Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет. Сіз шектеулі CSS қолдауы бар шолғыш нұсқасын пайдаланып жатырсыз. Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Оған қоса, тұрақты қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Бірден үш слайдтан тұратын карусельді көрсетеді. Бір уақытта үш слайд арқылы жылжу үшін «Алдыңғы» және «Келесі» түймелерін пайдаланыңыз немесе бір уақытта үш слайд арқылы жылжу үшін соңында сырғытпа түймелерін пайдаланыңыз.
Кеуекті кремний диоксиді бөлшектері кең кеуекті бөлшектерді алу үшін кейбір модификациялармен золь-гель әдісімен дайындалды. Бұл бөлшектер N-фенилмалеймидті интеркалирленген полиамидтерді алу үшін кері тізбекті тасымалдау-фрагментациялау (RAFT) полимерлеуі арқылы N-фенилмалеймид-метилвинил изоцианат (PMI) және стиролмен туындыланды. Стирол (ПМП) стационарлық фазасы. Тот баспайтын болаттан жасалған тар ұңғылы бағандар (ішкі диаметрі 100 × 1,8 мм) суспензиялы қаптамамен оралған. PMP колоннасының хроматографиялық өнімділігі бес пептидтен (Гли-Тир, Гли-Леу-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, Леу амин қышқылы энкефалин) және адамның триптикалық серумаль альбуминінен тұратын синтетикалық пептидтер қоспасын бөлу үшін бағаланды. Оңтайлы элюция жағдайында пептидтер қоспасы бар плиталардың теориялық саны 280 000 пластина/кв.м жетті. Әзірленген бағананың бөлу өнімділігін коммерциялық Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстыра отырып, PMP бағанының бөлу тиімділігі бөлу тиімділігі мен ажыратымдылығы бойынша коммерциялық бағанадан жоғары екендігі байқалды.
Биофармацевтика өнеркәсібі соңғы жылдары нарық үлесінің айтарлықтай өсуімен кеңейіп жатқан жаһандық нарыққа айналды. Биофармацевтика өнеркәсібінің қарқынды өсуімен1,2,3 пептидтік және ақуыздық талдауға үлкен қажеттілік туындайды. Пептидті синтездеу кезінде мақсатты пептидтен басқа әртүрлі қоспалар түзіледі, сондықтан пептидтің қажетті тазалығын алу үшін хроматографиялық тазарту қажет. Дене сұйықтықтарындағы, тіндеріндегі және жасушаларындағы ақуыздарды талдау және сипаттау бір үлгіде болуы мүмкін анықтауға болатын түрлердің көп болуына байланысты өте күрделі міндет болып табылады. Масс-спектрометрия пептидтер мен ақуыздарды секвенирлеудің тиімді құралы болғанымен, мұндай үлгілер масс-спектрометрге тікелей енгізілсе, бөлу қанағаттанарлықсыз болады. Бұл мәселені MS талдау алдында сұйық хроматография (СК) жүргізу арқылы шешуге болады, ол берілген уақытта масс-спектрометрге түсетін талданатын заттардың мөлшерін азайтады4,5,6. Сонымен қатар, сұйық фазаны бөлу кезінде талданатын заттар тар аймақта шоғырлануы мүмкін, осылайша бұл талданатын заттарды шоғырландырады және MS анықтау сезімталдығын арттырады. Сұйық хроматография (СК) соңғы онжылдықта айтарлықтай дамыды және протеомдық талдаудың кеңінен қолданылатын әдісі болды7,8,9,10.
Кері фазалық сұйық хроматография (RP-LC) стационарлық фаза ретінде октадецил-модификацияланған кремний диоксиді (ODS) пайдалана отырып, пептидтердің қоспаларын тазарту және бөлу үшін кеңінен қолданылады11,12,13. Дегенмен, күрделі құрылымы мен амфотерлік табиғатына байланысты 14,15 RP стационарлық фазалары пептидтер мен ақуыздардың қанағаттанарлық бөлінуін қамтамасыз ете алмайды. Сондықтан полярлы және полярлы емес фрагменттері бар пептидтер мен белоктарды талдау осы талдағыштарды өзара әрекеттесу және ұстап тұру үшін арнайы жасалған стационарлық фазаларды қажет етеді16. Мультимодальдық әрекеттесулерді ұсынатын аралас хроматография пептидтерді, ақуыздарды және басқа да күрделі қоспаларды бөлу үшін RP-LC-ге балама бола алады. Бірнеше аралас типті стационарлық фазалар дайындалды және пептидтер мен ақуыздарды бөлу үшін осы стационарлы фазалармен толтырылған бағаналар пайдаланылды17,18,19,20,21. Полярлы және полярсыз топтардың болуына байланысты аралас режимдегі стационарлы фазалар (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярлық интеркалация/RPLC) пептидтер мен ақуыздарды бөлу үшін қолайлы22,23,24,25,26,27,28. , ковалентті байланысқан полярлық топтары бар полярлық интеркалирленген стационар фазалар жақсы бөліну мүмкіндіктері мен полярлы және полярсыз талданатын заттар үшін бірегей селективтілікті көрсетеді, өйткені бөліну талданатын зат пен стационар фазаның өзара әрекеттесуіне байланысты Мультимодальдық әрекеттесулер 29,30,31,32. Жақында Чжан т.б. 30 полиаминдердің беенилмен аяқталатын стационарлық фазалары алынды және көмірсутектер, антидепрессанттар, флавоноидтар, нуклеозидтер, эстрогендер және кейбір басқа да талданатын заттар сәтті бөлінген. Полярлық кірістірілген стационарлық материалдың полярлық және полярлы емес топтары бар, сондықтан оны пептидтер мен ақуыздарды гидрофобты және гидрофильді бөліктерге бөлу үшін пайдалануға болады. Полярлық кірістірілген бағандар (мысалы, амидті кірістірілген C18 бағандары) Ascentis Express RP-Amide бағаналары сауда атауымен қол жетімді, бірақ бұл бағандар тек 33 аминді талдау үшін пайдаланылған.
Ағымдағы зерттеуде полярлық кірістіру стационарлық фазасы (N-фенилмалеймид, кірістірілген полистирол) пептидтердің бөлінуі және трипттік HSA бөлінуі үшін дайындалды және бағаланды. Стационарлық кезеңді дайындау үшін келесі стратегия қолданылды. Кеуекті кремнезем бөлшектері 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 дайындау сұлбаларында кейбір өзгерістермен алдыңғы жарияланымдарымызда сипатталған процедураларға сәйкес дайындалды. Несепнәр, полиэтиленгликоль (PEG), TMOS және сулы-сірке қышқылының арақатынастары кремнеземді тотығының үлкен бөлшектерін алу үшін реттелді. Екіншіден, жаңа фенилмалеймид-метилвинил изоцианат лиганды синтезделді және оның туынды кремнеземдік бөлшектері полярлы енгізілген стационарлық фазаларды дайындау үшін пайдаланылды. Алынған стационарлық фаза оңтайландырылған орау схемасы бойынша тот баспайтын болаттан жасалған колонкаға (ішкі диаметрі 100 × 1,8 мм) оралған. Колоннаның қаптамасы колонна ішінде біркелкі қабатты қамтамасыз ету үшін механикалық дірілмен көмектеседі. Қапталған колонна бес пептидтен тұратын пептидтер қоспасын бөлу үшін бағаланды (Гли-Тир, Гли-Леу-Тир, Гли-Гли-Тыр-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, лейцин-энкефалин пептид). және адам сарысуы альбуминінің (HSA) триптикалық гидролизаттары. Пептидтік қоспа мен HSA триптикалық дайджесті жақсы ажыратымдылықпен және тиімділікпен бөлінгені байқалды. PMP бағанының бөлу тиімділігі Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстырылды. Пептидтер мен протеиндер PMP бағанында жақсы ажыратымдылық пен жоғары бөлу тиімділігіне ие екендігі байқалды, ал PMP бағанының бөлу тиімділігі Ascentis Express RP-Amide бағанына қарағанда жоғары.
PEG (полиэтиленгликоль), мочевина, сірке қышқылы, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлоросилан (TMCS), трипсин, адам сарысуы альбумині (HSA), аммоний хлориді, мочевина, гексаметилметакрилоилдзилазан (HMDS), метхлорид, метил 4-гидрокси- TEMPO, бензоил пероксиді (BPO), HPLC үшін ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол және ацетон. Sigma-Oldrich компаниясы (Сент-Луис, Миссури, АҚШ).
Мочевина (8 г), полиэтиленгликоль (8 г) және 8 мл 0,01 Н сірке қышқылының қоспасы 10 минут бойы араластырылды және мұзбен салқындату кезінде оған 24 мл TMOS қосылды. Реакция қоспасы тот баспайтын болаттан жасалған автоклавта 40°C температурада 6 сағат, содан кейін 120°C температурада 8 сағат бойы қыздырылды. Су төгіліп, қалдық 70°C температурада 12 сағат бойы кептірілді. Кептірілген жұмсақ блоктар тегіс ұнтақталған және пеште 550 ° C температурада 12 сағат бойы күйдірілген. Бөлшек өлшемдерінің, кеуектер өлшемі мен бетінің қайталану мүмкіндігін сынау үшін үш партия дайындалды және сипатталды.
Полистирол тізбектері үшін полярлық топ және стационарлық фаза. Дайындау процесі төменде сипатталған.
N-фенилмалеймид (200 мг) және метилвинил изоцианат (100 мг) сусыз толуолда ерітілді, содан кейін фенилмалейминат пен метилил қышқылының (CPPM) сополимерін алу үшін реакциялық колбаға 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) қосылды. ) Қоспа 3 сағат бойы 60 ° C температурада қыздырылды, сүзіледі және пеште 3 сағат бойы 40 ° C температурада кептірілді.
Кептірілген кремний диоксиді бөлшектері (2 г) құрғақ толуолда (100 мл) дисперсті болды, араластырылды және 500 мл дөңгелек түбі бар колбада 10 минут бойы ультрадыбыстық әсерге ұшырады. PMCP (10 мг) толуолда ерітілді және қосу воронкасы арқылы реакциялық колбаға тамшылатып қосылды. Қоспа 8 сағат бойы 100 ° C температурада рефлюкспен өңделеді, сүзіледі, ацетонмен жуылады және 60 ° C температурада 3 сағат кептірілді. Содан кейін PMCP (100 г) бар кремний диоксиді бөлшектері толуолда (200 мл) ерітілді және оған катализатор ретінде 100 мкл дибутилтин дилауратының қатысуымен 4-гидрокси-ТЕМПО (2 мл) қосылды. Қоспа 8 сағат бойы 50 ° C температурада араластырылды, сүзіледі және 50 ° C температурада 3 сағат кептірілді.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиді BPO (0,5 мл) және TEMPO-PMCP (1,5 г) қосылған кремний диоксиді бөлшектері толуолда дисперсті және азотпен тазартылды. Стиролды полимерлеу 100°С температурада 12 сағат бойы жүргізілді. Алынған өнім метанолмен жуылып, түні бойы 60°C температурада кептірілді. Реакцияның жалпы схемасы күріште көрсетілген. бір.
Үлгілер 393 К температурада 1 сағат бойы 10-3 Торр-ден аз қалдық қысым алынғанша газсыздандырылды. Жалпы кеуек көлемін анықтау үшін салыстырмалы қысымда P/P0 = 0,99 адсорбцияланған N2 мөлшері қолданылды. Таза және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің морфологиясы сканерлеуші ​​электронды микроскоптың көмегімен зерттелді (Hitachi High Technologies, Токио, Жапония). Құрғақ үлгілер (таза кремний тотығы және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері) көміртекті таспаны пайдаланып алюминий таяқшаларына орналастырылды. Алтын Q150T шашыратқыш құрылғының көмегімен үлгіге қойылды және үлгіге қалыңдығы 5 нм Au қабаты қойылды. Бұл төмен кернеу процесінің тиімділігін жақсартады және жақсы суық бүркуді қамтамасыз етеді. Элементтік талдау Thermo Electron (Waltham, MA, АҚШ) Flash EA1112 элементтік құрам анализаторы арқылы орындалды. Бөлшек өлшемдерінің таралуын алу үшін Malvern бөлшектер өлшемі анализаторы (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 пайдаланылды. Қапталмаған кремний диоксиді бөлшектері және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері (әрқайсысы 5 мг) 5 мл изопропанолда дисперсті болды, 10 минут бойы ультрадыбыспен өңделді, 5 минут бойы араластырылды және Mastersizer оптикалық стендіне орналастырылды. Термогравиметриялық талдау 30-дан 800 °С-қа дейінгі температура диапазонында минутына 5 °С жылдамдықпен жүргізіледі.
Өлшемдері (ID 100 × 1,8 мм) шыны талшықпен қапталған тар саңылау тот баспайтын болаттан жасалған бағандар 31-анықтамадағыдай процедураны сақтай отырып, суспензияны толтыру әдісімен оралған. Тот баспайтын болаттан жасалған баған (шыны төселген, ID 100 × 1,8 мм) және 1 мкм фриті бар розетка (ILA, технологиялық фрит құрылғысына қосылған. АҚШ). 150 мг стационарлы фазаны 1,2 мл метанолға суспензия және резервуар колоннасына беру арқылы стационарлық фазаның суспензиясын дайындаңыз. Метанол суспензия еріткіші және бақылау еріткіші ретінде пайдаланылды. 10 минут бойы 100 МП, 15 минут үшін 80 МП және 30 минут бойы 60 МП қысым ретін қолдану арқылы бағанды ​​орау. Орау процесінде бағандардың біркелкі орауын қамтамасыз ету үшін механикалық діріл үшін екі газ хроматографиялық колонна вибраторы (Alltech, Deerfield, IL, АҚШ) қолданылды. Шламды орауды жабыңыз және жіпке зақым келтірмеу үшін қысымды баяу босатыңыз. Колонна суспензия саптамасынан ажыратылды және оның жұмысын тексеру үшін кіріске басқа фитинг бекітіліп, LC жүйесіне қосылды.
Арнайы MLC LC сорғысын (10AD Shimadzu, Жапония), 50 нЛ инъекциялық ілмегі бар сынама алғышты (Valco (АҚШ) C14 W.05), мембраналық газсыздандырғышты (Shimadzu DGU-14A) және UV-VIS капиллярлық терезесін пайдаланып құрастырылды. Детектор құрылғысы (УК-2075) және эмальданған микроколонна. Қосымша колоннаның кеңеюінің әсерін азайту үшін өте тар және қысқа байланыстырушы түтіктерді пайдаланыңыз. Колонканы толтырғаннан кейін 1/16 дюймдік редукциялық түйіннің шығысына капиллярды (50 мкм идентификатор 365) орнатыңыз және редукциялық түйіннің капиллярын (50 мкм) орнатыңыз. Деректерді жинау және хроматограмманы өңдеу Multichro 2000 бағдарламалық құралы арқылы орындалады. 254 нм, зерттелетін заттардың ультракүлгін жұтуы 0-де бақыланды. Хроматографиялық деректер OriginPro8 (Нортхэмптон, МА) көмегімен талданды.
Адам сарысуы альбумині, лиофилденген ұнтақ, ≥ 96% (агарозды гель электрофорезі) 3 мг трипсинмен (1,5 мг), 4,0 М мочевинамен (1 мл) және 0,2 М аммоний бикарбонатымен (1 мл) араласады. Ерітінді 10 минут бойы араластырып, су моншасында 37°C температурада 6 сағат ұсталды, содан кейін 1 мл 0,1% ТФҚ-мен сөндірілді. Ерітіндіні сүзіп, 4°C төмен температурада сақтаңыз.
PMP бағанында пептидтер мен трипттік дайджест HSA қоспасының бөлінуі бөлек бағаланды. PMP бағанымен бөлінген пептидтер мен HSA қоспасының триптикалық гидролизін тексеріңіз және нәтижелерді Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстырыңыз. Теориялық тақталардың саны келесі теңдеу арқылы есептеледі:
Таза кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің SEM кескіндері 2-суретте көрсетілген. Таза кремний тотығы бөлшектерінің (A, B) SEM кескіндері біздің алдыңғы зерттеулерімізбен салыстырғанда бөлшектер ұзартылған немесе тұрақты емес симметрияға ие сфералық пішінді көрсетеді. Лигандпен (С, D) байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің беті таза кремнеземдік бөлшектерге қарағанда тегіс болады, бұл кремний диоксиді бөлшектерінің бетін жауып тұрған полистирол тізбектерінен болуы мүмкін.
Таза кремний диоксиді бөлшектерінің (A, B) және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің (C, D) сканерленген электронды микросуреттері.
Таза кремнезем бөлшектері мен лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектер өлшемдерінің таралуы 2-суретте көрсетілген. 3(А). Бөлшектердің көлемдік таралу қисықтары кремний диоксиді бөлшектерінің мөлшері химиялық модификациядан кейін өскенін көрсетті (3А-сурет). Ағымдағы зерттеу мен алдыңғы зерттеудегі кремний диоксиді бөлшектерінің мөлшерін бөлу деректері 1(А) кестеде салыстырылған. PMP бөлшектерінің көлемдік өлшемі d(0,5) алдыңғы зерттеудегі 3,05 мкм ad(0,5) мәнімен салыстырғанда 3,36 мкм болды (полистиролмен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері)34. Реакциялық қоспадағы PEG, мочевина, TMOS және сірке қышқылының арақатынасының өзгеруіне байланысты бұл партияның бөлшектердің мөлшері бойынша таралуы біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда тар болды. PMP фазасының бөлшектерінің мөлшері біз бұрын зерттеген полистиролмен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің фазасынан сәл үлкенірек. Бұл кремнеземді бөлшектердің стиролмен бетінің функционализациясы кремний диоксиді бетінде тек полистирол қабатын (0,97 мкм) тұндырғанын білдіреді, ал PMP фазасында қабат қалыңдығы 1,38 мкм болды.
Таза кремнезем бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектердің өлшемдерінің таралуы (A) және кеуектерінің таралуы (B).
Осы зерттеуде пайдаланылған кремний тотығы бөлшектерінің кеуек өлшемі, кеуек көлемі және бетінің ауданы 1 (В) кестеде көрсетілген. Таза кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің PSD профильдері күріш. 3(B). Нәтижелер біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырмалы болды34. Таза және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің кеуектерінің өлшемдері сәйкесінше 310 Å және 241 Å болды, бұл химиялық модификациядан кейін 1 (B) кестеде көрсетілгендей кеуек өлшемі 69 Å азайғанын көрсетеді және ығысу қисығы суретте көрсетілген. біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстыруға болады (124 м2/г). 1(В)-кестеде көрсетілгендей, химиялық модификациядан кейін кремний диоксиді бөлшектерінің бетінің ауданы (м2/г) да 116 м2/г-дан 105 м2/г дейін төмендеді.
Стационарлық фазаның элементтік талдауының нәтижелері кестеде келтірілген. 2. Ағымдағы стационарлық фазаның көміртегі мөлшері 6,35% құрайды, бұл біздің алдыңғы зерттеуімізден төмен (полистиролмен байланысты кремний диоксиді бөлшектері, сәйкесінше, 7,93%35 және 10,21%) 42. Төмендегі ағымдағы стационарлы фазаның көміртегі мөлшері, өйткені кейбір полярлы лигандтар, мысалы, фенилмалеимид (МП) фенилмалеимид) МП. СП дайындауда стиролға қосымша 4-гидрокси-ТЕМПО қолданылды. Ағымдағы стационарлық фазадағы азоттың салмақтық пайызы алдыңғы зерттеулердегі 0,1735 және 0,85% салыстырғанда 2,21% құрайды42. Бұл қазіргі стационарлық фазада фенилмалеймидке байланысты азоттың жоғары салмақтық пайызы бар дегенді білдіреді. Сол сияқты, (4) және (5) өнімдерде көміртегі мөлшері сәйкесінше 2,7% және 2,9%, ал соңғы өнімде (6) 6,35% көміртегі бар, бұл 2-кестеде көрсетілген. Термогравиметриялық талдау (TGA) PMP стационарлық фазасында салмақ жоғалтуды сынау үшін қолданылды және TGA қисығы 4-суретте салмақ жоғалтуды көрсетеді. 8,6%, бұл көміртегі құрамымен жақсы сәйкес келеді (6,35%), өйткені лигандтарда тек C ғана емес, сонымен қатар N, O және H бар.
Лиганды фенилмалеймид-метилвинил изоцианаты полярлы фенилмалеймид пен винилизоцианат топтарына байланысты кремний диоксиді бөлшектерінің бетін өзгерту үшін таңдалды. Винил изоцианат топтары тірі радикалды полимерлеу арқылы стиролмен одан әрі әрекеттесе алады. Екінші себеп - талданатын затпен орташа әрекеттесетін және талданатын зат пен стационарлық фаза арасында күшті электростатикалық әрекеттесулері жоқ топты енгізу, өйткені фенилмалеймид бөлігінде қалыпты рН кезінде виртуалды заряд болмайды. Стационарлық фазаның полярлығын стиролдың оңтайлы мөлшерімен және бос радикалды полимерлену реакциясының уақытымен басқаруға болады. Реакцияның соңғы сатысы (бос радикалды полимерлеу) өте маңызды, өйткені ол стационарлық фазаның полярлығын өзгертеді. Осы стационарлық фазалардағы көміртегі құрамын тексеру үшін элементтік талдау жүргізілді. Стиролдың мөлшері мен реакция уақытын ұлғайту стационарлық фазадағы көміртегінің мөлшерін арттыратыны және керісінше байқалды. Әртүрлі стирол концентрациясымен дайындалған СП көміртегі жүктемелері әртүрлі. Сол сияқты, бұл стационарлық фазалар тот баспайтын болаттан жасалған бағандарға орналастырылды және олардың хроматографиялық сипаттамалары (селективтілік, рұқсат ету, N мәні және т.б.) тексерілді. Осы эксперименттердің негізінде басқарылатын полярлықты және талданатын заттың жақсы сақталуын қамтамасыз ету үшін PMP стационарлық фазасын дайындау үшін оңтайландырылған композиция таңдалды.
PMP бағанасы сонымен қатар жылжымалы фазаның сыйымдылығын пайдалана отырып, пептидтердің бес қоспасын (Гли-Тир, Гли-Леу-Тир, Гли-Гли-Тыр-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, лейцин-энкефалин) талдау үшін бағаланды. 60/40 (көлем/көлем) ACN/су (0,1% TFA) 80 мкл/мин ағын жылдамдығы. Оңтайлы элюция жағдайында (200 000 пластина/м) бір бағандағы теориялық пластиналардың (N) саны (100 × 1,8 мм) 20 000 ± 100 құрайды. Үш PMP бағанының N мәндері 3-кестеде және хроматограммалар 5А-суретте көрсетілген. PMP бағанында жоғары ағын жылдамдығында (700 мкл/мин) жылдам талдау, бес пептид бір минут ішінде элюцияланған, бір баған үшін тамаша N мәні 13500 ± 330 (диаметрі 100 x 1,8 мм), 135 000 пластина/м эквивалентті (Cурет 5B). Бірдей өлшемдегі үш баған (ішкі диаметрі 100 x 1,8 мм) қайталану мүмкіндігін тексеру үшін PMP стационарлық фазасының үш түрлі партиясымен толтырылды. Талдаушылар оңтайлы элюция жағдайларын, N теориялық пластиналардың санын және ұстау уақытын пайдалана отырып, әрбір бағандағы бірдей сынақ қоспасын бөлу арқылы әрбір баған үшін жазылды. PMP бағандарының қайталану деректері 4-кестеде көрсетілген. PMP бағанының қайталану мүмкіндігі 3-кестеде көрсетілгендей өте төмен %RSD мәндерімен жақсы байланысты.
PMP бағанында (B) және Ascentis Express RP-Amide бағанында (A) пептидтік қоспаларды бөлу, жылжымалы фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP бағанының өлшемдері (100 x 1,8 мм id), талдау Қосылыстардың элюция реті: 1 (Гли-Тир), 2Тир (Глай) (Гли-Гли-Тир-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) және 5 (лейцин қышқылы энкефалин).
PMP бағаны (ішкі диаметрі 100 x 1,8 мм) HPLC арқылы адам сарысуы альбуминінің триптикалық гидролизатын бөлу үшін бағаланды. 6-суреттегі хроматограмма үлгілердің өте жақсы ажыратымдылықпен жақсы бөлінгенін көрсетеді. HSA ерітінділері ағын жылдамдығы 100 мкл/мин, жылжымалы фаза 70/30 ацетонитрил/су және 0,1% TFA көмегімен талданған. HSA ыдырауы хроматограммада (6-сурет) көрсетілгендей 17 пептидке сәйкес 17 шыңға бөлінді. HSA гидролизатынан жеке шыңдарды бөлу тиімділігі есептелді және мәндері 5-кестеде көрсетілген.
HSA триптикалық гидролизаттары PMP бағанында (ішкі диаметрі 100 x 1,8 мм), ағын жылдамдығы (100 мкл/мин), жылжымалы фаза 60/40 ацетонитрил/су және 0,1% TFA бойынша бөлінді.
мұндағы L – баған ұзындығы, η – жылжымалы фазаның тұтқырлығы, ΔP – колоннаның кері қысымы, u – жылжымалы фазаның сызықтық жылдамдығы. PMP бағанының өткізгіштігі 2,5 × 10–14 м2, ағын жылдамдығы 25 мкл/мин, 60/40 в/в пайдаланылды. ACN/су. PMP бағанының өткізгіштігі (ID 100 × 1,8 мм) біздің алдыңғы Ref.34 зерттеуімізге ұқсас болды. Үсті кеуекті бөлшектермен толтырылған колоннаның өткізгіштігі 1,7×10,6 мкм, 5 мкм бөлшектер үшін 2,5×10-14 м243. Демек, PMP фазасының өткізгіштігі өлшемі 5 мкм болатын өзек-қабық бөлшектерінің өткізгіштігіне ұқсас.
мұндағы Wx – хлороформмен толтырылған колоннаның массасы, Wy – метанолмен толтырылған колоннаның массасы, ρ – еріткіштің тығыздығы. Метанол (ρ = 0,7866) және хлороформ (ρ = 1,484) тығыздығы. Кремний-C18 бөлшектерінің бағанының (100 × 1,8 мм ID)34 және біздің бұрын зерттелген C18-мочевинаның31 бағанының жалпы кеуектілігі сәйкесінше 0,63 және 0,55 болды. Бұл мочевина лигандтарының болуы стационарлық фазаның өткізгіштігін төмендететінін білдіреді. Екінші жағынан, PMP бағанының жалпы кеуектілігі (ішкі диаметрі 100 × 1,8 мм) 0,60 құрайды. PMP колонналары С18 байланысқан кремний диоксиді бөлшектерімен оралған бағандарға қарағанда өткізгіштігі аз, өйткені C18 типті стационар фазаларда C18 лигандтары кремний диоксиді бөлшектеріне сызықтық тізбектерде бекітіледі, ал полистирол түріндегі стационарлық фазаларда бөлшектердің айналасында салыстырмалы қалың полимер түзіледі. А қабаты. Әдеттегі тәжірибеде бағанның кеуектілігі келесідей есептеледі:
Суретте. 7A, B PMP бағанына (идентификаторы 100 x 1,8 мм) және Ascentis Express RP-Amide бағанына (идентификаторы 100 x 1,8 мм) арналған Ван Димтер сызбаларын көрсетеді, бірдей элюция жағдайында, 60/40 ACN/H2O және 0,1% TFA 20 мкл/мин бағандарда 80 мкл/мин. Оңтайлы ағын жылдамдығы кезінде (80 мкл/мин) ең төменгі HETP мәндері PMP бағанасы мен Ascentis Express RP-Amide бағанасы үшін тиісінше 2,6 мкм және 3,9 мкм болды. HETP мәндері PMP бағанының (100 x 1,8 мм идентификаторы) бөлу тиімділігінің коммерциялық қол жетімді Ascentis Express RP-Amide бағанынан (100 x 1,8 мм идентификатор) әлдеқайда жоғары екенін көрсетеді. 7(A)-суреттегі ван Димтер графигі N мәнінің төмендеуі алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда ағынның жоғарылауымен айтарлықтай жоғары емес екенін көрсетеді. Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстырғанда PMP бағанының (идентификаторы 100 × 1,8 мм) жоғарырақ бөлу тиімділігі жақсартылған бөлшектердің пішіні мен өлшеміне және ағымдағы жұмыста қолданылатын күрделі бағанды ​​орау процедурасына негізделген34.
(A) 0,1% TFA бар 60/40 ACN/H2O ішіндегі PMP бағанында (id 100 x 1,8 мм) алынған Ван Димтер графигі (HETP және жылжымалы фазаның сызықтық жылдамдығы). (B) 0,1% TFA бар 60/40 ACN/H2O ішінде Ascentis Express RP-Amide бағанында (id 100 x 1,8 мм) алынған Ван Димтер графигі (HETP және жылжымалы фазаның сызықтық жылдамдығы).
Интеркалирленген полистиролдың полярлық стационарлық фазасы жоғары өнімді сұйық хроматографияда адам сарысуы альбуминінің (HSA) синтетикалық пептидтер мен триптикалық гидролизат қоспасын бөлу үшін дайындалды және бағаланды. Пептидтік қоспалар үшін PMP бағандарының хроматографиялық көрсеткіштері бөлу тиімділігі мен ажыратымдылығы бойынша тамаша. PMP колонналарының жақсартылған бөліну тиімділігі кремний диоксиді бөлшектерінің өлшемі мен кеуек өлшемі, стационарлық фазалардың бақыланатын синтезі және күрделі бағанды ​​орау материалдары сияқты бірнеше себептерге байланысты. Жоғары бөліну тиімділігінен басқа, бұл стационарлық фазаның тағы бір артықшылығы - жоғары ағын жылдамдығында төмен бағана кері қысымы. PMP бағандары жоғары репродукциялы және пептидтер қоспаларын және әртүрлі ақуыздардың триптикалық қорытылуын талдау үшін пайдаланылуы мүмкін. Бұл бағанды ​​сұйық хроматографияда табиғи өнімдерден, дәрілік өсімдіктер мен саңырауқұлақтардың сығындыларынан биоактивті қосылыстарды бөлу үшін пайдалануды көздеп отырмыз. Болашақта PMP бағандары ақуыздар мен моноклоналды антиденелерді бөлу үшін де бағаланады.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Терс фазалық хроматографияның пептидтерді бөлу жүйелерін зерттеу I бөлім: Бағандарды сипаттау хаттамасын әзірлеу. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Терс фазалық хроматографияның пептидтерді бөлу жүйелерін зерттеу I бөлім: Бағанды ​​сипаттау хаттамасын әзірлеу.Филд, Дж.К., Оверби, MR, Лау, Дж., Тогерсен, Х. және Петерссон, П. Пептидтерді бөлу жүйелерін кері фазалы хроматография арқылы зерттеу, I бөлім: бағандарды сипаттау хаттамасын әзірлеу. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Терс фазалық хроматографияның пептидтерді бөлу жүйелерін зерттеу I бөлім: Баған сипаттамаларына арналған хаттаманы әзірлеу. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Терс фазалық хроматографияның пептидтерді бөлу жүйелерін зерттеу I бөлім: Баған сипаттамаларына арналған хаттаманы әзірлеу.Филд, Дж.К., Оверби, MR, Лау, Дж., Тогерсен, Х. және Петерссон, П. Пептидтерді бөлу жүйелерін кері фазалы хроматография арқылы зерттеу, I бөлім: бағандарды сипаттау хаттамасын әзірлеу.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Гомес, Б. және т.б. Жұқпалы ауруларды емдеуге арналған жақсартылған белсенді пептидтерді құру әдістері. Биотехнология. Жетістіктер 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Синтетикалық терапевтік пептидтер: ғылым және нарық. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Синтетикалық терапевтік пептидтер: ғылым және нарық.Vliege P, Lisowski V, Martinez J және Chreschatyski M. Синтетикалық терапевтік пептидтер: ғылым және нарық.Vliege P, Lisowski V, Martinez J және Khreschatsky M. Синтетикалық терапевтік пептидтер: ғылым және нарық. есірткінің ашылуы. Бүгін 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Жетілдірілген протеомдық сұйықтық хроматографиясы. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Жетілдірілген протеомдық сұйықтық хроматографиясы.F., Smith RD және Shen Yu қараңыз. Жетілдірілген протеомдық сұйықтық хроматографиясы. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Жетілдірілген ақуыз құрамы 液相色谱。F., Smith RD және Shen Yu қараңыз. Жетілдірілген протеомдық сұйықтық хроматографиясы.J. Хроматография. A 1261, 78–90 (2012).
Лю, В. және т.б. Жетілдірілген сұйық хроматография-масс-спектрометрия кең ауқымды метаболомика мен протеомиканы біріктіруге қабілетті. анус. Чим. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Фармацевтикалық дамудағы UHPLC рөлі. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Фармацевтикалық дамудағы UHPLC рөлі.Chesnut, SM және Salisbury, JJ Фармацевтикалық дамудағы UHPLC рөлі.Chesnut, SM және Salisbury, JJ Дәрілік заттарды әзірлеудегі UHPLC рөлі. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM. Жылдам бөлуге арналған ультра жоғары қысымды сұйықтық хроматографиясының негізгі және практикалық аспектілері. Wu, N. & Clausen, AM. Жылдам бөлуге арналған ультра жоғары қысымды сұйықтық хроматографиясының негізгі және практикалық аспектілері.Ву, Н. және Клаузен, А.М. Жылдам бөлу үшін жоғары қысымды сұйық хроматографияның негізгі және практикалық аспектілері. Ву, Н. және Клаузен, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Жылдам бөлуге арналған ультра жоғары қысымды сұйықтық хроматографиясының негізгі және практикалық аспектілері.Ву, Н. және Клаузен, А.М. Жылдам бөлу үшін жоғары қысымды сұйық хроматографияның негізгі және практикалық аспектілері.J. қыркүйек Ғылым. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelicheff, P. Фармацевтикалық дамуда ультра өнімді сұйық хроматографияны қолдану. Wren, SA & Tchelicheff, P. Фармацевтикалық дамуда ультра өнімді сұйық хроматографияны қолдану.Ren, SA және Chelischeff, P. Фармацевтикалық дамуда ультра жоғары өнімділік сұйық хроматографияны пайдалану. Wren, SA & Tchelicheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA және Tchelicheff, P.Рен, SA және Челишефф, П. Дәрілік заттарды әзірлеуде ультра өнімді сұйық хроматографияны қолдану.J. Хроматография. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, H. және т.б. Энтеровирусты тиімді тазарту үшін жоғары ішкі фазасы бар судағы май эмульсиясынан алынған монолитті макрокеуекті гидрогель 71. Химиялық. жоба. Журнал 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. & Вилкинс, Джа Сұйық хроматографияның протеомикадағы рөлі. Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. & Вилкинс, Джа Сұйық хроматографияның протеомикадағы рөлі.Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. және Уилкинс, Я.А. Протеомикадағы сұйық хроматографияның рөлі. Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. және Уилкинс, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. және Вилкинс, ДжаШи, Ю., Сян, Р., Хорват, С. және Уилкинс, Я.А. Протеомикадағы сұйық хроматографияның рөлі.J. Хроматография. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вутей, Дж.-Л. & Guillarme, D. Терапевтік пептидтер мен ақуыздардың кері фазалық сұйық хроматографиялық бөлінуіндегі жаңа тенденциялар: теория және қолдану. & Guillarme, D. Терапевтік пептидтер мен ақуыздардың кері фазалық сұйық хроматографиялық бөлінуіндегі жаңа тенденциялар: теория және қолдану. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов және белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория және приложения. & Guillarme, D. Терапевтік пептидтер мен ақуыздарды кері фазалық сұйық хроматография арқылы бөлудің жаңа тенденциялары: теория және қолдану. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Гильярм, Д.және Guillarmé, D. Кері фазалық сұйық хроматография арқылы емдік пептидтер мен ақуыздарды бөлудің жаңа тенденциялары: теория және қолдану.J. Pharm. Биомедициналық ғылым. анус. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Бірінші және екінші бөлу өлшемдерінде әртүрлі рН бар RP-RP-HPLC жүйесін пайдаланып пептидтерді екі өлшемді бөлу. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Бірінші және екінші бөлу өлшемдерінде әртүрлі рН бар RP-RP-HPLC жүйесін пайдаланып пептидтерді екі өлшемді бөлу.Гилар М., Оливова П., Дали А.Е. және Геблер Дж.К. Бірінші және екінші бөлу өлшемдерінде әртүрлі рН бар RP-RP-HPLC жүйесін пайдаланып пептидтерді екі өлшемді бөлу.Гилар М., Оливова П., Дали А.Е. және Геблер Дж.К. RP-RP-HPLC жүйесі арқылы бірінші және екінші бөлу өлшемдерінде әртүрлі рН мәндерін қолданып пептидтерді екі өлшемді бөлу. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Феллитти, С. және т.б. 2 мкм-ден аз толық кеуекті және үстірт кеуекті C18 бөлшектерімен оралған жоғары өнімді хроматографиялық колонналардың масса алмасуын және кинетикалық сипаттамаларын зерттеу. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Пиовесана, С. және т.б. Өсімдіктің биоактивті пептидтерін оқшаулау, идентификациялау және валидациялаудағы соңғы тенденциялар мен аналитикалық қиындықтар. анус. Аналық жаратылыс. Химиялық. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж.Б. және т.б. Тіршілік патшалығының протеомдық ландшафты. Табиғат 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
Де Лука, К. және т.б. Препараттық сұйықтық хроматографиясы арқылы емдік пептидтерді кейінгі өңдеу. Молекулалар (Базель, Швейцария) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Аралас режимдегі хроматография және оның биополимерлерге қолданылуы. Yang, Y. & Geng, X. Аралас режимдегі хроматография және оның биополимерлерге қолданылуы.Ян, Ю. және Генг, X. Аралас режимдегі хроматография және оның биополимерлерге қолданылуы. Ян, Ю және Гэн, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Аралас режимдегі хроматография және оның биополимерлерде қолданылуы.Ян, Ю. және Ген, X. Аралас режимдегі хроматография және оны биополимерлерге қолдану.J. Хроматография. A 1218(49), 8813–8825 (2011).