Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз шектеулі CSS қолдауы бар браузер нұсқасын пайдаланып жатырсыз. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған браузерді пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильдерсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Бір уақытта үш слайдтан тұратын карусельді көрсетеді. Бір уақытта үш слайд арқылы жылжу үшін «Алдыңғы» және «Келесі» түймелерін пайдаланыңыз немесе бір уақытта үш слайд арқылы жылжу үшін соңындағы сырғытпа түймелерін пайдаланыңыз.
Кеуекті кремний диоксиді бөлшектері кең кеуекті бөлшектерді алу үшін кейбір модификациялармен золь-гель әдісімен дайындалды. Бұл бөлшектер N-фенилмалеимид интеркаляцияланған полиамидтерін алу үшін кері тізбекті тасымалдау-фрагментациялау (RAFT) полимерлеуі арқылы N-фенилмалеимидпен және стиролмен туындыланды. Стирол (PMP) стационарлық фазасы. Тар диаметрлі тот баспайтын болаттан жасалған бағандар (ішкі диаметрі 100 × 1,8 мм) суспензиямен оралды. PMP бағанының хроматографиялық өнімділігі бес пептидтен (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu аминқышқылы энкефалині) және адам сарысуы альбуминінің (HAS) триптикалық гидролизатынан тұратын синтетикалық пептидтер қоспасын бөлу үшін бағаланды. Оңтайлы элюция жағдайында пептидтер қоспасы бар пластиналардың теориялық саны 280 000 пластина/ш.м-ге жетті. Әзірленген бағанның бөлу өнімділігін коммерциялық Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстыра отырып, PMP бағанының бөлу тиімділігі бөлу тиімділігі мен ажыратымдылығы жағынан коммерциялық бағанға қарағанда жоғары екені байқалды.
Биофармацевтика өнеркәсібі соңғы жылдары нарық үлесінің айтарлықтай артуымен кеңейіп келе жатқан әлемдік нарыққа айналды. Биофармацевтика өнеркәсібінің қарқынды өсуімен1,2,3 пептидтік және ақуыздық талдауға үлкен қажеттілік бар. Мақсатты пептидтен басқа, пептид синтезі кезінде әртүрлі қоспалар түзіледі, сондықтан пептидтің қажетті тазалығын алу үшін хроматографиялық тазарту қажет. Дене сұйықтықтарындағы, тіндеріндегі және жасушаларындағы ақуыздарды талдау және сипаттау бір үлгіде анықталуы мүмкін түрлердің көптігіне байланысты өте қиын міндет болып табылады. Масс-спектрометрия пептидтер мен ақуыздарды секвенирлеудің тиімді құралы болғанымен, егер мұндай үлгілер масс-спектрометрге тікелей енгізілсе, бөлу қанағаттанарлықсыз болады. Бұл мәселені MS талдауы алдында сұйық хроматографияны (СХ) жүргізу арқылы шешуге болады, бұл белгілі бір уақытта масс-спектрометрге түсетін аналиттердің мөлшерін азайтады4,5,6. Сонымен қатар, аналиттер сұйық фазаны бөлу кезінде тар аймақта шоғырлануы мүмкін, осылайша бұл аналитиктерді шоғырландырады және MS анықтау сезімталдығын арттырады. Сұйық хроматография (СХ) соңғы онжылдықта айтарлықтай дамыды және протеомдық талдау үшін кеңінен қолданылатын әдіске айналды7,8,9,10.
Кері фазалы сұйық хроматография (RP-LC) стационарлық фаза ретінде октадецил-модификацияланған кремний диоксидін (ODS) пайдаланып пептидтер қоспаларын тазарту және бөлу үшін кеңінен қолданылады11,12,13. Дегенмен, олардың күрделі құрылымы мен амфотерлік сипатына байланысты14,15 RP стационарлық фазалары пептидтер мен ақуыздарды қанағаттанарлықтай бөлуді қамтамасыз ете алмайды. Сондықтан, полярлы және полярлы емес фрагменттері бар пептидтер мен ақуыздарды талдау үшін осы аналитиктерді өзара әрекеттесу және сақтау үшін арнайы жасалған стационарлық фазалар қажет16. Мультимодальды өзара әрекеттесуді ұсынатын аралас хроматография пептидтерді, ақуыздарды және басқа да күрделі қоспаларды бөлу үшін RP-LC-ге балама бола алады. Бірнеше аралас типті стационарлық фазалар дайындалды және пептидтер мен ақуыздарды бөлу үшін осы стационарлық фазалармен толтырылған бағандар пайдаланылды17,18,19,20,21. Полярлық және полярлық емес топтардың болуына байланысты аралас режимдегі стационарлық фазалар (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярлық интеркаляция/RPLC) пептидтер мен ақуыздарды бөлуге жарамды22,23,24,25,26,27,28. , ковалентті байланысқан полярлық топтары бар полярлық интеркаляцияланған стационарлық фазалар полярлық және полярлық емес аналиттер үшін жақсы бөлу мүмкіндіктерін және бірегей селективтілікті көрсетеді, себебі бөлу аналит пен стационарлық фаза арасындағы өзара әрекеттесуге байланысты. Мультимодальды өзара әрекеттесулер29,30,31,32. Жақында Чжан және т.б.30 полиаминдердің бегенилмен аяқталған стационарлық фазаларын алып, көмірсутектерді, антидепрессанттарды, флавоноидтарды, нуклеозидтерді, эстрогендерді және басқа да кейбір аналиттерді сәтті бөлді. Полярлық ендірілген стационарлық материалда полярлық және полярлық емес топтар бар, сондықтан оны пептидтер мен ақуыздарды гидрофобты және гидрофильді бөліктерге бөлу үшін пайдалануға болады. Полярлық сызықтық бағандар (мысалы, амидті сызықтық бағандары бар C18 бағандары) Ascentis Express RP-Amide бағандары сауда атауымен қолжетімді, бірақ бұл бағандар тек 33 аминін талдау үшін пайдаланылды.
Ағымдағы зерттеуде полярлы ендірме стационарлық фазасы (N-фенилмалеимид, ендірме полистирол) дайындалып, пептидті бөлу және триптикалық HSA бөлінуі үшін бағаланды. Стационарлық фазаны дайындау үшін келесі стратегия қолданылды. Кеуекті кремний диоксиді бөлшектері алдыңғы басылымдарымызда сипатталған процедураларға сәйкес дайындалды, дайындау схемаларында 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 кейбір өзгерістер енгізілді. Үлкен кеуек өлшемдері бар кремний диоксиді бөлшектерін алу үшін мочевинаның, полиэтиленгликольдің (PEG), TMOS және сулы-сірке қышқылының қатынасы реттелді. Екіншіден, жаңа фенилмалеимид-метилвинилизоцианат лиганд синтезделді және оның туынды кремний диоксиді бөлшектері полярлы ендірме стационарлық фазаларды дайындау үшін пайдаланылды. Алынған стационарлық фаза оңтайландырылған қаптау схемасына сәйкес тот баспайтын болаттан жасалған бағанға (ішкі диаметрі 100 × 1,8 мм) оралды. Бағанды ​​қаптауға баған ішінде біркелкі қабатты қамтамасыз ету үшін механикалық діріл көмектеседі. Қапталған баған бес пептидтен (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин пептиді) және адам сарысуы альбуминінің (HSA) триптикалық гидролизаттарынан тұратын пептидтер қоспасын бөлу үшін бағаланды. Пептид қоспасы мен HSA триптикалық дайджесті жақсы ажыратымдылықпен және тиімділікпен бөлінетіні байқалды. PMP бағанының бөлу тиімділігі Ascentis Express RP-Amide бағанының бөлу тиімділігімен салыстырылды. Пептидтер мен ақуыздардың PMP бағанында жақсы ажыратымдылыққа және жоғары бөлу тиімділігіне ие екені, ал PMP бағанының бөлу тиімділігі Ascentis Express RP-Amide бағанының бөлу тиімділігінен жоғары екені байқалды.
PEG (полиэтиленгликоль), мочевина, сірке қышқылы, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трипсин, адам сарысуы альбумині (HSA), аммоний хлориді, мочевина, гексаметилметакрилойлдисилазан (HMDS), метакрилойлхлорид (MC), стирол, 4-гидрокси-TEMPO, бензоил пероксиді (BPO), HPLC үшін ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол және ацетон. Sigma-Aldrich компаниясы (Сент-Луис, Миссури, АҚШ).
Мочевина (8 г), полиэтиленгликоль (8 г) және 8 мл 0,01 Н сірке қышқылының қоспасы 10 минут бойы араластырылды, ал мұзбен салқындату кезінде оған 24 мл TMOS қосылды. Реакция қоспасы тот баспайтын болаттан жасалған автоклавта 40°C температурада 6 сағат, содан кейін 120°C температурада 8 сағат бойы қыздырылды. Су деканттан өткізіліп, қалдық 70°C температурада 12 сағат бойы кептірілді. Кептірілген жұмсақ блоктар тегіс ұнтақталып, 550°C температурада пеште 12 сағат бойы күйдірілді. Бөлшектердің өлшемдерінің, кеуектердің өлшемінің және бетінің ауданының қайталануын тексеру үшін үш партия дайындалып, сипатталды.
Полистирол тізбектері үшін полярлық топ және стационарлық фаза. Дайындау процедурасы төменде сипатталған.
N-фенилмалеимид (200 мг) және метилвинил изоцианат (100 мг) сусыз толуолда ерітілді, содан кейін фенилмалеимид пен метилвинил изоцианатының (PMCP) сополимерін алу үшін реакция колбасына 0,1 мл 2,2′-азоиизобутиронитрил (AIBN) қосылды. ) Қоспа 60°C температурада 3 сағат бойы қыздырылды, сүзіліп, пеште 40°C температурада 3 сағат бойы кептірілді.
Кептірілген кремний диоксиді бөлшектері (2 г) құрғақ толуолға (100 мл) ерітіліп, араластырылып, 500 мл дөңгелек түбі бар колбада 10 минут бойы ультрадыбыстық өңдеуден өтті. PMCP (10 мг) толуолда ерітіліп, қосымша воронка арқылы реакция колбасына тамшылатып қосылды. Қоспа 100°C температурада 8 сағат бойы қайта люкстелді, сүзілді, ацетонмен жуылды және 60°C температурада 3 сағат бойы кептірілді. Содан кейін PMCP (100 г)-мен байланысты кремний диоксиді бөлшектері толуолда (200 мл) ерітіліп, оған катализатор ретінде 100 мкл дибутилтин дилауратының қатысуымен 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) қосылды. Қоспа 50°C температурада 8 сағат бойы араластырылды, сүзілді және 50°C температурада 3 сағат бойы кептірілді.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиді BPO (0,5 мл) және TEMPO-PMCP-ге (1,5 г) қосылған кремний диоксиді бөлшектері толуолда ерітіліп, азотпен тазартылды. Стиролдың полимерленуі 100°C температурада 12 сағат бойы жүргізілді. Алынған өнім метанолмен жуылып, 60°C температурада түні бойы кептірілді. Реакцияның жалпы схемасы 1-суретте көрсетілген.
Үлгілер 10-3 Торрдан аз қалдық қысым алынғанша 393 К температурада 1 сағат бойы газсыздандырылды. Жалпы кеуек көлемін анықтау үшін P/P0 = 0,99 салыстырмалы қысымда адсорбцияланған N2 мөлшері пайдаланылды. Таза және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің морфологиясы сканерлеуші ​​электронды микроскоп (Hitachi High Technologies, Токио, Жапония) көмегімен зерттелді. Құрғақ үлгілер (таза кремний диоксиді және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері) көміртекті таспаны пайдаланып алюминий шыбықтарға орналастырылды. Q150T бүрку құрылғысын пайдаланып үлгіге алтын тұнды, ал үлгіге 5 нм қалыңдықтағы Au қабаты тұнды. Бұл төмен кернеулі процестің тиімділігін арттырады және ұсақ суық бүркуді қамтамасыз етеді. Элементтік талдау Thermo Electron (Waltham, MA, АҚШ) Flash EA1112 элементтік құрам анализаторын пайдаланып жүргізілді. Бөлшектердің өлшемдік таралуын алу үшін Malvern бөлшектерінің өлшемдік анализаторы (Worcestershire, Ұлыбритания) Mastersizer 2000 пайдаланылды. Қапталмаған кремний диоксиді бөлшектері және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері (әрқайсысы 5 мг) 5 мл изопропанолда ерітіліп, 10 минут бойы ультрадыбыстық өңдеуден өткізіліп, 5 минут бойы араластырылып, Mastersizer оптикалық стендіне қойылды. Термогравиметриялық талдау 30-дан 800 °C-қа дейінгі температура диапазонында минутына 5 °C жылдамдықпен жүргізіледі.
Өлшемдері (ID 100 × 1,8 мм) бар шыны талшықпен қапталған тар диаметрлі тот баспайтын болат бағандар 31-сілтемедегідей процедураны қолдана отырып, суспензия толтыру әдісімен оралды. Тот баспайтын болат баған (шынымен қапталған, ID 100 × 1,8 мм) және 1 мкм фриті бар шығыс суспензияны орау машинасына (Alltech Deerfield, IL, АҚШ) қосылды. Қозғалмайтын фазаның суспензиясын 1,2 мл метанолға 150 мг стационарлық фазаны суспензиялап, оны резервуар бағанына құю арқылы дайындаңыз. Метанол суспензия еріткіші және бақылау еріткіші ретінде пайдаланылды. Бағанды ​​10 минут бойы 100 МП, 15 минут бойы 80 МП және 30 минут бойы 60 МП қысым тізбегін қолдану арқылы орау процесінде бағанның біркелкі оралуын қамтамасыз ету үшін механикалық діріл үшін екі газ хроматография бағанының вибраторы (Alltech, Deerfield, IL, АҚШ) пайдаланылды. Шлам орау құрылғысын жауып, жіптің зақымдалуын болдырмау үшін қысымды баяу босатыңыз. Баған шлам форсункасынан ажыратылды және оның жұмысын тексеру үшін кіріске тағы бір арматура бекітіліп, LC жүйесіне қосылды.
Арнайы MLC LC сорғысын (10AD Shimadzu, Жапония), 50 нл инжекциялық ілмегі бар сынама алу құрылғысын (Valco (USA) C14 W.05), мембраналық дегазаторды (Shimadzu DGU-14A) және UV-VIS капиллярлық терезесін пайдаланып жасалды. Детектор құрылғысы (UV-2075) және эмальданған микроколонна. Қосымша баған кеңеюінің әсерін азайту үшін өте тар және қысқа байланыстырушы түтіктерді пайдаланыңыз. Колоннаны толтырғаннан кейін, 1/16 дюймдік тотықсыздандырғыш түйіннің шығысына капиллярды (50 мкм id 365) орнатыңыз және тотықсыздандырғыш түйіннің капиллярын (50 мкм) орнатыңыз. Деректерді жинау және хроматограмманы өңдеу Multichro 2000 бағдарламалық жасақтамасын пайдаланып жүзеге асырылады. 254 нм толқын ұзындығында зерттелетін заттардың UV жұтылуы 0-де бақыланды. Хроматографиялық деректер OriginPro8 (Нортгемптон, MA) көмегімен талданды.
Адам сарысуындағы альбумин, лиофилизацияланған ұнтақ, ≥ 96% (агароза гелімен электрофорез) 3 мг трипсинмен (1,5 мг), 4,0 М мочевинамен (1 мл) және 0,2 М аммоний бикарбонатымен (1 мл) араластырылған. Ерітінді 10 минут бойы араластырылып, 37°C температурада 6 сағат бойы су моншасында ұсталды, содан кейін 1 мл 0,1% TFA-мен сөндіру жүргізілді. Ерітіндіні сүзіп, 4°C-тан төмен температурада сақтаңыз.
ПМП бағанында пептидтер мен триптикалық дайджест HSA қоспасын бөлу бөлек бағаланды. ПМП бағанымен бөлінген пептидтер мен HSA қоспасының триптикалық гидролизін тексеріп, нәтижелерді Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстырыңыз. Теориялық пластиналар саны келесі теңдеуді пайдаланып есептеледі:
Таза кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің SEM суреттері 2-суретте көрсетілген. Таза кремний диоксиді бөлшектерінің (A, B) SEM суреттері алдыңғы зерттеулерімізбен салыстырғанда бөлшектердің созылған немесе дұрыс емес симметрияға ие сфералық пішінді көрсетеді. Лигандпен (C, D) байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің беті таза кремний диоксиді бөлшектеріне қарағанда тегіс, бұл кремний диоксиді бөлшектерінің бетін жабатын полистирол тізбектеріне байланысты болуы мүмкін.
Таза кремний диоксиді бөлшектерінің (A, B) және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің (C, D) сканерлеуші ​​электронды микрографиялары.
Таза кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектер өлшемінің таралуы 2-суретте көрсетілген. 3(A). Көлемдік бөлшектер өлшемінің таралу қисықтары химиялық модификациядан кейін кремний диоксиді бөлшектерінің өлшемінің артқанын көрсетті (3A сурет). Ағымдағы зерттеу мен алдыңғы зерттеудің кремний диоксиді бөлшектерінің таралу деректері 1(A) кестесінде салыстырылған. PMP көлемдік бөлшектерінің d(0,5) өлшемі 3,36 мкм болды, бұл біздің алдыңғы зерттеуіміздегі ad(0,5) мәні 3,05 мкм болды (полистиролмен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері)34. Реакция қоспасындағы PEG, мочевина, TMOS және сірке қышқылының арақатынасының өзгеруіне байланысты, бұл партияның бөлшектер өлшемінің таралуы біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда тар болды. PMP фазасының бөлшектер өлшемі біз бұрын зерттеген полистиролмен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері фазасының бөлшектер өлшемінен сәл үлкенірек. Бұл кремний диоксиді бөлшектерінің стиролмен беттік функционалдануы кремний диоксиді бетіне тек полистирол қабатын (0,97 мкм) төккенін, ал PMP фазасында қабат қалыңдығы 1,38 мкм болғанын білдіреді.
Таза кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектер өлшемінің таралуы (A) және кеуек өлшемінің таралуы (B).
Бұл зерттеуде қолданылған кремний диоксиді бөлшектерінің кеуек өлшемі, кеуек көлемі және беттік ауданы 1 (B) кестеде көрсетілген. Таза кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің PSD профильдері 3(B) суреттерінде көрсетілген. Нәтижелер біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырмалы болды34. Таза және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің кеуек өлшемдері сәйкесінше 310 Å және 241 Å болды, бұл химиялық модификациядан кейін кеуек өлшемінің 1 (B) кестеде көрсетілгендей 69 Å-ге азайғанын көрсетеді, ал ығысу қисығы суретте көрсетілген. Ағымдағы зерттеудегі кремний диоксиді бөлшектерінің меншікті беттік ауданы 116 м2/г құрайды, бұл біздің алдыңғы зерттеуімізбен (124 м2/г) салыстырмалы. 1(B) кестеде көрсетілгендей, химиялық модификациядан кейін кремний диоксиді бөлшектерінің беттік ауданы (м2/г) да 116 м2/г-дан 105 м2/г-ға дейін азайды.
Стационарлық фазаның элементтік талдау нәтижелері 2-кестеде келтірілген. Ағымдағы стационарлық фазаның көміртегі мөлшері 6,35% құрайды, бұл біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда төмен (полистиролмен байланысты кремний диоксиді бөлшектері сәйкесінше 7,93%35 және 10,21%) 42. Ағымдағы стационарлық фазаның көміртегі мөлшері төменде көрсетілген, себебі SP дайындау кезінде стиролдан басқа фенилмалеимид метилвинилизоцианаты (PCMP) және 4-гидрокси-TEMPO сияқты кейбір полярлық лигандтар қолданылған. Ағымдағы стационарлық фазадағы азоттың салмақтық пайызы алдыңғы зерттеулердегі 0,1735 және 0,85% салыстырғанда 2,21% құрайды42. Бұл ағымдағы стационарлық фазада фенилмалеимидтің әсерінен азоттың салмақтық пайызы жоғары екенін білдіреді. Сол сияқты, (4) және (5) өнімдерінде көміртегі мөлшері сәйкесінше 2,7% және 2,9% құрайды, ал соңғы өнімде (6) көміртегі мөлшері 6,35% құрайды, бұл 2-кестеде көрсетілген. PMP стационарлық фазасында салмақ жоғалтуды тексеру үшін термогравиметриялық талдау (TGA) қолданылды, ал TGA қисығы 4-суретте көрсетілген. TGA қисығы 8,6% салмақ жоғалтуды көрсетеді, бұл көміртегі мөлшерімен (6,35%) жақсы сәйкес келеді, себебі лигандтарда тек C ғана емес, сонымен қатар N, O және H де бар.
Кремний диоксиді бөлшектерінің бетін модификациялау үшін лиганд фенилмалеимид-метилвинилизоцианаты таңдалды, себебі оның полярлы фенилмалеимид және винилизоцианат топтары бар. Винил изоцианат топтары тірі радикалды полимерлеу арқылы стиролмен одан әрі әрекеттесе алады. Екінші себеп - аналитпен орташа өзара әрекеттесетін және аналит пен стационарлық фаза арасында күшті электростатикалық өзара әрекеттесулер жоқ топты енгізу, себебі фенилмалеимид бөлігінің қалыпты рН кезінде виртуалды заряды жоқ. Стационарлық фазаның полярлығын стиролдың оңтайлы мөлшерімен және бос радикалды полимерлеу реакция уақытымен басқаруға болады. Реакцияның соңғы кезеңі (бос радикалды полимерлеу) өте маңызды, себебі ол стационарлық фазаның полярлығын өзгертеді. Бұл стационарлық фазалардағы көміртек мөлшерін тексеру үшін элементтік талдау жүргізілді. Стирол мөлшерін және реакция уақытын арттыру стационарлық фазаның көміртек мөлшерін арттыратыны және керісінше байқалды. Стиролдың әртүрлі концентрацияларымен дайындалған SP-лерде әртүрлі көміртек жүктемелері болады. Сол сияқты, бұл стационарлық фазалар тот баспайтын болаттан жасалған бағандарға орналастырылды және олардың хроматографиялық сипаттамалары (селективтілік, ажыратымдылық, N мәні және т.б.) тексерілді. Осы тәжірибелерге сүйене отырып, бақыланатын полярлықты және аналиттің жақсы сақталуын қамтамасыз ету үшін PMP стационарлық фазасын дайындауға арналған оңтайландырылған құрам таңдалды.
PMP бағаны сонымен қатар жылжымалы фазаның сыйымдылығын пайдаланып, пептидтердің бес қоспасын (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин) талдау үшін бағаланды. 60/40 (көлем/көлем) ACN/су (0,1% TFA) 80 мкл/мин ағын жылдамдығында. Оңтайлы элюция жағдайында (200 000 пластина/м), бір бағанға (100 × 1,8 мм) теориялық пластиналар саны (N) 20 000 ± 100 құрайды. Үш PMP бағанының N мәндері 3-кестеде, ал хроматограммалар 5А-суретте көрсетілген. PMP бағанында жоғары ағын жылдамдығымен (700 мкл/мин) жылдам талдау, бір минут ішінде бес пептид элюцияланды, әр баған үшін 13 500 ± 330 N мәні тамаша (диаметрі 100 x 1,8 мм), бұл 135 000 пластина/м-ге тең (5B сурет). Бірдей өлшемдегі үш баған (ішкі диаметрі 100 x 1,8 мм) қайталануды тексеру үшін PMP стационарлық фазасының үш түрлі партиясымен толтырылды. Әрбір баған үшін аналиттер оңтайлы элюция жағдайларын, теориялық пластиналар саны N және сақтау уақытын пайдаланып, әр бағандағы бірдей сынақ қоспасын бөлу арқылы жазылды. PMP бағандарының қайталану деректері 4-кестеде көрсетілген. PMP бағанының қайталану мүмкіндігі 3-кестеде көрсетілгендей өте төмен %RSD мәндерімен жақсы корреляцияланды.
ПМП бағанында (B) және Ascentis Express RP-Amide бағанында (A) пептидтік қоспаларды бөлу, жылжымалы фазасы 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), ПМП бағанының өлшемдері (100 x 1,8 мм id), талдау Қосылыстардың элюция реті: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) және 5 (лейк қышқылы энкефалин).
Адам сарысуы альбуминінің триптикалық гидролизатын HPLC арқылы бөлу үшін PMP бағаны (ішкі диаметрі 100 x 1,8 мм) бағаланды. 6-суреттегі хроматограмма үлгілердің өте жақсы ажыратымдылықпен жақсы бөлінгенін көрсетеді. HSA ерітінділері 100 мкл/мин ағын жылдамдығы, 70/30 ацетонитрил/судан тұратын жылжымалы фаза және 0,1% TFA көмегімен талданды. HSA бөлінуі хроматограммада көрсетілгендей (6-сурет) 17 пептидке сәйкес келетін 17 шыңға бөлінді. HSA гидролизатынан жеке шыңдардың бөліну тиімділігі есептелді және мәндері 5-кестеде көрсетілген.
HSA триптикалық гидролизаттары PMP бағанында (ішкі диаметрі 100 x 1,8 мм), ағын жылдамдығында (100 мкл/мин), жылжымалы фазалы 60/40 ацетонитрил/суда және 0,1% TFA-да бөлінді.
мұндағы L - баған ұзындығы, η - жылжымалы фазаның тұтқырлығы, ΔP - бағанның кері қысымы, ал u - жылжымалы фазаның сызықтық жылдамдығы. PMP бағанының өткізгіштігі 2,5 × 10–14 м2, ағын жылдамдығы 25 мкл/мин, 60/40 v/v пайдаланылды. ACN/су. PMP бағанының өткізгіштігі (ID 100 × 1,8 мм) біздің алдыңғы 34-сілтемедегі зерттеуімізге ұқсас болды. Беткі кеуекті бөлшектермен толтырылған бағанның өткізгіштігі 1,7 × 10 0,6 мкм, 5 мкм бөлшектер үшін 2,5 × 10-14 м2 құрайды43. Сондықтан, PMP фазасының өткізгіштігі өлшемі 5 мкм болатын өзек-қабық бөлшектерінің өткізгіштігіне ұқсас.
мұндағы Wx - хлороформмен толтырылған бағанның массасы, Wy - метанолмен толтырылған бағанның массасы, ал ρ - еріткіштің тығыздығы. Метанолдың тығыздығы (ρ = 0,7866) және хлороформның (ρ = 1,484). Кремний-C18 бөлшектері бағанының (100 × 1,8 мм ID)34 және біз бұрын зерттеген C18-мочевина31 бағанының жалпы кеуектілігі сәйкесінше 0,63 және 0,55 болды. Бұл мочевина лигандтарының болуы стационарлық фазаның өткізгіштігін төмендететінін білдіреді. Екінші жағынан, PMP бағанының жалпы кеуектілігі (ішкі диаметрі 100 × 1,8 мм) 0,60 құрайды. PMP бағандары C18 байланысқан кремний диоксиді бөлшектерімен толтырылған бағандарға қарағанда өткізгіштігі төмен, себебі C18 типті стационарлық фазаларда C18 лигандтары кремний диоксиді бөлшектеріне сызықтық тізбектермен бекітіледі, ал полистирол типті стационарлық фазаларда бөлшектердің айналасында салыстырмалы түрде қалың полимер түзіледі. А қабаты. Әдеттегі тәжірибеде бағанның кеуектілігі келесідей есептеледі:
7A, B суреттерінде PMP бағанасы (id 100 x 1,8 мм) және Ascentis Express RP-Amide бағанасы (id 100 x 1,8 мм) үшін бірдей элюция жағдайларында, екі бағанда да 60/40 ACN/H2O және 0,1% TFA 20 мкл/мин-ден 800 мкл/мин-ге дейінгі Ван Деемтер графиктері көрсетілген. Оңтайлы ағын жылдамдығында (80 мкл/мин) HETP минималды мәндері PMP бағанасы мен Ascentis Express RP-Amide бағанасы үшін сәйкесінше 2,6 мкм және 3,9 мкм болды. HETP мәндері PMP бағанының (100 x 1,8 мм id) бөліну тиімділігі коммерциялық қолжетімді Ascentis Express RP-Amide бағанына (100 x 1,8 мм id) қарағанда әлдеқайда жоғары екенін көрсетеді. 7(A) суреттегі ван Демтердің графикасы N мәнінің төмендеуі алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда ағынның артуымен айтарлықтай жоғары емес екенін көрсетеді. Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстырғанда PMP бағанының жоғары бөлу тиімділігі (id 100 × 1,8 мм) бөлшектердің пішіні мен өлшемінің жақсаруына және ағымдағы жұмыста қолданылатын күрделі бағандарды орау процедурасына негізделген34.
(A) 0,1% TFA бар 60/40 ACN/H2O ішіндегі PMP бағанында (id 100 x 1,8 мм) алынған Ван Димтер графигі (HETP және жылжымалы фазалық сызықтық жылдамдық). (B) 0,1% TFA бар 60/40 ACN/H2O ішіндегі Ascentis Express RP-Amide бағанында (id 100 x 1,8 мм) алынған Ван Димтер графигі (HETP және жылжымалы фазалық сызықтық жылдамдық).
Жоғары өнімді сұйық хроматографияда синтетикалық пептидтер мен адам сарысуы альбуминінің (HSA) триптикалық гидролизатының қоспасын бөлу үшін интеркалирленген полистиролдың полярлы стационарлық фазасы дайындалды және бағаланды. Пептидтік қоспаларға арналған PMP бағандарының хроматографиялық көрсеткіштері бөлу тиімділігі мен ажыратымдылығы тұрғысынан өте жақсы. PMP бағандарының бөлу тиімділігінің жоғарылауы кремний диоксиді бөлшектерінің өлшемі мен кеуек өлшемі, стационарлық фазалардың бақыланатын синтезі және күрделі бағандарды орау материалдары сияқты бірнеше себептерге байланысты. Жоғары бөлу тиімділігінен басқа, бұл стационарлық фазаның тағы бір артықшылығы - жоғары ағын жылдамдығында бағанның төмен кері қысымы. PMP бағандары жоғары қайталанатын және пептидтер қоспаларын және әртүрлі ақуыздардың триптикалық қорытылуын талдау үшін пайдаланылуы мүмкін. Біз бұл бағанды ​​сұйық хроматографияда табиғи өнімдерден, дәрілік өсімдіктердің сығындылары мен саңырауқұлақтардан биоактивті қосылыстарды бөлу үшін пайдалануды жоспарлап отырмыз. Болашақта PMP бағандары ақуыздар мен моноклоналды антиденелерді бөлу үшін де бағаланады.
Филд, Дж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х. және Петерссон, П. Кері фазалы хроматография пептидтік бөлу жүйелерін зерттеу I бөлім: Бағанды ​​сипаттауға арналған хаттаманы әзірлеу. Филд, Дж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х. және Петерссон, П. Кері фазалы хроматография пептидтік бөлу жүйелерін зерттеу I бөлім: Бағанды ​​сипаттауға арналған хаттаманы әзірлеу.Филд, Дж.К., Оверби, М.Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х., және Петерссон, П. Кері фазалы хроматография арқылы пептидтерді бөлу жүйелерін зерттеу, I бөлім: Бағанды ​​сипаттау хаттамасын әзірлеу. Филд, Дж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х. және Петерссон, П. Кері фазалы хроматография пептидтік бөлу жүйелерін зерттеу I бөлім: Баған сипаттамалары үшін хаттаманы әзірлеу. Филд, Дж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х. және Петерссон, П. Кері фазалы хроматография пептидтік бөлу жүйелерін зерттеу I бөлім: Баған сипаттамалары үшін хаттаманы әзірлеу.Филд, Дж.К., Оверби, М.Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х., және Петерссон, П. Кері фазалы хроматография арқылы пептидтерді бөлу жүйелерін зерттеу, I бөлім: Бағанды ​​сипаттау хаттамасын әзірлеу.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Гомес, Б. және т.б. Жұқпалы ауруларды емдеуге арналған жақсартылған белсенді пептидтерді жасау әдістері. Биотехнология. Жетістіктер 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж. және Хрестчатиский, М. Синтетикалық терапиялық пептидтер: ғылым және нарық. Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж. және Хрестчатиский, М. Синтетикалық терапиялық пептидтер: ғылым және нарық.Влиеге П., Лисовски В., Мартинес Дж. және Хрещатиски М. Синтетикалық терапиялық пептидтер: ғылым және нарық.Влиеге П., Лисовски В., Мартинес Дж. және Хрещацкий М. Синтетикалық терапиялық пептидтер: ғылым және нарық. Дәрілік заттарды ашу. Бүгін 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Сие, Ф., Смит, РД және Шен, Ю. Жетілдірілген протеомды сұйықтық хроматографиясы. Сие, Ф., Смит, РД және Шен, Ю. Жетілдірілген протеомды сұйықтық хроматографиясы.Ф., Смит Р.Д. және Шен Ю. Қараңыз. Жетілдірілген протеомды сұйықтық хроматографиясы. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Жетілдірілген ақуыз құрамы 液相色谱。Ф., Смит Р.Д. және Шен Ю. Қараңыз. Жетілдірілген протеомды сұйықтық хроматографиясы.Хроматография журналы. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. және т.б. Жетілдірілген сұйық хроматография-масс-спектрометрия кең ауқымды метаболомика мен протеомиканы біріктіре алады. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, С.М. және Салисбери, Дж.Дж. Фармацевтикалық дамудағы UHPLC рөлі. Чеснат, С.М. және Салисбери, Дж.Дж. Фармацевтикалық дамудағы UHPLC рөлі.Чеснат, С.М. және Солсбери, Дж.Дж. Фармацевтикалық дамудағы UHPLC рөлі.Чеснат, С.М. және Салисбери, Дж.Дж. Дәрілік заттарды әзірлеудегі UHPLC рөлі. J. ​​Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Ву, Н. және Клаузен, А.М. Жылдам бөлуге арналған аса жоғары қысымды сұйықтық хроматографиясының негізгі және практикалық аспектілері. Ву, Н. және Клаузен, А.М. Жылдам бөлуге арналған аса жоғары қысымды сұйықтық хроматографиясының негізгі және практикалық аспектілері.Ву, Н. және Клаузен, А.М. Жылдам бөлуге арналған жоғары қысымды сұйықтық хроматографиясының негізгі және практикалық аспектілері. Ву, Н. және Клаузен, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Ву, Н. және Клаузен, А.М. Жылдам бөлуге арналған аса жоғары қысымды сұйықтық хроматографиясының негізгі және практикалық аспектілері.Ву, Н. және Клаузен, А.М. Жылдам бөлуге арналған жоғары қысымды сұйықтық хроматографиясының негізгі және практикалық аспектілері.J. September. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. және Челитчефф, П. Фармацевтикалық әзірлемелерде ультра өнімді сұйық хроматографияны қолдану. Рен, С.А. және Челитчефф, П. Фармацевтикалық әзірлемелерде ультра өнімді сұйық хроматографияны қолдану.Рен, С.А. және Челишефф, П. Фармацевтикалық әзірлемелерде аса жоғары өнімді сұйық хроматографияны қолдану. Wren, SA & Tchelicheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Рен, С.А. және Челитчефф, П.Рен, С.А. және Челишефф, П. Дәрілік заттарды әзірлеуде ультра өнімді сұйық хроматографияны қолдану.Хроматография журналы. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. және т.б. Энтеровирус 71-ді тиімді тазартуға арналған жоғары ішкі фазасы бар судағы май эмульсиясынан алынған монолитті макрокеуекті гидрогель. Химиялық жоба. Journal 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. және Уилкинс, ДЖА Сұйық хроматографияның протеомикадағы рөлі. Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. және Уилкинс, ДЖА Сұйық хроматографияның протеомикадағы рөлі.Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. және Уилкинс, ДЖА Сұйық хроматографияның протеомикадағы рөлі. Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. және Уилкинс, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. және Вилкинс, ДжаШи, Ю., Сян, Р., Хорват, К. және Уилкинс, ДЖА Сұйық хроматографияның протеомикадағы рөлі.Хроматография журналы. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вутей, Дж.-Л. & Гилларм, Д. Терапиялық пептидтер мен ақуыздарды кері фазалы сұйық хроматографиялық бөлудегі жаңа үрдістер: теория және қолданылуы. & Гилларм, Д. Терапиялық пептидтер мен ақуыздарды кері фазалы сұйық хроматографиялық бөлудегі жаңа үрдістер: теория және қолданылуы. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов және белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория және приложения. & Гийарм, Д. Терапиялық пептидтер мен ақуыздарды кері фазалы сұйықтық хроматографиясы арқылы бөлудегі жаңа үрдістер: теория және қолданылуы. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 және Гилярм, Д.және Гилярме, Д. Терапиялық пептидтер мен ақуыздарды кері фазалы сұйықтық хроматографиясы арқылы бөлудегі жаңа үрдістер: теория және қолданылуы.J. Pharm. Биомедициналық ғылым. анус. 69, 9–27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дэйли, А.Э. және Геблер, Дж.К. Бірінші және екінші бөлу өлшемдерінде әртүрлі рН мәні бар RP-RP-HPLC жүйесін қолдана отырып, пептидтерді екі өлшемді бөлу. Гилар, М., Оливова, П., Дэйли, А.Э. және Геблер, Дж.К. Бірінші және екінші бөлу өлшемдерінде әртүрлі рН мәні бар RP-RP-HPLC жүйесін қолдана отырып, пептидтерді екі өлшемді бөлу.Гилар М., Оливова П., Дали А.Е. және Геблер Дж.К. Бірінші және екінші бөлу өлшемдерінде әртүрлі рН мәні бар RP-RP-HPLC жүйесін қолдана отырып, пептидтерді екі өлшемді бөлу.Гилар М., Оливова П., Дали А.Е. және Геблер Дж.К. RP-RP-HPLC жүйесін қолдана отырып, бірінші және екінші бөлу өлшемдерінде әртүрлі рН мәндерін қолдана отырып, пептидтерді екі өлшемді бөлу. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Феллитти, С. және т.б. 2 мкм-ден кіші толық кеуекті және үстірт кеуекті C18 бөлшектерімен толтырылған жоғары өнімді хроматографиялық бағандардың масса алмасуын және кинетикалық сипаттамаларын зерттеу. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Пиовесана, С. және т.б. Өсімдік биоактивті пептидтерін оқшаулау, идентификациялау және валидациялаудағы соңғы үрдістер мен аналитикалық қиындықтар. анус. Анальды тіршілік иелері. Химиялық. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж.Б. және т.б. Тіршілік патшалығының протеомдық пейзажы. Табиғат 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
Де Лука, К. және т.б. Препараттық сұйық хроматография арқылы терапиялық пептидтерді өңдеуден кейінгі кезең. Molecules (Базель, Швейцария) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Аралас режимдегі хроматография және оны биополимерлерге қолдану. Yang, Y. & Geng, X. Аралас режимдегі хроматография және оны биополимерлерге қолдану.Ян, Ю. және Генг, Х. Аралас режимді хроматография және оны биополимерлерге қолдану. Ян, Ю және Гэн, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Аралас режимді хроматография және оны биополимерлерде қолдану.Ян, Ю. және Джин, Х. Аралас режимді хроматография және оны биополимерлерге қолдану.Хроматография журналы. A 1218(49), 8813–8825 (2011).