Nature.com saýtyna gireniňiz üçin sag boluň. Siz çäkli CSS goldawy bolan brauzer wersiýasyny ulanýarsyňyz. Iň gowy tejribe üçin täzelenen brauzer ulanmagyňyzy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de Gatnaşyklyk Režimini öçüriň). Mundan başga-da, yzygiderli goldawy üpjün etmek üçin saýty stillersiz we JavaScript-siz görkezýäris.
Birbada üç slaýdyň karuselini görkezýär. Birbada üç slaýdyň arasyndan geçmek üçin "Öňki" we "Indiki" düwmelerini ulanyň ýa-da birbada üç slaýdyň arasyndan geçmek üçin ahyryndaky sürgüç düwmelerini ulanyň.
Giň gözenekli bölejikleri almak üçin gözenekli kremniý bölejikleri käbir üýtgetmeler bilen sol-gel usuly bilen taýýarlanyldy. Bu bölejikler N-fenilmaleimid interkalirlenen poliamidleri öndürmek üçin ters zynjyrly geçiş-böleklenme (RAFT) polimerleşmesi arkaly N-fenilmaleimid-metilwinil izosiýanat (PMI) we stirol bilen türedilendirildi. Stirol (PMP) stasionar faza. Dar deşikli polat sütunlar (içki diametri 100 × 1,8 mm) suspenziýa gaplamasy bilen gaplandy. PMP sütunynyň hromatografik görkezijileri bäş peptidden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu aminokislotasy enkefalin) we adam syworotkasynyň albumininiň (HAS) triptik gidrolizatyndan ybarat sintetiki peptidleriň garyndysyny bölmek üçin bahalandyryldy. Optimal elýusiýa şertlerinde, peptidleriň garyndysy bolan plitalaryň nazaryýet sany 280,000 plastinka/kwadrat metre ýetdi. Işlenip düzülen sütünleriň bölüniş işini täjirçilik Ascentis Express RP-Amide sütünleri bilen deňeşdirende, PMP sütünleriniň bölüniş netijeliliginiň bölüniş netijeliligi we çözgüdi babatda täjirçilik sütünlerinden has ýokarydygy bellenildi.
Biofarmasewtika senagaty soňky ýyllarda bazar paýynyň ep-esli artmagy bilen giňelýän global bazara öwrüldi. Biofarmasewtika senagatynyň güýçli ösüşi bilen1,2,3 peptid we belok analizine uly zerurlyk bar. Maksatly peptidden başga-da, peptid sintezi wagtynda dürli garyndylar emele gelýär, şonuň üçin peptidiň islenýän arassalygyny almak üçin hromatografiki arassalamak zerurdyr. Bedeniň suwuklyklaryndaky, dokumalaryndaky we öýjüklerdäki beloklaryň analizi we häsiýetnamasy bir nusgada köp sanly mümkin bolan anyklanyp bilinýän görnüşleriň bolmagy sebäpli örän kyn işdir. Mass spektrometriýasy peptidleri we beloklary yzygiderliklemek üçin netijeli gural bolsa-da, şeýle nusgalar gönüden-göni mass spektrometrine girizilse, bölüniş kanagatlanarsyz bolar. Bu meseläni MS analizinden öň suwuk hromatografiýasyny (LH) geçirmek arkaly çözüp bolýar, bu bolsa belli bir wagtda mass spektrometrine girýän analitleriň mukdaryny azaldar4,5,6. Mundan başga-da, analitler suwuk faza bölünişi wagtynda dar sebitde jemlenip, şeýlelik bilen bu analitleri jemleýär we MS anyklaýyş duýgurlygyny ýokarlandyrýar. Suwuk hromatografiýa (SUH) soňky onýyllykda ep-esli ösüş gazandy we proteomik analiz üçin giňden ulanylýan usula öwrüldi7,8,9,10.
Ters fazaly suwuk hromatografiýa (RP-LC) stasionar faza hökmünde oktadesil-modifikasiýa edilen kremniý dioksidini (ODS) ulanyp, peptidleriň garyndylaryny arassalamak we bölmek üçin giňden ulanylýar11,12,13. Şeýle-de bolsa, çylşyrymly gurluşy we amfoter tebigaty sebäpli14,15 RP stasionar fazalary peptidleriň we beloklaryň kanagatlanarly bölünmegini üpjün edip bilmeýär. Şonuň üçin, polýar we polýar däl bölekleri bolan peptidleriň we beloklaryň analizi bu analizatorlaryň özara täsirleşmegi we saklanmagy üçin ýörite işlenip düzülen stasionar fazalary talap edýär16. Köpmodal özara täsirleri hödürleýän garyşyk hromatografiýa peptidleri, beloklary we beýleki çylşyrymly garyndylary bölmek üçin RP-LC-e alternatiwa bolup biler. Birnäçe garyşyk görnüşli stasionar fazalar taýýarlanyldy we bu stasionar fazalar bilen doldurylan sütunlar peptidleri we beloklary bölmek üçin ulanyldy17,18,19,20,21. Polýar we polýar däl toparlaryň bolmagy sebäpli, garyşyk režimli stasionar fazalar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polýar interkalasiýa/RPLC) peptidleri we beloklary bölmek üçin amatlydyr22,23,24,25,26,27,28. , kowalent taýdan baglanyşykly polýar toparlary bolan polýar interkalasiýaly stasionar fazalar polýar we polýar däl analitler üçin gowy bölmek mümkinçiliklerini we özboluşly selektiwligi görkezýär, sebäbi bölünmek analit bilen stasionar fazanyň arasyndaky özara täsire baglydyr. Köpmodal özara täsirler 29,30,31,32. Ýakynda Çžan we beýlekiler 30 poliaminleriň behenil bilen gutaran stasionar fazalaryny aldylar we uglewodorodlary, antidepressantlary, flavonoidleri, nukleozidleri, estrogenleri we käbir beýleki analitleri üstünlikli böldüler. Polýar içine goýlan stasionar materialyň hem polýar, hem-de polýar däl toparlary bar, şonuň üçin ony peptidleri we beloklary gidrofob we gidrofil böleklere bölmek üçin ulanyp bolýar. Polýar içki sütunlar (meselem, amid içki sütunlary bolan C18 sütunlary) Ascentis Express RP-Amide sütunlary söwda ady bilen elýeterlidir, ýöne bu sütunlar diňe amin 33-iň analizi üçin ulanyldy.
Häzirki gözlegde, polýar ýerleşdiriş stasionar fazasy (N-fenilmaleimid, ýerleşdiriş polistirol) taýýarlanyldy we peptid bölünmegi we triptik HSA bölünmegi üçin bahalandyryldy. Stasionar fazany taýýarlamak üçin aşakdaky strategiýa ulanyldy. Gözenekli kremniý bölejikleri öňki neşirlerimizde beýan edilen usullara laýyklykda taýýarlanyldy, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39 taýýarlamak shemalarynda käbir üýtgeşmeler girizildi. Uly gözenek ölçegli kremniý bölejiklerini almak üçin karbamid, polietilen glikol (PEG), TMOS we suwly-sirke kislotasynyň gatnaşyklary sazlandy. Ikinjiden, täze fenilmaleimid-metilwinil izosiýanat ligand sintez edildi we onuň türewlenen kremniý bölejikleri polýar ýerleşdiriş stasionar fazalaryny taýýarlamak üçin ulanyldy. Alnan stasionar faza optimizirlenen ýerleşdiriş shemasyna laýyklykda poslamaýan polat sütüne (içki diametri 100 × 1,8 mm) ýerleşdirildi. Sütüniň ýerleşdirilmegine sütüniň içinde birmeňzeş gatlak üpjün etmek üçin mehaniki titreme kömek edýär. Gaplanan sütun bäş peptidden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lýusin-enkefalin peptidi) we adam syworotkasynyň albumininiň (HSA) triptik gidrolizatlaryndan ybarat bolan peptidleriň garyndysyny bölmek üçin bahalandyryldy. Peptid garyndysynyň we HSA triptik digestiniň gowy çözgüt we netijelilik bilen bölünýändigi bellenildi. PMP sütunynyň bölüniş netijeliligi Ascentis Express RP-Amide sütunynyňky bilen deňeşdirildi. Peptidleriň we beloklaryň PMP sütunynda gowy çözgüt we ýokary bölüniş netijeliligi bardygy we PMP sütunynyň bölüniş netijeliliginiň Ascentis Express RP-Amide sütunynyňkydan ýokarydygy bellenildi.
PEG (polietilen glikol), karbamid, sirke kislotasy, trimetoksiorthosilikat (TMOS), trimetilhlorosilan (TMCS), tripsin, adam syworotkasy albumin (HSA), ammonium hlorid, karbamid, geksametilmetakrilloildisilazan (HMDS), metakriloil hlorid (MC), stirol, 4-gidroksi-TEMPO, benzoil peroksid (BPO), HPLC üçin asetonitril (ACN), metanol, 2-propanol we aseton. Sigma-Aldrich kompaniýasy (Sent-Luis, Missuri, ABŞ).
Karbamid (8 g), polietilen glikol (8 g) we 8 ml 0,01 N sirke kislotasynyň garyndysy 10 minutlap garyşdyryldy we buz bilen sowatmak arkaly oňa 24 ml TMOS goşuldy. Reaksiýa garyndysy 40°C-da 6 sagat, soňra 120°C-da 8 sagatlap polatdan ýasalan awtoklawda gyzdyryldy. Suw süzüldi we galan bölegi 70°C-da 12 sagatlap guradyldy. Guradylan ýumşak bloklar ýumşak üweldi we 550°C-da 12 sagatlap peçde kalsirlenen. Bölejikleriň ölçegleriniň, gözenekleriň ölçegleriniň we ýüz meýdanynyň gaýtalanmagyny barlamak üçin üç tapgyr taýýarlanyldy we häsiýetlendirildi.
Polistirol zynjyrlary üçin polýar topar we stasionar faza. Taýýarlamak tertibi aşakda beýan edilýär.
N-fenilmaleimid (200 mg) we metil winil izosiýanat (100 mg) suwsuz toluolda eredildi, soňra fenilmaleimid we metil winil izosiýanat (PMCP) kopolimerini almak üçin reaksiýa kolbasyna 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitril (AIBN) goşuldy. ) Garyndy 60°C-da 3 sagatlap gyzdyryldy, süzüldi we 40°C-da 3 sagatlap peçde guradyldy.
Gury kremniý bölejikleri (2 g) gurak toluolda (100 ml) eredildi, garyşdyryldy we 500 ml tegelek aşaky kolbada 10 minutlap ultrases bilen işlenip düzüldi. PMCP (10 mg) toluolda eredildi we goşmaça huni arkaly reaksiýa kolbasyna damjalaýyn goşuldy. Garyndy 100°C-da 8 sagatlap gaýtadan ýuksaldy, süzgüçden geçirildi, aseton bilen ýuwuldy we 60°C-da 3 sagatlap guradyldy. Soňra PMCP (100 g) bilen baglanyşykly kremniý bölejikleri toluolda (200 ml) eredildi we katalizator hökmünde 100 μl dibutiltin dilauratyň gatnaşmagynda oňa 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) goşuldy. Garyndy 50°C-da 8 sagatlap garyşdyryldy, süzgüçden geçirildi we 50°C-da 3 sagatlap guradyldy.
Stirol (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) we TEMPO-PMCP-e (1,5 g) birikdirilen kremniý bölejikleri toluolda eredildi we azot bilen arassalandy. Stirolyň polimerleşmesi 100°C-da 12 sagatlap geçirildi. Netijede dörän önüm metanol bilen ýuwuldy we 60°C-da bir gije guradyldy. Reaksiýanyň umumy shemasy 1-nji suratda görkezilen.
Nusgalar 10–3 Torr-dan az galyndy basyş alynýança 393 K-da 1 sagatlap gazsyzlandyryldy. Umumy gözenek göwrümini kesgitlemek üçin deňeşdirme basyşynda P/P0 = 0.99 adsorbsiýa edilen N2 mukdary ulanyldy. Arassa we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň morfologiýasy skanerleýji elektron mikroskopy (Hitachi High Technologies, Tokio, Ýaponiýa) arkaly barlandy. Gury nusgalar (arassa kremniý we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleri) uglerod lentasy arkaly alýumin sterženlere ýerleşdirildi. Altyn nusganyň üstüne Q150T püskürtme enjamy arkaly çökdürildi we nusganyň üstüne 5 nm galyňlykdaky Au gatlagy çökdürildi. Bu pes woltly prosesiň netijeliligini ýokarlandyrýar we inçe sowuk püskürtmegi üpjün edýär. Elemental analiz Thermo Electron (Waltham, MA, ABŞ) Flash EA1112 elementar düzüm analizatory arkaly geçirildi. Bölejikleriň ululygynyň paýlanyşyny almak üçin Malvern bölejikleriniň ululygynyň analizatory (Worcestershire, Beýik Britaniýa) Mastersizer 2000 ulanyldy. Örtülmedik kremniý bölejikleri we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleri (her biri 5 mg) 5 ml izopropanolda eredildi, 10 minutlap ultrases bilen işlenip, 5 minutlap garyşdyryldy we Mastersizer optiki skameýkasyna goýuldy. Termograwimetriki analiz 30-dan 800 °C-a çenli temperatura aralygynda minutda 5 °C tizlikde geçirilýär.
Ölçegleri (ID 100 × 1.8 mm) bolan aýna süýümli örtülen inçe deşikli polat sütunlar 31-nji salgylanmadaky ýaly prosedura laýyklykda şlam doldurmak usuly bilen gaplandy. Polat sütun (aýna örtülen, ID 100 × 1.8 mm) we 1 µm frit saklaýan çykyş şlam gaplama maşynyna (Alltech Deerfield, IL, ABŞ) birikdirildi. 150 mg hereketsiz fazany 1,2 ml metanola goýup we ony rezerwuar sütunyna guýup, hereketsiz fazanyň suspenziýasyny taýýarlaň. Metanol şlam eriji we gözegçilik eriji hökmünde ulanyldy. Sütüni 10 minut üçin 100 MP, 15 minut üçin 80 MP we 30 minut üçin 60 MP basyş yzygiderliligini ulanyp gaplaň. Gaplama prosesinde sütünleriň birmeňzeş gaplanmagyny üpjün etmek üçin mehaniki titreme üçin iki sany gaz hromatografiýa sütun wibratory (Alltech, Deerfield, IL, ABŞ) ulanyldy. Şemala zeper ýetmeginiň öňüni almak üçin şlam gaplaýjyny ýapyň we basyşy ýuwaşlyk bilen goýberiň. Sütün şlamyň nasadkasyndan aýryldy we onuň işini barlamak üçin girişe başga bir armatura berkidildi we LC ulgamyna birikdirildi.
LC nasosy (10AD Shimadzu, Ýaponiýa), 50 nL inýeksiýa halkasy bolan nusga alyjy (Valco (ABŞ) C14 W.05), membrana degasseri (Shimadzu DGU-14A) we UV-VIS kapillýar penjiresi ulanylyp, ýörite MLC guruldy. Detektiw enjam (UV-2075) we emal edilen mikrokolon. Goşmaça sütün giňelmeginiň täsirini azaltmak üçin örän dar we gysga birleşdiriji turbalary ulanyň. Sütüni doldurandan soň, 1/16″ reduktor birleşmäniň çykyşyna kapillýar (50 µm id 365) gurnaň we reduktor birleşmäniň kapillýaryny (50 µm) gurnaň. Maglumatlary ýygnamak we hromatogrammany işläp düzmek Multichro 2000 programma üpjünçiligi arkaly amala aşyrylýar. 254 nm-de, subýektleriň analizatorlarynyň UV siňdirilişi 0-da gözegçilik edildi. Hromatografik maglumatlar OriginPro8 (Northampton, MA) ulanyp seljerildi.
Adam syworotkasynyň albuminleri, liofilizlenen poroşok, ≥ 96% (agaroza gel elektroforez) 3 mg tripsin (1.5 mg), 4.0 M karbamid (1 ml) we 0.2 M ammonium bikarbonaty (1 ml) bilen garyşdyryldy. Eritme 10 minutlap garyşdyryldy we 37°C-de 6 sagatlap suw hammamynda saklandy, soňra 1 ml 0.1% TFA bilen öçürildi. Eritme süzüldi we 4°C-den aşak temperaturada saklandy.
PMP sütununda peptidleriň we triptik digest HSA garyndysynyň bölünmegi aýratynlykda bahalandyryldy. PMP sütuny bilen bölünen peptidleriň we HSA garyndysynyň triptik gidrolizini barlaň we netijeleri Ascentis Express RP-Amide sütuny bilen deňeşdiriň. Nazaryýet plitalarynyň sany aşakdaky deňleme arkaly hasaplanýar:
Arassa kremniý bölejikleriniň we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň SEM suratlary 2-nji suratda görkezilen. Arassa kremniý bölejikleriniň (A, B) SEM suratlary öňki gözleglerimiz bilen deňeşdirilende bölejikleriň uzalyp ýa-da düzgünsiz simmetriýa eýe bolan sferiki görnüşi görkezýär. Ligand (C, D) bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň ýüzi arassa kremniý bölejikleriniň ýüzi bilen deňeşdirilende has ýumşakdyr, bu bolsa kremniý bölejikleriniň ýüzini örtýän polistirol zynjyrlary bilen baglanyşykly bolup biler.
Arassa kremniý bölejikleriniň (A, B) we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň (C, D) skanirleýji elektron mikrograflary.
Arassa kremniý bölejikleriniň we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň bölejik ölçegleriniň paýlanyşy 2-nji suratda görkezilen. 3(A)-njy surat. Göwrüm bölejikleriniň paýlanyş egrileri himiki modifikasiýadan soň kremniý bölejikleriniň ölçegleriniň artandygyny görkezdi (3A-njy surat). Häzirki gözlegden we öňki gözlegden alnan kremniý bölejikleriniň ölçegleriniň paýlanyş maglumatlary 1(A)-njy tablisada deňeşdirilýär. PMP-niň göwrüm bölejikleriniň ölçegleriniň d(0.5)-i öňki gözlegimizdäki ad(0.5) gymmaty 3.05 µm bolan 3.36 µm boldy (polistirol bilen baglanyşykly kremniý bölejikleri)34. Reaksiýa garyndysyndaky PEG, karbamid, TMOS we sirke kislotasynyň gatnaşygynyň üýtgemegi sebäpli, bu partiýanyň bölejik ölçegleriniň paýlanyşy öňki gözlegimize garanyňda has dar boldy. PMP fazasynyň bölejikleriniň ölçegleri öň öwrenen polistirol bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň fazasyndan birneme uly. Bu, stirol bilen kremniý bölejikleriniň ýüzleý funksionalizasiýasynyň kremniý ýüzüne diňe polistirol gatlagyny (0,97 µm) çökdürendigini, PMP fazasynda bolsa gatlagyň galyňlygynyň 1,38 µm bolandygyny aňladýar.
Arassa kremniý bölejikleriniň we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň bölejik ölçegleriniň paýlanyşy (A) we gözenek ölçegleriniň paýlanyşy (B).
Bu gözlegde ulanylan kremniý bölejikleriniň gözenek ölçegi, gözenek göwrümi we ýüz meýdany 1-nji tablisada (B) görkezilen. Arassa kremniý bölejikleriniň we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň PSD profilleri 3(B) suratda görkezilen. Netijeler öňki gözlegimiz bilen deňeşdirilip bilnerdi34. Arassa we ligand bilen baglanyşykly kremniý bölejikleriniň gözenek ölçegleri degişlilikde 310 Å we 241 Å boldy, bu bolsa himiki modifikasiýadan soň gözenek ölçeginiň 1-nji tablisada (B) görkezilişi ýaly 69 Å azalandygyny we süýşme egrisiniň suratda görkezilendigini görkezýär. Häzirki gözlegde kremniý bölejikleriniň aýratyn ýüz meýdany 116 m2/g bolup, bu öňki gözlegimiz bilen deňeşdirilip bilner (124 m2/g). 1(B) tablisada görkezilişi ýaly, himiki modifikasiýadan soň kremniý bölejikleriniň ýüz meýdany (m2/g) hem 116 m2/g-dan 105 m2/g-a çenli azaldy.
Stasionar fazanyň elementar analiziniň netijeleri 2-nji tablisada görkezilen. Häzirki stasionar fazanyň uglerod mukdary 6,35%, bu bolsa öňki gözlegimizdäkiden pes (polistirol bilen baglanyşykly kremniý bölejikleri, degişlilikde 7,93%35 we 10,21%) 42. Häzirki stasionar fazanyň uglerod mukdary aşakda görkezilen, sebäbi SP taýýarlamakda stiroldan başga-da, fenilmaleimid metil winil izosiýanat (PCMP) we 4-gidroksi-TEMPO ýaly käbir polýar ligandlar ulanyldy. Häzirki stasionar fazadaky azotyň agram göterimi öňki gözleglerdäki 0,1735 we 0,85% bilen deňeşdirilende 2,21% -dir42. Bu häzirki stasionar fazanyň fenilmaleimid sebäpli azotyň agram göteriminiň ýokarydygyny aňladýar. Şonuň ýaly-da, (4) we (5) önümleriň uglerod mukdary degişlilikde 2,7% we 2,9%, soňky önümiň (6) uglerod mukdary bolsa 2-nji tablisada görkezilişi ýaly 6,35%. Termograwimetriki analiz (TGA) PMP-niň stasionar fazasynda agramyň azalmagyny barlamak üçin ulanyldy we TGA egrisi 4-nji suratda görkezilen. TGA egrisi agramyň 8,6% azalandygyny görkezýär, bu bolsa uglerod mukdaryna (6,35%) gowy gabat gelýär, sebäbi ligandlarda diňe C däl, eýsem N, O we H hem bar.
Ligand fenilmaleimid-metilwinil izosiýanat, onuň polýar fenilmaleimid we winilizosýanat toparlary sebäpli kremniý bölejikleriniň ýüzüni üýtgetmek üçin saýlandy. Winil izosiýanat toparlary diri radikal polimerleşme arkaly stirol bilen has reaksiýa girip bilerler. Ikinji sebäp, analit bilen ortaça özara täsirleşýän we analit bilen hereketsiz fazanyň arasynda güýçli elektrostatik özara täsirleşmeýän topary goşmakdyr, sebäbi fenilmaleimid böleginiň normal pH-da wirtual zarýady ýok. Hereketsiz fazanyň polýarlygyny stirolyň optimal mukdary we erkin radikal polimerleşmesiniň reaksiýa wagty bilen dolandyryp bolýar. Reaksiýanyň soňky ädimi (erkin radikal polimerleşme) örän möhümdir, sebäbi ol hereketsiz fazanyň polýarlygyny üýtgedýär. Bu hereketsiz fazalardaky uglerodyň mukdaryny barlamak üçin elementar analiz geçirildi. Stirolyň mukdaryny we reaksiýa wagtyny köpeltmegiň hereketsiz fazanyň uglerodyň mukdaryny köpeldýändigi we tersine, syn edildi. Stirolyň dürli konsentrasiýalary bilen taýýarlanan SP-leriň dürli uglerod ýükleri bar. Şonuň ýaly-da, bu hereketsiz fazalar poslamaýan polat sütünlere ýerleşdirildi we olaryň hromatografik häsiýetnamalary (seçijilik, çözgüt, N gymmaty we ş.m.) barlandy. Bu tejribeleriň esasynda, gözegçilik edilýän polýarlygy we analiz maddasynyň gowy saklanmagyny üpjün etmek üçin PMP hereketsiz fazasyny taýýarlamak üçin optimizirlenen düzüm saýlanyldy.
PMP sütünine şeýle hem, mobil fazanyň kuwwatyny ulanyp, bäş sany peptid garyndysynyň (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, lýusin-enkefalin) seljermesi üçin baha berildi. 60/40 (v/v) ACN/suw (0.1% TFA) 80 µl/min akym tizliginde. Optimal elusiýa şertlerinde (200,000 plastinka/m), her sütün üçin nazaryýet plastinkalarynyň sany (N) (100 × 1.8 mm) 20,000 ± 100-e deňdir. Üç PMP sütün üçin N gymmatlyklary 3-nji tablisada, hromatogrammalar bolsa 5A suratda görkezilen. PMP sütunynda ýokary akym tizliginde (700 µl/min) çalt analiz, bir minutda bäş peptid elusiýa edildi, her sütun üçin 13,500 ± 330 ajaýyp N gymmaty (100 x 1.8 mm diametr), 135,000 plastinka/m deňdir (5B surat). Gaýtalanmagy barlamak üçin birmeňzeş ululykdaky üç sütun (içki diametri 100 x 1.8 mm) PMP stasionar fazasynyň üç dürli tapgyry bilen dolduryldy. Optimal elusiýa şertlerini, nazary plastinkalaryň sanyny N we saklanma wagtyny ulanyp, her sütun üçin şol bir synag garyndysyny bölmek arkaly analitikler ýazylyp alyndy. PMP sütunlary üçin gaýtalanma maglumatlary 4-nji tablisada görkezilen. PMP sütunynyň gaýtalanma ukyby 3-nji tablisada görkezilişi ýaly örän pes %RSD gymmatlyklary bilen gowy baglanyşyklydy.
PMP sütüninde (B) we Ascentis Express RP-Amide sütüninde (A) peptid garyndylarynyň bölünmegi, ykjam faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP sütüniniň ölçegleri (100 x 1.8 mm id), analiz Birleşmeleriň elusiýa tertibi: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) we 5 (leýkin kislotasy enkefalin).
PMP sütüniniň (içki diametri 100 x 1.8 mm) HPLC arkaly adam syworotkasynyň albumininiň triptik gidrolizatyny bölmek üçin bahalandyryldy. 6-njy suratdaky hromatogramma nusgalaryň örän gowy çözgüt bilen gowy bölünendigini görkezýär. HSA erginleri 100 μl/min akym tizligi, 70/30 asetonitril/suwuň ykjam fazasy we 0.1% TFA ulanylyp seljerildi. HSA-nyň bölünmegi hromatogrammada görkezilişi ýaly (6-njy surat) 17 peptide laýyk gelýän 17 depelere bölündi. HSA gidrolizatyndan aýry-aýry depeleriň bölünmeginiň netijeliligi hasaplanyldy we gymmatlyklar 5-nji tablisada görkezildi.
HSA triptik gidrolizatlary PMP sütüninde (içki diametri 100 x 1.8 mm), akym tizligi (100 μl/min), hereketli faza 60/40 asetonitril/suwda we 0.1% TFA-da bölünip alyndy.
bu ýerde L sütün uzynlygy, η hereketli fazanyň ýapyşganlygy, ΔP sütüniň yzyna basyşy we u hereketli fazanyň çyzykly tizligidir. PMP sütüniniň geçirijiligi 2,5 × 10–14 m2, akym tizligi 25 µl/min, 60/40 v/v ulanyldy. ACN/suw. PMP sütüniniň geçirijiligi (ID 100 × 1,8 mm) öňki 34-nji salgylanma barlagymyza meňzeşdi. Ýüzleý gözenekli bölejikler bilen doldurylan sütüniniň geçirijiligi 1,7 × 10 .6 µm, 5 µm bölejikler üçin 2,5 × 10-14 m2-dir43. Şonuň üçin PMP fazasynyň geçirijiligi 5 µm ölçegli özen-gabyk bölejikleriniň geçirijiligine meňzeşdir.
bu ýerde Wx hloroform bilen doldurylan sütün massasy, Wy metanol bilen doldurylan sütün massasy we ρ erijiniň dykyzlygydyr. Metanolyň dykyzlygy (ρ = 0.7866) we hloroformyň dykyzlygy (ρ = 1.484). Kremniý-C18 bölejik sütüniniň (100 × 1.8 mm ID)34 we öň öwrenen C18-karbamid31 sütünimiziň umumy gözenekliligi degişlilikde 0.63 we 0.55 boldy. Bu, karbamid ligandlarynyň bolmagynyň hereketsiz fazanyň geçirijiligini peseldýändigini aňladýar. Beýleki tarapdan, PMP sütüniniň (içki diametri 100 × 1.8 mm) umumy gözenekliligi 0.60-a deňdir. PMP sütünleri C18 baglanyşykly kwarts bölejikleri bilen doldurylan sütünlere garanyňda az geçirijiliklidir, sebäbi C18 görnüşli hereketsiz fazalarda C18 ligandlary kwarts bölejiklerine çyzykly zynjyrlarda birikdirilýär, polistirol görnüşli hereketsiz fazalarda bolsa bölejikleriň daşynda deňeşdirme bilen galyň polimer emele gelýär. A gatlagy. Adaty tejribede sütün gözenekliligi aşakdaky ýaly hasaplanýar:
7A we B suratlarynda PMP sütüniniň (id 100 x 1.8 mm) we Ascentis Express RP-Amide sütüniniň (id 100 x 1.8 mm) iki sütün üçin hem şol bir elusiýa şertlerinde, 60/40 ACN/H2O we 0.1% TFA 20 µl/min-den 800 µl/min-e çenli Van Deemter grafikleri görkezilýär. Optimal akym tizliginde (80 µl/min) iň az HETP gymmatlyklary PMP sütüninde we Ascentis Express RP-Amide sütüninde degişlilikde 2.6 µm we 3.9 µm boldy. HETP gymmatlyklary PMP sütüniniň (100 x 1.8 mm id) bölüniş netijeliliginiň täjirçilik taýdan elýeterli Ascentis Express RP-Amide sütüniniň (100 x 1.8 mm id) bölmek netijeliliginden has ýokarydygyny görkezýär. 7(A) suratdaky van Deemter grafigi öňki gözlegimiz bilen deňeşdirilende akym artanda N gymmatynyň azalmagynyň düýpli ýokary däldigini görkezýär. Ascentis Express RP-Amide sütünine garanyňda PMP sütüniniň has ýokary bölüniş netijeliligi (id 100 × 1.8 mm) bölejikleriň görnüşiniň we ölçeginiň gowulandyrylmagyna, şeýle hem häzirki işde ulanylýan sütünleri gaplamak boýunça çylşyrymly prosedura esaslanýar34.
(A) 0.1% TFA bilen 60/40 ACN/H2O-da PMP sütüninde (id 100 x 1.8 mm) alnan Wan Deemter grafigi (HETP we hereketli faza çyzykly tizligi). (B) 0.1% TFA bilen 60/40 ACN/H2O-da Ascentis Express RP-Amide sütüninde (id 100 x 1.8 mm) alnan Wan Deemter grafigi (HETP we hereketli faza çyzykly tizligi).
Ýokary netijeli suwuklyk hromatografiýasynda sintetiki peptidleriň we adam serum albumininiň (HSA) triptik gidrolizatynyň garyndysyny bölmek üçin interkalatirlenen polistirolyň polýar stasionar fazasy taýýarlanyldy we bahalandyryldy. Peptid garyndylary üçin PMP sütunlarynyň hromatografik görkezijileri bölmek netijeliligi we çözgüdi babatda ajaýypdyr. PMP sütunlarynyň bölünmek netijeliliginiň ýokarlanmagy kremniý bölejikleriniň ölçegi we gözenek ölçegi, stasionar fazalaryň gözegçilikli sintezi we çylşyrymly sütun gaplama materiallary ýaly birnäçe sebäplere baglydyr. Ýokary bölünmek netijeliliginden başga-da, bu stasionar fazanyň ýene bir artykmaçlygy ýokary akym tizliginde sütunuň pes yza basyşydyr. PMP sütunlary ýokary derejede gaýtalanýar we peptidleriň garyndylaryny we dürli beloklaryň triptik siňdirilişini seljermek üçin ulanylyp bilner. Biz bu sütuny suwuklyk hromatografiýasynda tebigy önümlerden, dermanlyk ösümlikleriň ekstraktlaryndan we kömeleklerden bioaktiw birleşmeleri bölmek üçin ulanmagy meýilleşdirýäris. Geljekde PMP sütunlary beloklary we monoklonal antitelalary bölmek üçin hem bahalandyrylar.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. we Petersson, P. Ters fazaly hromatografiýa peptid bölmek ulgamlarynyň derňewi I bölüm: Sütünleriň häsiýetlendirilmegi üçin protokolyň işlenip düzülmegi. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. we Petersson, P. Ters fazaly hromatografiýa peptid bölmek ulgamlarynyň derňewi I bölüm: Sütünleriň häsiýetlendirilmegi üçin protokolyň işlenip düzülmegi.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., we Petersson, P. Ters fazaly hromatografiýa arkaly peptid bölmek ulgamlarynyň derňewi, I bölüm: Sütünleriň häsiýetnamasy üçin protokol işläp düzmek. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. we Petersson, P. Ters fazaly hromatografiýa peptid bölmek ulgamlarynyň derňewi I bölüm: Sütünleriň häsiýetnamalary üçin protokolyň işlenip düzülmegi. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. we Petersson, P. Ters fazaly hromatografiýa peptid bölmek ulgamlarynyň derňewi I bölüm: Sütünleriň häsiýetnamalary üçin protokolyň işlenip düzülmegi.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., we Petersson, P. Ters fazaly hromatografiýa arkaly peptid bölmek ulgamlarynyň derňewi, I bölüm: Sütünleriň häsiýetnamasy üçin protokol işläp düzmek.J. 色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. we beýlekiler. Ýokanç keselleri bejermek üçin gowulandyrylan işjeň peptidleri döretmegiň usullary. Biotehnologiýa. Üstünlikler 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. we Khrestchatisky, M. Sintetiki terapewtiki peptidler: Ylym we bazar. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. we Khrestchatisky, M. Sintetiki terapewtiki peptidler: Ylym we bazar.Vliege P, Lisowski V, Martinez J we Chreschatyski M. Sintetiki terapewtiki peptidler: ylym we bazar.Vliege P, Lisowski W, Martinez J we Khreschatsky M. Sintetiki terapewtiki peptidler: ylym we bazar. Derman açyşy. Şu gün 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD we Shen, Y. Öňdebaryjy proteomik suwuklyk hromatografiýasy. Xie, F., Smith, RD we Shen, Y. Öňdebaryjy proteomik suwuklyk hromatografiýasy.F., Smit RD we Şen Ýu serediň. Öňdebaryjy proteomik suwuklyk hromatografiýasy. Sie, F., Smith, RD & Şen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Sie, F., Smith, RD & Shen, Y. Ösen belok düzümi 液相色谱。F., Smit RD we Şen Ýu serediň. Öňdebaryjy proteomik suwuklyk hromatografiýasy.J. Hromatografiýa. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. we beýlekiler. Ösen suwuk hromatografiýa-mass spektrometriýasy giň esasly metabolomikany we proteomikany birleşdirip bilýär. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Çesnut, SM we Salisbury, JJ UHPLC-niň derman önümçiliginde roly. Çesnut, SM we Salisbury, JJ UHPLC-niň derman önümçiliginde roly.Çesnut, SM we Salisbury, JJ UHPLC-niň derman önümçiliginde roly.Çesnut, SM we Salisbury, JJ Derman işläp düzmekde UHPLC-niň roly. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. we Klauzen, AM Çalt bölmek üçin ultra ýokary basyşly suwuklyk hromatografiýasynyň esasy we amaly taraplary. Wu, N. we Klauzen, AM Çalt bölmek üçin ultra ýokary basyşly suwuklyk hromatografiýasynyň esasy we amaly taraplary.Wu, N. we Klauzen, AM Çalt bölmek üçin ýokary basyşly suwuklyk hromatografiýasynyň esasy we amaly taraplary. Wu, N. & Klauzen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. we Klauzen, AM Çalt bölmek üçin ultra ýokary basyşly suwuklyk hromatografiýasynyň esasy we amaly taraplary.Wu, N. we Klauzen, AM Çalt bölmek üçin ýokary basyşly suwuklyk hromatografiýasynyň esasy we amaly taraplary.J. Sentýabr. Ylym. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA we Tchelitcheff, P. Derman önümçiliginde ultra-ýokary netijeli suwuk hromatografiýanyň ulanylyşy. Wren, SA we Tchelitcheff, P. Derman önümçiliginde ultra-ýokary netijeli suwuk hromatografiýanyň ulanylyşy.Ren, SA we Chelischeff, P. Derman önümçiliginde ultra ýokary öndürijilikli suwuk hromatografiýasynyň ulanylyşy. Wren, SA & Thelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA we Tchelitcheff, P.Ren, SA we Chelischeff, P. Derman işläp düzmekde ultra-ýokary netijeli suwuk hromatografiýasynyň ulanylyşy.J. Hromatografiýa. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. we beýlekiler. Enterowirus 71-i netijeli arassalamak üçin ýokary içki fazaly suwdaky ýag emulsiýasyndan alynýan monolit makrogözenekli gidrogel. Himiki. taslama. Žurnal 401, 126051 (2020).
Şi, Ý., Xiang, R., Horwat, C. we Wilkins, JA Suwuk hromatografiýanyň proteomikadaky roly. Şi, Ý., Xiang, R., Horwat, C. we Wilkins, JA Suwuk hromatografiýanyň proteomikadaky roly.Şi, Ý., Xiang, R., Horvat, C. we Wilkins, JA Suwuk hromatografiýanyň proteomikadaky roly. Şi, Y .., Sýan, R., Horwat, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Şi, Y .., Sýan, R., Horwat, C. & Wilkins, JAŞi, Ý., Xiang, R., Horvat, C. we Wilkins, JA Suwuk hromatografiýanyň proteomikadaky roly.J. Hromatografiýa. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Terapewtiki peptidleriň we beloklaryň tersine fazaly suwuk hromatografik bölünişlerinde täze meýiller: Teoriýa we ulanylyşlar. & Guillarme, D. Terapewtiki peptidleriň we beloklaryň tersine fazaly suwuk hromatografik bölünişlerinde täze meýiller: Teoriýa we ulanylyşlar. & Гилларме, Д. & Guillarme, D. Ters fazaly suwuklyk hromatografiýasy arkaly terapewtiki peptidleriň we beloklaryň bölünmeginde täze meýiller: teoriýa we ulanylyşlar. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 we Gilarme, D.we Guillarmé, D. Ters fazaly suwuklyk hromatografiýasy arkaly terapewtiki peptidleriň we beloklaryň bölünmeginde täze meýiller: teoriýa we ulanylyşlar.J. Pharm. Biolukmançylyk Ylymlary. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE we Gebler, JC Birinji we ikinji bölmek ölçeglerinde dürli pH bolan RP-RP-HPLC ulgamyny ulanyp, peptidleriň iki ölçegli bölünmegi. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE we Gebler, JC Birinji we ikinji bölmek ölçeglerinde dürli pH bolan RP-RP-HPLC ulgamyny ulanyp, peptidleriň iki ölçegli bölünmegi.Gilar M., Olivowa P., Dali AE we Gebler JK Birinji we ikinji bölmek ölçeglerinde dürli pH bolan RP-RP-HPLC ulgamyny ulanyp, peptidleriň iki ölçegli bölünmegi.Gilar M., Olivova P., Dali AE we Gebler JK RP-RP-HPLC ulgamyny ulanyp, birinji we ikinji bölmek ölçeglerinde dürli pH gymmatlyklaryny ulanyp, peptidleriň iki ölçegli bölünişi. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. we beýlekiler. 2 µm-den kiçi doly gözenekli we ýüzleý gözenekli C18 bölejikleri bilen doldurylan ýokary öndürijilikli hromatografiýa sütünleriniň massa geçirijiliginiň we kinetik häsiýetleriniň öwrenilmegi. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. we beýlekiler. Ösümlik bioaktiw peptidlerini bölüp almakda, anyklamakda we tassyklamakda soňky tendensiýalar we analitiki kynçylyklar. anus. Jandar anal. Himiki. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB we beýlekiler. Ýaşaýyş patyşalygynyň proteomik landşafty. Tebigat 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luka, K. we beýlekiler. Terapewtiki peptidleriň taýýarlanyjy suwuk hromatografiýa arkaly bejerilişinden soňky bejergi. Molecules (Bazel, Şweýsariýa) 26(15), 4688 (2021).
Ýang, Y. we Geng, X. Gatyşyk režimli hromatografiýa we onuň biopolimerlere ulanylyşy. Ýang, Y. we Geng, X. Gatyşyk režimli hromatografiýa we onuň biopolimerlere ulanylyşy.Ýang, Ýu. we Geng, X. Gatyşyk režimli hromatografiýa we onuň biopolimerlere ulanylyşy. Yangaň, Y .. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Ýang, Y. we Geng, X. Gatyşyk režimli hromatografiýa we onuň biopolimerlerde ulanylyşy.Ýang, Ýu. we Gene, X. Gatyşyk režimli hromatografiýa we onuň biopolimerlere ulanylyşy.J. Hromatografiýa. A 1218(49), 8813–8825 (2011).