Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Naggamit ka og bersyon sa browser nga limitado ang suporta sa CSS. Para sa pinakamaayong kasinatian, among girekomendar nga mogamit ka og updated nga browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Dugang pa, aron masiguro ang padayon nga suporta, among gipakita ang site nga walay mga style ug JavaScript.
Nagpakita og carousel nga gilangkoban og tulo ka slide sa usa ka higayon. Gamita ang mga buton nga Previous ug Next aron mobalhin sa tulo ka slide matag higayon, o gamita ang mga buton sa slider sa katapusan aron mobalhin sa tulo ka slide matag higayon.
Ang mga porous silica particle giandam pinaagi sa sol-gel method nga adunay pipila ka mga pagbag-o aron makakuha og mga wide-pore particle. Kini nga mga particle gi-derivatize gamit ang N-phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate (PMI) ug styrene pinaagi sa reverse chain transfer-fragmentation (RAFT) polymerization aron makahimo og N-phenylmaleimide intercalated polyamides. Ang Styrene (PMP) stationary phase. Ang narrow bore stainless steel columns (100 × 1.8 mm inner diameter) gi-pack gamit ang slurry packing. Ang chromatographic performance sa PMP column gisusi aron ibulag ang usa ka sagol nga synthetic peptides nga gilangkoban sa lima ka peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amino acid enkephalin) ug tryptic hydrolyzate sa human serum albumin (HAS). Ubos sa optimal elution conditions, ang theoretical number sa mga plates nga adunay sagol nga peptides miabot sa 280,000 ka plates/sq.m. Sa pagtandi sa separation performance sa naugmad nga kolum sa komersyal nga Ascentis Express RP-Amide column, naobserbahan nga ang separation efficiency sa PMP column mas maayo kay sa komersyal nga kolum sa termino sa separation efficiency ug resolution.
Ang industriya sa biopharmaceutical nahimong usa ka nagkalapad nga merkado sa tibuok kalibutan nga adunay dakong pagtaas sa bahin sa merkado sa bag-ohay nga mga tuig. Uban sa kusog nga pagtubo sa industriya sa biopharmaceutical1,2,3 adunay dakong panginahanglan alang sa pag-analisar sa peptide ug protina. Gawas pa sa target nga peptide, lain-laing mga hugaw ang naporma atol sa peptide synthesis, busa gikinahanglan ang chromatographic purification aron makuha ang gitinguha nga kaputli sa peptide. Ang pag-analisar ug pag-ila sa mga protina sa mga pluwido sa lawas, mga tisyu, ug mga selula usa ka mahagiton nga buluhaton tungod sa daghang gidaghanon sa mga posibleng makit-an nga mga espisye nga anaa sa usa ka sample. Bisan tuod ang mass spectrometry usa ka epektibo nga himan alang sa pag-sequencing sa mga peptide ug protina, kung ang maong mga sample direktang ipaila sa mass spectrometer, ang pagbulag dili makatagbaw. Kini nga problema masulbad pinaagi sa paghimo sa liquid chromatography (LC) sa dili pa ang MS analysis, nga makapakunhod sa gidaghanon sa mga analyte nga mosulod sa mass spectrometer sa usa ka gihatag nga oras4,5,6. Dugang pa, ang mga analyte mahimong mag-concentrate sa usa ka pig-ot nga rehiyon atol sa liquid phase separation, sa ingon nag-concentrate niini nga mga analyte ug nagdugang sa pagkasensitibo sa MS detection. Ang liquid chromatography (LC) miuswag pag-ayo sa miaging dekada ug nahimong kaylap nga gigamit nga pamaagi alang sa proteomic analysis7,8,9,10.
Ang reverse-phase liquid chromatography (RP-LC) kay kaylap nga gigamit sa pagputli ug pagbulag sa mga sagol sa mga peptide gamit ang octadecyl-modified silica (ODS) isip stationary phase11,12,13. Apan, tungod sa ilang komplikado nga istruktura ug amphoteric nga kinaiya,14,15 ang RP stationary phases dili makahatag og makatagbaw nga pagbulag sa mga peptide ug protina. Busa, ang pag-analisar sa mga peptide ug protina nga adunay polar ug non-polar nga mga tipik nanginahanglan og espesyal nga gidisenyo nga stationary phases aron makig-uban ug magpabilin kini nga mga analyte16. Ang mixed chromatography, nga nagtanyag og multimodal interactions, mahimong alternatibo sa RP-LC alang sa pagbulag sa mga peptide, protina, ug uban pang komplikado nga mga sagol. Daghang mixed-type stationary phases ang giandam ug ang mga kolum nga puno niining stationary phases gigamit sa pagbulag sa mga peptide ug protina17,18,19,20,21. Tungod sa presensya sa polar ug non-polar nga mga grupo, ang mixed mode stationary phases (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar intercalation/RPLC) angay alang sa pagbulag sa mga peptide ug protina22,23,24,25,26,27,28. , ang polar intercalated stationary phases nga adunay covalently bonded polar groups nagpakita og maayong kapabilidad sa pagbulag ug talagsaon nga selectivity para sa polar ug non-polar analytes tungod kay ang pagbulag nagdepende sa interaksyon tali sa analyte ug sa stationary phase. Multimodal interactions 29,30,31,32. Bag-ohay lang, si Zhang et al. 30 nakakuha og behenyl-terminated stationary phases sa mga polyamines ug malampusong nakabulag sa mga hydrocarbons, antidepressants, flavonoids, nucleosides, estrogens, ug uban pang mga analyte. Ang polar embedded stationary material adunay polar ug non-polar nga mga grupo, busa magamit kini sa pagbulag sa mga peptide ug protina ngadto sa hydrophobic ug hydrophilic nga mga bahin. Ang mga polar inline column (pananglitan, C18 column nga adunay amide inline) anaa ubos sa trade name nga Ascentis Express RP-Amide column, apan kini nga mga column gigamit lamang alang sa pag-analisa sa amine 33.
Sa kasamtangang pagtuon, usa ka polar embedding stationary phase (N-phenylmaleimide, embedding polystyrene) ang giandam ug gisusi alang sa peptide separation ug tryptic HSA cleavage. Ang mosunod nga estratehiya gigamit aron maandam ang stationary phase. Ang mga porous silica particle giandam sumala sa mga pamaagi nga gihulagway sa among nangaging mga publikasyon, nga adunay pipila ka mga pagbag-o sa mga preparation scheme 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Ang mga ratio sa urea, polyethylene glycol (PEG), TMOS ug aqueous-acetic acid gi-adjust aron makakuha og mga silica particle nga adunay dagkong mga pore size. Ikaduha, usa ka bag-ong phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate ligand ang gi-synthesize ug ang derivatized silica particles niini gigamit aron maandam ang polar embedded stationary phases. Ang nakuha nga stationary phase giputos sa usa ka stainless steel column (inner diameter 100 × 1.8 mm) sumala sa usa ka optimized packing scheme. Ang pagputos sa column gitabangan sa mechanical vibration aron masiguro ang usa ka uniporme nga layer sulod sa column. Ang packed column gisusi alang sa pagbulag sa usa ka sagol nga mga peptide nga gilangkoban sa lima ka peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin peptide), ug tryptic hydrolysates sa human serum albumin (HSA). Naobserbahan nga ang sagol nga peptide ug ang HSA tryptic digest nagbulag nga adunay maayong resolusyon ug kahusayan. Ang kahusayan sa pagbulag sa PMP column gitandi sa Ascentis Express RP-Amide column. Naobserbahan nga ang mga peptide ug protina adunay maayong resolusyon ug taas nga kahusayan sa pagbulag sa PMP column, ug ang kahusayan sa pagbulag sa PMP column mas taas kaysa sa Ascentis Express RP-Amide column.
PEG (polyethylene glycol), urea, acetic acid, trimethoxyorthosilicate (TMOS), trimethylchlorosilane (TMCS), trypsin, human serum albumin (HSA), ammonium chloride, urea, hexamethylmethacryloyldisilazane (HMDS), methacryloyl chloride (MC), styrene, 4-hydroxy-TEMPO, benzoyl peroxide (BPO), acetonitrile (ACN) para sa HPLC, methanol, 2-propanol ug acetone. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
Usa ka sagol nga urea (8 g), polyethylene glycol (8 g) ug 8 ml nga 0.01 N. acetic acid ang gikutaw sulod sa 10 ka minuto, ug 24 ml nga TMOS ang gidugang niini ubos sa ice-cooling. Ang sagol nga reaksyon gipainit sa 40°C sulod sa 6 ka oras ug dayon sa 120°C sulod sa 8 ka oras sa usa ka stainless steel autoclave. Ang tubig gi-decant ug ang nahabilin gipauga sa 70°C sulod sa 12 ka oras. Ang mga uga nga humok nga bloke gigaling nga hapsay ug gi-calcine sa oven sa 550°C sulod sa 12 ka oras. Tulo ka batch ang giandam ug gi-characterize aron masulayan ang reproducibility sa mga gidak-on sa partikulo, gidak-on sa pore ug surface area.
Polar group ug stationary phase para sa mga polystyrene chain. Ang pamaagi sa pag-andam gihulagway sa ubos.
Ang N-phenylmaleimide (200 mg) ug methyl vinyl isocyanate (100 mg) gitunaw sa anhydrous toluene, ug dayon 0.1 ml nga 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) ang gidugang sa reaction flask aron makakuha og copolymer sa phenylmaleimide ug methyl vinyl isocyanate (PMCP). ) Ang sagol gipainit sa 60°C sulod sa 3 ka oras, gisala ug gipauga sa oven sa 40°C sulod sa 3 ka oras.
Ang mga uga nga partikulo sa silica (2 g) gisabwag sa uga nga toluene (100 ml), gikutaw ug gi-sonicate sulod sa 10 min sa usa ka 500 ml nga round bottom flask. Ang PMCP (10 mg) gitunaw sa toluene ug gidugang nga tinulo sa reaction flask pinaagi sa usa ka addition funnel. Ang sagol gi-reflux sa 100°C sulod sa 8 ka oras, gisala, gihugasan gamit ang acetone ug gipauga sa 60°C sulod sa 3 ka oras. Dayon, ang mga partikulo sa silica nga nalangkit sa PMCP (100 g) gitunaw sa toluene (200 ml), ug ang 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) gidugang niini uban sa presensya sa 100 μl nga dibutyltin dilaurate isip catalyst. Ang sagol gikutaw sa 50°C sulod sa 8 ka oras, gisala ug gipauga sa 50°C sulod sa 3 ka oras.
Ang Styrene (1 ml), benzoyl peroxide BPO (0.5 ml) ug mga partikulo sa silica nga gilakip sa TEMPO-PMCP (1.5 g) gisabwag sa toluene ug gilimpyohan gamit ang nitroheno. Ang polimerisasyon sa styrene gihimo sa 100°C sulod sa 12 ka oras. Ang resulta nga produkto gihugasan gamit ang methanol ug gipauga sa tibuok gabii sa 60°C. Ang kinatibuk-ang eskema sa reaksyon gipakita sa fig. uno.
Ang mga sample gi-degassed sa 393 K sulod sa 1 ka oras hangtod nga makuha ang nahabilin nga pressure nga ubos sa 10–3 Torr. Ang gidaghanon sa N2 nga na-adsorb sa relative pressure nga P/P0 = 0.99 gigamit aron mahibal-an ang kinatibuk-ang pore volume. Ang morphology sa puro ug ligand-bound silica particles gisusi gamit ang scanning electron microscope (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Ang mga dry sample (pure silica ug ligand-bound silica particles) gibutang sa mga aluminum rod gamit ang carbon tape. Ang bulawan gideposito sa sample gamit ang Q150T sputtering device, ug usa ka 5 nm nga gibag-on nga Au layer ang gideposito sa sample. Kini nagpauswag sa efficiency sa low voltage process ug naghatag og pino nga cold spraying. Ang elemental analysis gihimo gamit ang Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elemental composition analyzer. Usa ka Malvern particle size analyzer (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 ang gigamit aron makuha ang particle size distribution. Ang mga uncoated silica particles ug ligand-bound silica particles (5 mg matag usa) gisabwag sa 5 ml nga isopropanol, gi-sonicate sulod sa 10 ka minuto, gi-uyog sulod sa 5 ka minuto, ug gibutang sa usa ka Mastersizer optical bench. Ang thermogravimetric analysis gihimo sa rate nga 5 °C kada minuto sa temperatura nga gikan sa 30 hangtod 800 °C.
Ang mga haligi nga stainless steel nga gilibutan og glass fiber lining nga may mga dimensyon (ID 100 × 1.8 mm) giputos gamit ang slurry filling method nga nagsunod sa parehas nga pamaagi sama sa reference 31. Ang stainless steel column (gilibutan og bildo, ID 100 × 1 .8 mm) ug usa ka outlet nga adunay 1 µm frit gikonektar sa usa ka slurry packaging machine (Alltech Deerfield, IL, USA). Pag-andam og suspension sa stationary phase pinaagi sa pagsuspinde sa 150 mg sa stationary phase sa 1.2 ml nga methanol ug pagpakaon niini sa usa ka reservoir column. Ang methanol gigamit isip slurry solvent ug control solvent. I-pack ang column pinaagi sa pag-apply og pressure sequence nga 100 MP sulod sa 10 min, 80 MP sulod sa 15 min, ug 60 MP sulod sa 30 min. Ang proseso sa pagputos migamit og duha ka gas chromatography column vibrators (Alltech, Deerfield, IL, USA) para sa mechanical vibration aron masiguro ang uniporme nga pagputos sa column. Sirad-i ang slurry packer ug hinayhinay nga buhian ang pressure aron malikayan ang kadaot sa string. Ang kolum gitangtang sa higot gikan sa slurry nozzle ug laing fitting ang gilakip sa inlet ug gikonektar sa LC system aron sulayan ang operasyon niini.
Usa ka custom MLC ang gihimo gamit ang LC pump (10AD Shimadzu, Japan), usa ka sampler nga adunay 50 nL injection loop (Valco (USA) C14 W.05), usa ka membrane degasser (Shimadzu DGU-14A), ug usa ka UV-VIS capillary window. Detector device (UV-2075) ug enamelled microcolumn. Gamita ang pig-ot ug mubo nga connecting tubes aron maminusan ang epekto sa dugang nga column expansion. Human mapuno ang column, i-install ang capillary (50 µm id 365) sa outlet sa 1/16″ reducing junction ug i-install ang capillary (50 µm) sa reducing junction. Ang pagkolekta sa datos ug pagproseso sa chromatogram gihimo gamit ang Multichro 2000 software. Sa 254 nm, ang UV absorbance sa mga subject analytes gimonitor sa 0. Ang chromatographic data gi-analisa gamit ang OriginPro8 (Northampton, MA).
Human serum albumin, lyophilized powder, ≥ 96% (agarose gel electrophoresis) 3 mg nga gisagol sa trypsin (1.5 mg), 4.0 M urea (1 ml) ug 0.2 M ammonium bicarbonate (1 ml). Ang solusyon gikutaw sulod sa 10 minutos ug gibutang sa usa ka water bath sa 37°C sulod sa 6 ka oras, dayon gipalong gamit ang 1 ml nga 0.1% TFA. Salaa ang solusyon ug tipigi ubos sa 4°C.
Ang pagbulag sa usa ka sagol nga peptides ug tryptic digest HSA sa usa ka PMP column gisusi nga gilain. Susiha ang tryptic hydrolysis sa usa ka sagol nga peptides ug HSA nga gibulag sa usa ka PMP column ug itandi ang mga resulta sa usa ka Ascentis Express RP-Amide column. Ang gidaghanon sa theoretical plates gikalkulo gamit ang mosunod nga equation:
Ang mga hulagway sa SEM sa puro nga mga partikulo sa silica ug mga partikulo sa silica nga nakagapos sa ligand gipakita sa Figure 2. Ang mga hulagway sa SEM sa puro nga mga partikulo sa silica (A, B) nagpakita og lingin nga porma diin ang mga partikulo gipahaba o adunay dili regular nga simetriya kon itandi sa among nangaging mga pagtuon. Ang nawong sa mga partikulo sa silica nga nakagapos sa ligand (C, D) mas hamis kay sa puro nga mga partikulo sa silica, nga mahimong tungod sa mga kadena sa polystyrene nga nagtabon sa nawong sa mga partikulo sa silica.
Mga scanning electron micrograph sa purong silica particles (A, B) ug ligand bound silica particles (C, D).
Ang distribusyon sa gidak-on sa partikulo sa puro nga mga partikulo sa silica ug mga partikulo sa silica nga nakagapos sa ligand gipakita sa Fig. 2. 3(A). Ang mga kurba sa distribusyon sa gidak-on sa partikulo sa volumetric nagpakita nga ang gidak-on sa partikulo sa silica misaka human sa pagbag-o sa kemikal (Fig. 3A). Ang datos sa distribusyon sa gidak-on sa partikulo sa silica gikan sa kasamtangang pagtuon ug sa miaging pagtuon gitandi sa Table 1(A). Ang volumetric nga gidak-on sa partikulo nga d(0.5) sa PMP kay 3.36 µm, kon itandi sa bili sa ad(0.5) nga 3.05 µm sa among miaging pagtuon (mga partikulo sa polystyrene bonded silica)34. Tungod sa pagbag-o sa ratio sa PEG, urea, TMOS ug acetic acid sa sagol nga reaksyon, ang distribusyon sa gidak-on sa partikulo niini nga batch mas pig-ot kon itandi sa among miaging pagtuon. Ang gidak-on sa partikulo sa PMP phase gamay nga mas dako kaysa sa polystyrene bound silica particle phase nga among gitun-an ganina. Kini nagpasabot nga ang surface functionalization sa silica particles nga adunay styrene nagdeposito lamang og polystyrene layer (0.97 µm) sa silica surface, samtang sa PMP phase ang gibag-on sa layer kay 1.38 µm.
Distribusyon sa gidak-on sa partikulo (A) ug distribusyon sa gidak-on sa pore (B) sa puro nga mga partikulo sa silica ug mga partikulo sa silica nga nalambigit sa ligand.
Ang gidak-on sa pore, gidaghanon sa pore, ug gilapdon sa nawong sa mga partikulo sa silica nga gigamit niini nga pagtuon gipakita sa Table 1 (B). Ang mga PSD profile sa puro nga mga partikulo sa silica ug mga partikulo sa silica nga nakagapos sa ligand gipakita sa Figs. 3(B). Ang mga resulta ikatandi sa among miaging pagtuon34. Ang gidak-on sa pore sa puro ug mga partikulo sa silica nga nakagapos sa ligand kay 310 Å ug 241 Å, matag usa, nga nagpakita nga human sa kemikal nga pagbag-o, ang gidak-on sa pore mikunhod og 69 Å, sama sa gipakita sa Table 1 (B), ug ang shift curve gipakita sa Fig. Ang piho nga gilapdon sa nawong sa mga partikulo sa silica sa kasamtangang pagtuon kay 116 m2/g, nga ikatandi sa among miaging pagtuon (124 m2/g). Sama sa gipakita sa Table 1(B), ang gilapdon sa nawong (m2/g) sa mga partikulo sa silica human sa kemikal nga pagbag-o mikunhod usab gikan sa 116 m2/g ngadto sa 105 m2/g.
Ang mga resulta sa elemental analysis sa stationary phase gipakita sa Table. 2. Ang carbon content sa kasamtangang stationary phase kay 6.35%, nga mas ubos kay sa among miaging pagtuon (mga silica particle nga nalangkit sa polystyrene, 7.93%35 ug 10.21%, matag usa) 42. Ang carbon content sa kasamtangang stationary phase sa ubos, tungod kay ang ubang polar ligands sama sa phenylmaleimide methyl vinyl isocyanate (PCMP) ug 4-hydroxy-TEMPO gigamit dugang sa styrene sa pag-andam sa SP. Ang weight percentage sa nitrogen sa kasamtangang stationary phase kay 2.21% kon itandi sa 0.1735 ug 0.85% sa miaging mga pagtuon 42. Kini nagpasabot nga ang kasamtangang stationary phase adunay taas nga weight percentage sa nitrogen tungod sa phenylmaleimide. Susama, ang mga produkto (4) ug (5) adunay sulod nga carbon nga 2.7% ug 2.9%, matag usa, samtang ang katapusang produkto (6) adunay sulod nga carbon nga 6.35%, sama sa gipakita sa Table 2. Ang Thermogravimetric analysis (TGA) gigamit sa stationary phase sa PMP aron masulayan ang pagkawala sa timbang, ug ang TGA curve gipakita sa Figure 4. Ang TGA curve nagpakita sa pagkawala sa timbang nga 8.6%, nga nahiuyon sa sulod sa carbon (6.35%), tungod kay ang mga ligand dili lamang adunay C, apan lakip usab ang N, O ug H.
Ang ligand nga phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate gipili aron usbon ang nawong sa mga partikulo sa silica tungod sa polar nga phenylmaleimide ug vinylisocyanate nga mga grupo niini. Ang mga grupo sa vinyl isocyanate mahimong dugang nga mo-react sa styrene pinaagi sa buhing radical polymerization. Ang ikaduha nga hinungdan mao ang pagsal-ot sa usa ka grupo nga adunay kasarangan nga interaksyon sa analyte ug walay kusog nga electrostatic interaction tali sa analyte ug sa stationary phase, tungod kay ang phenylmaleimide moiety walay virtual charge sa normal nga pH. Ang polarity sa stationary phase mahimong makontrol sa labing maayo nga kantidad sa styrene ug sa oras sa reaksyon sa free radical polymerization. Ang katapusang lakang sa reaksyon (free radical polymerization) kritikal tungod kay kini nag-usab sa polarity sa stationary phase. Gihimo ang elemental analysis aron masusi ang carbon content niining mga stationary phase. Naobserbahan nga ang pagdugang sa kantidad sa styrene ug ang oras sa reaksyon nagdugang sa carbon content sa stationary phase ug vice versa. Ang mga SP nga giandam nga adunay lainlaing konsentrasyon sa styrene adunay lainlaing mga carbon load. Susama, kining mga stationary phase gibutang sa mga stainless steel column ug ang ilang chromatographic characteristics (selectivity, resolution, N value, ug uban pa) gisusi. Base sa kini nga mga eksperimento, usa ka optimized nga komposisyon para sa pag-andam sa PMP stationary phase ang gipili aron makahatag og kontroladong polarity ug maayong retention sa analyte.
Ang PMP column gisusi usab alang sa pag-analisa sa lima ka sagol nga peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) gamit ang kapasidad sa mobile phase nga 60/40 (v/v) ACN/tubig (0.1% TFA) sa flow rate nga 80 µl/min. Ubos sa optimal elution conditions (200,000 plates/m), ang gidaghanon sa theoretical plates (N) kada column (100 × 1.8 mm) kay 20,000 ± 100. Ang N values ​​para sa tulo ka PMP columns gipakita sa Table 3 ug ang mga chromatograms gipakita sa Figure 5A. Paspas nga pag-analisa sa taas nga flow rate (700 µl/min) sa usa ka PMP column, lima ka peptides ang gi-elute sulod sa usa ka minuto, maayo kaayong N value nga 13,500 ± 330 kada column (100 x 1.8 mm diameter), katumbas sa 135,000 plates/m (Fig. 5B). Tulo ka column nga parehas og gidak-on (inner diameter 100 x 1.8 mm) ang gipuno sa tulo ka lain-laing batch sa PMP stationary phase aron masulayan ang reproducibility. Ang mga analyte girekord alang sa matag column pinaagi sa pagbulag sa parehas nga test mixture sa matag column gamit ang optimal elution conditions, gidaghanon sa theoretical plates N, ug retention time. Ang reproducibility data alang sa mga PMP column gipakita sa Table 4. Ang reproducibility sa PMP column maayo nga nakig-uban sa ubos kaayo nga %RSD values ​​​​sama sa gipakita sa Table 3.
Pagbulag sa mga sagol nga peptide sa usa ka kolum sa PMP (B) ug usa ka kolum sa Ascentis Express RP-Amide (A), mobile phase 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), mga dimensyon sa kolum sa PMP (100 x 1.8 mm id), pag-analisa Elution order sa mga compound: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ug 5 (leucic acid enkephalin).
Usa ka PMP column (inner diameter nga 100 x 1.8 mm) ang gisusi alang sa pagbulag sa tryptic hydrolyzate sa human serum albumin pinaagi sa HPLC. Ang chromatogram sa Figure 6 nagpakita nga ang mga sample maayo ang pagkabulag nga adunay maayo kaayong resolusyon. Ang mga solusyon sa HSA gisusi gamit ang flow rate nga 100 μl/min, usa ka mobile phase nga 70/30 acetonitrile/tubig ug 0.1% TFA. Ang cleavage sa HSA gibahin sa 17 ka peaks, sama sa gipakita sa chromatogram (Fig. 6), nga katumbas sa 17 ka peptides. Ang mga efficiencies sa pagbulag sa indibidwal nga mga peak gikan sa HSA hydrolyzate gikalkulo ug ang mga kantidad gipakita sa Table 5.
Ang mga HSA tryptic hydrolysate gibulag sa usa ka PMP column (inner diameter 100 x 1.8 mm), flow rate (100 μl/min), mobile phase 60/40 acetonitrile/tubig, ug 0.1% TFA.
diin ang L mao ang gitas-on sa kolum, ang η mao ang viscosity sa mobile phase, ang ΔP mao ang back pressure sa kolum, ug ang u mao ang linear velocity sa mobile phase. Ang permeability sa kolum sa PMP kay 2.5 × 10–14 m2, ang flow rate kay 25 µl/min, 60/40 v/v ang gigamit. ACN/tubig. Ang permeability sa kolum sa PMP (ID 100 × 1.8 mm) susama sa among miaging pagtuon sa Ref.34. Ang permeability sa usa ka kolum nga puno sa superficially porous particles kay 1.7×10 .6 µm, 2.5×10-14 m2 para sa 5 µm particles43. Busa, ang permeability sa PMP phase susama sa permeability sa core-shell particles nga may gidak-on nga 5 μm.
diin ang Wx mao ang masa sa kolum nga puno sa chloroform, ang Wy mao ang masa sa kolum nga puno sa methanol, ug ang ρ mao ang densidad sa solvent. Densidad sa methanol (ρ = 0.7866) ug chloroform (ρ = 1.484). Ang kinatibuk-ang porosity sa kolum sa partikulo sa silica-C18 (100 × 1.8 mm ID)34 ug ang atong gitun-an kaniadto nga kolum nga C18-urea31 kay 0.63 ug 0.55, matag usa. Kini nagpasabot nga ang presensya sa urea ligands makapakunhod sa permeability sa stationary phase. Sa laing bahin, ang kinatibuk-ang porosity sa kolum sa PMP (inner diameter 100 × 1.8 mm) kay 0.60. Ang mga kolum sa PMP dili kaayo permeable kay sa mga kolum nga puno sa mga partikulo sa silica nga nakagapos sa C18 tungod kay sa mga stationary phase nga tipo sa C18 ang mga ligand sa C18 gilakip sa mga partikulo sa silica sa mga linear chain, samtang sa mga stationary phase nga tipo sa polystyrene usa ka medyo baga nga polymer ang naporma sa palibot sa mga partikulo. layer A. Sa usa ka tipikal nga eksperimento, ang porosity sa column gikalkulo sama sa mosunod:
Sa fig. 7A, B, ipakita ang mga Van Deemter plot para sa usa ka PMP column (id 100 x 1.8 mm) ug usa ka Ascentis Express RP-Amide column (id 100 x 1.8 mm) ubos sa parehas nga mga kondisyon sa elution, 60/40 ACN/H2O ug 0 .1% TFA 20 µl/min ngadto sa 800 µl/min sa duha ka column. Ang minimum nga HETP values ​​​​sa optimal flow rate (80 µl/min) kay 2.6 µm ug 3.9 µm para sa PMP column ug sa Ascentis Express RP-Amide column, matag usa. Ang HETP values ​​​​nagpakita nga ang separation efficiency sa PMP column (100 x 1.8 mm id) mas taas kay sa komersyal nga Ascentis Express RP-Amide column (100 x 1.8 mm id). Ang van Deemter graph sa Fig. 7(A) nagpakita nga ang pagkunhod sa bili sa N dili kaayo taas uban sa pagtaas sa agos kon itandi sa among miaging pagtuon. Ang mas taas nga separation efficiency sa PMP column (id 100 × 1.8 mm) kon itandi sa Ascentis Express RP-Amide column gibase sa gipauswag nga porma ug gidak-on sa partikulo ug sa sopistikado nga pamaagi sa pagputos sa column nga gigamit sa kasamtangang trabaho34.
(A) Van Deemter plot (HETP vs. mobile phase linear velocity) nga nakuha sa usa ka PMP column (id 100 x 1.8 mm) sa 60/40 ACN/H2O nga adunay 0.1% TFA. (B) Van Deemter plot (HETP vs. mobile phase linear velocity) nga nakuha sa usa ka Ascentis Express RP-Amide column (id 100 x 1.8 mm) sa 60/40 ACN/H2O nga adunay 0.1% TFA.
Usa ka polar stationary phase sa intercalated polystyrene ang giandam ug gisusi alang sa pagbulag sa usa ka sagol nga synthetic peptides ug tryptic hydrolyzate sa human serum albumin (HSA) sa high performance liquid chromatography. Ang chromatographic performance sa mga PMP column para sa mga peptide mixtures maayo kaayo sa termino sa separation efficiency ug resolution. Ang gipauswag nga separation efficiency sa mga PMP column tungod sa daghang mga hinungdan sama sa silica particle size ug pore size, kontrolado nga synthesis sa stationary phases, ug complex column packing materials. Gawas pa sa taas nga separation efficiency, laing bentaha niining stationary phase mao ang ubos nga column back pressure sa taas nga flow rates. Ang mga PMP column dali nga makopya ug magamit sa pag-analisa sa mga sagol nga peptides ug tryptic digestion sa lain-laing mga protina. Nagplano kami nga gamiton kini nga column alang sa pagbulag sa mga bioactive compound gikan sa natural nga mga produkto, mga extract sa mga tanom nga medisina ug mga uhong sa liquid chromatography. Sa umaabot, ang mga PMP column susihon usab alang sa pagbulag sa mga protina ug monoclonal antibodies.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Imbestigasyon sa reversed phase chromatography peptide separation systems bahin I: Pagpalambo sa usa ka protocol para sa column characterization. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Imbestigasyon sa reversed phase chromatography peptide separation systems bahin I: Pagpalambo sa usa ka protocol para sa column characterization.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., ug Petersson, P. Imbestigasyon sa mga Sistema sa Pagbulag sa Peptide pinaagi sa Reverse-Phase Chromatography, Bahin I: Pagpalambo og Protocol para sa Pag-ila sa Kolum. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Imbestigasyon sa reversed phase chromatography peptide separation systems bahin I: Pagpalambo sa usa ka protocol para sa mga kinaiya sa kolum. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Imbestigasyon sa reversed phase chromatography peptide separation systems bahin I: Pagpalambo sa usa ka protocol para sa mga kinaiya sa kolum.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., ug Petersson, P. Imbestigasyon sa mga Sistema sa Pagbulag sa Peptide pinaagi sa Reverse-Phase Chromatography, Bahin I: Pagpalambo og Protocol para sa Pag-ila sa Kolum.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. et al. Mga pamaagi sa paghimo og gipauswag nga aktibong peptides para sa pagtambal sa mga sakit nga makatakod. Biotechnology. Mga Kalampusan 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Mga sintetikong therapeutic peptide: Siyensya ug merkado. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Mga sintetikong therapeutic peptide: Siyensya ug merkado.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ug Chreschatyski M. Sintetikong mga peptide nga terapiya: siyensya ug merkado.Vliege P, Lisowski V, Martinez J ug Khreschatsky M. Sintetikong mga therapeutic peptide: siyensya ug merkado. pagdiskobre sa tambal. Karon 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Abansado nga proteomic liquid chromatography. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Abansado nga proteomic liquid chromatography.Tan-awa ang F., Smith RD ug Shen Yu. Abansado nga proteomic liquid chromatography. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced nga komposisyon sa protina 液相色谱。Tan-awa ang F., Smith RD ug Shen Yu. Abansado nga proteomic liquid chromatography.J. Kromatograpiya. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Ang abanteng liquid chromatography-mass spectrometry makahimo sa paghiusa sa halapad nga metabolomics ug proteomics. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ang papel sa UHPLC sa pagpalambo sa parmasyutiko. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ang papel sa UHPLC sa pagpalambo sa parmasyutiko.Chesnut, SM ug Salisbury, JJ Ang papel sa UHPLC sa pag-uswag sa parmasyutiko.Chesnut, SM ug Salisbury, JJ Ang papel sa UHPLC sa pagpalambo sa tambal. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Pundamental ug praktikal nga mga aspeto sa ultrahigh pressure liquid chromatography para sa paspas nga pagbulag. Wu, N. & Clausen, AM Pundamental ug praktikal nga mga aspeto sa ultrahigh pressure liquid chromatography para sa paspas nga pagbulag.Wu, N. ug Clausen, AM Pundamental ug praktikal nga mga aspeto sa high pressure liquid chromatography para sa paspas nga pagbulag. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Batakang ug praktikal nga mga aspeto sa ultra-high pressure liquid chromatography para sa paspas nga pagbulag.Wu, N. ug Clausen, AM Pundamental ug praktikal nga mga aspeto sa high pressure liquid chromatography para sa paspas nga pagbulag.J. Sept. Siyensya. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Paggamit sa ultra-performance liquid chromatography sa pagpalambo sa parmasyutiko. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Paggamit sa ultra-performance liquid chromatography sa pagpalambo sa parmasyutiko.Ren, SA ug Chelischeff, P. Ang paggamit sa ultra high performance liquid chromatography sa pagpalambo sa parmasyutiko. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA ug Chelischeff, P. Paggamit sa ultra-performance liquid chromatography sa pagpalambo sa tambal.J. Kromatograpiya. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Usa ka monolithic macroporous hydrogel nga nakuha gikan sa usa ka oil-in-water emulsion nga adunay taas nga internal phase para sa episyente nga pagputli sa enterovirus 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ang papel sa liquid chromatography sa proteomics. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ang papel sa liquid chromatography sa proteomics.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. ug Wilkins, JA Ang papel sa liquid chromatography sa proteomics. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. ug Wilkins, JA Ang papel sa liquid chromatography sa proteomics.J. Kromatograpiya. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Bag-ong mga uso sa reversed-phase liquid chromatographic separations sa therapeutic peptides ug mga protina: Teorya ug mga aplikasyon. & Guillarme, D. Bag-ong mga uso sa reversed-phase liquid chromatographic separations sa therapeutic peptides ug mga protina: Teorya ug mga aplikasyon. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографира хроматографира теория и приложения. & Guillarme, D. Bag-ong mga uso sa pagbulag sa mga therapeutic peptide ug mga protina pinaagi sa reverse phase liquid chromatography: teorya ug mga aplikasyon. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.ug Guillarmé, D. Bag-ong mga uso sa pagbulag sa mga therapeutic peptide ug mga protina pinaagi sa reverse phase liquid chromatography: teorya ug mga aplikasyon.J. Pharm. Biomedikal nga Siyensya. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Duha ka dimensyon nga pagbulag sa mga peptide gamit ang sistemang RP-RP-HPLC nga adunay lainlaing pH sa una ug ikaduha nga mga dimensyon sa pagbulag. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Duha ka dimensyon nga pagbulag sa mga peptide gamit ang sistemang RP-RP-HPLC nga adunay lainlaing pH sa una ug ikaduha nga mga dimensyon sa pagbulag.Gilar M., Olivova P., Dali AE ug Gebler JK Duha ka-dimensyon nga pagbulag sa mga peptide gamit ang sistemang RP-RP-HPLC nga adunay lainlaing pH sa una ug ikaduha nga mga dimensyon sa pagbulag.Gilar M., Olivova P., Dali AE ug Gebler JK Duha ka dimensyon nga pagbulag sa mga peptide gamit ang lainlaing mga kantidad sa pH sa una ug ikaduha nga mga dimensyon sa pagbulag gamit ang sistema sa RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Imbestigasyon sa mass transfer ug kinetic characteristics sa high-performance chromatography columns nga giputos sa hingpit nga porous ug superficially porous nga mga partikulo sa C18 nga mas gamay sa 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Mga bag-ong uso ug mga hagit sa pag-analisar sa pag-inusara, pag-ila, ug pag-validate sa mga bioactive peptide sa tanom. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomic nga talan-awon sa gingharian sa kinabuhi. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Post-treatment sa mga therapeutic peptide pinaagi sa preparative liquid chromatography. Molecules (Basel, Switzerland) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatography ug ang mga aplikasyon niini sa mga biopolymer. Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatography ug ang mga aplikasyon niini sa mga biopolymer.Yang, Yu. ug Geng, X. Mixed mode chromatography ug ang aplikasyon niini sa mga biopolymer. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Mixed mode chromatography ug ang aplikasyon niini sa mga biopolymer.Yang, Yu. ug Gene, X. Mixed mode chromatography ug ang aplikasyon niini sa mga biopolymer.J. Kromatograpiya. A 1218(49), 8813–8825 (2011).