Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Koristite verziju preglednika s ograničenom CSS podrškom. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažuriranu verziju preglednika (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). Osim toga, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazujemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Prikazuje karusel od tri slajda odjednom. Koristite dugmad Prethodno i Sljedeće za kretanje kroz tri slajda odjednom ili koristite klizače na kraju za kretanje kroz tri slajda odjednom.
Porozne čestice silicijum dioksida pripremljene su sol-gel metodom uz neke modifikacije kako bi se dobile čestice sa širokim porama. Ove čestice su derivatizirane sa N-fenilmaleimid-metilvinil izocijanatom (PMI) i stirenom putem polimerizacije reverznim prenosom lanca-fragmentacijom (RAFT) kako bi se dobili poliamidi interkalirani N-fenilmaleimidom. Stacionarna faza stirena (PMP). Kolone od nehrđajućeg čelika uskog promjera (unutrašnji promjer 100 × 1,8 mm) bile su punjene suspenzijom. Kromatografske performanse PMP kolone procijenjene su kako bi se odvojila smjesa sintetičkih peptida koja se sastoji od pet peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminokiselina enkefalin) i triptični hidrolizat humanog serumskog albumina (HAS). Pod optimalnim uvjetima elucije, teorijski broj ploča sa smjesom peptida dostigao je 280.000 ploča/m². Upoređujući performanse separacije razvijene kolone sa komercijalnom Ascentis Express RP-Amide kolonom, uočeno je da je efikasnost separacije PMP kolone bila superiornija u odnosu na komercijalnu kolonu u smislu efikasnosti separacije i rezolucije.
Biofarmaceutska industrija postala je globalno tržište u ekspanziji sa značajnim povećanjem tržišnog udjela posljednjih godina. S eksplozivnim rastom biofarmaceutske industrije1,2,3 postoji velika potreba za analizom peptida i proteina. Pored ciljnog peptida, tokom sinteze peptida nastaju različite nečistoće, tako da je potrebno hromatografsko prečišćavanje kako bi se postigla željena čistoća peptida. Analiza i karakterizacija proteina u tjelesnim tečnostima, tkivima i ćelijama izuzetno je izazovan zadatak zbog velikog broja potencijalno detektabilnih vrsta prisutnih u jednom uzorku. Iako je masena spektrometrija efikasan alat za sekvenciranje peptida i proteina, ako se takvi uzorci direktno unesu u maseni spektrometar, razdvajanje će biti nezadovoljavajuće. Ovaj problem se može riješiti izvođenjem tečne hromatografije (LC) prije MS analize, što će smanjiti količinu analita koji ulaze u maseni spektrometar u datom trenutku4,5,6. Osim toga, analiti se mogu koncentrisati u uskom području tokom razdvajanja tečne faze, čime se ovi analiti koncentrišu i povećava osjetljivost MS detekcije. Tečna hromatografija (LC) je značajno napredovala u posljednjoj deceniji i postala je široko korištena metoda za proteomsku analizu7,8,9,10.
Tečna hromatografija reverzne faze (RP-LC) se široko koristi za prečišćavanje i odvajanje smjesa peptida korištenjem oktadecil-modificiranog silicija (ODS) kao stacionarne faze11,12,13. Međutim, zbog svoje složene strukture i amfoterne prirode,14,15 RP stacionarne faze ne mogu osigurati zadovoljavajuće odvajanje peptida i proteina. Stoga, analiza peptida i proteina s polarnim i nepolarnim fragmentima zahtijeva posebno dizajnirane stacionarne faze za interakciju i zadržavanje ovih analita16. Mješovita hromatografija, koja nudi multimodalne interakcije, može biti alternativa RP-LC za odvajanje peptida, proteina i drugih složenih smjesa. Pripremljeno je nekoliko stacionarnih faza miješanog tipa i kolone napunjene ovim stacionarnim fazama korištene su za odvajanje peptida i proteina17,18,19,20,21. Zbog prisustva polarnih i nepolarnih grupa, stacionarne faze miješanog načina rada (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polarna interkalacija/RPLC) su pogodne za odvajanje peptida i proteina22,23,24,25,26,27,28. , polarne interkalirane stacionarne faze sa kovalentno vezanim polarnim grupama pokazuju dobre mogućnosti odvajanja i jedinstvenu selektivnost za polarne i nepolarne analite jer odvajanje zavisi od interakcije između analita i stacionarne faze. Multimodalne interakcije 29,30,31,32. Nedavno su Zhang i saradnici 30 dobili behenil-terminirane stacionarne faze poliamina i uspješno odvojili ugljikovodike, antidepresive, flavonoide, nukleozide, estrogene i neke druge analite. Polarno ugrađeni stacionarni materijal ima i polarne i nepolarne grupe, tako da se može koristiti za odvajanje peptida i proteina na hidrofobne i hidrofilne dijelove. Polarne linijske kolone (npr. C18 kolone sa linijskim amidom) dostupne su pod trgovačkim nazivom Ascentis Express RP-Amide kolone, ali ove kolone su korištene samo za analizu amina 33.
U trenutnoj studiji, pripremljena je polarna ugrađena stacionarna faza (N-fenilmaleimid, ugrađeni polistiren) i procijenjena za odvajanje peptida i triptinsko cijepanje HSA. Za pripremu stacionarne faze korištena je sljedeća strategija. Porozne čestice silicija pripremljene su prema postupcima opisanim u našim prethodnim publikacijama, s nekim promjenama u shemama pripreme 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Omjeri uree, polietilen glikola (PEG), TMOS-a i vodeno-sirćetne kiseline prilagođeni su kako bi se dobile čestice silicija s velikim veličinama pora. Drugo, sintetiziran je novi fenilmaleimid-metilvinil izocijanatni ligand i njegove derivatizirane čestice silicija korištene su za pripremu polarno ugrađenih stacionarnih faza. Dobivena stacionarna faza je pakirana u kolonu od nehrđajućeg čelika (unutrašnji promjer 100 × 1,8 mm) prema optimiziranoj shemi pakiranja. Pakiranje kolone je potpomognuto mehaničkim vibracijama kako bi se osigurao ujednačen sloj unutar kolone. Pakovana kolona je procijenjena za odvajanje smjese peptida koja se sastoji od pet peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin peptid) i triptinskih hidrolizata humanog serumskog albumina (HSA). Uočeno je da se smjesa peptida i triptični probavljeni HSA odvajaju s dobrom rezolucijom i efikasnošću. Efikasnost odvajanja PMP kolone upoređena je s efikasnošću Ascentis Express RP-Amide kolone. Uočeno je da peptidi i proteini imaju dobru rezoluciju i visoku efikasnost odvajanja na PMP koloni, a efikasnost odvajanja PMP kolone je veća od one na Ascentis Express RP-Amide koloni.
PEG (polietilen glikol), urea, sirćetna kiselina, trimetoksiortosilikat (TMOS), trimetilhlorosilan (TMCS), tripsin, humani serum albumin (HSA), amonijum hlorid, urea, heksametilmetakriloildisilazan (HMDS), metakriloil hlorid (MC), stiren, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksid (BPO), acetonitril (ACN) za HPLC, metanol, 2-propanol i aceton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, SAD).
Smjesa uree (8 g), polietilen glikola (8 g) i 8 ml 0,01 N. sirćetne kiseline miješana je 10 minuta, a zatim je dodano 24 ml TMOS-a uz hlađenje ledom. Reakcijska smjesa zagrijavana je na 40°C tokom 6 sati, a zatim na 120°C tokom 8 sati u autoklavu od nehrđajućeg čelika. Voda je dekantirana, a ostatak je sušen na 70°C tokom 12 sati. Osušeni meki blokovi su glatko samljeveni i kalcinirani u peći na 550°C tokom 12 sati. Pripremljene su i karakterizirane tri serije kako bi se testirala ponovljivost veličina čestica, veličine pora i površine.
Polarna grupa i stacionarna faza za polistirenske lance. Postupak pripreme opisan je u nastavku.
N-fenilmaleimid (200 mg) i metil vinil izocijanat (100 mg) su rastvoreni u bezvodnom toluenu, a zatim je u reakcijsku tikvicu dodano 0,1 ml 2,2'-azoizobutironitrila (AIBN) da bi se dobio kopolimer fenilmaleimida i metil vinil izocijanata (PMCP). Smjesa je zagrijavana na 60°C tokom 3 sata, filtrirana i sušena u pećnici na 40°C tokom 3 sata.
Osušene čestice silicijum dioksida (2 g) su dispergovane u suhom toluenu (100 ml), miješane i sonicirane 10 minuta u okrugloj tikvici od 500 ml. PMCP (10 mg) je rastvoren u toluenu i dodavan kap po kap u reakcijsku tikvicu putem lijevka za dodavanje. Smjesa je refluksirana na 100°C tokom 8 sati, filtrirana, isprana acetonom i sušena na 60°C tokom 3 sata. Zatim su čestice silicijum dioksida povezane sa PMCP (100 g) rastvorene u toluenu (200 ml), a 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) je dodan u prisustvo 100 μl dibutiltin dilaurata kao katalizatora. Smjesa je miješana na 50°C tokom 8 sati, filtrirana i sušena na 50°C tokom 3 sata.
Stiren (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) i čestice silicijum dioksida vezane za TEMPO-PMCP (1,5 g) dispergovane su u toluenu i pročišćene dušikom. Polimerizacija stirena provedena je na 100°C tokom 12 sati. Dobiveni produkt je ispran metanolom i sušen preko noći na 60°C. Opća shema reakcije prikazana je na slici jedan.
Uzorci su degazirani na 393 K tokom 1 sata dok se nije postigao rezidualni pritisak manji od 10–3 Torr. Količina N2 adsorbovanog pri relativnom pritisku P/P0 = 0,99 korištena je za određivanje ukupnog volumena pora. Morfologija čistih i ligandima vezanih čestica silicijum dioksida ispitana je pomoću skenirajućeg elektronskog mikroskopa (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Suhi uzorci (čisti silicijum dioksid i čestice silicijum dioksida vezane za ligand) postavljeni su na aluminijumske šipke pomoću ugljenične trake. Zlato je naneseno na uzorak pomoću uređaja za raspršivanje Q150T, a na uzorak je nanesen sloj Au debljine 5 nm. Ovo poboljšava efikasnost niskonaponskog procesa i omogućava fino hladno prskanje. Elementarna analiza je provedena pomoću analizatora elementarnog sastava Thermo Electron (Waltham, MA, SAD) Flash EA1112. Za dobijanje distribucije veličine čestica korišten je Malvern analizator veličine čestica (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000. Neobložene čestice silicijum dioksida i čestice silicijum dioksida vezane za ligand (5 mg svaka) dispergovane su u 5 ml izopropanola, sonicirane 10 minuta, miješane 5 minuta i postavljene na optički stol Mastersizer. Termogravimetrijska analiza se provodi brzinom od 5 °C u minuti u temperaturnom rasponu od 30 do 800 °C.
Kolone od nehrđajućeg čelika uskog promjera obložene staklenim vlaknima, dimenzija (ID 100 × 1,8 mm), pakirane su metodom punjenja suspenzijom, slijedeći isti postupak kao u referenci 31. Kolona od nehrđajućeg čelika (obložena staklom, ID 100 × 1,8 mm) i izlaz koji sadrži fritu od 1 µm spojeni su na stroj za pakiranje suspenzije (Alltech Deerfield, IL, SAD). Pripremite suspenziju stacionarne faze suspendiranjem 150 mg stacionarne faze u 1,2 ml metanola i ubacivanjem u kolonu s rezervoarom. Metanol je korišten kao otapalo za suspenziju i kontrolno otapalo. Napunite kolonu primjenom niza pritisaka od 100 MP tokom 10 minuta, 80 MP tokom 15 minuta i 60 MP tokom 30 minuta. Proces pakiranja koristio je dva vibratora kolone za plinsku hromatografiju (Alltech, Deerfield, IL, SAD) za mehaničke vibracije kako bi se osiguralo ujednačeno pakiranje kolone. Zatvorite paker suspenzije i polako otpustite pritisak kako biste spriječili oštećenje niza. Kolona je odvojena od mlaznice za suspenziju, a drugi priključak je pričvršćen na ulaz i povezan sa LC sistemom kako bi se testirao njen rad.
Prilagođeni MLC je konstruiran korištenjem LC pumpe (10AD Shimadzu, Japan), uzorkivača s injekcijskom petljom od 50 nL (Valco (SAD) C14 W.05), membranskog degazatora (Shimadzu DGU-14A) i UV-VIS kapilarnog prozora. Detektorski uređaj (UV-2075) i emajlirana mikrokolona. Koristite vrlo uske i kratke spojne cijevi kako biste smanjili učinak dodatnog širenja kolone. Nakon punjenja kolone, instalirajte kapilaru (50 µm id 365) na izlazu redukcijskog spoja od 1/16″ i instalirajte kapilaru (50 µm) redukcijskog spoja. Prikupljanje podataka i obrada hromatograma vrše se pomoću softvera Multichro 2000. Na 254 nm, UV apsorbancija analita je praćena na 0. Kromatografski podaci su analizirani pomoću OriginPro8 (Northampton, MA).
Ljudski serum albumin, liofilizirani prašak, ≥ 96% (elektroforeza na agaroznom gelu) 3 mg pomiješano sa tripsinom (1,5 mg), 4,0 M ureom (1 ml) i 0,2 M amonijum bikarbonatom (1 ml). Rastvor je miješan 10 minuta i držan u vodenom kupatilu na 37°C tokom 6 sati, a zatim je reakcija ugašena sa 1 ml 0,1% TFA. Filtrirati rastvor i čuvati na temperaturi ispod 4°C.
Razdvajanje smjese peptida i tripsinski razgrađenog HSA na PMP koloni procijenjeno je odvojeno. Provjerite tripsinsku hidrolizu smjese peptida i HSA razdvojenih PMP kolonom i uporedite rezultate s Ascentis Express RP-Amide kolonom. Broj teorijskih ploča izračunava se pomoću sljedeće jednačine:
SEM slike čistih čestica silicijum dioksida i čestica silicijum dioksida vezanih za ligand prikazane su na Slici 2. SEM slike čistih čestica silicijum dioksida (A, B) pokazuju sferni oblik u kojem su čestice izdužene ili imaju nepravilnu simetriju u poređenju s našim prethodnim studijama. Površina čestica silicijum dioksida vezanih za ligand (C, D) je glatkija od površine čistih čestica silicijum dioksida, što može biti posljedica polistirenskih lanaca koji prekrivaju površinu čestica silicijum dioksida.
Skenirajuće elektronske mikrografije čistih čestica silicijum dioksida (A, B) i čestica silicijum dioksida vezanih za ligand (C, D).
Raspodjela veličine čestica čistog silicijum dioksida i čestica silicijum dioksida vezanih za ligand prikazana je na Sl. 2.3(A). Krive volumetrijske raspodjele veličine čestica pokazale su da se veličina čestica silicijum dioksida povećala nakon hemijske modifikacije (Sl. 3A). Podaci o raspodjeli veličine čestica silicijum dioksida iz trenutne studije i prethodne studije upoređeni su u Tabeli 1(A). Volumetrijska veličina čestica d(0,5) PMP-a bila je 3,36 µm, u poređenju sa vrijednošću ad(0,5) od 3,05 µm u našoj prethodnoj studiji (čestice silicijum dioksida vezane za polistiren)34. Zbog promjene odnosa PEG-a, uree, TMOS-a i sirćetne kiseline u reakcijskoj smjesi, raspodjela veličine čestica ove serije bila je uža u poređenju s našom prethodnom studijom. Veličina čestica PMP faze je nešto veća od veličine čestica faze silicijum dioksida vezanih za polistiren koju smo ranije proučavali. To znači da je površinska funkcionalizacija čestica silicijum dioksida stirenom deponovala samo sloj polistirena (0,97 µm) na površini silicijum dioksida, dok je u PMP fazi debljina sloja bila 1,38 µm.
Raspodjela veličine čestica (A) i raspodjela veličine pora (B) čistih čestica silicijum dioksida i čestica silicijum dioksida vezanih za ligand.
Veličina pora, volumen pora i površina čestica silicijum dioksida korištenih u ovoj studiji prikazani su u Tabeli 1 (B). PSD profili čistih čestica silicijum dioksida i čestica silicijum dioksida vezanih za ligand prikazani su na Slikama 3 (B). Rezultati su bili uporedivi s našom prethodnom studijom34. Veličine pora čistih i čestica silicijum dioksida vezanih za ligand bile su 310 Å i 241 Å, respektivno, što ukazuje da se nakon hemijske modifikacije veličina pora smanjila za 69 Å, kao što je prikazano u Tabeli 1 (B), a krivulja pomaka prikazana je na Slici 3. Specifična površina čestica silicijum dioksida u trenutnoj studiji je 116 m2/g, što je uporedivo s našom prethodnom studijom (124 m2/g). Kao što je prikazano u Tabeli 1 (B), površina (m2/g) čestica silicijum dioksida nakon hemijske modifikacije također se smanjila sa 116 m2/g na 105 m2/g.
Rezultati elementarne analize stacionarne faze prikazani su u Tabeli 2. Sadržaj ugljika u trenutnoj stacionarnoj fazi je 6,35%, što je niže nego u našoj prethodnoj studiji (čestice silicija povezane s polistirenom, 7,93%35 i 10,21%, respektivno)42. Sadržaj ugljika u trenutnoj stacionarnoj fazi je ispod, budući da su neki polarni ligandi poput fenilmaleimid metil vinil izocijanata (PCMP) i 4-hidroksi-TEMPO korišteni pored stirena u pripremi SP. Težinski postotak dušika u trenutnoj stacionarnoj fazi je 2,21% u poređenju sa 0,1735 i 0,85% u prethodnim studijama42. To znači da trenutna stacionarna faza ima visok težinski postotak dušika zbog fenilmaleimida. Slično tome, produkti (4) i (5) imaju sadržaj ugljika od 2,7% odnosno 2,9%, dok konačni produkt (6) ima sadržaj ugljika od 6,35%, kao što je prikazano u Tabeli 2. Termogravimetrijska analiza (TGA) je korištena na stacionarnoj fazi PMP-a za testiranje gubitka težine, a TGA krivulja je prikazana na Slici 4. TGA krivulja pokazuje gubitak težine od 8,6%, što je u dobrom skladu sa sadržajem ugljika (6,35%), budući da ligandi sadrže ne samo C, već i N, O i H.
Ligand fenilmaleimid-metilvinil izocijanat odabran je za modificiranje površine čestica silicijum dioksida zbog svojih polarnih fenilmaleimidnih i vinilizocijanatnih grupa. Vinil izocijanatne grupe mogu dalje reagirati sa stirenom putem žive radikalne polimerizacije. Drugi razlog je umetanje grupe koja ima umjerene interakcije s analitom i nema jake elektrostatičke interakcije između analita i stacionarne faze, budući da fenilmaleimidni dio nema virtualni naboj pri normalnom pH. Polaritet stacionarne faze može se kontrolirati optimalnom količinom stirena i vremenom reakcije polimerizacije slobodnih radikala. Posljednji korak reakcije (polimerizacija slobodnih radikala) je kritičan jer mijenja polaritet stacionarne faze. Elementarna analiza provedena je kako bi se provjerio sadržaj ugljika u ovim stacionarnim fazama. Uočeno je da povećanje količine stirena i vremena reakcije povećava sadržaj ugljika u stacionarnoj fazi i obrnuto. SP pripremljeni s različitim koncentracijama stirena imaju različito opterećenje ugljikom. Slično tome, ove stacionarne faze su stavljene na kolone od nehrđajućeg čelika i provjerene su njihove hromatografske karakteristike (selektivnost, rezolucija, vrijednost N2, itd.). Na osnovu ovih eksperimenata, odabran je optimizirani sastav za pripremu stacionarne faze PMP-a kako bi se osigurala kontrolirana polarnost i dobro zadržavanje analita.
PMP kolona je također procijenjena za analizu pet smjesa peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin) korištenjem kapaciteta mobilne faze 60/40 (v/v) ACN/voda (0,1% TFA) pri brzini protoka od 80 µl/min. Pod optimalnim uvjetima elucije (200.000 ploča/m²), broj teorijskih ploča (N) po koloni (100 × 1,8 mm) je 20.000 ± 100. Vrijednosti N za tri PMP kolone prikazane su u Tabeli 3, a kromatogrami su prikazani na Slici 5A. Brza analiza pri visokoj brzini protoka (700 µl/min) na PMP koloni, pet peptida eluirano u roku od jedne minute, odlična vrijednost N od 13.500 ± 330 po koloni (100 x 1,8 mm promjera), što je ekvivalentno 135.000 ploča/m (Slika 5B). Tri kolone iste veličine (unutrašnji promjer 100 x 1,8 mm) napunjene su s tri različite serije stacionarne faze PMP-a radi testiranja reproducibilnosti. Analiti su zabilježeni za svaku kolonu odvajanjem iste testne smjese na svakoj koloni korištenjem optimalnih uvjeta elucije, broja teorijskih ploča N i vremena zadržavanja. Podaci o reproducibilnosti za PMP kolone prikazani su u Tabeli 4. Reproducibilnost PMP kolone dobro se korelirala s vrlo niskim vrijednostima %RSD-a kao što je prikazano u Tabeli 3.
Razdvajanje peptidnih smjesa na PMP koloni (B) i Ascentis Express RP-Amide koloni (A), mobilna faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimenzije PMP kolone (100 x 1,8 mm un. prečnik), analiza. Redoslijed eluiranja spojeva: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (leucinska kiselina enkefalin).
PMP kolona (unutrašnji promjer 100 x 1,8 mm) je procijenjena za odvajanje tripsinskog hidrolizata humanog serumskog albumina pomoću HPLC-a. Kromatogram na Slici 6 pokazuje da su uzorci dobro odvojeni s vrlo dobrom rezolucijom. HSA otopine su analizirane korištenjem brzine protoka od 100 μl/min, mobilne faze acetonitril/voda 70/30 i 0,1% TFA. Cijepanje HSA je podijeljeno na 17 vrhova, kao što je prikazano na kromatogramu (Slika 6), što odgovara 17 peptida. Izračunate su efikasnosti odvajanja pojedinačnih vrhova od HSA hidrolizata, a vrijednosti su prikazane u Tabeli 5.
Triptični hidrolizati HSA su odvojeni na PMP koloni (unutrašnji prečnik 100 x 1,8 mm), brzina protoka (100 μl/min), mobilna faza 60/40 acetonitril/voda i 0,1% TFA.
gdje je L dužina kolone, η viskoznost mobilne faze, ΔP povratni pritisak kolone, a u linearna brzina mobilne faze. Propusnost PMP kolone bila je 2,5 × 10–14 m2, brzina protoka bila je 25 µl/min, korišten je ACN/voda omjera 60/40 v/v. Propusnost PMP kolone (ID 100 × 1,8 mm) bila je slična onoj iz naše prethodne studije Ref.34. Propusnost kolone ispunjene površinski poroznim česticama iznosi 1,7×10,6 µm, 2,5×10-14 m2 za čestice od 5 µm43. Stoga je propusnost PMP faze slična propusnosti čestica jezgro-ljuska veličine 5 μm.
gdje je Wx masa kolone napunjene hloroformom, Wy je masa kolone napunjene metanolom, a ρ je gustoća rastvarača. Gustoća metanola (ρ = 0,7866) i hloroforma (ρ = 1,484). Ukupna poroznost kolone čestica silicijum dioksida-C18 (100 × 1,8 mm ID)34 i naše prethodno proučavane kolone C18-urea31 bila je 0,63 odnosno 0,55. To znači da prisustvo liganada uree smanjuje propusnost stacionarne faze. S druge strane, ukupna poroznost PMP kolone (unutrašnji prečnik 100 × 1,8 mm) je 0,60. PMP kolone su manje propusne od kolona napunjenih česticama silicijum dioksida vezanim za C18 jer su u stacionarnim fazama tipa C18 ligandi C18 vezani za čestice silicijum dioksida u linearnim lancima, dok se u stacionarnim fazama tipa polistirena oko čestica formira relativno debeli polimer. sloj A. U tipičnom eksperimentu, poroznost kolone se izračunava na sljedeći način:
Na sl. 7A i B prikazani su Van Deemterovi dijagrami za PMP kolonu (unutarnji prečnik 100 x 1,8 mm) i Ascentis Express RP-Amide kolonu (unutarnji prečnik 100 x 1,8 mm) pod istim uslovima elucije, 60/40 ACN/H2O i 0,1% TFA od 20 µl/min do 800 µl/min na obje kolone. Minimalne HETP vrijednosti pri optimalnoj brzini protoka (80 µl/min) bile su 2,6 µm i 3,9 µm za PMP kolonu i Ascentis Express RP-Amide kolonu, respektivno. HETP vrijednosti pokazuju da je efikasnost separacije PMP kolone (unutarnji prečnik 100 x 1,8 mm) mnogo veća od efikasnosti komercijalno dostupne Ascentis Express RP-Amide kolone (unutarnji prečnik 100 x 1,8 mm). Van Deemterov grafikon na slici 7(A) pokazuje da smanjenje vrijednosti N nije značajno veće s povećanjem protoka u poređenju s našom prethodnom studijom. Veća efikasnost separacije PMP kolone (id 100 × 1,8 mm) u poređenju s Ascentis Express RP-Amide kolonom zasniva se na poboljšanom obliku i veličini čestica i sofisticiranom postupku pakovanja kolone koji se koristi u trenutnom radu34.
(A) Van Deemterov dijagram (HETP u odnosu na linearnu brzinu mobilne faze) dobijen na PMP koloni (unutarnji prečnik 100 x 1,8 mm) u 60/40 ACN/H2O sa 0,1% TFA. (B) Van Deemterov dijagram (HETP u odnosu na linearnu brzinu mobilne faze) dobijen na Ascentis Express RP-Amide koloni (unutarnji prečnik 100 x 1,8 mm) u 60/40 ACN/H2O sa 0,1% TFA.
Polarna stacionarna faza interkaliranog polistirena pripremljena je i procijenjena za odvajanje smjese sintetičkih peptida i triptinskog hidrolizata humanog serumskog albumina (HSA) u tečnoj hromatografiji visokih performansi. Kromatografske performanse PMP kolona za smjese peptida su odlične u smislu efikasnosti odvajanja i rezolucije. Poboljšana efikasnost odvajanja PMP kolona je posljedica nekoliko razloga, kao što su veličina čestica silicijum dioksida i veličina pora, kontrolirana sinteza stacionarnih faza i složeni materijali za pakovanje kolone. Pored visoke efikasnosti odvajanja, još jedna prednost ove stacionarne faze je nizak povratni pritisak u koloni pri visokim brzinama protoka. PMP kolone su visoko reproducibilne i mogu se koristiti za analizu smjesa peptida i triptinsku digestiju različitih proteina. Namjeravamo koristiti ovu kolonu za odvajanje bioaktivnih spojeva od prirodnih proizvoda, ekstrakata ljekovitog bilja i gljiva u tečnoj hromatografiji. U budućnosti će se PMP kolone također procijeniti za odvajanje proteina i monoklonskih antitijela.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Istraživanje sistema za odvajanje peptida reverzno-faznom hromatografijom, dio I: Razvoj protokola za karakterizaciju kolone. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Istraživanje sistema za odvajanje peptida reverzno-faznom hromatografijom, dio I: Razvoj protokola za karakterizaciju kolone.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. i Petersson, P. Istraživanje sistema za odvajanje peptida reverzno-faznom hromatografijom, Dio I: Razvoj protokola za karakterizaciju kolone. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Istraživanje sistema za odvajanje peptida reverzno-faznom hromatografijom, dio I: Razvoj protokola za karakteristike kolone. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Istraživanje sistema za odvajanje peptida reverzno-faznom hromatografijom, dio I: Razvoj protokola za karakteristike kolone.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. i Petersson, P. Istraživanje sistema za odvajanje peptida reverzno-faznom hromatografijom, Dio I: Razvoj protokola za karakterizaciju kolone.J.色谱法。 1603, 113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. i dr. Metode za stvaranje poboljšanih aktivnih peptida za liječenje zaraznih bolesti. Biotehnologija. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetički terapijski peptidi: Nauka i tržište. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetički terapijski peptidi: Nauka i tržište.Vliege P, Lisowski V, Martinez J i Chreschatyski M. Sintetički terapijski peptidi: nauka i tržište.Vliege P, Lisowski V, Martinez J i Khreschatsky M. Sintetički terapijski peptidi: nauka i tržište. Otkriće lijekova. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Napredna proteomska tečna hromatografija. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Napredna proteomska tečna hromatografija.Vidi F., Smith RD i Shen Yu. Napredna proteomska tečna hromatografija. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Napredni sastav proteina 液相色谱。Vidi F., Smith RD i Shen Yu. Napredna proteomska tečna hromatografija.J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. i dr. Napredna tečna hromatografija-masena spektrometrija može kombinovati široko zasnovanu metabolomiku i proteomiku. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM i Salisbury, JJ Uloga UHPLC-a u farmaceutskom razvoju. Chesnut, SM i Salisbury, JJ Uloga UHPLC-a u farmaceutskom razvoju.Chesnut, SM i Salisbury, JJ Uloga UHPLC-a u farmaceutskom razvoju.Chesnut, SM i Salisbury, JJ Uloga UHPLC-a u razvoju lijekova. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentalni i praktični aspekti tečne hromatografije ultravisokog pritiska za brza odvajanja. Wu, N. & Clausen, AM Fundamentalni i praktični aspekti tečne hromatografije ultravisokog pritiska za brza odvajanja.Wu, N. i Clausen, AM Fundamentalni i praktični aspekti tečne hromatografije visokog pritiska za brzo odvajanje. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Osnovni i praktični aspekti tečne hromatografije ultravisokog pritiska za brzo odvajanje.Wu, N. i Clausen, AM Fundamentalni i praktični aspekti tečne hromatografije visokog pritiska za brzo odvajanje.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA i Tchelitcheff, P. Upotreba ultra-performansne tečne hromatografije u farmaceutskom razvoju. Wren, SA i Tchelitcheff, P. Upotreba ultra-performansne tečne hromatografije u farmaceutskom razvoju.Ren, SA i Chelischeff, P. Upotreba tečne hromatografije ultra visokih performansi u farmaceutskom razvoju. Wren, SA & Tchelicheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA i Tchelitcheff, P.Ren, SA i Chelischeff, P. Primjena ultra-performansne tečne hromatografije u razvoju lijekova.J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. i dr. Monolitni makroporozni hidrogel izveden iz emulzije ulja u vodi s visokom unutrašnjom fazom za efikasno prečišćavanje enterovirusa 71. Hemijski projekat. Časopis 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA Uloga tečne hromatografije u proteomici. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA Uloga tečne hromatografije u proteomici.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. i Wilkins, JA Uloga tečne hromatografije u proteomici. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. i Wilkins, JA Uloga tečne hromatografije u proteomici.J. Chromatography. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Novi trendovi u separacijama terapeutskih peptida i proteina reverzno-faznom tečnom hromatografijom: Teorija i primjene. & Guillarme, D. Novi trendovi u separacijama terapeutskih peptida i proteina reverzno-faznom tečnom hromatografijom: Teorija i primjene. & Guillarme, D. Nove tendencije u podjelu terapeutskih peptida i bjelančevina uz pomoć židkostne hromatografije s obraćenom fazom: teorijom i dodacima. & Guillarme, D. Novi trendovi u odvajanju terapijskih peptida i proteina pomoću tečne hromatografije reverzne faze: teorija i primjena. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.i Guillarmé, D. Novi trendovi u odvajanju terapijskih peptida i proteina pomoću tečne hromatografije reverzne faze: teorija i primjena.Časopis za farmaciju. Biomedicinske nauke. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dvodimenzionalno odvajanje peptida korištenjem RP-RP-HPLC sistema s različitim pH u prvoj i drugoj dimenziji odvajanja. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dvodimenzionalno odvajanje peptida korištenjem RP-RP-HPLC sistema s različitim pH u prvoj i drugoj dimenziji odvajanja.Gilar M., Olivova P., Dali AE i Gebler JK Dvodimenzionalno odvajanje peptida korištenjem RP-RP-HPLC sistema s različitim pH u prvoj i drugoj dimenziji odvajanja.Gilar M., Olivova P., Dali AE i Gebler JK Dvodimenzionalno odvajanje peptida korištenjem različitih pH vrijednosti u prvoj i drugoj dimenziji separacije korištenjem RP-RP-HPLC sistema. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. i dr. Istraživanje prijenosa mase i kinetičkih karakteristika kolona visokoučinkovite hromatografije napunjenih potpuno poroznim i površinski poroznim C18 česticama manjim od 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. i dr. Nedavni trendovi i analitički izazovi u izolaciji, identifikaciji i validaciji biljnih bioaktivnih peptida. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB i dr. Proteomski pejzaž carstva života. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. i dr. Naknadna obrada terapijskih peptida preparativnom tečnom hromatografijom. Molecules (Basel, Švicarska) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. i Geng, X. Mješovita hromatografija i njena primjena na biopolimere. Yang, Y. i Geng, X. Mješovita hromatografija i njena primjena na biopolimere.Yang, Yu. i Geng, X. Mješovita hromatografija i njena primjena na biopolimere. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. i Geng, X. Mješovita hromatografija i njena primjena u biopolimerima.Yang, Yu. i Gene, X. Mješovita hromatografija i njena primjena na biopolimere.J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).