вибратора для газохроматографических колонок (Alltech, Дирфилд, Иллинойс, США) для механической вибрации. Закройте шламоусадочный пакер и медленно сбросьте давление, чтобы предотвратить повреждение колонны. Колонна была отсоединена от шламоусадочного сопла, и к входному отверстию был присоединен другой фитинг, подключенный к системе LC для проверки ее работы.
Для создания многослойной жидкостной хроматографической колонки (МЖХ) использовалась жидкостная хроматографическая помпа (10AD Shimadzu, Япония), пробоотборник с инжекционной петлей объемом 50 нл (Valco (США) C14 W.05), мембранный дегазатор (Shimadzu DGU-14A) и капиллярное окно для УФ-видимого излучения. Детектор (UV-2075) и эмалированная микроколонка. Для минимизации влияния дополнительного расширения колонки использовались очень узкие и короткие соединительные трубки. После заполнения колонки на выходе восстанавливающего соединения 1/16″ устанавливался капилляр (50 мкм, внутренний диаметр 365). Сбор данных и обработка хроматограмм выполнялись с помощью программного обеспечения Multichro 2000. При длине волны 254 нм УФ-поглощение анализируемых веществ контролировалось при 0 нм. Хроматографические данные анализировались с помощью OriginPro8 (Нортгемптон, Массачусетс).
Лиофилизированный порошок человеческого сывороточного альбумина, ≥ 96% (электрофорез в агарозном геле). 3 мг смесили с трипсином (1,5 мг), 4,0 М мочевиной (1 мл) и 0,2 М бикарбонатом аммония (1 мл). Раствор перемешивали в течение 10 мин и выдерживали на водяной бане при 37°C в течение 6 ч, затем реакцию останавливали добавлением 1 мл 0,1% ТФК. Раствор фильтровали и хранили при температуре ниже 4°C.
Отдельно оценивалось разделение смеси пептидов и триптического гидролизата HSA на колонке PMP. Проверяли триптический гидролиз смеси пептидов и HSA, разделенных на колонке PMP, и сравнивали результаты с колонкой Ascentis Express RP-Amide. Количество теоретических тарелок рассчитывали по следующей формуле:
На рисунке 2 представлены изображения чистых частиц диоксида кремния и частиц диоксида кремния, связанных с лигандом, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ). Изображения чистых частиц диоксида кремния (А, В) показывают сферическую форму, в то время как частицы имеют вытянутую форму или неправильную симметрию по сравнению с нашими предыдущими исследованиями. Поверхность частиц диоксида кремния, связанных с лигандом (С, D), более гладкая, чем поверхность чистых частиц диоксида кремния, что может быть связано с цепями полистирола, покрывающими поверхность частиц диоксида кремния.
Сканирующие электронные микроснимки чистых частиц диоксида кремния (A, B) и частиц диоксида кремния, связанных с лигандом (C, D).
Распределение размеров частиц чистых частиц диоксида кремния и частиц диоксида кремния, связанных с лигандами, показано на рис. 2. 3(A). Кривые объемного распределения размеров частиц показали, что размер частиц диоксида кремния увеличился после химической модификации (рис. 3A). Данные о распределении размеров частиц диоксида кремния из настоящего исследования и предыдущего исследования сравниваются в таблице 1(A). Объемный размер частиц d(0,5) PMP составил 3,36 мкм по сравнению со значением ad(0,5) 3,05 мкм в нашем предыдущем исследовании (частицы диоксида кремния, связанные с полистиролом)34. Из-за изменения соотношения ПЭГ, мочевины, ТМОС и уксусной кислоты в реакционной смеси распределение размеров частиц этой партии было уже по сравнению с нашим предыдущим исследованием. Размер частиц фазы PMP немного больше, чем размер частиц фазы диоксида кремния, связанного с полистиролом, которую мы изучали ранее. Это означает, что функционализация поверхности частиц диоксида кремния стиролом привела к осаждению на поверхности диоксида кремния только слоя полистирола (0,97 мкм), тогда как в фазе ПМП толщина слоя составляла 1,38 мкм.
Распределение размеров частиц (A) и распределение размеров пор (B) чистых частиц диоксида кремния и частиц диоксида кремния, связанных с лигандом.
Размер пор, объем пор и площадь поверхности частиц диоксида кремния, использованных в данном исследовании, показаны в таблице 1 (B). Профили распределения размеров пор чистых частиц диоксида кремния и частиц диоксида кремния, связанных с лигандом, показаны на рис. 3 (B). Результаты сопоставимы с результатами нашего предыдущего исследования34. Размеры пор чистых и связанных с лигандом частиц диоксида кремния составляли 310 Å и 241 Å соответственно, что указывает на то, что после химической модификации размер пор уменьшился на 69 Å, как показано в таблице 1 (B), а кривая сдвига показана на рис. Удельная площадь поверхности частиц диоксида кремния в данном исследовании составляет 116 м2/г, что сопоставимо с результатами нашего предыдущего исследования (124 м2/г). Как показано в таблице 1 (B), площадь поверхности (м2/г) частиц диоксида кремния после химической модификации также уменьшилась со 116 м2/г до 105 м2/г.
Результаты элементного анализа стационарной фазы представлены в таблице 2. Содержание углерода в данной стационарной фазе составляет 6,35%, что ниже, чем в нашем предыдущем исследовании (частицы диоксида кремния, связанные с полистиролом, 7,93%35 и 10,21% соответственно)42. Низкое содержание углерода в данной стационарной фазе объясняется тем, что помимо стирола при приготовлении стационарной фазы использовались некоторые полярные лиганды, такие как фенилмалеимид, метилвинилизоцианат (PCMP) и 4-гидрокси-TEMPO. Массовая доля азота в данной стационарной фазе составляет 2,21% по сравнению с 0,1735 и 0,85% в предыдущих исследованиях42. Это означает, что данная стационарная фаза имеет высокую массовую долю азота благодаря фенилмалеимиду. Аналогично, продукты (4) и (5) имеют содержание углерода 2,7% и 2,9% соответственно, тогда как конечный продукт (6) имеет содержание углерода 6,35%, как показано в таблице 2. Термогравиметрический анализ (ТГА) был использован на стационарной фазе ПМП для определения потери веса, кривая ТГА показана на рисунке 4. Кривая ТГА показывает потерю веса 8,6%, что хорошо согласуется с содержанием углерода (6,35%), поскольку лиганды содержат не только C, но и N, O и H.
Для модификации поверхности частиц диоксида кремния был выбран лиганд фенилмалеимид-метилвинилизоцианат из-за наличия в его составе полярных фенилмалеимидных и винилизоцианатных групп. Винилизоцианатные группы могут дополнительно реагировать со стиролом посредством живой радикальной полимеризации. Вторая причина заключается в введении группы, обладающей умеренным взаимодействием с аналитом и не имеющей сильных электростатических взаимодействий между аналитом и стационарной фазой, поскольку фенилмалеимидная группа не имеет виртуального заряда при нормальном pH. Полярность стационарной фазы можно контролировать оптимальным количеством стирола и временем реакции свободнорадикальной полимеризации. Заключительный этап реакции (свободнорадикальная полимеризация) имеет решающее значение, поскольку он изменяет полярность стационарной фазы. Для проверки содержания углерода в этих стационарных фазах был проведен элементный анализ. Было замечено, что увеличение количества стирола и времени реакции приводит к увеличению содержания углерода в стационарной фазе и наоборот. Стабилизаторы диоксида кремния, приготовленные с различными концентрациями стирола, имеют различное содержание углерода. Аналогичным образом, эти стационарные фазы были помещены на колонки из нержавеющей стали, и были проверены их хроматографические характеристики (селективность, разрешение, значение N и т. д.). На основе этих экспериментов был выбран оптимизированный состав для приготовления стационарной фазы PMP, обеспечивающий контролируемую полярность и хорошее удерживание аналита.
Колонка PMP также была протестирована для анализа пяти смесей пептидов (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин) с использованием подвижной фазы 60/40 (об/об) ацетонитрил/вода (0,1% ТФК) при скорости потока 80 мкл/мин. При оптимальных условиях элюирования (200 000 тарелок/м) число теоретических тарелок (N) на колонку (100 × 1,8 мм) составляет 20 000 ± 100. Значения N для трех колонок PMP приведены в таблице 3, а хроматограммы показаны на рисунке 5A. Быстрый анализ при высокой скорости потока (700 мкл/мин) на колонке PMP, пять пептидов элюировались в течение одной минуты, отличное значение N 13 500 ± 330 на колонку (диаметр 100 x 1,8 мм), что эквивалентно 135 000 теоретических тарелок/м (рис. 5B). Три колонки одинакового размера (внутренний диаметр 100 x 1,8 мм) были заполнены тремя различными партиями стационарной фазы PMP для проверки воспроизводимости. Аналиты регистрировались для каждой колонки путем разделения одной и той же тестовой смеси на каждой колонке с использованием оптимальных условий элюирования, количества теоретических тарелок N и времени удерживания. Данные о воспроизводимости для колонок PMP приведены в таблице 4. Воспроизводимость колонки PMP хорошо коррелировала с очень низкими значениями %RSD, как показано в таблице 3.
Разделение смесей пептидов на колонке PMP (B) и колонке Ascentis Express RP-Amide (A), подвижная фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), размеры колонки PMP (100 x 1,8 мм внутреннего диаметра), анализ. Порядок элюции соединений: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) и 5 ​​(лейциновая кислота энкефалин).
Для разделения триптического гидролизата человеческого сывороточного альбумина методом ВЭЖХ была исследована колонка PMP (внутренний диаметр 100 x 1,8 мм). Хроматограмма на рисунке 6 показывает, что образцы хорошо разделены с очень хорошим разрешением. Растворы HSA анализировались при скорости потока 100 мкл/мин, подвижной фазе 70/30 ацетонитрил/вода и 0,1% ТФК. Расщепление HSA разделилось на 17 пиков, как показано на хроматограмме (рис. 6), соответствующих 17 пептидам. Эффективность разделения отдельных пиков из гидролизата HSA была рассчитана, и значения приведены в таблице 5.
Триптические гидролизаты HSA разделяли на колонке PMP (внутренний диаметр 100 x 1,8 мм) при скорости потока 100 мкл/мин, подвижной фазе 60/40 ацетонитрил/вода и 0,1% ТФК.
где L — длина колонки, η — вязкость подвижной фазы, ΔP — противодавление колонки, а u — линейная скорость подвижной фазы. Проницаемость колонки PMP составляла 2,5 × 10–14 м2, скорость потока — 25 мкл/мин, использовалась смесь ацетонитрила и воды 60/40 об./об. Проницаемость колонки PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) была аналогична проницаемости, описанной в нашем предыдущем исследовании [34]. Проницаемость колонки, заполненной поверхностно пористыми частицами, составляет 1,7 × 10,6 мкм, 2,5 × 10–14 м2 для частиц размером 5 мкм [43]. Следовательно, проницаемость фазы PMP аналогична проницаемости частиц типа «ядро-оболочка» размером 5 мкм.
где Wx — масса колонки, заполненной хлороформом, Wy — масса колонки, заполненной метанолом, а ρ — плотность растворителя. Плотность метанола (ρ = 0,7866) и хлороформа (ρ = 1,484). Общая пористость колонки с частицами диоксида кремния-C18 (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм)34 и ранее исследованной нами колонки с C18-мочевиной31 составляла 0,63 и 0,55 соответственно. Это означает, что присутствие лигандов мочевины снижает проницаемость стационарной фазы. С другой стороны, общая пористость колонки PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) составляет 0,60. Колонки из полистирола (PMP) менее проницаемы, чем колонки, заполненные частицами диоксида кремния, связанными с C18, потому что в стационарных фазах типа C18 лиганды C18 прикреплены к частицам диоксида кремния в виде линейных цепей, тогда как в стационарных фазах типа полистирола вокруг частиц образуется относительно толстый полимерный слой А. В типичном эксперименте пористость колонки рассчитывается следующим образом:
На рис. 7А и В показаны графики Ван Деемтера для колонки PMP (внутренний диаметр 100 х 1,8 мм) и колонки Ascentis Express RP-Amide (внутренний диаметр 100 х 1,8 мм) при одинаковых условиях элюирования: 60/40 ACN/H2O и 0,1% TFA, скорость потока от 20 мкл/мин до 800 мкл/мин на обеих колонках. Минимальные значения HETP при оптимальной скорости потока (80 мкл/мин) составили 2,6 мкм и 3,9 мкм для колонки PMP и колонки Ascentis Express RP-Amide соответственно. Значения HETP показывают, что эффективность разделения колонки PMP (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра) значительно выше, чем у коммерчески доступной колонки Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 мм внутреннего диаметра). График ван Деемтера на рис. 7(A) показывает, что уменьшение значения N не значительно выше с увеличением потока по сравнению с нашим предыдущим исследованием. Более высокая эффективность разделения колонки PMP (внутренний диаметр 100 × 1,8 мм) по сравнению с колонкой Ascentis Express RP-Amide обусловлена ​​улучшенной формой и размером частиц, а также усовершенствованной процедурой упаковки колонки, использованной в данной работе34.
(A) График Ван Деемтера (HETP в зависимости от линейной скорости подвижной фазы), полученный на колонке PMP (внутренний диаметр 100 x 1,8 мм) в смеси ацетонитрила и воды 60/40 с 0,1% ТФК. (B) График Ван Деемтера (HETP в зависимости от линейной скорости подвижной фазы), полученный на колонке Ascentis Express RP-Amide (внутренний диаметр 100 x 1,8 мм) в смеси ацетонитрила и воды 60/40 с 0,1% ТФК.
Была приготовлена ​​и исследована полярная стационарная фаза из интеркалированного полистирола для разделения смеси синтетических пептидов и триптического гидролизата человеческого сывороточного альбумина (HSA) в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Хроматографические характеристики колонок PMP для смесей пептидов превосходны с точки зрения эффективности разделения и разрешения. Улучшенная эффективность разделения колонок PMP обусловлена ​​несколькими причинами, такими как размер частиц и пор диоксида кремния, контролируемый синтез стационарных фаз и сложные упаковочные материалы для колонок. Помимо высокой эффективности разделения, еще одним преимуществом этой стационарной фазы является низкое противодавление колонки при высоких скоростях потока. Колонки PMP обладают высокой воспроизводимостью и могут использоваться для анализа смесей пептидов и триптического расщепления различных белков. Мы планируем использовать эту колонку для разделения биологически активных соединений из природных продуктов, экстрактов лекарственных растений и грибов в жидкостной хроматографии. В будущем колонки PMP также будут исследованы для разделения белков и моноклональных антител.
Филд, Дж. К., Эуэрби, М. Р., Лау, Дж., Тёгерсен, Х. и Петерссон, П. Исследование систем разделения пептидов методом обращенно-фазовой хроматографии. Часть I: Разработка протокола для характеристики колонки. Филд, Дж. К., Эуэрби, М. Р., Лау, Дж., Тёгерсен, Х. и Петерссон, П. Исследование систем разделения пептидов методом обращенно-фазовой хроматографии. Часть I: Разработка протокола для характеристики колонки.Филд, Дж. К., Оверби, М. Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х., и Петерссон, П. Исследование систем разделения пептидов методом обращенно-фазовой хроматографии, часть I: Разработка протокола для характеристики колонки. Филд, Дж. К., Эуэрби, М. Р., Лау, Дж., Тёгерсен, Х. и Петерссон, П. Исследование систем разделения пептидов методом обращенно-фазовой хроматографии. Часть I: Разработка протокола для определения характеристик колонки. Филд, Дж. К., Эуэрби, М. Р., Лау, Дж., Тёгерсен, Х. и Петерссон, П. Исследование систем разделения пептидов методом обращенно-фазовой хроматографии. Часть I: Разработка протокола для определения характеристик колонки.Филд, Дж. К., Оверби, М. Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х., и Петерссон, П. Исследование систем разделения пептидов методом обращенно-фазовой хроматографии, часть I: Разработка протокола для характеристики колонки.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Гомес, Б. и др. Методы создания улучшенных активных пептидов для лечения инфекционных заболеваний. Биотехнология. Достижения 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж. и Хрестчатиски, М. Синтетические терапевтические пептиды: наука и рынок. Влиге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж. и Хрестчатиски, М. Синтетические терапевтические пептиды: наука и рынок.Влиге П., Лисовски В., Мартинес Дж. и Хрешатыски М. Синтетические терапевтические пептиды: наука и рынок.Влиге П., Лисовски В., Мартинес Дж. и Крещацкий М. Синтетические терапевтические пептиды: наука и рынок. Разработка лекарств. Сегодня 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Се, Ф., Смит, Р. Д. и Шен, И. Усовершенствованная протеомная жидкостная хроматография. Се, Ф., Смит, Р. Д. и Шен, И. Усовершенствованная протеомная жидкостная хроматография.См. F., Smith RD и Shen Yu. Усовершенствованная протеомная жидкостная хроматография. Се Ф., Смит Р.Д. и Шен Ю. 高级蛋白质组液相色谱. Се Ф., Смит Р.Д. и Шен Ю. Усовершенствованный белковый состав.См. F., Smith RD и Shen Yu. Усовершенствованная протеомная жидкостная хроматография.Журнал хроматографии. А 1261, 78–90 (2012).
Лю, В. и др. Усовершенствованная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия позволяет объединить широкий спектр метаболомики и протеомики. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, С.М. и Солсбери, Дж.Дж. Роль ВЭЖХ в разработке фармацевтических препаратов. Чеснат, С.М. и Солсбери, Дж.Дж. Роль ВЭЖХ в разработке фармацевтических препаратов.Чеснат, С.М. и Солсбери, Дж.Дж. Роль ВЭЖХ в разработке фармацевтических препаратов.Чеснат, С.М. и Солсбери, Дж.Дж. Роль ВЭЖХ в разработке лекарств. Журнал сентябрьской науки. 30(8), 1183–1190 (2007).
Ву, Н. и Клаузен, А.М. Фундаментальные и практические аспекты сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии для быстрого разделения веществ. Ву, Н. и Клаузен, А.М. Фундаментальные и практические аспекты сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии для быстрого разделения веществ.Ву, Н. и Клаузен, А.М. Фундаментальные и практические аспекты высокоэффективной жидкостной хроматографии для быстрого разделения. Ву, Н. и Клаузен, А.М. Ву, Н. и Клаусен, А.М. Основные и практические аспекты сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии для быстрого разделения.Ву, Н. и Клаузен, А.М. Фундаментальные и практические аспекты высокоэффективной жидкостной хроматографии для быстрого разделения.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. и Челищефф, П. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармацевтической разработке. Рен, С.А. и Челищефф, П. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармацевтической разработке.Рен, С.А. и Челишефф, П. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармацевтической разработке. Рен, С.А. и Челищефф, П. Рен, С.А. и Челищефф, П.Рен, С.А. и Челишефф, П. Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в разработке лекарственных препаратов.Журнал хроматографии. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. и др. Монолитный макропористый гидрогель, полученный из эмульсии типа «масло в воде» с высокой внутренней фазой, для эффективной очистки энтеровируса 71. Химический проект. Журнал 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. и Уилкинс, Дж. А. Роль жидкостной хроматографии в протеомике. Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. и Уилкинс, Дж. А. Роль жидкостной хроматографии в протеомике.Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. и Уилкинс, Дж. А. Роль жидкостной хроматографии в протеомике. Ши Ю., Сян Р., Хорват К. и Уилкинс Дж. А. Ши Ю., Сян Р., Хорват К. и Уилкинс Дж.А.Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. и Уилкинс, Дж. А. Роль жидкостной хроматографии в протеомике.Журнал хроматографии. А 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вутей, Ж.-Л. & Гийарме, Д. Новые тенденции в жидкостной хроматографии с обращенной фазой для разделения терапевтических пептидов и белков: теория и приложения. & Гийарме, Д. Новые тенденции в жидкостной хроматографии с обращенной фазой для разделения терапевтических пептидов и белков: теория и приложения. И Гийярм, Д. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с применением фазы: теория и применение. & Гийарме, Д. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии: теория и применение. и Гийярме, Д. Справочная информация: 理论 和应用. & Гийарме, Д.и Гийарме, Д. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии: теория и применение.J. Pharm. Biomedical Science. anus. 69, 9–27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дейли, А.Е. и Геблер, Дж.К. Двумерное разделение пептидов с использованием системы ВЭЖХ с обращенной фазой и обращенной фазой при различном pH в первом и втором измерениях разделения. Гилар, М., Оливова, П., Дейли, А.Е. и Геблер, Дж.К. Двумерное разделение пептидов с использованием системы ВЭЖХ с обращенной фазой и обращенной фазой при различном pH в первом и втором измерениях разделения.Гилар М., Оливова П., Дали А.Е. и Геблер Дж.К. Двумерное разделение пептидов с использованием системы RP-RP-HPLC с различным pH в первом и втором измерениях разделения.Гилар М., Оливова П., Дали А.Е. и Геблер Дж.К. Двумерное разделение пептидов с использованием различных значений pH в первом и втором измерениях разделения с помощью системы RP-RP-HPLC. Журнал сентябрьской науки. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Феллити, С. и др. Исследование массопереноса и кинетических характеристик колонок высокоэффективной хроматографии, заполненных полностью пористыми и поверхностно пористыми частицами C18 размером менее 2 мкм. Журнал сентябрьской науки. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Пиовесана, С. и др. Последние тенденции и аналитические проблемы в выделении, идентификации и валидации растительных биоактивных пептидов. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж. Б. и др. Протеомный ландшафт царства жизни. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
Де Лука, К. и др. Постобработка терапевтических пептидов препаративной жидкостной хроматографией. Молекулы (Базель, Швейцария) 26(15), 4688 (2021).
Ян, Ю. и Гэн, С. Хроматография в смешанном режиме и ее применение к биополимерам. Ян, Ю. и Гэн, С. Хроматография в смешанном режиме и ее применение к биополимерам.Ян Ю. и Гэн С. Хроматография в смешанном режиме и ее применение к биополимерам. Ян Ю. и Гэн X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. Ян, Ю. и Гэн, С. Хроматография в смешанном режиме и ее применение в биополимерах.Ян, Ю. и Джин, С. Хроматография в смешанном режиме и ее применение к биополимерам.Журнал хроматографии. А 1218(49), 8813–8825 (2011).