Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз CSS колдоосу чектелген браузер версиясын колдонуп жатасыз. Эң жакшы тажрыйба алуу үчүн, биз сизге жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде Шайкештик режимин өчүрүңүз). Мындан тышкары, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Бир эле учурда үч слайддын каруселин көрсөтөт. Бир убакта үч слайддын арасынан жылуу үчүн "Мурунку" жана "Кийинки" баскычтарын колдонуңуз же бир убакта үч слайддын арасынан жылуу үчүн аягындагы жылдыргыч баскычтарын колдонуңуз.
Кеуектүү кремний бөлүкчөлөрү кеңири тешиктүү бөлүкчөлөрдү алуу үчүн бир аз өзгөртүүлөр менен золь-гель ыкмасы менен даярдалган. Бул бөлүкчөлөр N-фенилмалеимид интеркалатталган полиамиддерди алуу үчүн тескери чынжырлуу которуу-фрагментациялоо (RAFT) полимеризациясы аркылуу N-фенилмалеимид жана стирол менен дериватташтырылган. Стирол (PMP) стационардык фазасы. Кууш диаметрлүү дат баспас болоттон жасалган мамычалар (ички диаметри 100 × 1,8 мм) суспензия таңгагы менен таңгакталган. PMP мамычасынын хроматографиялык көрсөткүчтөрү беш пептидден (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu аминокислотасы энкефалин) жана адамдын кан сары суусундагы альбуминдин (HAS) триптикалык гидролизатынан турган синтетикалык пептиддердин аралашмасын бөлүү үчүн бааланган. Оптималдуу элюция шарттарында пептиддердин аралашмасы бар пластиналардын теориялык саны 280 000 пластина/кв.м жеткен. Иштелип чыккан колоннанын бөлүү көрсөткүчтөрүн коммерциялык Ascentis Express RP-Amide колоннасы менен салыштырып көрсөк, PMP колоннасынын бөлүү эффективдүүлүгү бөлүү эффективдүүлүгү жана чечилиши жагынан коммерциялык колоннага караганда жогору экени байкалган.
Акыркы жылдары биофармацевтика тармагы рыноктук үлүшүнүн олуттуу өсүшү менен кеңейип жаткан дүйнөлүк рынокко айланды. Биофармацевтика тармагынын кескин өсүшү менен1,2,3 пептиддик жана белоктук анализге чоң муктаждык бар. Максаттуу пептидден тышкары, пептиддик синтез учурунда ар кандай кошулмалар пайда болот, ошондуктан пептиддин каалаган тазалыгын алуу үчүн хроматографиялык тазалоо талап кылынат. Бир үлгүдө потенциалдуу түрдө аныкталуучу түрлөрдүн көптүгүнөн улам дене суюктуктарындагы, ткандардагы жана клеткалардагы белокторду талдоо жана мүнөздөө өтө татаал милдет болуп саналат. Массалык спектрометрия пептиддерди жана белокторду секвенирлөө үчүн натыйжалуу курал болгону менен, эгерде мындай үлгүлөр массалык спектрометрге түз киргизилсе, бөлүү канааттандырарлык болбойт. Бул көйгөйдү MS анализинин алдында суюк хроматографияны (СУ) жүргүзүү менен чечүүгө болот, бул белгилүү бир убакта массалык спектрометрге кирген аналиттердин көлөмүн азайтат4,5,6. Мындан тышкары, аналиттер суюк фазаны бөлүү учурунда тар аймакта топтолушу мүмкүн, ошону менен бул аналиттерди топтоштуруп, MS аныктоонун сезгичтигин жогорулатат. Суюк хроматография (СУХ) акыркы он жылдыкта бир топ өнүктү жана протеомдук анализ үчүн кеңири колдонулган ыкмага айланды7,8,9,10.
Тескери фазалуу суюк хроматография (RP-LC) стационардык фаза катары октадецил-модификацияланган кремнийди (ODS) колдонуу менен пептиддердин аралашмаларын тазалоо жана бөлүү үчүн кеңири колдонулат11,12,13. Бирок, алардын татаал түзүлүшүнө жана амфотерикалык мүнөзүнө байланыштуу14,15 RP стационардык фазалары пептиддерди жана белокторду канааттандырарлык бөлүүнү камсыз кыла албайт. Ошондуктан, полярдык жана полярдык эмес фрагменттери бар пептиддерди жана белокторду анализдөө бул аналиттерди өз ара аракеттенүү жана сактоо үчүн атайын иштелип чыккан стационардык фазаларды талап кылат16. Мультимодалдык өз ара аракеттенүүнү сунуш кылган аралаш хроматография пептиддерди, белокторду жана башка татаал аралашмаларды бөлүү үчүн RP-LCге альтернатива боло алат. Бир нече аралаш типтеги стационардык фазалар даярдалган жана бул стационардык фазалар менен толтурулган колонкалар пептиддерди жана белокторду бөлүү үчүн колдонулган17,18,19,20,21. Полярдык жана полярдык эмес топтордун болушунан улам, аралаш режимдеги стационардык фазалар (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярдык интеркаляция/RPLC) пептиддерди жана белокторду бөлүү үчүн ылайыктуу22,23,24,25,26,27,28. , коваленттик байланышы бар полярдык топтору бар полярдык интеркаляцияланган стационардык фазалар полярдык жана полярдык эмес аналиттер үчүн жакшы бөлүү мүмкүнчүлүктөрүн жана уникалдуу селективдүүлүктү көрсөтөт, анткени бөлүү аналит менен стационардык фазанын ортосундагы өз ара аракеттенүүгө көз каранды. Көп модалдык өз ара аракеттенүүлөр 29,30,31,32. Жакында эле Чжан жана башкалар 30 полиаминдердин бегенил менен аяктаган стационардык фазаларын алып, углеводороддорду, антидепрессанттарды, флавоноиддерди, нуклеозиддерди, эстрогендерди жана башка кээ бир аналиттерди ийгиликтүү бөлүп алышкан. Полярдык камтылган стационардык материал полярдык жана полярдык эмес топторго ээ, ошондуктан аны пептиддерди жана белокторду гидрофобдук жана гидрофилдик бөлүктөргө бөлүү үчүн колдонсо болот. Полярдык сызыктуу мамычалар (мисалы, амид сызыгы бар C18 мамычалары) Ascentis Express RP-Amide мамычалары соода аталышы астында жеткиликтүү, бирок бул мамычалар 33 аминин анализдөө үчүн гана колдонулган.
Учурдагы изилдөөдө полярдык жайгаштыруу стационардык фазасы (N-фенилмалеимид, жайгаштыруу полистирол) даярдалып, пептиддерди бөлүү жана триптикалык HSA бөлүнүшү үчүн бааланган. Стационардык фазаны даярдоо үчүн төмөнкү стратегия колдонулган. Кеуектүү кремний бөлүкчөлөрү мурунку басылмаларыбызда сүрөттөлгөн процедураларга ылайык даярдалган, даярдоо схемаларында 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 айрым өзгөртүүлөр киргизилген. Чоң тешикчелүү кремний бөлүкчөлөрүн алуу үчүн мочевинанын, полиэтиленгликолдун (PEG), TMOSтун жана суу-уксус кислотасынын катышы туураланган. Экинчиден, жаңы фенилмалеимид-метилвинилизоцианат лиганд синтезделип, анын туунду кремний бөлүкчөлөрү полярдык жайгаштыруу стационардык фазаларын даярдоо үчүн колдонулган. Алынган стационардык фаза оптималдаштырылган жайгаштыруу схемасына ылайык дат баспас болоттон жасалган колоннага (ички диаметри 100 × 1,8 мм) жайгаштырылган. Колоннанын жайгаштырылышына колоннанын ичинде бирдей катмарды камсыз кылуу үчүн механикалык титирөө жардам берет. Таңгакталган колонка беш пептидден (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин пептиди) жана адамдын кан сары суусундагы альбуминдин (HSA) триптикалык гидролизаттарынан турган пептиддердин аралашмасын бөлүү үчүн бааланган. Пептиддик аралашма жана HSA триптикалык дайджести жакшы чечилиште жана натыйжалуулукта бөлүнгөнү байкалган. PMP колонкасынын бөлүү натыйжалуулугу Ascentis Express RP-Amide колонкасынын бөлүү натыйжалуулугу менен салыштырылган. Пептиддер менен белоктордун PMP колонкасында жакшы чечилиште жана жогорку ажыратуу натыйжалуулугуна ээ экени жана PMP колонкасынын бөлүү натыйжалуулугу Ascentis Express RP-Amide колонкасыныкынан жогору экени байкалган.
PEG (полиэтиленгликоль), мочевина, уксус кислотасы, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трипсин, адамдын кан сары суусундагы альбумин (HSA), аммоний хлориди, мочевина, гексаметилметакрилойлдисилазан (HMDS), метакрилойлхлорид (MC), стирол, 4-гидрокси-TEMPO, бензоил пероксиди (BPO), HPLC үчүн ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол жана ацетон. Sigma-Aldrich компаниясы (Сент-Луис, Миссури, АКШ).
Мочевина (8 г), полиэтиленгликоль (8 г) жана 8 мл 0,01 Н уксус кислотасынын аралашмасы 10 мүнөт аралаштырылып, ага муздаткычта 24 мл TMOS кошулган. Реакциялык аралашма дат баспас болоттон жасалган автоклавда 40°C температурада 6 саат, андан кийин 120°C температурада 8 саат ысытылган. Суу декантталган жана калдык 70°C температурада 12 саат кургатылган. Кургатылган жумшак блоктор жылмакай майдаланып, 550°C температурадагы меште 12 саат бою күйдүрүлгөн. Бөлүкчөлөрдүн өлчөмдөрүнүн, тешикчелердин өлчөмүнүн жана беттик аянтынын кайталанышын текшерүү үчүн үч партия даярдалып, мүнөздөмө берилген.
Полистирол чынжырлары үчүн полярдык топ жана стационардык фаза. Даярдоо процедурасы төмөндө баяндалган.
N-фенилмалеимид (200 мг) жана метилвинил изоцианат (100 мг) суусуз толуолдо эритилип, андан кийин фенилмалеимид менен метилвинил изоцианаттын (PMCP) сополимерин алуу үчүн реакция колбасына 0,1 мл 2,2′-азоиизобутиронитрил (AIBN) кошулган. Аралашма 60°C температурада 3 саат ысытылып, чыпкаланып, 40°C температурада меште 3 саат кургатылган.
Кургатылган кремний кычкылынын бөлүкчөлөрү (2 г) кургак толуолго (100 мл) таркатылып, аралаштырылып, 500 мл тегерек түбүндөгү колбада 10 мүнөт ультраүн менен иштетилген. PMCP (10 мг) толуолдо эритилип, кошумча воронка аркылуу реакция колбасына тамчылатып кошулган. Аралашма 100°C температурада 8 саат бою кайра люксталган, чыпкаланган, ацетон менен жуулган жана 60°C температурада 3 саат кургатылган. Андан кийин, PMCP (100 г) менен байланышкан кремний кычкылынын бөлүкчөлөрү толуолдо (200 мл) эритилип, ага катализатор катары 100 мкл дибутилтин дилауратынын катышуусунда 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) кошулган. Аралашма 50°C температурада 8 саат бою аралаштырылган, чыпкаланган жана 50°C температурада 3 саат бою кургатылган.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиди BPO (0,5 мл) жана TEMPO-PMCPге (1,5 г) бекитилген кремний бөлүкчөлөрү толуолдо дисперстелип, азот менен тазаланышкан. Стиролдун полимерлениши 100°C температурада 12 саат бою жүргүзүлгөн. Алынган продукт метанол менен жуулуп, 60°C температурада түнү бою кургатылган. Реакциянын жалпы схемасы 1-сүрөттө көрсөтүлгөн.
Үлгүлөр 10–3 Торрдон аз калдык басым алынганга чейин 393 К температурада 1 саат бою дегазацияланган. Жалпы тешикчелердин көлөмүн аныктоо үчүн P/P0 = 0,99 салыштырмалуу басымда адсорбцияланган N2 көлөмү колдонулган. Таза жана лиганд менен байланышкан кремний диоксиди бөлүкчөлөрүнүн морфологиясы сканерлөөчү электрондук микроскоп (Hitachi High Technologies, Токио, Япония) аркылуу изилденген. Кургак үлгүлөр (таза кремний диоксиди жана лиганд менен байланышкан кремний диоксиди бөлүкчөлөрү) көмүртек лентасын колдонуп алюминий таякчаларына жайгаштырылган. Q150T чачыраткыч түзүлүшүн колдонуп, үлгүгө алтын чөктүрүлгөн, ал эми үлгүгө 5 нм калыңдыктагы Au катмары чөктүрүлгөн. Бул төмөнкү чыңалуудагы процесстин натыйжалуулугун жогорулатат жана майда муздак чачыратууну камсыз кылат. Элементтик анализ Thermo Electron (Waltham, MA, АКШ) Flash EA1112 элементтик курам анализаторун колдонуу менен жүргүзүлдү. Бөлүкчөлөрдүн өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшүн алуу үчүн Malvern бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүн анализатор (Worcestershire, Улуу Британия) Mastersizer 2000 колдонулган. Капталбаган кремний бөлүкчөлөрү жана лиганд менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрү (ар бири 5 мг) 5 мл изопропанолго эритилип, 10 мүнөт ультраүн менен иштетилип, 5 мүнөт аралаштырылып, Mastersizer оптикалык стендине коюлду. Термогравиметриялык анализ 30дан 800 °Cге чейинки температура диапазонунда мүнөтүнө 5 °C ылдамдыкта жүргүзүлөт.
Айнек буласы менен капталган кууш диаметрлүү дат баспас болоттон жасалган мамычалар (ID 100 × 1,8 мм) 31-шилтемедегидей эле процедураны аткаруу менен суспензияны толтуруу ыкмасы менен таңгакталган. Дат баспас болоттон жасалган мамычалар (айнек менен капталган, ID 100 × 1,8 мм) жана 1 мкм фритти камтыган чыгуучу жер суспензияны таңгактоочу машинага (Alltech Deerfield, IL, АКШ) туташтырылган. Стационардык фазанын суспензиясын 1,2 мл метанолго 150 мг стационардык фазаны суспензиялап, аны резервуар мамычага куюу менен даярдаңыз. Метанол суспензия эриткичи жана башкаруу эриткичи катары колдонулган. Мамыча 10 мүнөткө 100 МП, 15 мүнөткө 80 МП жана 30 мүнөткө 60 МП басым ырааттуулугун колдонуу менен таңгакталган. Таңгактоо процессинде мамычанын бирдей таңгагын камсыз кылуу үчүн механикалык термелүү үчүн эки газ хроматография мамычасы вибратору (Alltech, Deerfield, IL, АКШ) колдонулган. Шлам таңгактоочуну жаап, жиптин бузулушуна жол бербөө үчүн басымды жай бошотуңуз. Колонка шламдын соплосунан ажыратылып, анын иштешин текшерүү үчүн кирүүчү жерге дагы бир фитинг бекитилип, LC системасына туташтырылган.
LC насосу (10AD Shimadzu, Япония), 50 нл инжекциялык цикли бар үлгү алгыч (Valco (АКШ) C14 W.05), мембраналык дегазатор (Shimadzu DGU-14A) жана UV-VIS капиллярдык терезеси колдонулуп, заказ боюнча MLC курулган. Детектордук түзүлүш (UV-2075) жана эмаль менен капталган микроколонна. Кошумча тилкенин кеңейишинин таасирин минималдаштыруу үчүн өтө кууш жана кыска туташтыруучу түтүктөрдү колдонуңуз. Колоннаны толтургандан кийин, 1/16 дюймдук калыбына келтирүүчү түйүндүн чыгышына капиллярды (50 мкм id 365) орнотуп, калыбына келтирүүчү түйүндүн капиллярын (50 мкм) орнотуңуз. Маалыматтарды чогултуу жана хроматограмманы иштетүү Multichro 2000 программалык камсыздоосу аркылуу жүргүзүлөт. 254 нмде талдануучулардын UV сиңирүүсү 0до көзөмөлдөнгөн. Хроматографиялык маалыматтар OriginPro8 (Нортгемптон, MA) аркылуу талданган.
Адамдын кан сары суусундагы альбумин, лиофилизацияланган порошок, ≥ 96% (агароза гелинин электрофорези) 3 мг трипсин (1,5 мг), 4,0 М мочевина (1 мл) жана 0,2 М аммоний бикарбонаты (1 мл) менен аралаштырылган. Эритме 10 мүнөт аралаштырылып, 37°C температурадагы суу мончосунда 6 саат кармалып, андан кийин 1 мл 0,1% TFA менен чыңалган. Эритмени чыпкалап, 4°C төмөн температурада сактаңыз.
ПМП колонкасында пептиддердин жана триптикалык дайджест HSA аралашмасын бөлүү өзүнчө бааланган. ПМП колонкасы менен бөлүнгөн пептиддердин жана HSA аралашмасынын триптикалык гидролизин текшерип, жыйынтыктарды Ascentis Express RP-Amide колонкасы менен салыштырыңыз. Теориялык пластиналардын саны төмөнкү теңдемени колдонуу менен эсептелет:
Таза кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд менен байланышкан кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн SEM сүрөттөрү 2-сүрөттө көрсөтүлгөн. Таза кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн (A, B) SEM сүрөттөрү мурунку изилдөөлөрүбүзгө салыштырмалуу бөлүкчөлөр узун же туура эмес симметрияга ээ болгон тоголок форманы көрсөтөт. Лиганд (C, D) менен байланышкан кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн бети таза кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнө караганда жылмакай, бул кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн бетин каптаган полистирол чынжырларына байланыштуу болушу мүмкүн.
Таза кремний бөлүкчөлөрүнүн (A, B) жана лиганд менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрүнүн (C, D) сканерлөөчү электрондук микросүрөттөрү.
Таза кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд менен байланышкан кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшү 2-сүрөттүн 3(A) бөлүгүндө көрсөтүлгөн. Көлөмдүк бөлүкчөлөрдүн өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшүнүн ийри сызыктары химиялык модификациядан кийин кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн өлчөмү көбөйгөнүн көрсөттү (3A-сүрөт). Учурдагы изилдөөнүн жана мурунку изилдөөнүн кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшүнүн маалыматтары 1(A) таблицасында салыштырылган. PMPнин көлөмдүк бөлүкчөлөрүнүн өлчөмү d(0.5) 3,36 мкмди түздү, бул биздин мурунку изилдөөбүздөгү ad(0.5) мааниси 3,05 мкм (полистирол менен байланышкан кремний диоксидинин бөлүкчөлөрү)34. Реакция аралашмасындагы PEG, мочевина, TMOS жана уксус кислотасынын катышынын өзгөрүшүнөн улам, бул партиянын бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшү мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу кууш болгон. PMP фазасынын бөлүкчөлөрүнүн өлчөмү биз мурда изилдеген полистирол менен байланышкан кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн фазасына караганда бир аз чоңураак. Бул кремний бөлүкчөлөрүнүн стирол менен беттик функционалдашуусу кремнийдин бетине полистирол катмарын (0,97 мкм) гана пайда кылганын, ал эми PMP фазасында катмардын калыңдыгы 1,38 мкм болгонун билдирет.
Таза кремний бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрүнүн бөлүкчөлөрүнүн өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшү (A) жана тешикчелердин өлчөмүнүн бөлүштүрүлүшү (B).
Бул изилдөөдө колдонулган кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн тешикчелеринин өлчөмү, тешикчелеринин көлөмү жана беттик аянты 1-таблицада (B) көрсөтүлгөн. Таза кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн жана лиганд менен байланышкан кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн PSD профилдери 3(B) сүрөттөрүндө көрсөтүлгөн. Жыйынтыктар мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу болду34. Таза жана лиганд менен байланышкан кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн тешикчелеринин өлчөмдөрү тиешелүүлүгүнө жараша 310 Å жана 241 Å түзгөн, бул химиялык модификациядан кийин тешикчелердин өлчөмү 1-таблицада (B) көрсөтүлгөндөй 69 Åге азайганын, ал эми жылышуу ийри сызыгы сүрөттө көрсөтүлгөн. Учурдагы изилдөөдөгү кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн салыштырма беттик аянты 116 м2/г түзөт, бул биздин мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу (124 м2/г). 1(B) таблицада көрсөтүлгөндөй, химиялык модификациядан кийин кремний диоксидинин бөлүкчөлөрүнүн беттик аянты (м2/г) да 116 м2/гден 105 м2/гге чейин азайган.
Стационардык фазанын элементтик анализинин жыйынтыктары 2-таблицада келтирилген. Учурдагы стационардык фазанын көмүртек курамы 6,35% түзөт, бул биздин мурунку изилдөөбүзгө караганда төмөн (полистирол менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрү тиешелүүлүгүнө жараша 7,93%35 жана 10,21%) 42. Учурдагы стационардык фазанын көмүртек курамы төмөндө келтирилген, анткени SP даярдоодо стиролдон тышкары фенилмалеимид метилвинил изоцианаты (PCMP) жана 4-гидрокси-TEMPO сыяктуу кээ бир полярдык лиганддар колдонулган. Учурдагы стационардык фазадагы азоттун салмактык пайызы мурунку изилдөөлөрдөгү 0,1735 жана 0,85%га салыштырмалуу 2,21% түзөт42. Бул учурдагы стационардык фазада фенилмалеимиддин айынан азоттун салмактык пайызы жогору экенин билдирет42. Ошо сыяктуу эле, (4) жана (5) продуктыларында көмүртектин курамы тиешелүүлүгүнө жараша 2,7% жана 2,9% түзөт, ал эми акыркы продуктусунда (6) көмүртектин курамы 6,35% түзөт, бул 2-таблицада көрсөтүлгөн. PMPнин стационардык фазасында арыктоого текшерүү үчүн термогравиметриялык анализ (TGA) колдонулган жана TGA ийри сызыгы 4-сүрөттө көрсөтүлгөн. TGA ийри сызыгы 8,6% салмактын жоголгонун көрсөтөт, бул көмүртектин курамына (6,35%) жакшы дал келет, анткени лиганддарда C гана эмес, N, O жана H да бар.
Лиганд фенилмалеимид-метилвинилизоцианат кремний бөлүкчөлөрүнүн бетин өзгөртүү үчүн анын полярдык фенилмалеимид жана винилизоцианат топторунан улам тандалып алынган. Винил изоцианат топтору тирүү радикалдык полимерлешүү аркылуу стирол менен андан ары реакцияга кирише алышат. Экинчи себеп - аналит менен орточо өз ара аракеттенүүсүнө ээ болгон жана аналит менен стационардык фазанын ортосунда күчтүү электростатикалык өз ара аракеттенүү жок топту киргизүү, анткени фенилмалеимид бөлүгүнүн кадимки рН деңгээлинде виртуалдык заряды жок. Стационардык фазанын полярдуулугун стиролдун оптималдуу көлөмү жана эркин радикалдык полимерлешүүнүн реакция убактысы менен башкарууга болот. Реакциянын акыркы кадамы (эркин радикалдык полимерлешүү) өтө маанилүү, анткени ал стационардык фазанын полярдуулугун өзгөртөт. Бул стационардык фазалардагы көмүртектин курамын текшерүү үчүн элементардык анализ жүргүзүлдү. Стиролдун көлөмүн жана реакция убактысын көбөйтүү стационардык фазанын көмүртек курамын көбөйтөөрү жана тескерисинче байкалган. Стиролдун ар кандай концентрациялары менен даярдалган SPлер ар кандай көмүртек жүктөмдөрүнө ээ. Ошо сыяктуу эле, бул стационардык фазалар дат баспас болоттон жасалган мамычаларга жайгаштырылып, алардын хроматографиялык мүнөздөмөлөрү (тандоочулук, чечилиш, N мааниси ж.б.) текшерилген. Бул эксперименттердин негизинде, башкарылуучу полярдуулукту жана аналиттин жакшы сакталышын камсыз кылуу үчүн PMP стационардык фазасын даярдоо үчүн оптималдаштырылган курам тандалып алынган.
Ошондой эле, PMP тилкеси мобилдик фазанын кубаттуулугун колдонуп, пептиддердин беш аралашмасын (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин) талдоо үчүн бааланган. 60/40 (v/v) ACN/суу (0,1% TFA) 80 мкл/мин агым ылдамдыгында. Оптималдуу элюция шарттарында (200 000 пластина/м), ар бир тилкедеги теориялык пластиналардын саны (N) (100 × 1,8 мм) 20 000 ± 100 түзөт. Үч PMP тилкеси үчүн N маанилери 3-таблицада, ал эми хроматограммалар 5А-сүрөттө көрсөтүлгөн. PMP колонкасында жогорку агым ылдамдыгында (700 мкл/мин) тез анализ жүргүзүлдү, бир мүнөттүн ичинде беш пептид элюцияланды, ар бир колонкада 13 500 ± 330 N мааниси (диаметри 100 x 1,8 мм), бул 135 000 пластина/м барабар (5B-сүрөт). Кайра жарамдуулукту текшерүү үчүн бирдей өлчөмдөгү үч колонка (ички диаметри 100 x 1,8 мм) PMP стационардык фазасынын үч башка партиясы менен толтурулду. Ар бир колонка үчүн аналиттер оптималдуу элюция шарттарын, теориялык пластиналардын санын N жана кармоо убактысын колдонуп, ар бир колонкада бир эле сыноо аралашмасын бөлүү менен жазылды. PMP колонкаларынын кайта жарамдуулук маалыматтары 4-таблицада көрсөтүлгөн. PMP колонкасынын кайта жарамдуулугу 3-таблицада көрсөтүлгөндөй, өтө төмөн %RSD маанилери менен жакшы корреляцияланган.
ПМП колонкасында (B) жана Ascentis Express RP-Amide колонкасында (A) пептиддик аралашмаларды бөлүү, кыймылдуу фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), ПМП колонкасынын өлчөмдөрү (100 x 1,8 мм id), анализ. Кошулмалардын элюция тартиби: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) жана 5 (лейцин кислотасынын энкефалини).
Адамдын кан сары суусундагы альбуминдин триптикалык гидролизатын HPLC аркылуу бөлүү үчүн PMP тилкеси (ички диаметри 100 x 1,8 мм) бааланган. 6-сүрөттөгү хроматограмма үлгүлөрдүн жакшы бөлүнгөнүн жана абдан жакшы чечилиште экенин көрсөтүп турат. HSA эритмелери 100 мкл/мин агым ылдамдыгын, 70/30 ацетонитрил/суунун кыймылдуу фазасын жана 0,1% TFAны колдонуу менен талданган. HSAнын бөлүнүшү хроматограммада көрсөтүлгөндөй (6-сүрөт) 17 пептидге туура келген 17 чокуга бөлүнгөн. HSA гидролизатынан жеке чокулардын бөлүнүү эффективдүүлүгү эсептелген жана маанилери 5-таблицада көрсөтүлгөн.
HSA триптикалык гидролизаттары PMP тилкесинде (ички диаметри 100 x 1,8 мм), агым ылдамдыгы (100 мкл/мин), кыймылдуу фаза 60/40 ацетонитрил/сууда жана 0,1% TFAда бөлүнгөн.
мында L - мамычанын узундугу, η - кыймылдуу фазанын илешкектиги, ΔP - мамычанын арткы басымы жана u - кыймылдуу фазанын сызыктуу ылдамдыгы. PMP мамычанын өткөрүмдүүлүгү 2,5 × 10–14 м2, агым ылдамдыгы 25 мкл/мин болгон, 60/40 v/v колдонулган. ACN/суу. PMP мамычанын өткөрүмдүүлүгү (ID 100 × 1,8 мм) биздин мурунку 34-шилтемедеги изилдөөбүзгө окшош болгон. Үстүртөн тешиктүү бөлүкчөлөр менен толтурулган мамычанын өткөрүмдүүлүгү 1,7 × 10 0,6 мкм, 5 мкм бөлүкчөлөр үчүн 2,5 × 10-14 м2 түзөт43. Ошондуктан, PMP фазасынын өткөрүмдүүлүгү 5 мкм өлчөмүндөгү өзөк-кабык бөлүкчөлөрүнүн өткөрүмдүүлүгүнө окшош.
мында Wx - хлороформ менен толтурулган колоннанын массасы, Wy - метанол менен толтурулган колоннанын массасы, ал эми ρ - эриткичтин тыгыздыгы. Метанолдун тыгыздыгы (ρ = 0.7866) жана хлороформдун (ρ = 1.484). Кремний-C18 бөлүкчөлөр колоннасынын (100 × 1.8 мм ID)34 жана биз мурда изилдеген C18-мочевина31 колоннасынын жалпы кеуектүүлүгү тиешелүүлүгүнө жараша 0.63 жана 0.55 түзгөн. Бул мочевина лиганддарынын болушу стационардык фазанын өткөрүмдүүлүгүн төмөндөтөт дегенди билдирет. Башка жагынан алганда, PMP колоннасынын жалпы кеуектүүлүгү (ички диаметри 100 × 1.8 мм) 0.60 түзөт. PMP колонналары C18 менен байланышкан кремний бөлүкчөлөрү менен толтурулган колонналарга караганда аз өткөрүмдүүлүккө ээ, анткени C18 тибиндеги стационардык фазаларда C18 лиганддары кремний бөлүкчөлөрүнө сызыктуу чынжырлар менен туташат, ал эми полистирол тибиндеги стационардык фазаларда бөлүкчөлөрдүн айланасында салыштырмалуу калың полимер пайда болот. А катмары. Типтүү экспериментте мамычанын кеуектүүлүгү төмөнкүдөй эсептелет:
7A жана B сүрөттөрүндө PMP мамычасы (id 100 x 1,8 мм) жана Ascentis Express RP-Amide мамычасы (id 100 x 1,8 мм) үчүн бирдей элюция шарттарында, эки мамычада тең 60/40 ACN/H2O жана 0,1% TFA 20 мкл/минден 800 мкл/минге чейинки Ван Деемтердин графиктери көрсөтүлгөн. Оптималдуу агым ылдамдыгындагы (80 мкл/мин) минималдуу HETP маанилери PMP мамычасы жана Ascentis Express RP-Amide мамычасы үчүн тиешелүүлүгүнө жараша 2,6 мкм жана 3,9 мкм болгон. HETP маанилери PMP мамычасын бөлүү эффективдүүлүгүнүн (100 x 1,8 мм id) коммерциялык жактан жеткиликтүү Ascentis Express RP-Amide мамычасыныкына (100 x 1,8 мм id) караганда алда канча жогору экенин көрсөтүп турат. 7(А)-сүрөттөгү Ван Демтердин графиги мурунку изилдөөбүзгө салыштырмалуу агымдын көбөйүшү менен N маанисинин төмөндөшү анчалык деле жогору эмес экенин көрсөтүп турат. Ascentis Express RP-Amide колоннасына салыштырмалуу PMP тилкесинин жогорку бөлүү эффективдүүлүгү (id 100 × 1,8 мм) бөлүкчөлөрдүн формасынын жана өлчөмүнүн жакшырышына жана учурдагы иште колдонулган татаал колонна таңгактоо процедурасына негизделген34.
(A) 0,1% TFA менен 60/40 ACN/H2O ичиндеги PMP тилкесинде (id 100 x 1,8 мм) алынган Ван Димтердин графиги (HETP vs. кыймылдуу фаза сызыктуу ылдамдыгы). (B) 0,1% TFA менен 60/40 ACN/H2O ичиндеги Ascentis Express RP-Amide тилкесинде (id 100 x 1,8 мм) алынган Ван Димтердин графиги (HETP vs. кыймылдуу фаза сызыктуу ылдамдыгы).
Жогорку натыйжалуу суюк хроматографияда синтетикалык пептиддердин жана адамдын кан сары суусунун альбумининин (HSA) триптикалык гидролизатынын аралашмасын бөлүү үчүн интеркалатталган полистиролдун полярдык стационардык фазасы даярдалып, бааланган. Пептиддик аралашмалар үчүн PMP мамычаларынын хроматографиялык көрсөткүчтөрү бөлүү натыйжалуулугу жана чечилиши жагынан эң сонун. PMP мамычаларынын бөлүү натыйжалуулугунун жогорулашы кремний бөлүкчөлөрүнүн өлчөмү жана тешикчелердин өлчөмү, стационардык фазалардын көзөмөлдөнгөн синтези жана татаал мамыча таңгактоочу материалдар сыяктуу бир нече себептерге байланыштуу. Жогорку бөлүү натыйжалуулугунан тышкары, бул стационардык фазанын дагы бир артыкчылыгы - жогорку агым ылдамдыгында мамычалардын төмөнкү артка басымы. PMP мамычалары жогорку деңгээлде кайталануучу жана пептиддердин аралашмаларын жана ар кандай белоктордун триптикалык сиңирүүсүн талдоо үчүн колдонулушу мүмкүн. Биз бул мамычаларды суюк хроматографияда табигый продуктылардан, дары өсүмдүктөрүнүн экстракттарынан жана козу карындардан биоактивдүү кошулмаларды бөлүү үчүн колдонууну көздөп жатабыз. Келечекте PMP мамычалары белокторду жана моноклоналдык антителолорду бөлүү үчүн да бааланат.
Филд, Ж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х. жана Петерссон, П. Тескери фазалуу хроматография пептиддик бөлүү системаларын изилдөө I бөлүк: Колонналарды мүнөздөө протоколун иштеп чыгуу. Филд, Ж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х. жана Петерссон, П. Тескери фазалуу хроматография пептиддик бөлүү системаларын изилдөө I бөлүк: Колонналарды мүнөздөө протоколун иштеп чыгуу.Филд, Ж.К., Оверби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х., жана Петерссон, П. Пептиддерди бөлүү системаларын тескери фазалуу хроматография аркылуу изилдөө, I бөлүк: Мамыча мүнөздөмөсү үчүн протоколду иштеп чыгуу. Филд, Ж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х. жана Петерссон, П. Тескери фазалуу хроматографиянын пептиддик бөлүү системаларын изилдөө I бөлүк: Колонна мүнөздөмөлөрү үчүн протоколду иштеп чыгуу. Филд, Ж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х. жана Петерссон, П. Тескери фазалуу хроматографиянын пептиддик бөлүү системаларын изилдөө I бөлүк: Колонна мүнөздөмөлөрү үчүн протоколду иштеп чыгуу.Филд, Ж.К., Оверби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х., жана Петерссон, П. Пептиддерди бөлүү системаларын тескери фазалуу хроматография аркылуу изилдөө, I бөлүк: Мамыча мүнөздөмөсү үчүн протоколду иштеп чыгуу.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Гомес, Б. жана башкалар. Жугуштуу ооруларды дарылоо үчүн жакшыртылган активдүү пептиддерди түзүү ыкмалары. Биотехнология. Жетишкендиктер 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж. жана Хрестчатиский, М. Синтетикалык терапиялык пептиддер: Илим жана рынок. Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж. жана Хрестчатиский, М. Синтетикалык терапиялык пептиддер: Илим жана рынок.Влиеге П., Лисовски В., Мартинес Ж. жана Хрещатиски М. Синтетикалык терапиялык пептиддер: илим жана рынок.Влиеге П., Лисовски В., Мартинес Ж. жана Хрещацкий М. Синтетикалык терапиялык пептиддер: илим жана рынок. Дары-дармектерди ачуу. Бүгүн 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Се, Ф., Смит, РД жана Шен, Ю. Өркүндөтүлгөн протеомдук суюк хроматография. Се, Ф., Смит, РД жана Шен, Ю. Өркүндөтүлгөн протеомдук суюк хроматография.Караңыз: Ф., Смит РД жана Шен Ю. Өркүндөтүлгөн протеомдук суюк хроматография. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced белок курамы 液相色谱。Караңыз: Ф., Смит РД жана Шен Ю. Өркүндөтүлгөн протеомдук суюк хроматография.Хроматография журналы. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. жана башкалар. Өркүндөтүлгөн суюк хроматография-массалык спектрометрия кеңири метаболомиканы жана протеомиканы айкалыштыра алат. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, С.М. жана Солсбери, Ж.Ж. Фармацевтикалык өнүгүүдө UHPLC ролу. Чеснат, С.М. жана Солсбери, Ж.Ж. Фармацевтикалык өнүгүүдө UHPLC ролу.Чеснат, С.М. жана Солсбери, Ж.Ж. Фармацевтикалык өнүгүүдө UHPLC ролу.Чеснат, С.М. жана Солсбери, Ж.Ж. Дары-дармектерди иштеп чыгууда UHPLC ролу. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Ву, Н. жана Клаузен, AM Тез бөлүү үчүн өтө жогорку басымдагы суюк хроматографиянын фундаменталдык жана практикалык аспектилери. Ву, Н. жана Клаузен, AM Тез бөлүү үчүн өтө жогорку басымдагы суюк хроматографиянын фундаменталдык жана практикалык аспектилери.Ву, Н. жана Клаузен, AM Тез бөлүү үчүн жогорку басымдагы суюктук хроматографиясынын фундаменталдык жана практикалык аспектилери. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Ву, Н. жана Клаузен, А.М. Тез бөлүү үчүн өтө жогорку басымдагы суюк хроматографиянын негизги жана практикалык аспектилери.Ву, Н. жана Клаузен, AM Тез бөлүү үчүн жогорку басымдагы суюктук хроматографиясынын фундаменталдык жана практикалык аспектилери.J. September. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. жана Челитчефф, П. Фармацевтикалык иштеп чыгууда өтө натыйжалуу суюк хроматографияны колдонуу. Рен, С.А. жана Челитчефф, П. Фармацевтикалык иштеп чыгууда өтө натыйжалуу суюк хроматографияны колдонуу.Рен, SA жана Челишефф, П. Фармацевтикалык иштеп чыгууда өтө жогорку натыйжалуу суюк хроматографияны колдонуу. Wren, SA & Tchelicheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Рен, SA жана Челитчефф, П.Рен, С.А. жана Челишефф, П. Дары-дармектерди иштеп чыгууда өтө натыйжалуу суюк хроматографияны колдонуу.Хроматография журналы. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. жана башкалар. Энтеровирус 71ди натыйжалуу тазалоо үчүн жогорку ички фазалуу суудагы май эмульсиясынан алынган монолиттүү макропороздуу гидрогель. Химиялык. долбоор. Journal 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. жана Уилкинс, Ж.А. Протеомикадагы суюк хроматографиянын ролу. Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. жана Уилкинс, Ж.А. Протеомикадагы суюк хроматографиянын ролу.Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. жана Уилкинс, Ж.А. Протеомикадагы суюк хроматографиянын ролу. Ши, Ю., Сианг, Р., Хорват, С. & Уилкинс, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. & Уилкинс, Ж.АШи, Ю., Сян, Р., Хорват, К. жана Уилкинс, Ж.А. Протеомикадагы суюк хроматографиянын ролу.Хроматография журналы. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вутей, Ж.-Л. & Гийарм, Д. Терапиялык пептиддерди жана белокторду тескери фазадагы суюк хроматографиялык бөлүүдөгү жаңы тенденциялар: Теория жана колдонмолор. & Гийарм, Д. Терапиялык пептиддерди жана белокторду тескери фазадагы суюк хроматографиялык бөлүүдөгү жаңы тенденциялар: Теория жана колдонмолор. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория жана приложения. & Гийарме, Д. Терапиялык пептиддерди жана белокторду тескери фазалуу суюк хроматография аркылуу бөлүүдөгү жаңы тенденциялар: теория жана колдонмолор. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 жана Гилярм, Д.жана Гийарме, Д. Терапиялык пептиддерди жана белокторду тескери фазалуу суюк хроматография аркылуу бөлүүдөгү жаңы тенденциялар: теория жана колдонмолор.J. Pharm. Биомедициналык илим. анус. 69, 9–27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дэйли, А.Э. жана Геблер, Ж.К. Биринчи жана экинчи бөлүү өлчөмдөрүндө ар кандай рН менен RP-RP-HPLC системасын колдонуу менен пептиддерди эки өлчөмдүү бөлүү. Гилар, М., Оливова, П., Дэйли, А.Э. жана Геблер, Ж.К. Биринчи жана экинчи бөлүү өлчөмдөрүндө ар кандай рН менен RP-RP-HPLC системасын колдонуу менен пептиддерди эки өлчөмдүү бөлүү.Гилар М., Оливова П., Дали А.Э. жана Геблер Ж.К. Биринчи жана экинчи бөлүү өлчөмдөрүндө ар кандай рН менен RP-RP-HPLC системасын колдонуу менен пептиддерди эки өлчөмдүү бөлүү.Гилар М., Оливова П., Дали А.Э. жана Геблер Ж.К. RP-RP-HPLC системасын колдонуп, биринчи жана экинчи бөлүү өлчөмдөрүндө ар кандай рН маанилерин колдонуп пептиддерди эки өлчөмдүү бөлүү. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Феллитти, С. жана башкалар. 2 мкмден кичине толук тешиктүү жана үстүртөн тешиктүү C18 бөлүкчөлөрү менен толтурулган жогорку өндүрүмдүү хроматографиялык колонкалардын массалык өткөрүмдүүлүгүн жана кинетикалык мүнөздөмөлөрүн изилдөө. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Пиовесана, С. жана башкалар. Өсүмдүктөрдүн биоактивдүү пептиддерин бөлүп алуу, идентификациялоо жана валидациялоодогу акыркы тенденциялар жана аналитикалык кыйынчылыктар. анус. Аналдык жандык. Химиялык. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Ж.Б. жана башкалар. Жашоо падышачылыгынын протеомикалык пейзажы. Жаратылыш 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
Де Лука, К. жана башкалар. Терапиялык пептиддерди даярдоочу суюк хроматография менен дарылоодон кийинки дарылоо. Molecules (Базель, Швейцария) 26(15), 4688 (2021).
Ян, Ю. жана Генг, Х. Аралаш режимдеги хроматография жана анын биополимерлерге колдонулушу. Ян, Ю. жана Генг, Х. Аралаш режимдеги хроматография жана анын биополимерлерге колдонулушу.Ян, Ю. жана Генг, Х. Аралаш режимдеги хроматография жана анын биополимерлерге колдонулушу. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Ян, Ю. жана Генг, Х. Аралаш режимдеги хроматография жана анын биополимерлерде колдонулушу.Ян, Ю. жана Джин, Х. Аралаш режимдеги хроматография жана анын биополимерлерге колдонулушу.Хроматография журналы. A 1218(49), 8813–8825 (2011).