ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com คุณกำลังใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันที่มีการรองรับ CSS จำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) นอกจากนี้ เพื่อให้มั่นใจได้ว่าเว็บไซต์จะได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจึงแสดงเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
แสดงภาพสไลด์สามภาพพร้อมกัน ใช้ปุ่ม "ก่อนหน้า" และ "ถัดไป" เพื่อเลื่อนดูสไลด์ทีละสามภาพ หรือใช้ปุ่มเลื่อนที่ด้านท้ายเพื่อเลื่อนดูสไลด์ทีละสามภาพ
อนุภาคซิลิกาพรุนถูกเตรียมโดยวิธีโซล-เจล โดยมีการดัดแปลงบางส่วนเพื่อให้ได้อนุภาคที่มีรูพรุนกว้าง อนุภาคเหล่านี้ถูกทำให้เกิดอนุพันธ์ด้วย N-phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate (PMI) และสไตรีนผ่านพอลิเมอไรเซชันแบบ RAFT (reverse chain transfer-fragmentation) เพื่อผลิตพอลิเอไมด์ที่แทรกด้วย N-phenylmaleimide เฟสคงที่คือสไตรีน (PMP) คอลัมน์สแตนเลสแบบรูแคบ (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) ถูกบรรจุด้วยสารบรรจุแบบสลอรี่ ประสิทธิภาพการแยกสารด้วยโครมาโทกราฟีของคอลัมน์ PMP ถูกประเมินเพื่อแยกส่วนผสมของเปปไทด์สังเคราะห์ที่ประกอบด้วยเปปไทด์ห้าชนิด (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu กรดอะมิโนเอนเคฟาลิน) และสารไฮโดรไลเซตของอัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ (HAS) ที่ได้จากการย่อยด้วยเอนไซม์ทริปซิน ภายใต้สภาวะการชะล้างที่เหมาะสม จำนวนเพลทตามทฤษฎีที่มีส่วนผสมของเปปไทด์สูงถึง 280,000 เพลท/ตร.ม. เมื่อเปรียบเทียบประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ที่พัฒนาขึ้นกับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide ที่วางจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ พบว่าประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP นั้นเหนือกว่าคอลัมน์เชิงพาณิชย์ทั้งในแง่ของประสิทธิภาพการแยกและความละเอียด
อุตสาหกรรมยาชีวภาพได้กลายเป็นตลาดโลกที่กำลังขยายตัว โดยมีส่วนแบ่งการตลาดเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา ด้วยการเติบโตอย่างรวดเร็วของอุตสาหกรรมยาชีวภาพ1,2,3 ทำให้มีความต้องการอย่างมากในการวิเคราะห์เปปไทด์และโปรตีน นอกจากเปปไทด์เป้าหมายแล้ว ยังมีสิ่งเจือปนต่างๆ เกิดขึ้นระหว่างการสังเคราะห์เปปไทด์ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธีโครมาโทกราฟีเพื่อให้ได้เปปไทด์ที่มีความบริสุทธิ์ตามที่ต้องการ การวิเคราะห์และจำแนกลักษณะของโปรตีนในของเหลวในร่างกาย เนื้อเยื่อ และเซลล์ เป็นงานที่ท้าทายอย่างยิ่ง เนื่องจากมีสารที่อาจตรวจพบได้จำนวนมากในตัวอย่างเดียว แม้ว่าแมสสเปกโทรเมตรีจะเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการจัดลำดับเปปไทด์และโปรตีน แต่หากนำตัวอย่างดังกล่าวเข้าสู่แมสสเปกโทรเมตรีโดยตรง การแยกสารจะไม่เป็นที่น่าพอใจ ปัญหานี้สามารถแก้ไขได้โดยการทำโครมาโทกราฟีของเหลว (LC) ก่อนการวิเคราะห์ด้วย MS ซึ่งจะช่วยลดปริมาณของสารวิเคราะห์ที่เข้าสู่แมสสเปกโทรเมตรีในแต่ละครั้ง4,5,6 นอกจากนี้ สารวิเคราะห์สามารถรวมตัวกันในบริเวณแคบๆ ระหว่างการแยกเฟสของเหลว ซึ่งจะทำให้สารวิเคราะห์เหล่านี้มีความเข้มข้นมากขึ้นและเพิ่มความไวในการตรวจจับด้วย MS โครมาโทกราฟีของเหลว (LC) ได้พัฒนาไปอย่างมากในช่วงทศวรรษที่ผ่านมาและกลายเป็นวิธีการที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการวิเคราะห์โปรตีน7,8,9,10
โครมาโทกราฟีของเหลวแบบย้อนกลับ (RP-LC) ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการทำให้บริสุทธิ์และแยกส่วนผสมของเปปไทด์โดยใช้ซิลิกาที่ดัดแปลงด้วยออกตาเดซิล (ODS) เป็นเฟสคงที่11,12,13 อย่างไรก็ตาม เนื่องจากโครงสร้างที่ซับซ้อนและคุณสมบัติแอมโฟเทอริก14,15 เฟสคงที่ของ RP จึงไม่สามารถแยกเปปไทด์และโปรตีนได้อย่างน่าพอใจ ดังนั้น การวิเคราะห์เปปไทด์และโปรตีนที่มีชิ้นส่วนขั้วและไม่มีขั้วจึงต้องใช้เฟสคงที่ที่ออกแบบมาเป็นพิเศษเพื่อทำปฏิกิริยาและกักเก็บสารวิเคราะห์เหล่านี้16 โครมาโทกราฟีแบบผสม ซึ่งให้ปฏิสัมพันธ์แบบหลายโหมด สามารถเป็นทางเลือกแทน RP-LC สำหรับการแยกเปปไทด์ โปรตีน และส่วนผสมที่ซับซ้อนอื่นๆ เฟสคงที่แบบผสมหลายชนิดได้รับการเตรียมขึ้น และคอลัมน์ที่บรรจุด้วยเฟสคงที่เหล่านี้ถูกนำมาใช้ในการแยกเปปไทด์และโปรตีน17,18,19,20,21 เนื่องจากการมีอยู่ของกลุ่มขั้วและกลุ่มที่ไม่เป็นขั้ว เฟสคงที่แบบผสม (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, การแทรกขั้ว/RPLC) จึงเหมาะสมสำหรับการแยกเปปไทด์และโปรตีน22,23,24,25,26,27,28 เฟสคงที่แบบแทรกขั้วที่มีกลุ่มขั้วที่เชื่อมต่อกันด้วยพันธะโควาเลนต์แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการแยกที่ดีและการเลือกสรรที่เป็นเอกลักษณ์สำหรับสารวิเคราะห์ที่มีขั้วและไม่เป็นขั้ว เนื่องจากการแยกขึ้นอยู่กับปฏิสัมพันธ์ระหว่างสารวิเคราะห์และเฟสคงที่ ปฏิสัมพันธ์แบบหลายโหมด 29,30,31,32 เมื่อเร็ว ๆ นี้ Zhang et al. 30 ได้รับเฟสคงที่ที่ปลายเบเฮนิลของโพลีเอมีนและประสบความสำเร็จในการแยกไฮโดรคาร์บอน ยาต้านอาการซึมเศร้า ฟลาโวนอยด์ นิวคลีโอไซด์ เอสโตรเจน และสารวิเคราะห์อื่น ๆ วัสดุคงที่แบบฝังขั้วมีทั้งกลุ่มขั้วและกลุ่มที่ไม่เป็นขั้ว ดังนั้นจึงสามารถใช้ในการแยกเปปไทด์และโปรตีนออกเป็นส่วนที่ชอบน้ำและไม่ชอบน้ำได้ คอลัมน์แบบอินไลน์ที่มีขั้ว (เช่น คอลัมน์ C18 ที่มีอะไมด์อินไลน์) มีจำหน่ายภายใต้ชื่อทางการค้า Ascentis Express RP-Amide columns แต่คอลัมน์เหล่านี้ใช้สำหรับการวิเคราะห์อะมีน 33 เท่านั้น
ในการศึกษาปัจจุบันนี้ ได้เตรียมและประเมินเฟสคงที่แบบฝังตัวขั้ว (N-phenylmaleimide, โพลีสไตรีนแบบฝังตัว) สำหรับการแยกเปปไทด์และการตัด HSA ด้วยเอนไซม์ทริปซิน กลยุทธ์ที่ใช้ในการเตรียมเฟสคงที่มีดังนี้ อนุภาคซิลิกาที่มีรูพรุนถูกเตรียมตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ในสิ่งพิมพ์ก่อนหน้าของเรา โดยมีการเปลี่ยนแปลงบางอย่างในแผนการเตรียม 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 อัตราส่วนของยูเรีย โพลีเอทิลีนไกลคอล (PEG) TMOS และกรดอะซิติกในน้ำถูกปรับเพื่อให้ได้อนุภาคซิลิกาที่มีขนาดรูพรุนใหญ่ ประการที่สอง ได้สังเคราะห์ลิแกนด์ phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate ใหม่ และใช้อนุภาคซิลิกาที่ดัดแปลงแล้วในการเตรียมเฟสคงที่แบบฝังตัวขั้ว เฟสคงที่ที่ได้ถูกบรรจุลงในคอลัมน์สแตนเลส (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) ตามแผนการบรรจุที่เหมาะสมที่สุด การบรรจุคอลัมน์ได้รับการช่วยเหลือจากการสั่นสะเทือนเชิงกลเพื่อให้แน่ใจว่าชั้นภายในคอลัมน์มีความสม่ำเสมอ คอลัมน์ที่บรรจุแล้วได้รับการประเมินสำหรับการแยกส่วนผสมของเปปไทด์ซึ่งประกอบด้วยเปปไทด์ห้าชนิด (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin peptide) และสารไฮโดรไลเสตของอัลบูมินในซีรัมมนุษย์ (HSA) ที่ได้จากการย่อยด้วยเอนไซม์ทริปซิน พบว่าส่วนผสมของเปปไทด์และสารไฮโดรไลเสตของ HSA ที่ได้จากการย่อยด้วยเอนไซม์ทริปซินสามารถแยกออกจากกันได้ด้วยความละเอียดและประสิทธิภาพที่ดี ประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP ถูกเปรียบเทียบกับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide พบว่าเปปไทด์และโปรตีนมีความละเอียดที่ดีและประสิทธิภาพการแยกสูงบนคอลัมน์ PMP และประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP สูงกว่าคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide
PEG (โพลีเอทิลีนไกลคอล), ยูเรีย, กรดอะซิติก, ไตรเมทอกซีออร์โธซิลิเคต (TMOS), ไตรเมทิลคลอโรซิเลน (TMCS), ทริปซิน, อัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ (HSA), แอมโมเนียมคลอไรด์, ยูเรีย, เฮกซาเมทิลเมทาคริลอยล์ไดซิลาเซน (HMDS), เมทาคริลอยล์คลอไรด์ (MC), สไตรีน, 4-ไฮดรอกซี-TEMPO, เบนโซอิลเปอร์ออกไซด์ (BPO), อะซีโตไนไตรล์ (ACN) สำหรับ HPLC, เมทานอล, 2-โพรพานอล และอะซิโตน บริษัท ซิกมา-อัลดริช (เซนต์หลุยส์ รัฐมิสซูรี สหรัฐอเมริกา)
นำยูเรีย (8 กรัม), โพลีเอทิลีนไกลคอล (8 กรัม) และกรดอะซิติก 0.01 N จำนวน 8 มิลลิลิตร มาคนให้เข้ากันเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นเติม TMOS 24 มิลลิลิตรลงไปในขณะที่แช่เย็นด้วยน้ำแข็ง นำส่วนผสมของปฏิกิริยาไปให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 40°C เป็นเวลา 6 ชั่วโมง แล้วต่อด้วยอุณหภูมิ 120°C เป็นเวลา 8 ชั่วโมง ในหม้ออัดความดันสแตนเลส เทน้ำออก และนำสารตกค้างไปอบแห้งที่อุณหภูมิ 70°C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง นำบล็อกอ่อนที่แห้งแล้วมาบดให้ละเอียดและเผาในเตาอบที่อุณหภูมิ 550°C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง เตรียมตัวอย่าง 3 ชุด และนำมาวิเคราะห์เพื่อทดสอบความสามารถในการทำซ้ำของขนาดอนุภาค ขนาดรูพรุน และพื้นที่ผิว
กลุ่มขั้วและเฟสคงที่สำหรับสายโซ่โพลีสไตรีน ขั้นตอนการเตรียมมีรายละเอียดดังต่อไปนี้
นำ N-phenylmaleimide (200 มก.) และ methyl vinyl isocyanate (100 มก.) ละลายในโทลูอีนปราศจากน้ำ จากนั้นเติม 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) 0.1 มล. ลงในขวดปฏิกิริยาเพื่อให้ได้โคพอลิเมอร์ของ phenylmaleimide และ methyl vinyl isocyanate (PMCP) นำส่วนผสมไปให้ความร้อนที่ 60°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง กรอง และอบแห้งในเตาอบที่ 40°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง
นำอนุภาคซิลิกาแห้ง (2 กรัม) มากระจายตัวในโทลูอีนแห้ง (100 มิลลิลิตร) คนและใช้คลื่นเสียงอัลตราโซนิกเป็นเวลา 10 นาทีในขวดก้นกลมขนาด 500 มิลลิลิตร ละลาย PMCP (10 มิลลิกรัม) ในโทลูอีนแล้วค่อยๆ หยดลงในขวดปฏิกิริยาผ่านกรวยเติมสาร นำส่วนผสมไปต้มกลั่นที่อุณหภูมิ 100°C เป็นเวลา 8 ชั่วโมง กรอง ล้างด้วยอะซิโตน และทำให้แห้งที่อุณหภูมิ 60°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง จากนั้น นำอนุภาคซิลิกาที่จับตัวกับ PMCP (100 กรัม) มาละลายในโทลูอีน (200 มิลลิลิตร) และเติม 4-ไฮดรอกซี-TEMPO (2 มิลลิลิตร) ลงไปพร้อมกับไดบิวทิลทินไดลอเรต 100 ไมโครลิตรเป็นตัวเร่งปฏิกิริยา นำส่วนผสมไปคนให้เข้ากันที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 8 ชั่วโมง กรอง และทำให้แห้งที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง
นำสไตรีน (1 มล.), เบนโซอิลเปอร์ออกไซด์ BPO (0.5 มล.) และอนุภาคซิลิกาที่ติดอยู่กับ TEMPO-PMCP (1.5 กรัม) มากระจายตัวในโทลูอีนและไล่ก๊าซออกด้วยไนโตรเจน จากนั้นทำการพอลิเมอไรเซชันของสไตรีนที่อุณหภูมิ 100°C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง ล้างผลิตภัณฑ์ที่ได้ด้วยเมทานอลและทำให้แห้งข้ามคืนที่อุณหภูมิ 60°C แผนภาพโดยรวมของปฏิกิริยาแสดงในรูปที่หนึ่ง
ตัวอย่างถูกไล่แก๊สที่อุณหภูมิ 393 K เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จนกระทั่งความดันตกค้างน้อยกว่า 10–3 Torr ปริมาณ N2 ที่ถูกดูดซับที่ความดันสัมพัทธ์ P/P0 = 0.99 ถูกนำมาใช้ในการกำหนดปริมาตรของรูพรุนทั้งหมด ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของอนุภาคซิลิกาบริสุทธิ์และอนุภาคซิลิกาที่จับกับลิแกนด์ถูกตรวจสอบโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน (Hitachi High Technologies, โตเกียว, ประเทศญี่ปุ่น) ตัวอย่างแห้ง (อนุภาคซิลิกาบริสุทธิ์และอนุภาคซิลิกาที่จับกับลิแกนด์) ถูกวางบนแท่งอลูมิเนียมโดยใช้เทปคาร์บอน ทองคำถูกเคลือบลงบนตัวอย่างโดยใช้เครื่องสปัตเตอร์ Q150T และเคลือบชั้น Au หนา 5 นาโนเมตรลงบนตัวอย่าง วิธีนี้ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของกระบวนการแรงดันต่ำและให้การพ่นเย็นที่ละเอียด การวิเคราะห์องค์ประกอบทางเคมีทำโดยใช้เครื่องวิเคราะห์องค์ประกอบทางเคมี Thermo Electron (Waltham, MA, สหรัฐอเมริกา) Flash EA1112 ใช้เครื่องวิเคราะห์ขนาดอนุภาค Malvern (Worcestershire, สหราชอาณาจักร) รุ่น Mastersizer 2000 ในการหาการกระจายขนาดอนุภาค โดยนำอนุภาคซิลิกาที่ไม่มีการเคลือบและอนุภาคซิลิกาที่จับกับลิแกนด์ (อย่างละ 5 มิลลิกรัม) มากระจายในไอโซโพรพานอล 5 มิลลิลิตร ทำการอัลตราโซนิคเป็นเวลา 10 นาที กวนเป็นเวลา 5 นาที แล้ววางบนแท่นวางแบบออปติคอลของเครื่อง Mastersizer ทำการวิเคราะห์เทอร์โมกราวิเมตริกด้วยอัตรา 5 องศาเซลเซียสต่อนาที ในช่วงอุณหภูมิ 30 ถึง 800 องศาเซลเซียส
คอลัมน์สแตนเลสแบบรูแคบที่บุด้วยใยแก้ว ขนาด (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) ถูกบรรจุโดยวิธีการเติมสารละลายข้นตามขั้นตอนเดียวกับในเอกสารอ้างอิงที่ 31 คอลัมน์สแตนเลส (บุด้วยใยแก้ว เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) และช่องทางออกที่มีตัวกรองขนาด 1 µm ถูกเชื่อมต่อกับเครื่องบรรจุสารละลายข้น (Alltech Deerfield, IL, USA) เตรียมสารแขวนลอยของเฟสคงที่โดยการแขวนลอยเฟสคงที่ 150 มก. ในเมทานอล 1.2 มล. แล้วป้อนเข้าไปในคอลัมน์เก็บ เมทานอลถูกใช้เป็นตัวทำละลายสารละลายข้นและตัวทำละลายควบคุม บรรจุคอลัมน์โดยใช้แรงดันตามลำดับ 100 MPa เป็นเวลา 10 นาที 80 MPa เป็นเวลา 15 นาที และ 60 MPa เป็นเวลา 30 นาที กระบวนการบรรจุใช้เครื่องสั่นคอลัมน์แก๊สโครมาโทกราฟีสองเครื่อง (Alltech, Deerfield, IL, USA) สำหรับการสั่นสะเทือนทางกลเพื่อให้แน่ใจว่าการบรรจุคอลัมน์มีความสม่ำเสมอ ปิดตัวกั้นสารละลายและค่อยๆ คลายแรงดันเพื่อป้องกันความเสียหายต่อท่อ จากนั้นถอดคอลัมน์ออกจากหัวฉีดสารละลายและติดตั้งอุปกรณ์อีกชิ้นหนึ่งเข้ากับทางเข้าและเชื่อมต่อกับระบบ LC เพื่อทดสอบการทำงาน
ได้สร้าง MLC แบบกำหนดเองโดยใช้ปั๊ม LC (10AD Shimadzu, ญี่ปุ่น), ตัวอย่างที่มีลูปฉีด 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), เครื่องกำจัดฟองอากาศแบบเมมเบรน (Shimadzu DGU-14A) และหน้าต่างแคปิลลารี UV-VIS อุปกรณ์ตรวจจับ (UV-2075) และไมโครคอลัมน์เคลือบ ใช้ท่อเชื่อมต่อที่แคบและสั้นมากเพื่อลดผลกระทบจากการขยายตัวของคอลัมน์เพิ่มเติม หลังจากเติมคอลัมน์แล้ว ให้ติดตั้งแคปิลลารี (50 µm id 365) ที่ทางออกของข้อต่อลดขนาด 1/16″ และติดตั้งแคปิลลารี (50 µm) ที่ข้อต่อลดขนาด การเก็บรวบรวมข้อมูลและการประมวลผลโครมาโทแกรมดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Multichro 2000 ที่ 254 nm ค่าการดูดกลืนแสง UV ของสารวิเคราะห์ถูกตรวจสอบที่ 0 ข้อมูลโครมาโทกราฟิกได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ OriginPro8 (Northampton, MA)
นำอัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ชนิดผงแห้ง (lyophilized powder) ความบริสุทธิ์ ≥ 96% (จากการวิเคราะห์ด้วยเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสแบบอะกาโรส) 3 มิลลิกรัม ผสมกับทริปซิน (1.5 มิลลิกรัม), ยูเรีย 4.0 M (1 มิลลิลิตร) และแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 0.2 M (1 มิลลิลิตร) คนสารละลายเป็นเวลา 10 นาที แล้วนำไปแช่ในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 6 ชั่วโมง จากนั้นเติม TFA 0.1% ปริมาณ 1 มิลลิลิตร เพื่อทำให้ปฏิกิริยาหยุดลง กรองสารละลายและเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิต่ำกว่า 4°C
การแยกส่วนผสมของเปปไทด์และ HSA ที่ผ่านการย่อยด้วยเอนไซม์ทริปซินบนคอลัมน์ PMP ได้รับการประเมินแยกกัน ตรวจสอบการไฮโดรไลซิสด้วยเอนไซม์ทริปซินของส่วนผสมของเปปไทด์และ HSA ที่แยกโดยคอลัมน์ PMP และเปรียบเทียบผลลัพธ์กับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide จำนวนเพลทเชิงทฤษฎีคำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้:
ภาพถ่าย SEM ของอนุภาคซิลิกาบริสุทธิ์และอนุภาคซิลิกาที่จับกับลิแกนด์แสดงอยู่ในรูปที่ 2 ภาพถ่าย SEM ของอนุภาคซิลิกาบริสุทธิ์ (A, B) แสดงให้เห็นรูปร่างทรงกลม โดยที่อนุภาคมีลักษณะยาวหรือมีสมมาตรไม่สม่ำเสมอเมื่อเทียบกับการศึกษาครั้งก่อนของเรา พื้นผิวของอนุภาคซิลิกาที่จับกับลิแกนด์ (C, D) มีความเรียบกว่าอนุภาคซิลิกาบริสุทธิ์ ซึ่งอาจเป็นเพราะสายโซ่โพลีสไตรีนปกคลุมอยู่บนพื้นผิวของอนุภาคซิลิกา
ภาพถ่ายจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกนของอนุภาคซิลิกาบริสุทธิ์ (A, B) และอนุภาคซิลิกาที่จับกับลิแกนด์ (C, D)
การกระจายขนาดอนุภาคของอนุภาคซิลิกาบริสุทธิ์และอนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยลิแกนด์แสดงในรูปที่ 2 3(A) เส้นโค้งการกระจายขนาดอนุภาคตามปริมาตรแสดงให้เห็นว่าขนาดอนุภาคซิลิกาเพิ่มขึ้นหลังจากการดัดแปลงทางเคมี (รูปที่ 3A) ข้อมูลการกระจายขนาดอนุภาคซิลิกาจากการศึกษาปัจจุบันและการศึกษาครั้งก่อนถูกนำมาเปรียบเทียบในตารางที่ 1(A) ขนาดอนุภาคตามปริมาตร d(0.5) ของ PMP คือ 3.36 µm เมื่อเทียบกับค่า ad(0.5) ที่ 3.05 µm ในการศึกษาครั้งก่อนของเรา (อนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยพอลิสไตรีน)34 เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงอัตราส่วนของ PEG ยูเรีย TMOS และกรดอะซิติกในส่วนผสมของปฏิกิริยา การกระจายขนาดอนุภาคของชุดนี้จึงแคบกว่าเมื่อเทียบกับการศึกษาครั้งก่อนของเรา ขนาดอนุภาคของเฟส PMP มีขนาดใหญ่กว่าเล็กน้อยเมื่อเทียบกับเฟสอนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยพอลิสไตรีนที่เราศึกษาไว้ก่อนหน้านี้ นั่นหมายความว่า การปรับปรุงพื้นผิวของอนุภาคซิลิกาด้วยสไตรีน ทำให้เกิดชั้นโพลีสไตรีน (0.97 ไมโครเมตร) บนพื้นผิวซิลิกาเท่านั้น ในขณะที่ในเฟส PMP ความหนาของชั้นอยู่ที่ 1.38 ไมโครเมตร
การกระจายขนาดอนุภาค (A) และการกระจายขนาดรูพรุน (B) ของอนุภาคซิลิกาบริสุทธิ์และอนุภาคซิลิกาที่จับกับลิแกนด์
ขนาดรูพรุน ปริมาตรรูพรุน และพื้นที่ผิวของอนุภาคซิลิกาที่ใช้ในการศึกษานี้แสดงอยู่ในตารางที่ 1 (B) โปรไฟล์ PSD ของอนุภาคซิลิกาบริสุทธิ์และอนุภาคซิลิกาที่จับกับลิแกนด์แสดงอยู่ในรูปที่ 3 (B) ผลลัพธ์ที่ได้เทียบเคียงได้กับการศึกษาครั้งก่อนของเรา34 ขนาดรูพรุนของอนุภาคซิลิกาบริสุทธิ์และอนุภาคซิลิกาที่จับกับลิแกนด์คือ 310 Å และ 241 Å ตามลำดับ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าหลังจากการดัดแปลงทางเคมี ขนาดรูพรุนลดลง 69 Å ดังแสดงในตารางที่ 1 (B) และเส้นโค้งการเปลี่ยนแปลงแสดงอยู่ในรูปที่ 3 พื้นที่ผิวจำเพาะของอนุภาคซิลิกาในการศึกษาปัจจุบันคือ 116 m2/g ซึ่งเทียบเคียงได้กับการศึกษาครั้งก่อนของเรา (124 m2/g) ดังแสดงในตารางที่ 1 (B) พื้นที่ผิว (m2/g) ของอนุภาคซิลิกาหลังจากการดัดแปลงทางเคมีก็ลดลงจาก 116 m2/g เหลือ 105 m2/g
ผลการวิเคราะห์องค์ประกอบทางเคมีของเฟสคงที่แสดงอยู่ในตารางที่ 2 ปริมาณคาร์บอนของเฟสคงที่ในปัจจุบันคือ 6.35% ซึ่งต่ำกว่าในงานวิจัยก่อนหน้าของเรา (อนุภาคซิลิกาที่เกี่ยวข้องกับโพลีสไตรีน 7.93%35 และ 10.21% ตามลำดับ) 42 ปริมาณคาร์บอนของเฟสคงที่ในปัจจุบันต่ำกว่า เนื่องจากมีการใช้ลิแกนด์ขั้วบางชนิด เช่น ฟีนิลมาเลอิไมด์เมทิลไวนิลไอโซไซยาเนต (PCMP) และ 4-ไฮดรอกซี-TEMPO นอกเหนือจากสไตรีนในการเตรียม SP เปอร์เซ็นต์น้ำหนักของไนโตรเจนในเฟสคงที่ในปัจจุบันคือ 2.21% เมื่อเทียบกับ 0.1735 และ 0.85% ในงานวิจัยก่อนหน้า42 ซึ่งหมายความว่าเฟสคงที่ในปัจจุบันมีเปอร์เซ็นต์น้ำหนักของไนโตรเจนสูงเนื่องจากฟีนิลมาเลอิไมด์ ในทำนองเดียวกัน ผลิตภัณฑ์ (4) และ (5) มีปริมาณคาร์บอน 2.7% และ 2.9% ตามลำดับ ในขณะที่ผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย (6) มีปริมาณคาร์บอน 6.35% ดังแสดงในตารางที่ 2 การวิเคราะห์เทอร์โมกราวิเมตริก (TGA) ถูกนำมาใช้กับเฟสคงที่ของ PMP เพื่อทดสอบการสูญเสียน้ำหนัก และเส้นโค้ง TGA แสดงในรูปที่ 4 เส้นโค้ง TGA แสดงการสูญเสียน้ำหนัก 8.6% ซึ่งสอดคล้องกับปริมาณคาร์บอน (6.35%) เป็นอย่างดี เนื่องจากลิแกนด์ไม่เพียงแต่มี C เท่านั้น แต่ยังมี N, O และ H ด้วย
เลือกใช้ลิแกนด์ฟีนิลมาเลอิไมด์-เมทิลไวนิลไอโซไซยาเนตในการปรับเปลี่ยนพื้นผิวของอนุภาคซิลิกา เนื่องจากมีหมู่ฟีนิลมาเลอิไมด์และไวนิลไอโซไซยาเนตที่เป็นขั้ว หมู่ไวนิลไอโซไซยาเนตสามารถทำปฏิกิริยากับสไตรีนได้ต่อไปโดยกระบวนการพอลิเมอไรเซชันแบบอนุมูลอิสระที่มีชีวิต เหตุผลที่สองคือการใส่หมู่ที่มีปฏิสัมพันธ์ปานกลางกับสารวิเคราะห์และไม่มีปฏิสัมพันธ์ทางไฟฟ้าสถิตที่รุนแรงระหว่างสารวิเคราะห์กับเฟสคงที่ เนื่องจากหมู่ฟีนิลมาเลอิไมด์ไม่มีประจุเสมือนที่ค่า pH ปกติ ความเป็นขั้วของเฟสคงที่สามารถควบคุมได้โดยปริมาณสไตรีนที่เหมาะสมและเวลาในการทำปฏิกิริยาของพอลิเมอไรเซชันแบบอนุมูลอิสระ ขั้นตอนสุดท้ายของปฏิกิริยา (พอลิเมอไรเซชันแบบอนุมูลอิสระ) มีความสำคัญอย่างยิ่งเนื่องจากเป็นขั้นตอนที่เปลี่ยนแปลงความเป็นขั้วของเฟสคงที่ การวิเคราะห์ธาตุถูกดำเนินการเพื่อตรวจสอบปริมาณคาร์บอนในเฟสคงที่เหล่านี้ พบว่าการเพิ่มปริมาณสไตรีนและเวลาในการทำปฏิกิริยาจะเพิ่มปริมาณคาร์บอนในเฟสคงที่ และในทางกลับกัน เฟสคงที่ (SP) ที่เตรียมด้วยความเข้มข้นของสไตรีนที่แตกต่างกันจะมีปริมาณคาร์บอนที่แตกต่างกัน ในทำนองเดียวกัน เฟสคงที่เหล่านี้ถูกวางบนคอลัมน์สแตนเลส และตรวจสอบคุณลักษณะทางโครมาโทกราฟี (การเลือกสรร ความละเอียด ค่า N เป็นต้น) จากการทดลองเหล่านี้ จึงได้เลือกองค์ประกอบที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการเตรียมเฟสคงที่ PMP เพื่อให้ได้ขั้วที่ควบคุมได้และการกักเก็บสารวิเคราะห์ที่ดี
นอกจากนี้ ยังมีการประเมินคอลัมน์ PMP สำหรับการวิเคราะห์ส่วนผสมของเปปไทด์ 5 ชนิด (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) โดยใช้ความสามารถของเฟสเคลื่อนที่ 60/40 (v/v) ACN/น้ำ (0.1% TFA) ที่อัตราการไหล 80 µl/min ภายใต้สภาวะการชะล้างที่เหมาะสม (200,000 เพลท/เมตร) จำนวนเพลทเชิงทฤษฎี (N) ต่อคอลัมน์ (100 × 1.8 มม.) คือ 20,000 ± 100 ค่า N สำหรับคอลัมน์ PMP ทั้งสามแสดงในตารางที่ 3 และโครมาโตแกรมแสดงในรูปที่ 5A การวิเคราะห์อย่างรวดเร็วด้วยอัตราการไหลสูง (700 µl/min) บนคอลัมน์ PMP พบว่ามีเปปไทด์ 5 ชนิดที่ถูกชะออกมาภายในหนึ่งนาที โดยมีค่า N ที่ยอดเยี่ยม 13,500 ± 330 ต่อคอลัมน์ (ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 100 x 1.8 มม.) เทียบเท่ากับ 135,000 เพลท/เมตร (รูปที่ 5B) คอลัมน์ขนาดเดียวกัน 3 คอลัมน์ (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 x 1.8 มม.) ถูกบรรจุด้วยเฟสคงที่ PMP ที่แตกต่างกัน 3 ชุด เพื่อทดสอบความสามารถในการทำซ้ำ มีการบันทึกสารวิเคราะห์สำหรับแต่ละคอลัมน์โดยการแยกส่วนผสมทดสอบเดียวกันบนแต่ละคอลัมน์โดยใช้สภาวะการชะที่เหมาะสม จำนวนเพลทเชิงทฤษฎี N และเวลาการกักเก็บ ข้อมูลความสามารถในการทำซ้ำสำหรับคอลัมน์ PMP แสดงในตารางที่ 4 ความสามารถในการทำซ้ำของคอลัมน์ PMP สอดคล้องกับค่า %RSD ที่ต่ำมาก ดังแสดงในตารางที่ 3
การแยกส่วนผสมของเปปไทด์บนคอลัมน์ PMP (B) และคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (A) เฟสเคลื่อนที่ 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%) ขนาดคอลัมน์ PMP (100 x 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) ลำดับการชะล้างของสารประกอบ: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) และ 5 (leucic acid enkephalin)
คอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 x 1.8 มม.) ได้รับการประเมินสำหรับการแยกไฮโดรไลเซตของไตรปซินจากอัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์โดยวิธี HPLC โครมาโตแกรมในรูปที่ 6 แสดงให้เห็นว่าตัวอย่างถูกแยกออกจากกันได้ดีและมีความละเอียดสูง สารละลาย HSA ถูกวิเคราะห์โดยใช้ความเร็วการไหล 100 μl/min เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยอะซีโตไนไตรล์/น้ำ 70/30 และ TFA 0.1% การแตกตัวของ HSA แบ่งออกเป็น 17 พีค ดังแสดงในโครมาโตแกรม (รูปที่ 6) ซึ่งสอดคล้องกับเปปไทด์ 17 ชนิด ประสิทธิภาพการแยกของแต่ละพีคจากไฮโดรไลเซตของ HSA ถูกคำนวณและแสดงค่าไว้ในตารางที่ 5
สารไฮโดรไลเสตของ HSA ที่ได้จากการย่อยด้วยทริปซินถูกแยกบนคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 x 1.8 มม.) ด้วยอัตราการไหล (100 μl/นาที) เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยอะซีโตไนไตรล์/น้ำ ในอัตราส่วน 60/40 และ TFA 0.1%
โดยที่ L คือความยาวของคอลัมน์, η คือความหนืดของเฟสเคลื่อนที่, ΔP คือแรงดันย้อนกลับของคอลัมน์ และ u คือความเร็วเชิงเส้นของเฟสเคลื่อนที่ ค่าการซึมผ่านของคอลัมน์ PMP คือ 2.5 × 10–14 m2 อัตราการไหลคือ 25 µl/min และใช้ ACN/น้ำ ในอัตราส่วน 60/40 v/v ค่าการซึมผ่านของคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) มีค่าใกล้เคียงกับผลการศึกษาอ้างอิงก่อนหน้าของเรา Ref.34 ค่าการซึมผ่านของคอลัมน์ที่บรรจุด้วยอนุภาคที่มีรูพรุนที่ผิวคือ 1.7×10 .6 µm และ 2.5×10-14 m2 สำหรับอนุภาคขนาด 5 µm43 ดังนั้น ค่าการซึมผ่านของเฟส PMP จึงมีค่าใกล้เคียงกับค่าการซึมผ่านของอนุภาคแบบแกนและเปลือกที่มีขนาด 5 µm
โดยที่ Wx คือมวลของคอลัมน์ที่บรรจุคลอโรฟอร์ม, Wy คือมวลของคอลัมน์ที่บรรจุเมทานอล และ ρ คือความหนาแน่นของตัวทำละลาย ความหนาแน่นของเมทานอล (ρ = 0.7866) และคลอโรฟอร์ม (ρ = 1.484) ความพรุนรวมของคอลัมน์อนุภาคซิลิกา-C18 (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน)34 และคอลัมน์ C18-ยูเรีย31 ที่เราศึกษาไว้ก่อนหน้านี้คือ 0.63 และ 0.55 ตามลำดับ ซึ่งหมายความว่าการมีอยู่ของลิแกนด์ยูเรียช่วยลดการซึมผ่านของเฟสคงที่ ในทางกลับกัน ความพรุนรวมของคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) คือ 0.60 คอลัมน์ PMP มีความซึมผ่านได้น้อยกว่าคอลัมน์ที่บรรจุด้วยอนุภาคซิลิกาที่ยึดติดกับ C18 เนื่องจากในเฟสคงที่แบบ C18 นั้น ลิแกนด์ C18 จะยึดติดกับอนุภาคซิลิกาในสายโซ่เชิงเส้น ในขณะที่ในเฟสคงที่แบบโพลีสไตรีนนั้น จะมีพอลิเมอร์ที่ค่อนข้างหนาเกิดขึ้นรอบๆ อนุภาค ในการทดลองทั่วไป ความพรุนของคอลัมน์จะคำนวณได้ดังนี้:
ภาพที่ 7A และ 7B แสดงกราฟ Van Deemter สำหรับคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 x 1.8 มม.) และคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 x 1.8 มม.) ภายใต้สภาวะการชะล้างเดียวกัน คือ 60/40 ACN/H2O และ 0.1% TFA ที่อัตราการไหล 20 µl/min ถึง 800 µl/min สำหรับทั้งสองคอลัมน์ ค่า HETP ต่ำสุดที่อัตราการไหลที่เหมาะสม (80 µl/min) คือ 2.6 µm และ 3.9 µm สำหรับคอลัมน์ PMP และคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide ตามลำดับ ค่า HETP แสดงให้เห็นว่าประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 x 1.8 มม.) สูงกว่าคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 x 1.8 มม.) ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์มาก กราฟ van Deemter ในรูปที่ 7(A) แสดงให้เห็นว่าการลดลงของค่า N ไม่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่ออัตราการไหลเพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับการศึกษาครั้งก่อนของเรา ประสิทธิภาพการแยกที่สูงกว่าของคอลัมน์ PMP (id 100 × 1.8 มม.) เมื่อเทียบกับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide นั้นขึ้นอยู่กับรูปร่างและขนาดของอนุภาคที่ดีขึ้นและขั้นตอนการบรรจุคอลัมน์ที่ซับซ้อนที่ใช้ในงานปัจจุบัน34
(A) กราฟ Van Deemter (HETP เทียบกับความเร็วเชิงเส้นของเฟสเคลื่อนที่) ที่ได้จากคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 x 1.8 มม.) ในสารละลาย 60/40 ACN/H2O ที่มี TFA 0.1% (B) กราฟ Van Deemter (HETP เทียบกับความเร็วเชิงเส้นของเฟสเคลื่อนที่) ที่ได้จากคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 x 1.8 มม.) ในสารละลาย 60/40 ACN/H2O ที่มี TFA 0.1%
ได้มีการเตรียมและประเมินเฟสคงที่แบบมีขั้วของพอลิสไตรีนแทรกสอดสำหรับการแยกส่วนผสมของเปปไทด์สังเคราะห์และไฮโดรไลเซตของอัลบูมินในซีรัมมนุษย์ (HSA) ด้วยโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง ประสิทธิภาพการแยกสารของคอลัมน์ PMP สำหรับส่วนผสมของเปปไทด์นั้นยอดเยี่ยมในแง่ของประสิทธิภาพการแยกและความละเอียด ประสิทธิภาพการแยกที่ดีขึ้นของคอลัมน์ PMP เกิดจากหลายสาเหตุ เช่น ขนาดอนุภาคซิลิกาและขนาดรูพรุน การสังเคราะห์เฟสคงที่ที่ควบคุมได้ และวัสดุบรรจุคอลัมน์ที่ซับซ้อน นอกจากประสิทธิภาพการแยกที่สูงแล้ว ข้อดีอีกประการหนึ่งของเฟสคงที่นี้คือแรงดันย้อนกลับของคอลัมน์ต่ำที่อัตราการไหลสูง คอลัมน์ PMP มีความแม่นยำสูงและสามารถใช้ในการวิเคราะห์ส่วนผสมของเปปไทด์และการย่อยโปรตีนต่างๆ ด้วยเอนไซม์ทริปซิน เราตั้งใจที่จะใช้คอลัมน์นี้สำหรับการแยกสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากผลิตภัณฑ์ธรรมชาติ สารสกัดจากพืชสมุนไพร และเห็ดในโครมาโทกราฟีของเหลว ในอนาคต คอลัมน์ PMP จะได้รับการประเมินสำหรับการแยกโปรตีนและโมโนโคลนอลแอนติบอดีด้วย
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. การตรวจสอบระบบการแยกเปปไทด์ด้วยโครมาโทกราฟีแบบเฟสผกผัน ตอนที่ 1: การพัฒนากระบวนการสำหรับการกำหนดลักษณะเฉพาะของคอลัมน์ Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. การตรวจสอบระบบการแยกเปปไทด์ด้วยโครมาโทกราฟีแบบเฟสผกผัน ตอนที่ 1: การพัฒนากระบวนการสำหรับการกำหนดลักษณะเฉพาะของคอลัมน์Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. และ Petersson, P. การตรวจสอบระบบการแยกเปปไทด์โดยโครมาโทกราฟีแบบเฟสผกผัน ตอนที่ 1: การพัฒนากระบวนการสำหรับการกำหนดลักษณะเฉพาะของคอลัมน์ Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. การตรวจสอบระบบการแยกเปปไทด์ด้วยโครมาโทกราฟีแบบเฟสผกผัน ตอนที่ 1: การพัฒนากระบวนการสำหรับลักษณะเฉพาะของคอลัมน์ Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. การตรวจสอบระบบการแยกเปปไทด์ด้วยโครมาโทกราฟีแบบเฟสผกผัน ตอนที่ 1: การพัฒนากระบวนการสำหรับลักษณะเฉพาะของคอลัมน์Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H. และ Petersson, P. การตรวจสอบระบบการแยกเปปไทด์โดยโครมาโทกราฟีแบบเฟสผกผัน ตอนที่ 1: การพัฒนากระบวนการสำหรับการกำหนดลักษณะเฉพาะของคอลัมน์J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. และคณะ วิธีการสร้างเปปไทด์ออกฤทธิ์ที่ดีขึ้นสำหรับการรักษาโรคติดเชื้อ เทคโนโลยีชีวภาพ ความสำเร็จ 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018)
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. และ Khrestchatisky, M. เปปไทด์บำบัดสังเคราะห์: วิทยาศาสตร์และตลาด Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. และ Khrestchatisky, M. เปปไทด์บำบัดสังเคราะห์: วิทยาศาสตร์และตลาดVliege P, Lisowski V, Martinez J และ Chreschatyski M. เปปไทด์บำบัดสังเคราะห์: วิทยาศาสตร์และตลาดVliege P, Lisowski V, Martinez J และ Khreschatsky M. เปปไทด์บำบัดสังเคราะห์: วิทยาศาสตร์และตลาด การค้นพบยา Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010)
Xie, F., Smith, RD และ Shen, Y. โครมาโทกราฟีของเหลวเชิงโปรตีนขั้นสูง Xie, F., Smith, RD และ Shen, Y. โครมาโทกราฟีของเหลวเชิงโปรตีนขั้นสูงดู F., Smith RD และ Shen Yu. Advanced proteomic liquid chromatography. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. องค์ประกอบโปรตีนขั้นสูง 液相色谱。ดู F., Smith RD และ Shen Yu. Advanced proteomic liquid chromatography.J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. และคณะ โครมาโทกราฟีของเหลวขั้นสูง-แมสสเปกโทรเมตรีสามารถรวมเมตาโบลิกส์และโปรตีโอมิกส์แบบกว้างๆ ได้ วารสารเคมีทวารหนัก 1069, 89–97 (2019)
เชสนัท, เอสเอ็ม และ ซอลส์เบอรี, เจเจ บทบาทของ UHPLC ในการพัฒนายา เชสนัท, เอสเอ็ม และ ซอลส์เบอรี, เจเจ บทบาทของ UHPLC ในการพัฒนายาเชสนัต, เอสเอ็ม และ ซอลส์เบอรี, เจเจ บทบาทของ UHPLC ในการพัฒนายาChesnut, SM และ Salisbury, JJ บทบาทของ UHPLC ในการพัฒนายา J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007)
Wu, N. & Clausen, AM แง่มุมพื้นฐานและเชิงปฏิบัติของโครมาโทกราฟีของเหลวความดันสูงพิเศษสำหรับการแยกอย่างรวดเร็ว Wu, N. & Clausen, AM แง่มุมพื้นฐานและเชิงปฏิบัติของโครมาโทกราฟีของเหลวความดันสูงพิเศษสำหรับการแยกอย่างรวดเร็วWu, N. และ Clausen, AM แง่มุมพื้นฐานและเชิงปฏิบัติของโครมาโทกราฟีของเหลวความดันสูงสำหรับการแยกอย่างรวดเร็ว Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方เลดี้。 Wu, N. และ Clausen, AM. แง่มุมพื้นฐานและเชิงปฏิบัติของโครมาโทกราฟีของเหลวแรงดันสูงพิเศษสำหรับการแยกอย่างรวดเร็วWu, N. และ Clausen, AM แง่มุมพื้นฐานและเชิงปฏิบัติของโครมาโทกราฟีของเหลวความดันสูงสำหรับการแยกอย่างรวดเร็วJ. กันยายน วิทยาศาสตร์. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA และ Tchelitcheff, P. การใช้โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษในการพัฒนายา Wren, SA และ Tchelitcheff, P. การใช้โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษในการพัฒนายาRen, SA และ Chelischeff, P. การใช้โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษในการพัฒนายา Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物เปิด发中的应用。 เรน, เอสเอ และ เชลิเชฟฟ์, พี.Ren, SA และ Chelischeff, P. การประยุกต์ใช้โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษในการพัฒนายาJ. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. และคณะ ไฮโดรเจลมาโครพอรัสแบบโมโนลิธิกที่ได้จากอิมัลชันน้ำมันในน้ำที่มีเฟสภายในสูงเพื่อการทำให้บริสุทธิ์ของเอนเทอโรไวรัส 71 อย่างมีประสิทธิภาพ วารสารโครงการเคมี 401, 126051 (2020)
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. และ Wilkins, JA บทบาทของโครมาโทกราฟีของเหลวในโปรตีโอมิกส์ Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. และ Wilkins, JA บทบาทของโครมาโทกราฟีของเหลวในโปรตีโอมิกส์Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. และ Wilkins, JA บทบาทของโครมาโทกราฟีของเหลวในโปรตีโอมิกส์ Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. และ Wilkins, JA บทบาทของโครมาโทกราฟีของเหลวในโปรตีโอมิกส์J. Chromatography. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
เฟเคเต, เอส., วูเตย์, เจ.-แอล. & Guillarme, D. แนวโน้มใหม่ในการแยกสารเปปไทด์และโปรตีนทางการรักษาด้วยวิธีโครมาโทกราฟีของเหลวแบบย้อนกลับ: ทฤษฎีและการประยุกต์ใช้ & Guillarme, D. แนวโน้มใหม่ในการแยกสารเปปไทด์และโปรตีนทางการรักษาด้วยวิธีโครมาโทกราฟีของเหลวแบบย้อนกลับ: ทฤษฎีและการประยุกต์ใช้ & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. แนวโน้มใหม่ในการแยกเปปไทด์และโปรตีนทางการรักษาโดยโครมาโทกราฟีของเหลวแบบย้อนกลับ: ทฤษฎีและการประยุกต์ใช้ & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 และ กิลลาร์ม, ดี.และ Guillarmé, D. แนวโน้มใหม่ในการแยกเปปไทด์และโปรตีนทางการรักษาโดยโครมาโทกราฟีของเหลวแบบย้อนกลับ: ทฤษฎีและการประยุกต์ใช้J. Pharm. Biomedical Science. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE และ Gebler, JC การแยกเปปไทด์แบบสองมิติโดยใช้ระบบ RP-RP-HPLC ที่มีค่า pH ต่างกันในมิติการแยกแรกและมิติการแยกที่สอง Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE และ Gebler, JC การแยกเปปไทด์แบบสองมิติโดยใช้ระบบ RP-RP-HPLC ที่มีค่า pH ต่างกันในมิติการแยกแรกและมิติการแยกที่สองGilar M., Olivova P., Dali AE และ Gebler JK การแยกเปปไทด์แบบสองมิติโดยใช้ระบบ RP-RP-HPLC ที่มีค่า pH ต่างกันในมิติการแยกแรกและมิติการแยกที่สองGilar M., Olivova P., Dali AE และ Gebler JK การแยกเปปไทด์แบบสองมิติโดยใช้ค่า pH ที่แตกต่างกันในมิติการแยกแรกและมิติการแยกที่สองโดยใช้ระบบ RP-RP-HPLC J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005)
Fellitti, S. และคณะ การตรวจสอบการถ่ายโอนมวลและลักษณะจลนศาสตร์ของคอลัมน์โครมาโทกราฟีประสิทธิภาพสูงที่บรรจุด้วยอนุภาค C18 ที่มีรูพรุนเต็มที่และมีรูพรุนเฉพาะผิวที่มีขนาดเล็กกว่า 2 µm J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020)
Piovesana, S. และคณะ แนวโน้มล่าสุดและความท้าทายในการวิเคราะห์ในการแยก การระบุ และการตรวจสอบความถูกต้องของเปปไทด์ชีวแอคทีฟจากพืช ทวารหนัก สิ่งมีชีวิต ทวารหนัก เคมี 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018)
Muller, JB และคณะ ภูมิทัศน์โปรตีโอมิกส์ของอาณาจักรแห่งชีวิต Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020)
De Luca, K. และคณะ การบำบัดหลังการผลิตเปปไทด์บำบัดด้วยโครมาโทกราฟีของเหลวแบบเตรียม Molecules (Basel, Switzerland) 26(15), 4688 (2021)
หยาง, วาย. และ เกิง, เอ็กซ์. โครมาโทกราฟีแบบผสมและการประยุกต์ใช้กับไบโอโพลีเมอร์ หยาง, วาย. และ เกิง, เอ็กซ์. โครมาโทกราฟีแบบผสมและการประยุกต์ใช้กับไบโอโพลีเมอร์หยาง, ยู และ เกิง, เอ็กซ์ โครมาโทกราฟีแบบผสมและการประยุกต์ใช้กับไบโอโพลีเมอร์ Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 หยาง, วาย. และ เกิง, เอ็กซ์. โครมาโทกราฟีแบบผสมและการประยุกต์ใช้ในไบโอโพลีเมอร์หยาง, ยู และ จีน, เอ็กซ์. โครมาโทกราฟีแบบผสมและการประยุกต์ใช้กับไบโอโพลีเมอร์J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).