Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз чектелген CSS колдоосу менен серепчи версиясын колдонуп жатасыз. Мыкты тажрыйба үчүн жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerдеги Шайкештик режимин өчүрүү). Мындан тышкары, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн биз сайтты стилсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Бир эле учурда үч слайддан турган каруселди көрсөтөт. Бир убакта үч слайд аркылуу өтүү үчүн Мурунку жана Кийинки баскычтарын колдонуңуз, же бир эле учурда үч слайд аркылуу өтүү үчүн аягындагы сыдырма баскычтарын колдонуңуз.
Кеңу тешиктүү бөлүкчөлөрдү алуу үчүн кээ бир модификациялар менен соль-гел ыкмасы менен кремнеземдин кеуектүү бөлүкчөлөрү даярдалган. Бул бөлүкчөлөр N-phenylmaleimide intercalated полиамиддерди өндүрүү үчүн тескери чынжыр которуу-фрагментациялоо (RAFT) полимерлештирүү аркылуу N-phenylmaleimide-метилвинил изоцианат (PMI) жана стирол менен туунду. Стирол (PMP) стационардык фазасы. Дат баспас болоттон жасалган кууш тештик мамычалар (ички диаметри 100 × 1,8 мм) шламды таңгак менен таңгакталган. PMP колоннасынын хроматографиялык көрсөткүчтөрү беш пептидден (Гли-Тир, Гли-Леу-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, Лей аминокислота enkephalin) жана адамдын триптикалык сериал альбомунун (Триптический альбумин гидролизин) турган синтетикалык пептиддердин аралашмасын бөлүү үчүн бааланган. Элюциянын оптималдуу шарттарында пептиддердин аралашмасы бар плиталардын теориялык саны 280 000 пластина/кв.мге жетти. Иштелип чыккан мамычанын бөлүү көрсөткүчтөрүн коммерциялык Ascentis Express RP-Amide мамычасы менен салыштырганда, PMP тилкесинин бөлүү эффективдүүлүгү, бөлүү эффективдүүлүгү жана чечүүчүлүгү боюнча коммерциялык мамычага караганда жогору экени байкалды.
Биофармацевтика өнөр жайы акыркы жылдары рыноктун үлүшүнүн олуттуу өсүшү менен кеңейип жаткан дүйнөлүк рынокко айланды. Биофармацевтикалык өнөр жайдын жарылуучу өсүшү менен1,2,3 пептиддик жана белок анализине чоң муктаждык бар. Максаттуу пептидден тышкары пептиддердин синтези учурунда ар кандай аралашмалар пайда болот, ошондуктан пептиддин керектүү тазалыгын алуу үчүн хроматографиялык тазалоо талап кылынат. Дене суюктуктарындагы, кыртыштардагы жана клеткалардагы протеиндердин анализи жана мүнөздөмөсү бир үлгүдө мүмкүн болуучу аныкталуучу түрлөрдүн көптүгүнө байланыштуу өтө татаал маселе. Масс-спектрометрия пептиддер менен протеиндерди секвенирлөөнүн эффективдүү куралы болгону менен, эгерде мындай үлгүлөр түздөн-түз масс-спектрометрге киргизилсе, бөлүү канааттандырарлык эмес болот. Бул маселени MS анализинин алдында суюк хроматографияны (ЛК) жүргүзүү менен чечүүгө болот, бул белгилүү бир убакытта масс-спектрометрге кирген аналиттердин санын азайтат4,5,6. Мындан тышкары, аналиттер суюк фазаны бөлүү учурунда тар аймакта топтолушу мүмкүн, ошону менен бул аналиттер топтолуп, MS аныктоонун сезгичтиги жогорулайт. Суюк хроматография (LC) акыркы он жылдын ичинде бир кыйла өнүккөн жана протеомикалык анализдин кеңири колдонулган ыкмасы болуп калды7,8,9,10.
Тескери фазалуу суюк хроматография (RP-LC) стационардык фаза катары октадецил-модификацияланган кремнеземди (ODS) колдонуу менен пептиддердин аралашмаларын тазалоо жана бөлүү үчүн кеңири колдонулат11,12,13. Бирок, татаал түзүлүшү жана амфотердик табиятынан улам 14,15 RP стационардык фазалары пептиддер менен белоктордун канааттандырарлык бөлүнүшүн камсыз кыла албайт. Ошондуктан, полярдуу жана полярдуу эмес фрагменттери бар пептиддерди жана белокторду талдоо бул аналиттерди16 өз ара аракеттенүү жана кармап туруу үчүн атайын иштелип чыккан стационардык фазаларды талап кылат. Мультимодалдык өз ара аракеттенүүнү сунуш кылган аралаш хроматография пептиддерди, белокторду жана башка татаал аралашмаларды бөлүү үчүн RP-LCге альтернатива боло алат. Бир нече аралаш типтеги стационардык фазалар даярдалган жана бул стационардык фазалар менен толтурулган мамычалар пептиддерди жана белокторду бөлүү үчүн колдонулган17,18,19,20,21. Полярдуу жана полярдуу эмес топтордун болушуна байланыштуу, аралаш режимдеги стационардык фазалар (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярдык интеркалация/RPLC) пептиддерди жана белокторду бөлүү үчүн ылайыктуу.22,23,24,25,26,27,28. , коваленттик байланыштагы полярдуу топтору бар полярдык интеркалацияланган стационардык фазалар жакшы бөлүү мүмкүнчүлүктөрүн жана полярдуу жана полярдуу эмес талдоочулар үчүн уникалдуу тандалма касиеттерин көрсөтөт, анткени бөлүү анализденүүчү зат менен стационардык фазанын ортосундагы өз ара аракеттенүүдөн көз каранды Мультимодалдык өз ара аракеттешүүлөр 29,30,31,32. Жакында Чжан жана башкалар. 30 полиаминдердин беенил-терминацияланган стационардык фазаларын алышты жана углеводороддорду, антидепрессанттарды, флавоноиддерди, нуклеозиддерди, эстрогендерди жана кээ бир башка анализдөөчүлөрдү ийгиликтүү ажыратышты. Полярдык орнотулган стационардык материалдын полярдуу жана полярдуу эмес топтору бар, ошондуктан ал пептиддерди жана протеиндерди гидрофобдук жана гидрофильдүү бөлүктөргө бөлүү үчүн колдонулушу мүмкүн. Полярдык сап мамычалары (мисалы, амиддик саптары бар C18 мамычалары) Ascentis Express RP-Amide мамычалары соода аталышы менен жеткиликтүү, бирок бул мамычалар амин 33 анализи үчүн гана колдонулган.
Учурдагы изилдөөдө, полярдык кыстаруу стационардык фазасы (N-фенилмалеимид, кыстаруу полистирол) даярдалган жана пептиддик бөлүү жана трипттик HSA бөлүү үчүн бааланган. Стационардык фазаны даярдоо үчүн төмөнкү стратегия колдонулган. Кеңири кремнезем бөлүкчөлөрү биздин мурунку басылмаларда сүрөттөлгөн жол-жоболор боюнча даярдалган, даярдоо схемаларында 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Карбамид, полиэтиленгликол (PEG), TMOS жана суу-уксус кислотасынын катышы кремнеземдин чоң бөлүкчөлөрүн алуу үчүн туураланган. Экинчиден, жаңы фенилмалеймид-метилвинил изоцианат лиганды синтезделди жана анын туунду кремнезем бөлүкчөлөрү полярдык камтылган стационардык фазаларды даярдоо үчүн колдонулган. Алынган стационардык фаза оптималдаштырылган таңгактоо схемасына ылайык дат баспас болоттон жасалган колонкага (ички диаметри 100 × 1,8 мм) таңгакталган. Колонканы таңгактоо колонканын ичинде бирдей катмарды камсыз кылуу үчүн механикалык титирөө менен жардам берет. Капталган колонна беш пептидден турган пептиддердин аралашмасын бөлүү үчүн бааланган (Гли-Тир, Гли-Леу-Тир, Гли-Гли-Тыр-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, лейцин-энкефалин пептид). жана адамдын кан сары суусунун альбумининин триптикалык гидролизаттары (HSA). Бул пептид аралашмасы жана HSA триптикалык дайджест жакшы чечим жана натыйжалуулук менен бөлүнгөнү байкалды. PMP мамычасынын бөлүү эффективдүүлүгү Ascentis Express RP-Amide тилкеси менен салыштырылган. Пептиддердин жана протеиндердин PMP тилкесинде жакшы чечүүчүлүгү жана жогорку бөлүү эффективдүүлүгү байкалды, ал эми PMP мамычасынын бөлүү эффективдүүлүгү Ascentis Express RP-Amide мамычасына караганда жогору.
PEG (полиэтиленгликол), мочевина, уксус кислотасы, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлоросилан (TMCS), трипсин, адамдын кан сары суусу альбумини (HSA), аммоний хлориди, мочевина, гексаметилметакрилодисилазан (HMDS, метоксил), метхлор 4-гидрокси- TEMPO, бензоил перекиси (BPO), HPLC үчүн acetonitril (ACN), метанол, 2-пропанол жана ацетон. Sigma-Oldrich компаниясы (Сент-Луис, Миссури, АКШ).
Мочевина (8 г), полиэтиленгликол (8 г) жана 8 мл 0,01 N. уксус кислотасынын аралашмасы 10 мүнөт аралаштырылды жана музда муздатуу алдында ага 24 мл TMOS кошулду. Реакция аралашмасы 40°С температурада 6 саат, андан кийин 120°С температурада 8 саат дат баспас болоттон жасалган автоклавда ысытылды. Суу куюлуп, калдык 70°С температурада 12 саат кургатылган. Кургатылган жумшак блоктор 12 саат бою 550°С температурада меште жылмакай майдаланган жана кальциленген. Үч партия даярдалды жана бөлүкчөлөрдүн өлчөмдөрүнүн, тешикчелердин өлчөмүнүн жана бетинин аянтынын кайталанышын текшерүү үчүн мүнөздөлдү.
Полистрол чынжырлары үчүн полярдык топ жана стационардык фаза. даярдоо тартиби төмөндө сүрөттөлгөн.
N-фенилмалеймид (200 мг) жана метил винил изоцианат (100 мг) суусуз толуолдо эритилип, андан кийин фенилмалейминаттын (CPPM жана метилан) сополимерин алуу үчүн реакциялык колбага 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) кошулду. ) Аралашма 60°С температурада 3 саат ысытылган, чыпкаланган жана 40°С температурада 3 саат духовкада кургатылган.
Кургатылган кремний диоксиди бөлүкчөлөрү (2 г) кургак толуолдо (100 мл) дисперсацияланды, 500 мл тегерек түбү колбада 10 мүнөт аралаштырылды жана sonicated. PMCP (10 мг) толуолдо эриди жана кошумча воронка аркылуу реакциялык колбага тамчылатып кошулду. Аралашма 8 саат бою 100°С температурада рефлюкс менен сүзүлүп, ацетон менен жууп, 60°С температурада 3 саат кургатылган. Андан кийин, PMCP (100 г) менен байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрү толуолдо (200 мл) эриди жана ага катализатор катары 100 мкл дибутилтин дилураттын катышуусунда 4-гидрокси-ТЕМПО (2 мл) кошулду. Аралашма 50°С температурада 8 саат аралаштырылды, фильтрден өткөрүлдү жана 50°C температурада 3 саат кургады.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиди BPO (0,5 мл) жана TEMPO-PMCP (1,5 г) менен байланышкан кремний диоксиди бөлүкчөлөрү толуолдо диспергирленген жана азот менен тазаланган. Стиролдун полимеризациясы 100°С температурада 12 саат бою жүргүзүлдү. Алынган продукт метанол менен жууп, түнү 60°Cде кургатылган. Реакциянын жалпы схемасы 2-сүрөттө көрсөтүлгөн. бир .
Үлгүлөр 10-3 Торрдан аз калган басым алынганга чейин 1 саат бою 393 К дегазацияланган. P/P0 = 0,99 салыштырмалуу басымда адсорбцияланган N2 өлчөмү жалпы тешикчелердин көлөмүн аныктоо үчүн колдонулган. Таза жана лиганд менен байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрүнүн морфологиясы сканерлөөчү электрондук микроскоптун (Hitachi High Technologies, Токио, Япония) жардамы менен изилденген. Кургак үлгүлөр (таза кремний жана лиганд менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрү) көмүртек лентасын колдонуу менен алюминий таякчаларына жайгаштырылды. Алтын Q150T чачуу аппаратынын жардамы менен үлгүгө салынган жана үлгүгө калыңдыгы 5 нм Au катмары салынган. Бул төмөнкү чыңалуу процессинин эффективдүүлүгүн жакшыртат жана жакшы муздак чачууну камсыз кылат. Элементтик анализ Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 элементардык курамы анализаторунун жардамы менен жүргүзүлдү. Бөлүкчөлөрдүн өлчөмүн бөлүштүрүүнү алуу үчүн Малверн бөлүкчөлөрүнүн өлчөмү анализатору (Вустершир, Улуу Британия) Mastersizer 2000 колдонулган. Капталбаган кремнезем бөлүкчөлөрү жана лиганд менен байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрү (ар бири 5 мг) 5 мл изопропанолдо диспергирленген, 10 мүнөт ультрадыбыс менен иштетилген, 5 мүнөт козголуп, Mastersizer оптикалык отургучка коюлган. Термогравиметриялык анализ 30дан 800°Сге чейинки температура диапазонунда мүнөтүнө 5°С ылдамдыкта жүргүзүлөт.
Өлчөмдөрү (ID 100 × 1,8 мм) менен айнек була менен капталган кууш дат баспас болоттон жасалган мамычалар 31-маалыматтагыдай эле жол-жобосу боюнча суспензия толтуруу ыкмасы менен таңгакталган. Дат баспас болоттон жасалган колонка (айнек капталган, ID 100 × 1,8 мм) жана 1 мкм фритти камтыган розетка (ILA, Techfields, ILA Packaging Machines менен туташтырылган) АКШ). 150 мг стационардык фазаны 1,2 мл метанолго суспензиялоо жана резервуар колоннасына берүү аркылуу стационардык фазанын суспензиясын даярдаңыз. Метанол суюктук эриткич жана контролдоочу эриткич катары колдонулган. 10 мүнөткө 100 МП, 15 мүнөткө 80 МП жана 30 мүнөткө 60 МП басым ырааттуулугун колдонуу менен мамычаны пакеттеңиз. Таңгактоо процессинде колонканы бирдей таңгактоо үчүн механикалык титирөө үчүн эки газ хроматографиялык колонна вибратору (Alltech, Deerfield, IL, USA) колдонулган. Шламды таңгычты жаап, жипке зыян келтирбөө үчүн басымды акырын бошотуңуз. Колонна шламды соплодон ажыратылды жана анын иштешин текшерүү үчүн киришке башка арматура орнотулду жана LC тутумуна кошулду.
Ыңгайлаштырылган MLC LC насосу (10AD Shimadzu, Япония), 50 nL сайынуу цикли менен үлгү алуучу (Valco (АКШ) C14 W.05), мембраналык дегазатор (Shimadzu DGU-14A) жана UV-VIS капилляр терезеси аркылуу курулган. Детектор аппараты (УВ-2075) жана эмалдалган микроколонна. Кошумча мамычаларды кеңейтүүнүн таасирин азайтуу үчүн өтө тар жана кыска туташтыруучу түтүктөрдү колдонуңуз. Колонканы толтургандан кийин, капиллярды (50 μm id 365) 1/16″ редукциялоочу түйүнүнүн чыгышына орнотуңуз жана редукциялоочу түйүнүнүн капиллярын (50 мкм) орнотуңуз. Маалыматтарды чогултуу жана хроматограмманы иштетүү Multichro 2000 программалык камсыздоону колдонуу менен ишке ашырылат. 254 нмде, субъекттердин аналитиктеринин UV жутуусу 0дө көзөмөлдөндү. Хроматографиялык маалыматтар OriginPro8 (Нортхэмптон, MA) аркылуу талданды.
Адамдын сывороткасы альбумин, лиофилизацияланган порошок, ≥ 96% (агароздук гел электрофорез) 3 мг трипсин (1,5 мг), 4,0 М мочевина (1 мл) жана 0,2 М аммоний бикарбонаты (1 мл) менен аралаштырылган. Эритме 10 мүнөт аралаштырылды жана 37°С суу ваннасында 6 саат кармалып, андан кийин 1 мл 0,1% ТФА менен өчүрүлдү. Эритмени чыпкалап, 4°Сден төмөн температурада сактаңыз.
PMP тилкесинде пептиддердин жана триптикалык дайджесттин HSA аралашмасын бөлүү өзүнчө бааланды. PMP мамычасы менен бөлүнгөн пептиддердин жана HSA аралашмасынын триптикалык гидролизин текшериңиз жана натыйжаларды Ascentis Express RP-Amide тилкеси менен салыштырыңыз. Теориялык плиталардын саны төмөнкү теңдемени колдонуу менен эсептелет:
Таза кремнезем бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд менен байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрүнүн SEM сүрөттөрү 2-сүрөттө көрсөтүлгөн. Таза кремнезем бөлүкчөлөрүнүн (A, B) SEM сүрөттөрү биздин мурунку изилдөөлөргө салыштырмалуу бөлүкчөлөр узартылган же туура эмес симметрияга ээ болгон сфералык форманы көрсөтөт. Лиганд (С, D) менен байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрүнүн бети таза кремний бөлүкчөлөрүнө караганда жылмакай, бул кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн бетин каптаган полистирол чынжырларынын эсебинен болушу мүмкүн.
Таза кремнезем бөлүкчөлөрүнүн (A, B) жана лиганд менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрүнүн (С, D) сканерлөөчү электрондук микросүрөттөрү.
Таза кремнезем бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд менен байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрдүн өлчөмү боюнча бөлүштүрүлүшү 2-сүрөттө көрсөтүлгөн. 3(А). Көлөмдүү бөлүкчөлөрдүн өлчөмүн бөлүштүрүү ийри кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн өлчөмү химиялык модификациядан кийин көбөйгөнүн көрсөттү (сүрөт 3A). Учурдагы изилдөө жана мурунку изилдөөдөн кремнеземдин бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүн бөлүштүрүү маалыматтары 1(А) таблицасында салыштырылган. Биздин мурунку изилдөөбүздө (полистирол менен байланышкан кремний диоксиди бөлүкчөлөрү) 3,05 мкм болгон ad(0,5) маанисине салыштырмалуу PMPдин көлөмдүк бөлүкчөлөрүнүн d(0,5) өлчөмү 3,36 мкм болгон. Реакция аралашмасындагы PEG, мочевина, TMOS жана уксус кислотасынын катышынын өзгөрүшүнө байланыштуу, бул партиянын бөлүкчөлөрүнүн көлөмү биздин мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу тар болду. PMP фазасынын бөлүкчөлөрүнүн көлөмү биз мурда изилдеген полистирол менен байланышкан кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн фазасынан бир аз чоңураак. Бул кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн стирол менен беттик функционализациясы кремнеземдин бетине полистирол катмарын гана (0,97 мкм) каптаганын билдирет, ал эми PMP фазасында катмардын калыңдыгы 1,38 мкм болгон.
Таза кремнезем бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд менен байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүн бөлүштүрүү (A) жана тешикчелердин өлчөмүн бөлүштүрүү (B).
Бул изилдөөдө колдонулган кремнезем бөлүкчөлөрүнүн тешикчелеринин өлчөмү, тешикчелердин көлөмү жана бетинин аянты 1-таблицада (B) көрсөтүлгөн. Таза кремний бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрүнүн PSD профилдери Fig. 3(B). Натыйжалар биздин мурунку изилдөөбүз менен салыштырууга болот34. Таза жана лиганд менен байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрүнүн тешикчелеринин өлчөмдөрү тиешелүүлүгүнө жараша 310 Å жана 241 Å болгон, бул химиялык модификациядан кийин 1-таблицада (B) көрсөтүлгөндөй, тешикчелердин өлчөмү 69 Å га азайгандыгын көрсөтүп турат, ал эми жылышуу ийри сызыгы сүрөттө көрсөтүлгөн. мурунку изилдөөбүз менен салыштырууга болот (124 м2/г). 1(В) таблицада көрсөтүлгөндөй, химиялык модификациядан кийин кремнезем бөлүкчөлөрүнүн бетинин аянты (м2/г) да 116 м2/гдан 105 м2/г чейин азайган.
Стационардык фазанын элементардык анализинин натыйжалары таблицада келтирилген. 2. Учурдагы стационардык фазадагы көмүртек 6,35%ды түзөт, бул биздин мурунку изилдөөбүзгө караганда төмөн (полистирол менен байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрү, тиешелүүлүгүнө жараша 7,93%35 жана 10,21%) 42. Төмөндө учурдагы стационардык фазадагы көмүртектин мазмуну, анткени кээ бир полярдык лиганддар, мисалы, фенилмалевинид (метилмалеимид) жана МПП. СП даярдоодо стиролдон тышкары 4-гидрокси-ТЕМПО колдонулган. Азыркы стационардык фазадагы азоттун салмагынын пайызы мурунку изилдөөлөрдөгү 0,1735 жана 0,85% салыштырганда 2,21%ды түзөт42. Бул азыркы стационардык фазада фенилмалеймиддин эсебинен азоттун жогорку салмактык пайызы бар дегенди билдирет. Ошо сыяктуу эле, продуктылар (4) жана (5) тиешелүүлүгүнө жараша 2,7% жана 2,9% көмүртектерге ээ, ал эми акыркы продукт (6) 2-таблицада көрсөтүлгөндөй, көмүртектин мазмуну 6,35% түзөт. Термогравиметриялык анализ (TGA) PMP стационардык фазасында арыктоо үчүн тестирлөө үчүн колдонулган, ал эми TGA ийри сызыгы салмактын азайышын көрсөтөт. 8,6%, бул көмүртектин курамына (6,35%) туура келет, анткени лиганддарда C гана эмес, N, O жана H да бар.
Лиганд фенилмалеимид-метилвинил изоцианат кремнезем бөлүкчөлөрүнүн бетин өзгөртүү үчүн тандалып алынган, анткени анын полярдуу фенилмалеймид жана винилизоцианат топтору бар. Vinyl изоцианат топтору андан ары тирүү радикалдык полимерлөө жолу менен стирол менен реакцияга киришет. Экинчи себеп - аналитик менен орточо өз ара аракеттешкен топту киргизүү жана аналит менен стационардык фазанын ортосунда күчтүү электростатикалык өз ара аракеттешүү жок, анткени фенилмалеймиддин бөлүгү нормалдуу рНда виртуалдык зарядга ээ эмес. Стационардык фазанын полярдуулугун стиролдун оптималдуу өлчөмү жана эркин радикал полимеризациясынын реакция убактысы менен башкарууга болот. Реакциянын акыркы баскычы (эркин радикалдык полимеризация) стационардык фазанын полярдуулугун өзгөрткөндүктөн, өтө маанилүү. Бул стационардык фазалардагы көмүртектин мазмунун текшерүү үчүн элементардык анализ жүргүзүлгөн. Стиролдун өлчөмүн жана реакция убактысын көбөйтүү стационардык фазадагы көмүртектин көлөмүн көбөйтө тургандыгы жана тескерисинче байкалган. Стиролдун ар кандай концентрациясы менен даярдалган СПлар ар кандай көмүртек жүктөмүнө ээ. Ошо сыяктуу эле, бул стационардык фазалар дат баспас болоттон жасалган мамыларга жайгаштырылып, алардын хроматографиялык мүнөздөмөлөрү (тандоочулук, чечүүчүлүк, N мааниси ж.б.) текшерилген. Бул эксперименттердин негизинде PMP стационардык фазасын даярдоо үчүн оптималдаштырылган композиция башкарылуучу полярдуулукту жана аналиттин жакшы кармалышын камсыз кылуу үчүн тандалган.
PMP колоннасы ошондой эле мобилдик фазанын кубаттуулугун колдонуу менен пептиддердин беш аралашмасын (Гли-Тир, Гли-Леу-Тир, Гли-Глы-Тыр-Арг, Тир-Иле-Глы-Сер-Арг, лейцин-энкефалин) анализдөө үчүн бааланган. 60/40 (v/v) ACN/суу (0,1% TFA) 80 мкл/мүнөттө. Оптималдуу элюция шарттарында (200 000 пластинка/м) бир мамычадагы теориялык плиталардын (N) саны (100 × 1,8 мм) 20 000 ± 100. Үч PMP мамычасынын N маанилери 3-таблицада жана хроматограммалар 5А-сүрөттө көрсөтүлгөн. PMP тилкесинде жогорку агым ылдамдыгында (700 мкл/мин) тез талдоо, бир мүнөттүн ичинде элюталанган беш пептид, ар бир мамычага 13,500 ± 330 (диаметри 100 х 1,8), 135,000 табак/м барабар (сүрөт 5B). Ошол эле өлчөмдөгү үч мамыча (ички диаметри 100 х 1,8 мм) кайра жаралуу мүмкүнчүлүгүн текшерүү үчүн PMP стационардык фазасынын үч түрдүү партиясы менен толтурулган. Аналиттер ар бир колонна үчүн оптималдуу элюция шарттарын, теориялык пластинкалардын саны N жана кармоо убактысын колдонуу менен ар бир колонкада бирдей сыноо аралашмасын бөлүү жолу менен жазылган. PMP мамычаларынын кайталануу маалыматтары 4-таблицада көрсөтүлгөн. PMP тилкесинин кайталануу мүмкүнчүлүгү 3-таблицада көрсөтүлгөндөй өтө төмөн %RSD маанилери менен жакшы корреляцияланган.
PMP тилкесинде (B) жана Ascentis Express RP-Amide мамычасында (A) пептиддик аралашмаларды бөлүү, мобилдик фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP мамычасынын өлчөмдөрү (100 x 1,8 мм id), анализ Кошулмалардын элюциялык тартиби: 1 (Гли-Тир), 2Тир (Глай) (Гли-Гли-Тыр-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) жана 5 (лейк кислотасы энкефалин).
PMP мамычасы (ички диаметри 100 х 1,8 мм) HPLC аркылуу адамдын сары суусунун альбумининин триптикалык гидролизатын бөлүү үчүн бааланган. 6-сүрөттөгү хроматограмма үлгүлөр абдан жакшы чечим менен жакшы бөлүнгөнүн көрсөтүп турат. HSA эритмелери 100 мкл/мүнөт, 70/30 ацетонитрил/суу жана 0,1% TFA кыймылдуу фазасын колдонуу менен талданды. HSAнын бөлүнүшү хроматограммада (6-сүрөт) көрсөтүлгөндөй, 17 пептидге туура келген 17 чокуга бөлүнгөн. HSA гидролизатынан айрым чокуларды бөлүү эффективдүүлүгү эсептелген жана баалуулуктар 5-таблицада көрсөтүлгөн.
HSA tryptic hydrolysates PMP мамыча (ички диаметри 100 х 1,8 мм), агымынын ылдамдыгы (100 мкл / мин), мобилдик фаза 60/40 acetonitril / суу жана 0,1% TFA боюнча бөлүнгөн.
мында L – мамычанын узундугу, η – кыймылдуу фазанын илешкектүүлүгү, ΔP – мамычанын арткы басымы, ал эми u – кыймылдуу фазанын сызыктуу ылдамдыгы. PMP мамычасынын өткөргүчтүгү 2,5 × 10–14 м2, агымынын ылдамдыгы 25 мкл/мин, 60/40 в/в колдонулган. ACN/суу. PMP мамычасынын өткөрүмдүүлүк (ID 100 × 1,8 мм) мурунку Ref.34 изилдөөбүзгө окшош болгон. Үстүртөн тешиктүү бөлүкчөлөр менен толтурулган колонканын өткөрүмдүүлүгү 1,7×10,6 мкм, 5 мкм бөлүкчөлөр үчүн 2,5×10-14 м243. Демек, PMP фазасынын өткөргүчтүгү 5 мкм өлчөмүндөгү өзөк-кабык бөлүкчөлөрүнүн өткөрүмдүүлүгүнө окшош.
мында Wx - хлороформ менен толтурулган колонканын массасы, Wy - метанол менен толтурулган колонканын массасы, ρ - эриткичтин тыгыздыгы. Метанолдун (ρ = 0,7866) жана хлороформдун (ρ = 1,484) тыгыздыгы. Кремний-C18 бөлүкчөлөр мамычасынын жалпы көзөнөктүүлүгү (100 × 1,8 мм ID)34 жана биздин мурда изилденген C18-карбамид31 мамычасы тиешелүүлүгүнө жараша 0,63 жана 0,55 болгон. Бул карбамид лиганддарынын болушу стационардык фазанын өткөрүмдүүлүгүн азайтат дегенди билдирет. Башка жагынан алганда, PMP мамычасынын жалпы көзөнөктүүлүгү (ички диаметри 100 × 1,8 мм) 0,60 түзөт. PMP мамычалары C18 менен байланышкан кремнезем бөлүкчөлөрү менен таңгакталган мамычаларга караганда өткөргүчтүгү азыраак, анткени C18 тибиндеги стационардык фазаларда C18 лиганддары кремнезем бөлүкчөлөрүнө сызыктуу чынжырлар менен кошулат, ал эми полистирол тибиндеги стационардык фазаларда бөлүкчөлөрдүн тегерегинде салыштырмалуу жоон полимер пайда болот. А катмары. Типтүү экспериментте мамычанын көзөнөктүүлүгү төмөнкүдөй эсептелет:
fig боюнча. 7A, B PMP тилкеси (id 100 x 1,8 мм) жана Ascentis Express RP-Amide мамычасы (id 100 x 1,8 мм) үчүн Ван Димтер графигин көрсөтөт, ошол эле элюция шарттарында, 60/40 ACN/H2O жана 0 .1% TFA 20 мкл/мин. 80 мкл/мин. Оптималдуу агым ылдамдыгында (80 мкл/мин) минималдуу HETP маанилери PMP тилкеси жана Ascentis Express RP-Amide тилкеси үчүн тиешелүүлүгүнө жараша 2,6 мкм жана 3,9 мкм болгон. HETP маанилери PMP мамычасынын (100 x 1,8 мм id) бөлүү натыйжалуулугу коммерциялык Ascentis Express RP-Amide мамычасына (100 x 1,8 мм id) караганда бир топ жогору экенин көрсөтүп турат. Van Deemter графиги 7(А) графиги N маанисинин азайышы биздин мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу агымдын көбөйүшү менен анча жогору эмес экенин көрсөтүп турат. Ascentis Express RP-Amide мамычасына салыштырмалуу PMP мамычасынын (id 100 × 1,8 мм) жогорку бөлүү эффективдүүлүгү жакшыртылган бөлүкчөлөрдүн формасына жана өлчөмүнө жана учурдагы иште колдонулган мамычаны таңгактоо процедурасынын татаалдыгына негизделген34.
(A) 0,1% TFA менен 60/40 ACN/H2O PMP мамычасында (id 100 x 1,8 мм) алынган Ван Димтер графиги (HETP vs. мобилдик фаза сызыктуу ылдамдыгы). (B) 0,1% TFA менен 60/40 ACN/H2O менен Ascentis Express RP-Amide мамычасында (id 100 x 1,8 мм) алынган Ван Димтер графиги (HETP менен мобилдик фаза сызыктуу ылдамдыгы).
Интеркалацияланган полистиролдун полярдык стационардык фазасы даярдалды жана синтетикалык пептиддердин аралашмасын жана адамдын сары суусунун альбумининин (HSA) триптикалык гидролизатын жогорку натыйжалуу суюк хроматографияда бөлүү үчүн бааланды. Пептиддик аралашмалар үчүн PMP мамычаларынын хроматографиялык көрсөткүчтөрү бөлүү натыйжалуулугу жана чечүүчүлүгү жагынан эң сонун. PMP мамычаларынын жакшыртылган бөлүү эффективдүүлүгү кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн өлчөмү жана тешикчелердин өлчөмү, стационардык фазалардын контролдонуучу синтези жана комплекстүү мамычаларды таңгактоочу материалдар сыяктуу бир нече себептерге байланыштуу. Жогорку бөлүү эффективдүүлүгүнөн тышкары, бул стационардык фазанын дагы бир артыкчылыгы - агымдын жогорку ылдамдыгында мамычанын арткы басымы. PMP мамычалары өтө кайталанууга жөндөмдүү жана пептиддердин аралашмаларын жана ар кандай протеиндердин триптикалык сиңирүүсүн талдоо үчүн колдонулушу мүмкүн. Биз бул колонканы суюк хроматографияда табигый продуктылардан, дары-дармек өсүмдүктөрүнүн жана козу карындардын экстракттарынан биоактивдүү кошулмаларды бөлүү үчүн колдонууну көздөп жатабыз. Келечекте, PMP мамычалары да белокторду жана моноклоналдык антителолорду бөлүү үчүн бааланат.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Reversed фазалык хроматография пептиддик бөлүү системаларын изилдөө I бөлүгү: мамычаларды мүнөздөө үчүн протоколду иштеп чыгуу. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Тергөө. Тескери фазалык хроматография пептиддик бөлүү системалары I бөлүгү: мамычанын мүнөздөмөлөрү үчүн протоколду иштеп чыгуу.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Peptide Separation Systems of Reverse-Phase Chromatography аркылуу изилдөө, I бөлүк: Колонналарды мүнөздөө үчүн протоколду иштеп чыгуу. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Тергөө. Тескери фазалык хроматография пептиддик бөлүү системалары I бөлүгү: мамычанын мүнөздөмөлөрү үчүн протоколду иштеп чыгуу. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Тергөө. Тескери фазалык хроматография пептиддик бөлүү системалары I бөлүгү: мамычанын мүнөздөмөлөрү үчүн протоколду иштеп чыгуу.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Peptide Separation Systems of Reverse-Phase Chromatography аркылуу изилдөө, I бөлүк: Колонналарды мүнөздөө үчүн протоколду иштеп чыгуу.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Гомес, Б. Жугуштуу ооруларды дарылоо үчүн жакшыртылган активдүү пептиддерди түзүү ыкмалары. Биотехнология. Жетишкендиктер 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Синтетикалык терапиялык пептиддер: Илим жана рынок. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Синтетикалык терапиялык пептиддер: Илим жана рынок.Vliege P, Lisowski V, Martinez J жана Chreschatyski M. Синтетикалык терапиялык пептиддер: илим жана рынок.Vliege P, Lisowski V, Martinez J жана Khreschatsky M. Синтетикалык терапиялык пептиддер: илим жана рынок. дары ачылышы. Бүгүн 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced протеомдук суюк хроматография. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced протеомдук суюк хроматография.Караңыз: Ф., Смит РД жана Шен Ю. Өркүндөтүлгөн протеомдук суюк хроматография. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced белок курамы 液相色谱。Караңыз: Ф., Смит РД жана Шен Ю. Өркүндөтүлгөн протеомдук суюк хроматография.J. Хроматография. A 1261, 78–90 (2012).
Лю, В. жана башкалар. Өркүндөтүлгөн суюк хроматография-масс-спектрометрия кеңири негизделген метаболомиканы жана протеомиканы айкалыштыра алат. анус. Чим. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Solsbury, JJ Фармацевтиканы өнүктүрүүдө UHPLCтин ролу. Chesnut, SM & Solsbury, JJ Фармацевтиканы өнүктүрүүдө UHPLCтин ролу.Чеснут, SM жана Солсбери, JJ UHPLCтин фармацевтиканы өнүктүрүүдөгү ролу.Чеснут, СМ жана Солсбери, Дж. Дж. УHPLCтин дарыларды иштеп чыгуудагы ролу. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM. Тез бөлүү үчүн өтө жогорку басымдагы суюк хроматографиянын фундаменталдык жана практикалык аспектилери. Wu, N. & Clausen, AM. Тез бөлүү үчүн өтө жогорку басымдагы суюк хроматографиянын фундаменталдык жана практикалык аспектилери.Ву, Н. жана Клаузен, AM Тез бөлүү үчүн жогорку басымдагы суюк хроматографиянын негизги жана практикалык аспектилери. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Тез бөлүү үчүн ультра жогорку басымдагы суюк хроматографиянын негизги жана практикалык аспектилери.Ву, Н. жана Клаузен, AM Тез бөлүү үчүн жогорку басымдагы суюк хроматографиянын негизги жана практикалык аспектилери.J. Сентябрь Илим. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelicheff, P. Фармацевтиканы өнүктүрүүдө ультра эффективдүү суюк хроматографияны колдонуу. Wren, SA & Tchelicheff, P. Фармацевтиканы өнүктүрүүдө ультра эффективдүү суюк хроматографияны колдонуу.Рен, SA жана Chelischeff, P. Фармацевтиканы өнүктүрүүдө ультра жогорку натыйжалуу суюк хроматографияны колдонуу. Wren, SA & Tchelicheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelicheff, P.Рен, SA жана Chelischeff, P. Дарыны иштеп чыгууда ультра натыйжалуу суюк хроматографияны колдонуу.J. Хроматография. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, H. жана башкалар. Энтеровирусту эффективдүү тазалоо үчүн жогорку ички фазасы бар суудагы май эмульсиясынан алынган монолиттүү макропороздуу гидрогель 71. Химиялык. долбоор. Журнал 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA протеомикада суюк хроматографиянын ролу. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA протеомикада суюк хроматографиянын ролу.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. жана Wilkins, JA протеомикада суюк хроматографиянын ролу. Ши, Ю., Сианг, Р., Хорват, С. & Уилкинс, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. & Уилкинс, Ж.АShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. жана Wilkins, JA протеомикада суюк хроматографиянын ролу.J. Хроматография. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вутей, Ж.-Л. & Guillarme, D. Терапевтикалык пептиддердин жана протеиндердин тескери фазалуу суюк хроматографиялык бөлүктөрүнүн жаңы тенденциялары: Теория жана колдонуу. & Guillarme, D. Терапевтикалык пептиддердин жана протеиндердин тескери фазалуу суюк хроматографиялык бөлүктөрүнүн жаңы тенденциялары: Теория жана колдонуу. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория жана приложения. & Guillarme, D. Терапевтикалык пептиддерди жана протеиндерди тескери фазалык суюк хроматография аркылуу бөлүүдө жаңы тенденциялар: теория жана колдонуу. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Гильярм, Д.жана Guillarmé, D. Терапевтикалык пептиддерди жана протеиндерди тескери фазалык суюк хроматография менен бөлүүдө жаңы тенденциялар: теория жана колдонуу.J. Pharm. Биомедициналык илим. анус. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC биринчи жана экинчи бөлүү өлчөмдөрү ар кандай рН менен RP-RP-HPLC системасын колдонуу менен пептиддердин эки өлчөмдүү бөлүү. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC биринчи жана экинчи бөлүү өлчөмдөрү ар кандай рН менен RP-RP-HPLC системасын колдонуу менен пептиддердин эки өлчөмдүү бөлүү.Gilar M., Olivova P., Dali AE жана Gebler JK. Биринчи жана экинчи бөлүү өлчөмдөрүндө ар кандай рН менен RP-RP-HPLC системасын колдонуу менен пептиддердин эки өлчөмдүү бөлүнүшү.Гилар М., Оливова П., Дали АЕ жана Геблер Дж.К. RP-RP-HPLC тутумун колдонуу менен биринчи жана экинчи бөлүү өлчөмдөрүндө ар кандай рН баалуулуктарын колдонуу менен пептиддердин эки өлчөмдүү бөлүнүшү. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Феллитти, С жана башкалар. 2 мкмден кичине толук көзөнөктүү жана үстүртөн тешиктүү C18 бөлүкчөлөрү менен таңгакталган жогорку натыйжалуу хроматография колонналарынын масса өткөрүмдүүлүгүн жана кинетикалык мүнөздөмөлөрүн изилдөө. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Пиовесана, С жана башкалар. Өсүмдүк биоактивдүү пептиддерин изоляциялоо, идентификациялоо жана валидациялоодогу акыркы тенденциялар жана аналитикалык кыйынчылыктар. анус. Жаратылыш анал. Химиялык. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Жашоо падышачылыгынын протеомикалык пейзажы. Жаратылыш 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
Де Лука, К. жана башкалар. Терапиялык пептиддерди препараттык суюк хроматография аркылуу дарылоодон кийинки. Молекулалар (Базель, Швейцария) 26(15), 4688 (2021).
Янг, Y. & Geng, X. Аралаш режимдеги хроматография жана анын биополимерлерге колдонулушу. Янг, Y. & Geng, X. Аралаш режимдеги хроматография жана анын биополимерлерге колдонулушу.Ян, Ю. жана Генг, X. Аралаш режимдеги хроматография жана аны биополимерлерге колдонуу. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Аралаш режимдеги хроматография жана анын биополимерлерде колдонулушу.Ян, Ю. жана ген, X. Аралаш режимдеги хроматография жана аны биополимерлерге колдонуу.J. Хроматография. A 1218(49), 8813–8825 (2011).