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Partículas de sílica porosa foram preparadas pelo método sol-gel com algumas modificações para obtenção de partículas com poros largos. Essas partículas foram derivatizadas com N-fenilmaleimida-metilvinil isocianato (PMI) e estireno via polimerização por transferência de cadeia reversa-fragmentação (RAFT) para produzir poliamidas intercaladas com N-fenilmaleimida. A fase estacionária utilizada foi o estireno (PMP). Colunas de aço inoxidável de diâmetro interno estreito (100 × 1,8 mm) foram preenchidas com uma suspensão. O desempenho cromatográfico da coluna de PMP foi avaliado na separação de uma mistura de peptídeos sintéticos composta por cinco peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina, aminoácido encefalina) e hidrolisado tríptico de albumina sérica humana (HAS). Em condições ótimas de eluição, o número teórico de pratos com uma mistura de peptídeos atingiu 280.000 pratos/m². Comparando o desempenho de separação da coluna desenvolvida com a coluna comercial Ascentis Express RP-Amide, observou-se que a eficiência de separação da coluna PMP foi superior à da coluna comercial em termos de eficiência e resolução.
A indústria biofarmacêutica tornou-se um mercado global em expansão, com um aumento significativo na participação de mercado nos últimos anos. Com o crescimento explosivo da indústria biofarmacêutica^1,2,3, há uma grande necessidade de análise de peptídeos e proteínas. Além do peptídeo alvo, várias impurezas são formadas durante a síntese de peptídeos, sendo necessária a purificação cromatográfica para obter a pureza desejada do peptídeo. A análise e caracterização de proteínas em fluidos corporais, tecidos e células é uma tarefa extremamente desafiadora devido ao grande número de espécies potencialmente detectáveis ​​presentes em uma única amostra. Embora a espectrometria de massas seja uma ferramenta eficaz para o sequenciamento de peptídeos e proteínas, se essas amostras forem introduzidas diretamente no espectrômetro de massas, a separação será insatisfatória. Esse problema pode ser resolvido realizando-se cromatografia líquida (CL) antes da análise por espectrometria de massas, o que reduzirá a quantidade de analitos que entram no espectrômetro de massas em um determinado momento^4,5,6. Além disso, os analitos podem se concentrar em uma região estreita durante a separação em fase líquida, concentrando-os e aumentando a sensibilidade da detecção por espectrometria de massas. A cromatografia líquida (CL) avançou significativamente na última década e tornou-se um método amplamente utilizado para análise proteômica7,8,9,10.
A cromatografia líquida de fase reversa (RP-LC) é amplamente utilizada para purificar e separar misturas de peptídeos usando sílica modificada com octadecil (ODS) como fase estacionária^11,12,13. No entanto, devido à sua estrutura complexa e natureza anfotérica^14,15, as fases estacionárias de RP não conseguem proporcionar uma separação satisfatória de peptídeos e proteínas. Portanto, a análise de peptídeos e proteínas com fragmentos polares e apolares requer fases estacionárias especialmente projetadas para interagir e reter esses analitos¹⁶. A cromatografia mista, que oferece interações multimodais, pode ser uma alternativa à RP-LC para separar peptídeos, proteínas e outras misturas complexas. Diversas fases estacionárias de tipo misto foram preparadas e colunas preenchidas com essas fases estacionárias foram utilizadas para separar peptídeos e proteínas^{17,18,19,20,21}. Devido à presença de grupos polares e apolares, as fases estacionárias de modo misto (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalação polar/RPLC) são adequadas para a separação de peptídeos e proteínas22,23,24,25,26,27,28. As fases estacionárias intercaladas polares, com grupos polares ligados covalentemente, apresentam boa capacidade de separação e seletividade única para analitos polares e apolares, uma vez que a separação depende da interação entre o analito e a fase estacionária (interações multimodais)29,30,31,32. Recentemente, Zhang et al.30 obtiveram fases estacionárias com terminação behenil de poliaminas e separaram com sucesso hidrocarbonetos, antidepressivos, flavonoides, nucleosídeos, estrogênios e alguns outros analitos. O material estacionário com grupos polares incorporados possui grupos polares e apolares, podendo, portanto, ser utilizado para separar peptídeos e proteínas em partes hidrofóbicas e hidrofílicas. Colunas polares em linha (por exemplo, colunas C18 com amida em linha) estão disponíveis sob o nome comercial Ascentis Express RP-Amide columns, mas essas colunas foram usadas apenas para a análise da amina 33.
No presente estudo, uma fase estacionária polar de incorporação (N-fenilmaleimida, incorporação em poliestireno) foi preparada e avaliada para a separação de peptídeos e clivagem tríptica de HSA. A seguinte estratégia foi utilizada para preparar a fase estacionária. Partículas de sílica porosa foram preparadas de acordo com os procedimentos descritos em nossas publicações anteriores, com algumas alterações nos esquemas de preparação 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. As proporções de ureia, polietilenoglicol (PEG), TMOS e ácido acético aquoso foram ajustadas para obter partículas de sílica com poros de tamanho grande. Em seguida, um novo ligante fenilmaleimida-isocianato de metilvinila foi sintetizado e suas partículas de sílica derivadas foram utilizadas para preparar fases estacionárias polares de incorporação. A fase estacionária obtida foi empacotada em uma coluna de aço inoxidável (diâmetro interno de 100 × 1,8 mm) de acordo com um esquema de empacotamento otimizado. O empacotamento da coluna é auxiliado por vibração mecânica para garantir uma camada uniforme em seu interior. A coluna empacotada foi avaliada para a separação de uma mistura de peptídeos composta por cinco peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptídeo leucina-encefalina) e hidrolisados ​​trípticos de albumina sérica humana (HSA). Observou-se que a mistura de peptídeos e o hidrolisado tríptico de HSA foram separados com boa resolução e eficiência. A eficiência de separação da coluna PMP foi comparada à da coluna Ascentis Express RP-Amide. Observou-se que os peptídeos e proteínas apresentam boa resolução e alta eficiência de separação na coluna PMP, sendo a eficiência de separação da coluna PMP superior à da coluna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenoglicol), ureia, ácido acético, trimetoxiortosilicato (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albumina sérica humana (HSA), cloreto de amônio, ureia, hexametilmetacriloildisilazano (HMDS), cloreto de metacriloíla (MC), estireno, 4-hidroxi-TEMPO, peróxido de benzoíla (BPO), acetonitrila (ACN) para HPLC, metanol, 2-propanol e acetona. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, EUA).
Uma mistura de ureia (8 g), polietilenoglicol (8 g) e 8 ml de ácido acético 0,01 N foi agitada por 10 minutos, e 24 ml de TMOS foram adicionados sob resfriamento com gelo. A mistura reacional foi aquecida a 40 °C por 6 horas e, em seguida, a 120 °C por 8 horas em uma autoclave de aço inoxidável. A água foi decantada e o resíduo foi seco a 70 °C por 12 horas. Os blocos macios secos foram moídos até obter uma mistura homogênea e calcinados em estufa a 550 °C por 12 horas. Três lotes foram preparados e caracterizados para testar a reprodutibilidade do tamanho das partículas, do tamanho dos poros e da área superficial.
Grupo polar e fase estacionária para cadeias de poliestireno. O procedimento de preparação é descrito abaixo.
N-fenilmaleimida (200 mg) e isocianato de vinila de metila (100 mg) foram dissolvidos em tolueno anidro, e então 0,1 ml de 2,2′-azoisobutironitrila (AIBN) foi adicionado ao frasco de reação para obter um copolímero de fenilmaleimida e isocianato de vinila de metila (PMCP). A mistura foi aquecida a 60 °C por 3 horas, filtrada e seca em estufa a 40 °C por 3 horas.
Partículas de sílica seca (2 g) foram dispersas em tolueno seco (100 ml), agitadas e sonicadas por 10 min em um balão de fundo redondo de 500 ml. PMCP (10 mg) foi dissolvido em tolueno e adicionado gota a gota ao balão de reação através de um funil de adição. A mistura foi refluxada a 100 °C por 8 horas, filtrada, lavada com acetona e seca a 60 °C por 3 horas. Em seguida, as partículas de sílica associadas ao PMCP (100 g) foram dissolvidas em tolueno (200 ml), e 4-hidroxi-TEMPO (2 ml) foi adicionado na presença de 100 μl de dilaurato de dibutilestanho como catalisador. A mistura foi agitada a 50 °C por 8 horas, filtrada e seca a 50 °C por 3 horas.
Estireno (1 ml), peróxido de benzoíla (BPO) (0,5 ml) e partículas de sílica ligadas a TEMPO-PMCP (1,5 g) foram dispersos em tolueno e purgados com nitrogênio. A polimerização do estireno foi realizada a 100 °C por 12 horas. O produto resultante foi lavado com metanol e seco durante a noite a 60 °C. O esquema geral da reação é mostrado na figura 1.
As amostras foram desgaseificadas a 393 K durante 1 h até se obter uma pressão residual inferior a 10–3 Torr. A quantidade de N2 adsorvida a uma pressão relativa P/P0 = 0,99 foi utilizada para determinar o volume total de poros. A morfologia das partículas de sílica pura e ligada a ligantes foi examinada utilizando um microscópio eletrônico de varredura (MEV) (Hitachi High Technologies, Tóquio, Japão). As amostras secas (partículas de sílica pura e sílica ligada a ligantes) foram colocadas em hastes de alumínio utilizando fita de carbono. O ouro foi depositado sobre a amostra utilizando um dispositivo de pulverização catódica Q150T, resultando numa camada de Au com 5 nm de espessura. Este processo melhora a eficiência do processo de baixa voltagem e proporciona uma pulverização a frio de alta qualidade. A análise elementar foi realizada utilizando um analisador de composição elementar Thermo Electron (Waltham, MA, EUA) Flash EA1112. Um analisador de tamanho de partículas Malvern (Worcestershire, Reino Unido) Mastersizer 2000 foi utilizado para obter a distribuição do tamanho das partículas. Partículas de sílica sem revestimento e partículas de sílica ligadas a ligantes (5 mg cada) foram dispersas em 5 ml de isopropanol, sonicadas por 10 minutos, agitadas por 5 minutos e colocadas em uma bancada óptica Mastersizer. A análise termogravimétrica foi realizada a uma taxa de 5 °C por minuto na faixa de temperatura de 30 a 800 °C.
Colunas de aço inoxidável de diâmetro interno estreito, revestidas com fibra de vidro (100 × 1,8 mm), foram empacotadas pelo método de enchimento por suspensão, seguindo o mesmo procedimento descrito na referência 31. A coluna de aço inoxidável (revestida com fibra de vidro, 100 × 1,8 mm) e uma saída contendo uma frita de 1 µm foram conectadas a uma máquina de empacotamento por suspensão (Alltech, Deerfield, IL, EUA). Preparou-se uma suspensão da fase estacionária, dissolvendo 150 mg da fase estacionária em 1,2 mL de metanol e alimentando-a em uma coluna reservatório. O metanol foi utilizado como solvente da suspensão e como solvente de controle. O empacotamento da coluna foi realizado aplicando-se uma sequência de pressão de 100 MPa por 10 min, 80 MPa por 15 min e 60 MPa por 30 min. O processo de empacotamento utilizou dois vibradores de coluna para cromatografia gasosa (Alltech, Deerfield, IL, EUA) para vibração mecânica, garantindo um empacotamento uniforme da coluna. Feche o packer de polpa e libere a pressão lentamente para evitar danos à coluna. A coluna foi desconectada do bocal de polpa e outra conexão foi acoplada à entrada e conectada ao sistema de LC para testar seu funcionamento.
Um sistema MLC personalizado foi construído utilizando uma bomba LC (10AD Shimadzu, Japão), um amostrador com alça de injeção de 50 nL (Valco (EUA) C14 W.05), um desgaseificador de membrana (Shimadzu DGU-14A) e uma janela capilar UV-VIS. O detector (UV-2075) e a microcoluna esmaltada foram utilizados. Tubos de conexão muito estreitos e curtos foram usados ​​para minimizar o efeito da expansão adicional da coluna. Após o preenchimento da coluna, um capilar (50 µm d.i. 365) foi instalado na saída da junção redutora de 1/16″ e outro capilar (50 µm) foi instalado na junção redutora. A coleta de dados e o processamento do cromatograma foram realizados utilizando o software Multichro 2000. A absorbância UV dos analitos foi monitorada em 254 nm. Os dados cromatográficos foram analisados ​​utilizando o OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina sérica humana, pó liofilizado, ≥ 96% (eletroforese em gel de agarose) 3 mg misturada com tripsina (1,5 mg), ureia 4,0 M (1 ml) e bicarbonato de amônio 0,2 M (1 ml). A solução foi agitada por 10 min e mantida em banho-maria a 37 °C por 6 h, sendo então neutralizada com 1 ml de TFA a 0,1%. A solução foi filtrada e armazenada abaixo de 4 °C.
A separação de uma mistura de peptídeos e HSA digerida por tríptica em uma coluna PMP foi avaliada separadamente. Verifique a hidrólise tríptica de uma mistura de peptídeos e HSA separada por uma coluna PMP e compare os resultados com uma coluna Ascentis Express RP-Amide. O número de pratos teóricos é calculado usando a seguinte equação:
As imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de partículas de sílica pura e de partículas de sílica ligadas ao ligante são mostradas na Figura 2. As imagens de MEV das partículas de sílica pura (A, B) mostram uma forma esférica na qual as partículas são alongadas ou apresentam simetria irregular em comparação com nossos estudos anteriores. A superfície das partículas de sílica ligadas ao ligante (C, D) é mais lisa do que a das partículas de sílica pura, o que pode ser devido às cadeias de poliestireno que recobrem a superfície das partículas de sílica.
Micrografias eletrônicas de varredura de partículas de sílica pura (A, B) e partículas de sílica ligadas a ligantes (C, D).
A distribuição do tamanho de partículas de sílica pura e de sílica ligada a ligantes é mostrada na Figura 2. 3(A). As curvas de distribuição volumétrica do tamanho de partículas mostraram que o tamanho das partículas de sílica aumentou após a modificação química (Figura 3A). Os dados de distribuição do tamanho de partículas de sílica deste estudo e de um estudo anterior são comparados na Tabela 1(A). O tamanho volumétrico de partícula d(0,5) do PMP foi de 3,36 µm, comparado ao valor ad(0,5) de 3,05 µm em nosso estudo anterior (partículas de sílica ligadas a poliestireno)34. Devido à mudança na proporção de PEG, ureia, TMOS e ácido acético na mistura reacional, a distribuição do tamanho de partículas deste lote foi mais estreita em comparação com nosso estudo anterior. O tamanho de partícula da fase PMP é ligeiramente maior do que o da fase de partículas de sílica ligadas a poliestireno que estudamos anteriormente. Isso significa que a funcionalização da superfície das partículas de sílica com estireno depositou apenas uma camada de poliestireno (0,97 µm) na superfície da sílica, enquanto na fase PMP a espessura da camada foi de 1,38 µm.
Distribuição do tamanho das partículas (A) e distribuição do tamanho dos poros (B) de partículas de sílica pura e partículas de sílica ligadas a ligantes.
O tamanho dos poros, o volume dos poros e a área superficial das partículas de sílica utilizadas neste estudo são apresentados na Tabela 1 (B). Os perfis de distribuição do tamanho dos poros (PSD) das partículas de sílica pura e das partículas de sílica ligadas a ligantes são mostrados na Figura 3 (B). Os resultados foram comparáveis ​​aos do nosso estudo anterior³⁴. Os tamanhos dos poros das partículas de sílica pura e ligada a ligantes foram de 310 Å e 241 Å, respectivamente, indicando que, após a modificação química, o tamanho dos poros diminuiu em 69 Å, conforme mostrado na Tabela 1 (B), e a curva de deslocamento é mostrada na Figura 3 (B). A área superficial específica das partículas de sílica neste estudo é de 116 m²/g, comparável à do nosso estudo anterior (124 m²/g). Como mostrado na Tabela 1 (B), a área superficial (m²/g) das partículas de sílica após a modificação química também diminuiu de 116 m²/g para 105 m²/g.
Os resultados da análise elementar da fase estacionária são apresentados na Tabela 2. O teor de carbono da fase estacionária atual é de 6,35%, inferior ao do nosso estudo anterior (partículas de sílica associadas ao poliestireno, 7,93%35 e 10,21%, respectivamente)42. O teor de carbono da fase estacionária atual é inferior devido à utilização de alguns ligantes polares, como o fenilmaleimida metil vinil isocianato (PCMP) e o 4-hidroxi-TEMPO, em adição ao estireno, na preparação da fase estacionária. A porcentagem em massa de nitrogênio na fase estacionária atual é de 2,21%, comparada a 0,1735% e 0,85% em estudos anteriores42. Isso significa que a fase estacionária atual apresenta uma alta porcentagem em massa de nitrogênio devido à presença do fenilmaleimida. De forma semelhante, os produtos (4) e (5) apresentam um teor de carbono de 2,7% e 2,9%, respectivamente, enquanto o produto final (6) apresenta um teor de carbono de 6,35%, conforme mostrado na Tabela 2. A análise termogravimétrica (TGA) foi utilizada na fase estacionária do PMP para verificar a perda de massa, e a curva TGA é mostrada na Figura 4. A curva TGA mostra uma perda de massa de 8,6%, o que está em boa concordância com o teor de carbono (6,35%), visto que os ligantes contêm não apenas C, mas também N, O e H.
O ligante fenilmaleimida-isocianato de metilvinila foi escolhido para modificar a superfície das partículas de sílica devido aos seus grupos polares fenilmaleimida e isocianato de vinila. Os grupos isocianato de vinila podem reagir com o estireno por meio de polimerização radicalar viva. A segunda razão é inserir um grupo que apresente interações moderadas com o analito e não interações eletrostáticas fortes entre o analito e a fase estacionária, visto que a porção fenilmaleimida não possui carga virtual em pH normal. A polaridade da fase estacionária pode ser controlada pela quantidade ideal de estireno e pelo tempo de reação da polimerização radicalar livre. A etapa final da reação (polimerização radicalar livre) é crítica, pois altera a polaridade da fase estacionária. A análise elementar foi realizada para verificar o teor de carbono nessas fases estacionárias. Observou-se que o aumento da quantidade de estireno e do tempo de reação aumenta o teor de carbono da fase estacionária e vice-versa. As fases estacionárias preparadas com diferentes concentrações de estireno apresentam diferentes teores de carbono. De forma semelhante, essas fases estacionárias foram colocadas em colunas de aço inoxidável e suas características cromatográficas (seletividade, resolução, valor N, etc.) foram verificadas. Com base nesses experimentos, uma composição otimizada para a preparação da fase estacionária PMP foi escolhida para proporcionar polaridade controlada e boa retenção do analito.
A coluna PMP também foi avaliada para a análise de cinco misturas de peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina-encefalina) utilizando a capacidade da fase móvel 60/40 (v/v) ACN/água (0,1% TFA) a uma vazão de 80 µl/min. Sob condições ótimas de eluição (200.000 pratos/m), o número de pratos teóricos (N) por coluna (100 × 1,8 mm) é de 20.000 ± 100. Os valores de N para as três colunas PMP são mostrados na Tabela 3 e os cromatogramas são mostrados na Figura 5A. Análise rápida com alta vazão (700 µl/min) em uma coluna PMP, com cinco peptídeos eluídos em um minuto, apresentou um excelente valor N de 13.500 ± 330 por coluna (100 x 1,8 mm de diâmetro), equivalente a 135.000 pratos/m (Fig. 5B). Três colunas do mesmo tamanho (diâmetro interno de 100 x 1,8 mm) foram preenchidas com três lotes diferentes de fase estacionária PMP para testar a reprodutibilidade. Os analitos foram registrados para cada coluna separando-se a mesma mistura de teste em cada coluna, utilizando condições de eluição otimizadas, número de pratos teóricos N e tempo de retenção. Os dados de reprodutibilidade para as colunas PMP são mostrados na Tabela 4. A reprodutibilidade da coluna PMP apresentou boa correlação com valores de %RSD muito baixos, conforme mostrado na Tabela 3.
Separação de misturas de peptídeos em uma coluna PMP (B) e uma coluna Ascentis Express RP-Amide (A), fase móvel 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensões da coluna PMP (100 x 1,8 mm d.i.), ordem de eluição dos compostos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) e 5 (encefalina do ácido leucico).
Uma coluna PMP (diâmetro interno de 100 x 1,8 mm) foi avaliada para a separação do hidrolisado tríptico da albumina sérica humana por HPLC. O cromatograma na Figura 6 mostra que as amostras estão bem separadas com excelente resolução. As soluções de HSA foram analisadas utilizando uma vazão de 100 μl/min, uma fase móvel composta por 70/30 acetonitrila/água e 0,1% de TFA. A clivagem da HSA resultou em 17 picos, conforme mostrado no cromatograma (Fig. 6), correspondentes a 17 peptídeos. As eficiências de separação dos picos individuais do hidrolisado de HSA foram calculadas e os valores são apresentados na Tabela 5.
Os hidrolisados ​​trípticos de HSA foram separados em uma coluna PMP (diâmetro interno de 100 x 1,8 mm), vazão de 100 μl/min, fase móvel composta por 60/40 acetonitrila/água e 0,1% de TFA.
onde L é o comprimento da coluna, η é a viscosidade da fase móvel, ΔP é a contrapressão da coluna e u é a velocidade linear da fase móvel. A permeabilidade da coluna PMP foi de 2,5 × 10⁻¹⁴ m², a vazão foi de 25 µl/min e utilizou-se uma mistura de 60/40 v/v de ACN/água. A permeabilidade da coluna PMP (DI 100 × 1,8 mm) foi semelhante à do nosso estudo anterior (Ref. 34). A permeabilidade de uma coluna preenchida com partículas superficialmente porosas é de 1,7 × 10⁻⁶ µm e de 2,5 × 10⁻¹⁴ m² para partículas de 5 µm (43). Portanto, a permeabilidade da fase PMP é semelhante à permeabilidade de partículas núcleo-casca com tamanho de 5 µm.
onde Wx é a massa da coluna preenchida com clorofórmio, Wy é a massa da coluna preenchida com metanol e ρ é a densidade do solvente. Densidade do metanol (ρ = 0,7866) e do clorofórmio (ρ = 1,484). A porosidade total da coluna de partículas de sílica-C18 (100 × 1,8 mm DI)34 e da nossa coluna de C18-ureia estudada anteriormente31 foi de 0,63 e 0,55, respectivamente. Isso significa que a presença de ligantes de ureia reduz a permeabilidade da fase estacionária. Por outro lado, a porosidade total da coluna de PMP (diâmetro interno de 100 × 1,8 mm) é de 0,60. As colunas PMP são menos permeáveis ​​do que as colunas empacotadas com partículas de sílica ligadas a C18 porque, nas fases estacionárias do tipo C18, os ligantes C18 estão ligados às partículas de sílica em cadeias lineares, enquanto nas fases estacionárias do tipo poliestireno, forma-se um polímero relativamente espesso ao redor das partículas. Camada A. Em um experimento típico, a porosidade da coluna é calculada da seguinte forma:
As figuras 7A e 7B mostram os gráficos de Van Deemter para uma coluna PMP (diâmetro interno de 100 x 1,8 mm) e uma coluna Ascentis Express RP-Amide (diâmetro interno de 100 x 1,8 mm) sob as mesmas condições de eluição: 60/40 ACN/H2O e 0,1% de TFA, com vazões de 20 µl/min a 800 µl/min em ambas as colunas. Os valores mínimos de HETP na vazão ideal (80 µl/min) foram de 2,6 µm e 3,9 µm para a coluna PMP e a coluna Ascentis Express RP-Amide, respectivamente. Os valores de HETP demonstram que a eficiência de separação da coluna PMP (100 x 1,8 mm de diâmetro interno) é muito superior à da coluna comercial Ascentis Express RP-Amide (100 x 1,8 mm de diâmetro interno). O gráfico de van Deemter na Fig. 7(A) mostra que a diminuição no valor de N não é significativamente maior com o aumento do fluxo em comparação com nosso estudo anterior. A maior eficiência de separação da coluna PMP (diâmetro interno de 100 × 1,8 mm) em comparação com a coluna Ascentis Express RP-Amide é baseada na melhoria da forma e do tamanho das partículas e no sofisticado procedimento de empacotamento da coluna usado neste trabalho34.
(A) Gráfico de Van Deemter (HETP versus velocidade linear da fase móvel) obtido em uma coluna PMP (diâmetro interno 100 x 1,8 mm) em ACN/H2O 60/40 com 0,1% de TFA. (B) Gráfico de Van Deemter (HETP versus velocidade linear da fase móvel) obtido em uma coluna Ascentis Express RP-Amide (diâmetro interno 100 x 1,8 mm) em ACN/H2O 60/40 com 0,1% de TFA.
Uma fase estacionária polar de poliestireno intercalado foi preparada e avaliada para a separação de uma mistura de peptídeos sintéticos e hidrolisado tríptico de albumina sérica humana (HSA) em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O desempenho cromatográfico das colunas PMP para misturas de peptídeos é excelente em termos de eficiência de separação e resolução. A melhoria na eficiência de separação das colunas PMP deve-se a diversos fatores, como o tamanho das partículas de sílica e o tamanho dos poros, a síntese controlada das fases estacionárias e os materiais complexos de empacotamento da coluna. Além da alta eficiência de separação, outra vantagem dessa fase estacionária é a baixa contrapressão da coluna em altas taxas de fluxo. As colunas PMP são altamente reprodutíveis e podem ser usadas para analisar misturas de peptídeos e digestão tríptica de diversas proteínas. Pretendemos utilizar essa coluna para a separação de compostos bioativos de produtos naturais, extratos de plantas medicinais e cogumelos em cromatografia líquida. No futuro, as colunas PMP também serão avaliadas para a separação de proteínas e anticorpos monoclonais.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigação de sistemas de separação de peptídeos por cromatografia de fase reversa - Parte I: Desenvolvimento de um protocolo para caracterização de colunas. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigação de sistemas de separação de peptídeos por cromatografia de fase reversa - Parte I: Desenvolvimento de um protocolo para caracterização de colunas.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., e Petersson, P. Investigação de sistemas de separação de peptídeos por cromatografia de fase reversa, Parte I: Desenvolvimento de um protocolo para caracterização de colunas. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigação de sistemas de separação de peptídeos por cromatografia de fase reversa - Parte I: Desenvolvimento de um protocolo para caracterização de colunas. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investigação de sistemas de separação de peptídeos por cromatografia de fase reversa - Parte I: Desenvolvimento de um protocolo para caracterização de colunas.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., e Petersson, P. Investigação de sistemas de separação de peptídeos por cromatografia de fase reversa, Parte I: Desenvolvimento de um protocolo para caracterização de colunas.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
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