Tack för att du besöker Nature.com. Du använder en webbläsarversion med begränsat CSS-stöd. För bästa möjliga upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer). För att säkerställa fortsatt support visar vi dessutom webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Visar en karusell med tre bilder samtidigt. Använd knapparna Föregående och Nästa för att bläddra igenom tre bilder åt gången, eller använd skjutreglageknapparna i slutet för att bläddra igenom tre bilder åt gången.
Porösa kiseldioxidpartiklar framställdes med sol-gel-metoden med vissa modifieringar för att erhålla partiklar med breda porer. Dessa partiklar derivatiserades med N-fenylmaleimid-metylvinylisocyanat (PMI) och styren via RAFT-polymerisation (reverse chain transfer-fragmentation) för att producera interkalerade N-fenylmaleimidpolyamider. Styren (PMP) stationär fas. Smalborrade kolonner av rostfritt stål (100 × 1,8 mm innerdiameter) packades med en uppslamningspackning. PMP-kolonnens kromatografiska prestanda utvärderades för att separera en blandning av syntetiska peptider bestående av fem peptider (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu-aminosyrankefalin) och tryptisk hydrolysat av humant serumalbumin (HAS). Under optimala elueringsförhållanden nådde det teoretiska antalet plattor med en blandning av peptider 280 000 plattor/kvm. Vid jämförelse av separationsprestandan hos den utvecklade kolonnen med den kommersiella Ascentis Express RP-Amide-kolonnen observerades att separationseffektiviteten hos PMP-kolonnen var överlägsen den kommersiella kolonnen vad gäller separationseffektivitet och upplösning.
Den biofarmaceutiska industrin har blivit en expanderande global marknad med en betydande ökning av marknadsandelar under senare år. Med den explosionsartade tillväxten inom den biofarmaceutiska industrin1,2,3 finns det ett stort behov av peptid- och proteinanalys. Förutom målpeptiden bildas olika föroreningar under peptidsyntesen, så kromatografisk rening krävs för att uppnå önskad renhet hos peptiden. Analys och karakterisering av proteiner i kroppsvätskor, vävnader och celler är en extremt utmanande uppgift på grund av det stora antalet potentiellt detekterbara arter som finns i ett enda prov. Även om masspektrometri är ett effektivt verktyg för att sekvensera peptider och proteiner, kommer separationen att vara otillfredsställande om sådana prover introduceras direkt i masspektrometern. Detta problem kan lösas genom att utföra vätskekromatografi (LC) före MS-analys, vilket minskar mängden analyter som kommer in i masspektrometern vid en given tidpunkt4,5,6. Dessutom kan analyter koncentreras i ett smalt område under vätskefasseparation, varigenom dessa analyter koncentreras och känsligheten för MS-detektion ökar. Vätskekromatografi (LC) har utvecklats avsevärt under det senaste decenniet och har blivit en allmänt använd metod för proteomanalys .
Omvändfasvätskekromatografi (RP-LC) används ofta för att rena och separera blandningar av peptider med oktadecylmodifierad kiseldioxid (ODS) som stationär fas11,12,13. På grund av deras komplexa struktur och amfotera natur14,15 kan dock RP-stationära faser inte ge en tillfredsställande separation av peptider och proteiner. Därför kräver analys av peptider och proteiner med polära och icke-polära fragment specialdesignade stationära faser för att interagera och bibehålla dessa analyter16. Blandad kromatografi, som erbjuder multimodala interaktioner, kan vara ett alternativ till RP-LC för att separera peptider, proteiner och andra komplexa blandningar. Flera stationära faser av blandad typ framställdes och kolonner fyllda med dessa stationära faser användes för att separera peptider och proteiner17,18,19,20,21. På grund av närvaron av polära och opolära grupper är blandade stationära faser (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polär interkalering/RPLC) lämpliga för separation av peptider och proteiner22,23,24,25,26,27,28. Polära interkalerade stationära faser med kovalent bundna polära grupper uppvisar goda separationsförmågor och unik selektivitet för polära och opolära analyter eftersom separationen beror på interaktionen mellan analyten och den stationära fasen. Multimodala interaktioner29,30,31,32. Nyligen erhöll Zhang et al.30 behenylterminerade stationära faser av polyaminer och separerade framgångsrikt kolväten, antidepressiva medel, flavonoider, nukleosider, östrogener och vissa andra analyter. Det polärt inbäddade stationära materialet har både polära och opolära grupper, så det kan användas för att separera peptider och proteiner i hydrofoba och hydrofila delar. Polära inline-kolonner (t.ex. C18-kolonner med amid inline) finns tillgängliga under handelsnamnet Ascentis Express RP-Amide-kolonner, men dessa kolonner har endast använts för analys av amin 33.
I den aktuella studien framställdes en polärt inbäddad stationär fas (N-fenylmaleimid, inbäddad polystyren) och utvärderades för peptidseparation och tryptisk HSA-klyvning. Följande strategi användes för att framställa den stationära fasen. Porösa kiseldioxidpartiklar framställdes enligt de procedurer som beskrivs i våra tidigare publikationer, med vissa ändringar i framställningsscheman 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Förhållandena urea, polyetylenglykol (PEG), TMOS och vattenhaltig ättiksyra justerades för att erhålla kiseldioxidpartiklar med stora porstorlekar. För det andra syntetiserades en ny fenylmaleimid-metylvinylisocyanatligand och dess derivatiserade kiseldioxidpartiklar användes för att framställa polära inbäddade stationära faser. Den erhållna stationära fasen packades i en kolonn av rostfritt stål (innerdiameter 100 × 1,8 mm) enligt ett optimerat packningsschema. Packningen av kolonnen underlättas av mekanisk vibration för att säkerställa ett enhetligt lager i kolonnen. Den packade kolonnen utvärderades för separation av en blandning av peptider bestående av fem peptider (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalinpeptid) och tryptiska hydrolysat av humant serumalbumin (HSA). Det observerades att peptidblandningen och HSA-tryptisk digest separerade med god upplösning och effektivitet. Separationseffektiviteten för PMP-kolonnen jämfördes med den för Ascentis Express RP-Amide-kolonnen. Det observerades att peptider och proteiner har god upplösning och hög separationseffektivitet på PMP-kolonnen, och separationseffektiviteten för PMP-kolonnen är högre än den för Ascentis Express RP-Amide-kolonnen.
PEG (polyetylenglykol), urea, ättiksyra, trimetoxiortosilikat (TMOS), trimetylklorsilan (TMCS), trypsin, humant serumalbumin (HSA), ammoniumklorid, urea, hexametylmetakryloyldisilazan (HMDS), metakryloylklorid (MC), styren, 4-hydroxi-TEMPO, bensoylperoxid (BPO), acetonitril (ACN) för HPLC, metanol, 2-propanol och aceton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
En blandning av urea (8 g), polyetylenglykol (8 g) och 8 ml 0,01 N ättiksyra omrördes i 10 minuter, och 24 ml TMOS tillsattes under iskylning. Reaktionsblandningen upphettades vid 40 °C i 6 timmar och sedan vid 120 °C i 8 timmar i en autoklav av rostfritt stål. Vattnet dekanterades och återstoden torkades vid 70 °C i 12 timmar. De torkade mjuka blocken maldes slätt och kalcinerades i en ugn vid 550 °C i 12 timmar. Tre satser framställdes och karakteriserades för att testa reproducerbarheten av partikelstorlekar, porstorlek och ytarea.
Polär grupp och stationär fas för polystyrenkedjor. Framställningsförfarandet beskrivs nedan.
N-fenylmaleimid (200 mg) och metylvinylisocyanat (100 mg) löstes i vattenfri toluen, och sedan tillsattes 0,1 ml 2,2'-azoisobutyronitril (AIBN) till reaktionskolven för att erhålla en sampolymer av fenylmaleimid och metylvinylisocyanat (PMCP). Blandningen upphettades vid 60 °C i 3 timmar, filtrerades och torkades i en ugn vid 40 °C i 3 timmar.
Torkade kiseldioxidpartiklar (2 g) dispergerades i torr toluen (100 ml), omrördes och sonikerades i 10 minuter i en 500 ml rundbottnad kolv. PMCP (10 mg) löstes i toluen och tillsattes droppvis till reaktionskolven via en tillsatstratt. Blandningen återloppskokades vid 100 °C i 8 timmar, filtrerades, tvättades med aceton och torkades vid 60 °C i 3 timmar. Därefter löstes kiseldioxidpartiklarna associerade med PMCP (100 g) i toluen (200 ml), och 4-hydroxi-TEMPO (2 ml) tillsattes därtill i närvaro av 100 μl dibutyltenndilaurat som katalysator. Blandningen omrördes vid 50 °C i 8 timmar, filtrerades och torkades vid 50 °C i 3 timmar.
Styren (1 ml), bensoylperoxid BPO (0,5 ml) och kiseldioxidpartiklar bundna till TEMPO-PMCP (1,5 g) dispergerades i toluen och spolades med kväve. Polymerisationen av styren utfördes vid 100 °C i 12 timmar. Den resulterande produkten tvättades med metanol och torkades över natten vid 60 °C. Det allmänna reaktionsschemat visas i figur ett.
Proverna avgasades vid 393 K i 1 timme tills ett resttryck på mindre än 10–3 Torr erhölls. Mängden N2 adsorberad vid relativt tryck P/P0 = 0,99 användes för att bestämma den totala porvolymen. Morfologin hos rena och ligandbundna kiseldioxidpartiklar undersöktes med hjälp av ett svepelektronmikroskop (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Torra prover (ren kiseldioxid och ligandbundna kiseldioxidpartiklar) placerades på aluminiumstavar med hjälp av koltejp. Guld deponerades på provet med hjälp av en Q150T-sputtringsanordning, och ett 5 nm tjockt Au-lager deponerades på provet. Detta förbättrar effektiviteten i lågspänningsprocessen och ger fin kallsprutning. Elementaranalys utfördes med en Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elementarkompositionsanalysator. En Malvern-partikelstorleksanalysator (Worcestershire, Storbritannien) Mastersizer 2000 användes för att erhålla partikelstorleksfördelningen. Obelagda kiseldioxidpartiklar och ligandbundna kiseldioxidpartiklar (5 mg vardera) dispergerades i 5 ml isopropanol, sonikerades i 10 minuter, omrördes i 5 minuter och placerades på en Mastersizer optisk bänk. Termogravimetrisk analys utfördes med en hastighet av 5 °C per minut i temperaturintervallet 30 till 800 °C.
Glasfiberfodrade kolonner av rostfritt stål med smal borrning och dimensionerna (ID 100 × 1,8 mm) packades med slamfyllningsmetoden enligt samma procedur som i referens 31. Rostfri stålkolonn (glasfiberfodrad, ID 100 × 1,8 mm) och ett utlopp innehållande en 1 µm fritta anslöts till en slamförpackningsmaskin (Alltech Deerfield, IL, USA). Bered en suspension av den stationära fasen genom att suspendera 150 mg av den stationära fasen i 1,2 ml metanol och mata in den i en reservoarkolonn. Metanol användes som slamlösningsmedel och kontrolllösningsmedel. Packa kolonnen genom att applicera en trycksekvens på 100 MP i 10 min, 80 MP i 15 min och 60 MP i 30 min. Packningsprocessen använde två gaskromatografikolonnvibratorer (Alltech, Deerfield, IL, USA) för mekanisk vibration för att säkerställa jämn kolonnpackning. Stäng slampackaren och släpp trycket långsamt för att förhindra skador på strängen. Kolonnen kopplades bort från uppslamningsmunstycket och en annan koppling fästes vid inloppet och anslöts till LC-systemet för att testa dess funktion.
En specialanpassad MLC konstruerades med hjälp av en LC-pump (10AD Shimadzu, Japan), en provtagare med en 50 nL injektionsslinga (Valco (USA) C14 W.05), en membranavgasare (Shimadzu DGU-14A) och ett UV-VIS-kapillärfönster. Detektoranordning (UV-2075) och emaljerad mikrokolonn. Använd mycket smala och korta anslutningsrör för att minimera effekten av ytterligare kolonnexpansion. Efter att kolonnen fyllts, installera en kapillär (50 µm id 365) vid utloppet av den reducerande övergången på 1/16″ och installera en kapillär (50 µm) vid den reducerande övergången. Datainsamling och kromatogrambehandling utfördes med hjälp av Multichro 2000-programvaran. Vid 254 nm övervakades UV-absorbansen hos de försökspersonernas analyter vid 0. Kromatografiska data analyserades med hjälp av OriginPro8 (Northampton, MA).
Humant serumalbumin, frystorkat pulver, ≥ 96 % (agarosgelelektrofores) 3 mg blandat med trypsin (1,5 mg), 4,0 M urea (1 ml) och 0,2 M ammoniumbikarbonat (1 ml). Lösningen omrördes i 10 minuter och hölls i ett vattenbad vid 37 °C i 6 timmar, varefter lösningen släcktes med 1 ml 0,1 % TFA. Filtrera lösningen och förvara vid högst 4 °C.
Separation av en blandning av peptider och tryptisk digest HSA på en PMP-kolonn utvärderades separat. Kontrollera den tryptiska hydrolysen av en blandning av peptider och HSA separerad med en PMP-kolonn och jämför resultaten med en Ascentis Express RP-Amide-kolonn. Antalet teoretiska plattor beräknas med följande ekvation:
SEM-bilder av rena kiseldioxidpartiklar och ligandbundna kiseldioxidpartiklar visas i figur 2. SEM-bilder av rena kiseldioxidpartiklar (A, B) visar en sfärisk form där partiklarna är förlängda eller har oregelbunden symmetri jämfört med våra tidigare studier. Ytan på kiseldioxidpartiklarna bundna av liganden (C, D) är jämnare än den hos rena kiseldioxidpartiklar, vilket kan bero på polystyrenkedjorna som täcker ytan på kiseldioxidpartiklarna.
Svepelektronmikroskopbilder av rena kiseldioxidpartiklar (A, B) och ligandbundna kiseldioxidpartiklar (C, D).
Partikelstorleksfördelningen för rena kiseldioxidpartiklar och ligandbundna kiseldioxidpartiklar visas i figur 2.3(A). Volymetriska partikelstorleksfördelningskurvor visade att kiseldioxidpartikelstorleken ökade efter kemisk modifiering (figur 3A). Data för kiseldioxidpartikelstorleksfördelningen från den aktuella studien och den tidigare studien jämförs i tabell 1(A). Den volymetriska partikelstorleken d(0,5) för PMP var 3,36 µm, jämfört med ad(0,5)-värdet på 3,05 µm i vår tidigare studie (polystyrenbundna kiseldioxidpartiklar)34. På grund av förändringen i förhållandet mellan PEG, urea, TMOS och ättiksyra i reaktionsblandningen var partikelstorleksfördelningen för denna sats smalare jämfört med vår tidigare studie. Partikelstorleken för PMP-fasen är något större än för den polystyrenbundna kiseldioxidpartikelfasen som vi studerade tidigare. Detta innebär att ytfunktionaliseringen av kiseldioxidpartiklar med styren endast avsatte ett polystyrenlager (0,97 µm) på kiseldioxidytan, medan skikttjockleken i PMP-fasen var 1,38 µm.
Partikelstorleksfördelning (A) och porstorleksfördelning (B) för rena kiseldioxidpartiklar och ligandbundna kiseldioxidpartiklar.
Porstorleken, porvolymen och ytan för de kiseldioxidpartiklar som användes i denna studie visas i tabell 1 (B). PSD-profilerna för rena kiseldioxidpartiklar och ligandbundna kiseldioxidpartiklar visas i figur 3 (B). Resultaten var jämförbara med vår tidigare studie34. Porstorlekarna för rena och ligandbundna kiseldioxidpartiklar var 310 Å respektive 241 Å, vilket indikerar att porstorleken minskade med 69 Å efter kemisk modifiering, såsom visas i tabell 1 (B), och förskjutningskurvan visas i figur 3. Den specifika ytan för kiseldioxidpartiklar i den aktuella studien är 116 m2/g, vilket är jämförbart med vår tidigare studie (124 m2/g). Som visas i tabell 1 (B) minskade även ytan (m2/g) för kiseldioxidpartiklar efter kemisk modifiering från 116 m2/g till 105 m2/g.
Resultaten av elementaranalysen av den stationära fasen presenteras i tabell 2. Kolhalten i den nuvarande stationära fasen är 6,35 %, vilket är lägre än i vår tidigare studie (kiseldioxidpartiklar associerade med polystyren, 7,93 %35 respektive 10,21 %)42. Kolhalten i den nuvarande stationära fasen nedan, eftersom vissa polära ligander såsom fenylmaleimid, metylvinylisocyanat (PCMP) och 4-hydroxi-TEMPO har använts utöver styren vid framställningen av SP. Viktprocenten kväve i den nuvarande stationära fasen är 2,21 % jämfört med 0,1735 och 0,85 % i tidigare studier42. Detta innebär att den nuvarande stationära fasen har en hög viktprocent kväve på grund av fenylmaleimiden. På liknande sätt har produkterna (4) och (5) en kolhalt på 2,7 % respektive 2,9 %, medan slutprodukten (6) har en kolhalt på 6,35 %, såsom visas i tabell 2. Termogravimetrisk analys (TGA) användes på den stationära fasen av PMP för att testa viktförlust, och TGA-kurvan visas i figur 4. TGA-kurvan visar en viktförlust på 8,6 %, vilket stämmer väl överens med kolhalten (6,35 %), eftersom liganderna inte bara innehåller C1, utan även N2, O2 och H2.
Liganden fenylmaleimid-metylvinylisocyanat valdes för att modifiera ytan på kiseldioxidpartiklarna på grund av dess polära fenylmaleimid- och vinylisocyanatgrupper. Vinylisocyanatgrupper kan reagera ytterligare med styren genom levande radikalpolymerisation. Det andra skälet är att infoga en grupp som har måttliga interaktioner med analyten och inga starka elektrostatiska interaktioner mellan analyten och den stationära fasen, eftersom fenylmaleimiddelen inte har någon virtuell laddning vid normalt pH. Polariteten hos den stationära fasen kan kontrolleras av den optimala mängden styren och reaktionstiden för den fria radikalpolymerisationen. Det sista steget i reaktionen (fri radikalpolymerisation) är kritiskt eftersom det ändrar polariteten hos den stationära fasen. Elementaranalys utfördes för att kontrollera kolhalten i dessa stationära faser. Det har observerats att en ökning av mängden styren och reaktionstiden ökar kolhalten i den stationära fasen och vice versa. SP:er framställda med olika koncentrationer av styren har olika kolbelastningar. På liknande sätt placerades dessa stationära faser på kolonner av rostfritt stål och deras kromatografiska egenskaper (selektivitet, upplösning, N-värde etc.) kontrollerades. Baserat på dessa experiment valdes en optimerad komposition för framställning av den stationära PMP-fasen för att ge kontrollerad polaritet och god retention av analyten.
PMP-kolonnen utvärderades också för analys av fem blandningar av peptider (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin) med användning av den mobila fasens kapacitet. 60/40 (v/v) ACN/vatten (0,1% TFA) vid en flödeshastighet av 80 µl/min. Under optimala elueringsförhållanden (200 000 plattor/m²) är antalet teoretiska plattor (N) per kolonn (100 × 1,8 mm) 20 000 ± 100. N-värdena för de tre PMP-kolonnerna visas i tabell 3 och kromatogrammen visas i figur 5A. Snabb analys vid hög flödeshastighet (700 µl/min) på en PMP-kolonn, fem peptider eluerade inom en minut, utmärkt N-värde på 13 500 ± 330 per kolonn (100 x 1,8 mm diameter), motsvarande 135 000 plattor/m² (Fig. 5B). Tre kolonner av samma storlek (innerdiameter 100 x 1,8 mm) fylldes med tre olika satser av PMP stationär fas för att testa reproducerbarheten. Analyter registrerades för varje kolonn genom att separera samma testblandning på varje kolonn med optimala elueringsförhållanden, antal teoretiska plattor N och retentionstid. Reproducerbarhetsdata för PMP-kolonnerna visas i tabell 4. Reproducerbarheten för PMP-kolonnen korrelerade väl med mycket låga %RSD-värden som visas i tabell 3.
Separation av peptidblandningar på en PMP-kolonn (B) och en Ascentis Express RP-Amid-kolonn (A), mobil fas 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), PMP-kolonnens dimensioner (100 x 1,8 mm innerdiameter), analys. Elueringsordning för föreningarna: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) och 5 (leucinsyraenkefalin).
En PMP-kolonn (innerdiameter 100 x 1,8 mm) utvärderades för separation av tryptisk hydrolysat av humant serumalbumin med HPLC. Kromatogrammet i figur 6 visar att proverna är väl separerade med mycket god upplösning. HSA-lösningar analyserades med en flödeshastighet på 100 μl/min, en mobil fas av 70/30 acetonitril/vatten och 0,1 % TFA. Klyvningen av HSA delades in i 17 toppar, såsom visas i kromatogrammet (fig. 6), motsvarande 17 peptider. Separationseffektiviteten för individuella toppar från HSA-hydrolysatet beräknades och värdena visas i tabell 5.
HSA-tryptiska hydrolysat separerades på en PMP-kolonn (innerdiameter 100 x 1,8 mm), flödeshastighet (100 μl/min), mobil fas 60/40 acetonitril/vatten och 0,1 % TFA.
där L är kolonnlängden, η är viskositeten hos den mobila fasen, ΔP är kolonnens mottryck och u är den linjära hastigheten hos den mobila fasen. PMP-kolonnens permeabilitet var 2,5 × 10⁻⁴ m², flödeshastigheten var 25 µl/min, 60/40 v/v användes. ACN/vatten. PMP-kolonnens permeabilitet (ID 100 × 1,8 mm) var liknande den i vår tidigare Ref. 34-studie. Permeabiliteten för en kolonn fylld med ytligt porösa partiklar är 1,7 × 10⁻⁴ µm, 2,5 × 10⁻⁴ m² för 5 µm partiklar43. Därför är PMP-fasens permeabilitet liknande permeabiliteten för kärna-skal-partiklar med en storlek på 5 μm.
där Wx är massan av kolonnen fylld med kloroform, Wy är massan av kolonnen fylld med metanol och ρ är lösningsmedlets densitet. Densiteten för metanol (ρ = 0,7866) och kloroform (ρ = 1,484). Den totala porositeten för kiseldioxid-C18-partikelkolonnen (100 × 1,8 mm ID)34 och vår tidigare studerade C18-urea31-kolonn var 0,63 respektive 0,55. Detta innebär att närvaron av urealigander minskar permeabiliteten för den stationära fasen. Å andra sidan är den totala porositeten för PMP-kolonnen (innerdiameter 100 × 1,8 mm) 0,60. PMP-kolonner är mindre permeabla än kolonner packade med C18-bundna kiseldioxidpartiklar eftersom C18-liganderna i stationära faser av C18-typ är bundna till kiseldioxidpartiklarna i linjära kedjor, medan en relativt tjock polymer bildas runt partiklarna i stationära faser av polystyrentyp. lager A. I ett typiskt experiment beräknas kolonnens porositet enligt följande:
Figur 7A och B visar Van Deemter-diagram för en PMP-kolonn (innerdiameter 100 x 1,8 mm) och en Ascentis Express RP-Amid-kolonn (innerdiameter 100 x 1,8 mm) under samma elueringsförhållanden, 60/40 ACN/H2O och 0,1 % TFA 20 µl/min till 800 µl/min på båda kolonnerna. De lägsta HETP-värdena vid optimal flödeshastighet (80 µl/min) var 2,6 µm respektive 3,9 µm för PMP-kolonnen och Ascentis Express RP-Amid-kolonnen. HETP-värdena visar att separationseffektiviteten för PMP-kolonnen (100 x 1,8 mm innerdiameter) är mycket högre än för den kommersiellt tillgängliga Ascentis Express RP-Amid-kolonnen (100 x 1,8 mm innerdiameter). Van Deemter-grafen i figur 7(A) visar att minskningen av N-värdet inte är signifikant högre med ökande flöde jämfört med vår tidigare studie. Den högre separationseffektiviteten hos PMP-kolonnen (id 100 × 1,8 mm) jämfört med Ascentis Express RP-Amide-kolonnen är baserad på den förbättrade partikelformen och storleken samt den sofistikerade kolonnpackningsproceduren som används i nuvarande arbete34.
(A) Van Deemter-diagram (HETP kontra linjär hastighet för mobil fas) erhållet på en PMP-kolonn (id 100 x 1,8 mm) i 60/40 ACN/H2O med 0,1 % TFA. (B) Van Deemter-diagram (HETP kontra linjär hastighet för mobil fas) erhållet på en Ascentis Express RP-Amide-kolonn (id 100 x 1,8 mm) i 60/40 ACN/H2O med 0,1 % TFA.
En polär stationär fas av interkalerad polystyren framställdes och utvärderades för separation av en blandning av syntetiska peptider och tryptisk hydrolysat av humant serumalbumin (HSA) i högpresterande vätskekromatografi. Den kromatografiska prestandan hos PMP-kolonner för peptidblandningar är utmärkt vad gäller separationseffektivitet och upplösning. Den förbättrade separationseffektiviteten hos PMP-kolonner beror på flera orsaker, såsom kiseldioxidpartikelstorlek och porstorlek, kontrollerad syntes av stationära faser och komplexa kolonnpackningsmaterial. Förutom den höga separationseffektiviteten är en annan fördel med denna stationära fas det låga kolonnmottrycket vid höga flödeshastigheter. PMP-kolonner är mycket reproducerbara och kan användas för att analysera blandningar av peptider och tryptisk digestion av olika proteiner. Vi avser att använda denna kolonn för separation av bioaktiva föreningar från naturprodukter, extrakt av medicinalväxter och svamp i vätskekromatografi. I framtiden kommer PMP-kolonner också att utvärderas för separation av proteiner och monoklonala antikroppar.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersökning av peptidseparationssystem med omvänd faskromatografi del I: Utveckling av ett protokoll för kolonnkarakterisering. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersökning av peptidseparationssystem med omvänd faskromatografi del I: Utveckling av ett protokoll för kolonnkarakterisering.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., och Petersson, P. Undersökning av peptidseparationssystem med omvändfaskromatografi, del I: Utveckling av ett protokoll för kolonnkarakterisering. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersökning av peptidseparationssystem med omvänd faskromatografi del I: Utveckling av ett protokoll för kolonnkarakteristika. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersökning av peptidseparationssystem med omvänd faskromatografi del I: Utveckling av ett protokoll för kolonnkarakteristika.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., och Petersson, P. Undersökning av peptidseparationssystem med omvändfaskromatografi, del I: Utveckling av ett protokoll för kolonnkarakterisering.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Metoder för att skapa förbättrade aktiva peptider för behandling av infektionssjukdomar. Biotechnology. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetiska terapeutiska peptider: Vetenskap och marknad. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetiska terapeutiska peptider: Vetenskap och marknad.Vliege P, Lisowski V, Martinez J och Chreschatyski M. Syntetiska terapeutiska peptider: vetenskap och marknad.Vliege P, Lisowski V, Martinez J och Khreschatsky M. Syntetiska terapeutiska peptider: vetenskap och marknad. läkemedelsutveckling. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Avancerad proteomisk vätskekromatografi. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Avancerad proteomisk vätskekromatografi.Se F., Smith RD och Shen Yu. Avancerad proteomisk vätskekromatografi. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Avancerad proteinsammansättning 液相色谱。Se F., Smith RD och Shen Yu. Avancerad proteomisk vätskekromatografi.J. Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Avancerad vätskekromatografi-masspektrometri kan kombinera bredbaserad metabolomik och proteomik. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC:s roll i läkemedelsutveckling. Chesnut, SM & Salisbury, JJ UHPLC:s roll i läkemedelsutveckling.Chesnut, SM och Salisbury, JJ UHPLC:s roll i läkemedelsutveckling.Chesnut, SM och Salisbury, JJ. UHPLC:s roll i läkemedelsutveckling. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Grundläggande och praktiska aspekter av ultrahögtrycksvätskekromatografi för snabba separationer. Wu, N. & Clausen, AM Grundläggande och praktiska aspekter av ultrahögtrycksvätskekromatografi för snabba separationer.Wu, N. och Clausen, AM Grundläggande och praktiska aspekter av högtrycksvätskekromatografi för snabb separation. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Grundläggande och praktiska aspekter av ultrahögtrycksvätskekromatografi för snabb separation.Wu, N. och Clausen, AM Grundläggande och praktiska aspekter av högtrycksvätskekromatografi för snabb separation.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Användning av ultraljudsvätskekromatografi inom läkemedelsutveckling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Användning av ultraljudsvätskekromatografi inom läkemedelsutveckling.Ren, SA och Chelischeff, P. Användningen av ultrahögpresterande vätskekromatografi vid läkemedelsutveckling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA och Tchelitcheff, P.Ren, SA och Chelischeff, P. Tillämpning av ultraljudsvätskekromatografi vid läkemedelsutveckling.J. Kromatografi. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. En monolitisk makroporös hydrogel härledd från en olja-i-vatten-emulsion med en hög intern fas för effektiv rening av enterovirus 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Vätskekromatografins roll i proteomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Vätskekromatografins roll i proteomik.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. och Wilkins, JA Vätskekromatografins roll i proteomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. och Wilkins, JA Vätskekromatografins roll i proteomik.J. Kromatografi. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nya trender inom omvändfasvätskekromatografisk separation av terapeutiska peptider och proteiner: Teori och tillämpningar. & Guillarme, D. Nya trender inom omvändfasvätskekromatografisk separation av terapeutiska peptider och proteiner: Teori och tillämpningar. & Guillarme, D. фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Nya trender inom separation av terapeutiska peptider och proteiner genom omvänd fasvätskekromatografi: teori och tillämpningar. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.och Guillarmé, D. Nya trender inom separation av terapeutiska peptider och proteiner genom omvänd fasvätskekromatografi: teori och tillämpningar.J. Pharm. Biomedicinsk vetenskap. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tvådimensionell separation av peptider med hjälp av RP-RP-HPLC-system med olika pH i första och andra separationsdimensioner. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tvådimensionell separation av peptider med hjälp av RP-RP-HPLC-system med olika pH i första och andra separationsdimensioner.Gilar M., Olivova P., Dali AE och Gebler JK Tvådimensionell separation av peptider med hjälp av RP-RP-HPLC-systemet med olika pH i den första och andra separationsdimensionen.Gilar M., Olivova P., Dali AE och Gebler JK Tvådimensionell separation av peptider med olika pH-värden i den första och andra separationsdimensionen med RP-RP-HPLC-systemet. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Undersökning av massöverföring och kinetiska egenskaper hos högpresterande kromatografikolonner packade med helt porösa och ytligt porösa C18-partiklar mindre än 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Nya trender och analytiska utmaningar inom isolering, identifiering och validering av växtbioaktiva peptider. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomiskt landskap i livets rike. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Efterbehandling av terapeutiska peptider genom preparativ vätskekromatografi. Molecules (Basel, Schweiz) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode-kromatografi och dess tillämpningar på biopolymerer. Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode-kromatografi och dess tillämpningar på biopolymerer.Yang, Yu. och Geng, X. Mixed mode-kromatografi och dess tillämpning på biopolymerer. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Mixed mode-kromatografi och dess tillämpning i biopolymerer.Yang, Yu. och Gene, X. Mixed mode-kromatografi och dess tillämpning på biopolymerer.J. Kromatografi. A 1218(49), 8813–8825 (2011).