Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа. Та хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй хөтчийн хувилбарыг ашиглаж байна. Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох). Нэмж дурдахад, байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг хэв маяг, JavaScript-гүй харуулж байна.
Гурван слайдаас бүрдсэн тойргийг нэг дор харуулна. Өмнөх болон Дараагийн товчийг ашиглан гурван слайдыг нэг дор гүйлгэх, эсвэл төгсгөлд байрлах гулсагч товчлуурыг ашиглан гурван слайдыг нэг дор гүйлгэж болно.
Сүвэрхэг цахиурын тоосонцорыг соль-гелийн аргаар бэлтгэж, өргөн нүхтэй хэсгүүдийг гаргаж авсан. Эдгээр хэсгүүдийг урвуу гинжин хэлхээний хуваагдал (RAFT) полимержуулалтаар N-фенилмалеймид-метилвинил изоцианат (PMI) ба стиролаар гаргаж авч, N-фенилмалеймидын хоорондын полиамидуудыг гаргаж авсан. Стирол (PMP) суурин үе шат. Нарийн цооногтой зэвэрдэггүй ган багануудыг (дотоод диаметр нь 100 × 1.8 мм) зутангаар савласан. PMP баганын хроматографийн гүйцэтгэлийг таван пептид (Гли-Тир, Гли-Лью-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, Леу амин хүчлийн энкефалин) ба хүний ​​триптик гидролиз альбуминаас бүрдсэн синтетик пептидийн хольцыг ялгахын тулд үнэлэв. Оновчтой шүүрлийн нөхцөлд пептидийн холимог бүхий ялтсуудын онолын тоо 280,000 хавтан/м2 хүрчээ. Боловсруулсан баганын салгах гүйцэтгэлийг арилжааны Ascentis Express RP-Amide баганатай харьцуулж үзэхэд PMP баганын салгах үр ашиг нь салгах үр ашиг, нягтралын хувьд арилжааны баганагаас илүү байгаа нь ажиглагдсан.
Био эм үйлдвэрлэлийн салбар нь сүүлийн жилүүдэд зах зээлд эзлэх хувь мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн дэлхийн зах зээл болж өргөжиж байна. Биофармацевтикийн үйлдвэрлэлийн1,2,3 тэсрэлттэй өсөлттэй холбоотойгоор пептид, уургийн шинжилгээ хийх шаардлагатай байна. Пептидийн нийлэгжилтийн явцад зорилтот пептидээс гадна янз бүрийн хольц үүсдэг тул пептидийн хүссэн цэвэр байдлыг олж авахын тулд хроматографийн цэвэршүүлэх шаардлагатай. Биеийн шингэн, эд, эс дэх уургийн шинжилгээ, шинж чанарыг тодорхойлох нь нэг дээжинд олон тооны илрэх боломжтой зүйлүүд байдаг тул маш хэцүү ажил юм. Масс спектрометр нь пептид ба уургийн дарааллыг тогтоох үр дүнтэй хэрэгсэл боловч хэрэв ийм дээжийг масс спектрометрт шууд оруулбал салалт нь хангалтгүй байх болно. MS шинжилгээний өмнө шингэн хроматографи (LC) хийснээр энэ асуудлыг шийдэж болох бөгөөд энэ нь өгөгдсөн хугацаанд масс спектрометрт орж буй аналитийн хэмжээг багасгах болно4,5,6. Нэмж дурдахад шингэний фазыг салгах явцад анализаторууд нарийн бүсэд төвлөрч, улмаар эдгээр аналитуудыг төвлөрүүлж, MS илрүүлэх мэдрэмжийг нэмэгдүүлдэг. Шингэн хроматографи (LC) нь сүүлийн 10 жилийн хугацаанд ихээхэн ахиц дэвшил гарсан бөгөөд протеомикийн шинжилгээнд өргөн хэрэглэгддэг арга болсон7,8,9,10.
Урвуу фазын шингэн хроматографийг (RP-LC) суурин фаз болгон октадецилийн өөрчилсөн цахиур (ODS) ашиглан пептидийн хольцыг цэвэршүүлэх, салгахад өргөн хэрэглэгддэг11,12,13. Гэсэн хэдий ч нийлмэл бүтэц, амфотер шинж чанараас шалтгаалан 14,15 RP-ийн суурин фазууд нь пептид ба уургийг хангалттай тусгаарлаж чадахгүй. Иймд туйл ба туйлшгүй хэлтэрхий бүхий пептид ба уургийн шинжилгээнд эдгээр аналитуудыг харилцан үйлчилж, хадгалахын тулд тусгайлан зохион бүтээсэн суурин фазуудыг шаарддаг16. Олон төрлийн харилцан үйлчлэлийг санал болгодог холимог хроматограф нь пептид, уураг болон бусад нарийн төвөгтэй хольцыг ялгах RP-LC-ийн өөр хувилбар байж болно. Холимог хэлбэрийн хэд хэдэн суурин фазуудыг бэлтгэж, эдгээр суурин фазаар дүүргэсэн баганыг пептид, уурагуудыг ялгахад ашигласан17,18,19,20,21. Туйлт ба туйлшралгүй бүлгүүд байгаа тул холимог горимын суурин фазууд (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, туйлын интеркаляци/RPLC) нь пептид ба уурагуудыг ялгахад тохиромжтой22,23,24,25,26,27,28. , Ковалентын холбоо бүхий туйлын бүлгүүдтэй туйлтай харилцан уялдаатай хөдөлгөөнгүй фазууд нь ялгах чадвар сайтай, туйл ба туйл бус шинжлүүлэгчид онцгой сонгомол чанарыг харуулдаг, учир нь салгах нь шинжлэгч болон суурин фазын харилцан үйлчлэлээс хамаардаг Мультимодал харилцан үйлчлэл 29,30,31,32. Саяхан Zhang et al. 30 нь беенил төгсгөлтэй полиаминуудын суурин фазуудыг олж авсан бөгөөд нүүрсустөрөгч, антидепрессант, флавоноид, нуклеозид, эстроген болон бусад зарим аналитуудыг амжилттай тусгаарлав. Туйлын суулгагдсан суурин материал нь туйл ба туйл биш бүлэгтэй тул пептид, уургийг гидрофобик болон гидрофил хэсгүүдэд салгахад ашиглаж болно. Туйлын шугаман багануудыг (жишээ нь, амид доторлогоотой C18 багана) Ascentis Express RP-Amide багана худалдааны нэрээр авах боломжтой боловч эдгээр баганыг зөвхөн амин 33-ын шинжилгээнд ашигласан.
Одоогийн судалгаагаар туйлшрал бүхий суурин фазыг (N-фенилмалеймид, полистирол) бэлтгэж, пептид салгах болон триптийн HSA хуваагдлыг үнэлэв. Суурин үе шатыг бэлтгэхийн тулд дараах стратегийг ашигласан. Сүвэрхэг цахиурын тоосонцорыг өмнөх хэвлэлд дурдсан журмын дагуу бэлтгэсэн бөгөөд бэлтгэлийн схем 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39-д зарим өөрчлөлт оруулав. Мочевин, полиэтилен гликол (PEG), TMOS болон усан-цууны хүчлийн харьцааг том хэмжээтэй цахиурын хэсгүүдтэй болгохын тулд тохируулсан. Хоёрдугаарт, шинэ фенилмалеймид-метилвинил изоцианатын лигандыг нэгтгэж, түүний үүсмэл цахиурын тоосонцорыг туйлширсан суурин фазуудыг бэлтгэхэд ашигласан. Олж авсан суурин үеийг оновчтой савлах схемийн дагуу зэвэрдэггүй ган баганад (дотоод диаметр нь 100 × 1.8 мм) савласан. Баганын савлагаа нь механик чичиргээний тусламжтайгаар баганын дотор жигд давхаргыг хангана. Савласан баганыг таван пептид (Гли-Тир, Гли-Лью-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, лейцин-энкефалин пептид) -ээс бүрдсэн пептидийн хольцыг ялгах зорилгоор үнэлэв. хүний ​​ийлдэс альбумин (HSA) -ийн триптик гидролизатууд. Пептидийн хольц ба HSA триптик задрал нь сайн нягтаршилтай, үр дүнтэйгээр тусгаарлагдсан нь ажиглагдсан. PMP баганын салгах үр ашгийг Ascentis Express RP-Amide баганатай харьцуулсан. PMP багана дээр пептид, уураг нь сайн нягтаршилтай, ялгах өндөр үр ашигтай байдаг ба PMP баганын салгах үр ашиг нь Ascentis Express RP-Amide баганынхаас өндөр байгаа нь ажиглагдсан.
PEG (полиэтилен гликол), мочевин, цууны хүчил, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлоросилан (TMCS), трипсин, хүний ​​ийлдэс альбумин (HSA), аммонийн хлорид, мочевин, гексаметилметакрилоилдсилазан (HMDS), мочевин (HMDS), метохлор 4-гидрокси- TEMPO, бензоил хэт исэл (BPO), HPLC-д зориулсан ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол, ацетон. Sigma-Oldrich компани (АНУ, Миссури, Сент-Луис).
Мочевин (8 гр), полиэтилен гликол (8 гр), 8 мл 0.01 N цууны хүчлийн холимогийг 10 минутын турш хутгаж, мөсөөр хөргөхөд 24 мл TMOS нэмсэн. Урвалын хольцыг зэвэрдэггүй ган автоклавт 400С-т 6 цагийн турш, дараа нь 1200С-т 8 цагийн турш халаана. Усыг зайлуулж, үлдэгдлийг 70 ° C-т 12 цагийн турш хатаана. Хатаасан зөөлөн блокуудыг жигд нунтаглаж, 550 градусын зууханд 12 цагийн турш кальцилсан. Гурван багцыг бэлтгэж, бөөмийн хэмжээ, нүх сүвний хэмжээ, гадаргуугийн талбайн давтагдах чадварыг туршихын тулд тодорхойлсон.
Полистирол гинжний туйлын бүлэг ба суурин үе шат. Бэлтгэх журмыг доор тайлбарлав.
N-фенилмалеймид (200 мг) ба метил винил изоцианатыг (100 мг) усгүй толуолд уусгаж, дараа нь фенилмалейимид ба метианилатын сополимерыг авахын тулд урвалын колбонд 0.1 мл 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) нэмэв. ) Хольцыг 600С-т 3 цагийн турш халааж, шүүж, 400С-т зууханд 3 цагийн турш хатаана.
Хатаасан цахиурын тоосонцорыг (2 гр) хуурай толуолд (100 мл) тарааж, хутгаж, 500 мл-ийн дугуй ёроолтой колбонд 10 минутын турш дуу авианы горимд оруулав. PMCP (10 мг)-ийг толуолд уусгаж, нэмэлт юүлүүрээр урвалын колбонд дуслаар нэмсэн. Хольцыг 8 цагийн турш 100 градусын температурт рефлюкс хийж, шүүж, ацетоноор угааж, 60 градусын температурт 3 цагийн турш хатаана. Дараа нь PMCP (100 гр) -тай холбоотой цахиурын тоосонцорыг толуолд (200 мл) уусгаж, катализатор болгон 100 мкл дибутилтин дилаураттай 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) нэмсэн. Хольцыг 50 градусын температурт 8 цагийн турш хутгаж, шүүж, 50 градусын температурт 3 цагийн турш хатаана.
Стирол (1 мл), бензоил хэт исэл BPO (0.5 мл), TEMPO-PMCP (1.5 гр) -д наалдсан цахиурын тоосонцорыг толуолд тарааж, азотоор цэвэрлэв. Стиролын полимержилтийг 100 градусын температурт 12 цагийн турш явуулсан. Үүссэн бүтээгдэхүүнийг метанолоор угааж, 60 хэмд шөнийн турш хатаана. Урвалын ерөнхий схемийг зурагт үзүүлэв. нэг .
Дээжийг 10-3 Торр-аас бага үлдэгдэл даралтыг авах хүртэл 1 цагийн турш 393 К температурт хийгүйжүүлсэн. P/P0 = 0.99 харьцангуй даралтад шингэсэн N2-ийн хэмжээг нийт нүхний эзэлхүүнийг тодорхойлоход ашигласан. Цэвэр болон лигандтай цахиурын хэсгүүдийн морфологийг сканнерийн электрон микроскоп (Hitachi High Technologies, Токио, Япон) ашиглан шалгасан. Хуурай дээжийг (цэвэр цахиур ба лиганд холбогдсон цахиурын тоосонцор) нүүрстөрөгчийн тууз ашиглан хөнгөн цагаан саваа дээр байрлуулсан. Дээж дээр Q150T шүрших төхөөрөмж ашиглан алтыг тунасан ба дээж дээр 5 нм зузаантай Au давхарга тунасан. Энэ нь бага хүчдэлийн процессын үр ашгийг дээшлүүлж, нарийн хүйтэн шүрших боломжийг олгодог. Элементийн шинжилгээг Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 элементийн найрлагын анализатор ашиглан хийсэн. Бөөмийн хэмжээний тархалтыг олж авахын тулд Malvern ширхэгийн хэмжээ анализатор (Вустершир, Их Британи) Mastersizer 2000 ашигласан. Бүрээгүй цахиурын тоосонцор болон лигандтай холбогдсон цахиурын ислийн тоосонцорыг (тус бүр нь 5 мг) 5 мл изопропанолд тарааж, 10 минутын турш дууны долгионоор хийн, 5 минутын турш хутгаж, Mastersizer оптик вандан сандал дээр байрлуулсан. Термогравиметрийн шинжилгээг 30-аас 800 ° C-ийн температурт минутанд 5 ° С-ийн хурдаар гүйцэтгэдэг.
Шилэн шилэн доторлогоотой нарийн цооног зэвэрдэггүй ган баганыг (ID 100 × 1.8 мм) хэмжээстэй, 31-р лавлагааны дагуу зутан дүүргэх аргаар савласан. Зэвэрдэггүй ган багана (шилэн доторлогоотой, ID 100 × 1.8 мм) ба 1 мкм фрит агуулсан гаралт (ILA, Techfields машинтай холбосон). АНУ). 150 мг суурин фазыг 1.2 мл метанолд түдгэлзүүлж, усан сангийн баганад тэжээх замаар суурин фазын суспензийг бэлтгэнэ. Метанолыг зутан уусгагч болон хяналтын уусгагч болгон ашигласан. 10 минутын турш 100 МП, 15 минутын турш 80 МП, 30 минутын турш 60 МП даралтын дарааллаар баганыг боож өгнө. Баганыг жигд савлахын тулд савлах явцад механик чичиргээнд зориулж хоёр хийн хроматографийн баганын чичиргээг (Alltech, Deerfield, IL, USA) ашигласан. Утсыг гэмтээхгүйн тулд зутан савлагчийг хааж, даралтыг аажмаар суллана. Багана нь зутангийн хушуунаас салгагдаж, оролтод өөр холбох хэрэгсэл залгаж, ажиллагааг шалгахын тулд LC системд холбосон.
Захиалгат MLC-ийг LC насос (10AD Shimadzu, Japan), 50 nL тарилгын гогцоотой дээж авагч (Valco (АНУ) C14 W.05), мембраны хий арилгагч (Shimadzu DGU-14A) болон UV-VIS хялгасан судасны цонх ашиглан хийсэн. Илрүүлэгч төхөөрөмж (UV-2075) болон пааландсан бичил багана. Нэмэлт баганын өргөтгөлийн нөлөөг багасгахын тулд маш нарийн, богино холбох хоолойг ашиглана. Багануудыг дүүргэсний дараа 1/16 ″ бууруулах уулзварын гаралтын хэсэгт хялгасан судсыг (50 μm id 365) суулгаж, багасгах уулзварын капиллярыг (50 μм) суулгана. Мэдээлэл цуглуулах, хроматограмм боловсруулалтыг Multichro 2000 программ ашиглан гүйцэтгэдэг. 254 нм долгионы долгионы долгионы долгионы долгионы хэмжигдэхүүнд шинжилгээнд хамрагдагсдын хэт ягаан туяаны шингээлтийг 0 хэмд хянана. Хроматографийн өгөгдөлд OriginPro8 (Northampton, MA) ашиглан дүн шинжилгээ хийсэн.
Хүний ийлдэс альбумин, лиофилжсэн нунтаг, ≥ 96% (агароз гель электрофорез) 3 мг трипсин (1.5 мг), 4.0 М мочевин (1 мл) ба 0.2 М аммонийн бикарбонат (1 мл) хольсон. Уусмалыг 10 минутын турш хутгаж, 370С-ийн усан ваннд 6 цагийн турш байлгасны дараа 1 мл 0.1% TFA-тай унтраасан. Уусмалыг шүүж, 4 хэмээс доош температурт хадгална.
PMP багана дээрх пептид ба триптик задралын HSA-ийн холимогийг тусад нь үнэлэв. PMP баганаар тусгаарлагдсан пептид ба HSA-ийн холимгийн триптик гидролизийг шалгаж, үр дүнг Ascentis Express RP-Amide баганатай харьцуулна уу. Онолын хавтангийн тоог дараахь томъёогоор тооцоолно.
Цэвэр цахиурын тоосонцор болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн SEM зургийг Зураг 2-т үзүүлэв. Цэвэр цахиурын хэсгүүдийн (A, B) SEM зураг нь бидний өмнөх судалгаатай харьцуулахад хэсгүүд нь сунасан буюу жигд бус тэгш хэмтэй бөмбөрцөг хэлбэртэй байгааг харуулж байна. Лигандтай (C, D) холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн гадаргуу нь цэвэр цахиурын хэсгүүдээс илүү гөлгөр байдаг нь цахиурын хэсгүүдийн гадаргууг бүрхсэн полистирол гинжтэй холбоотой байж болох юм.
Цэвэр цахиурын тоосонцор (A, B) болон лигандтай цахиурын тоосонцор (C, D) -ийн электрон микрографикийг сканнердаж байна.
Цэвэр цахиурын тоосонцор болон лигандтай цахиурын тоосонцоруудын ширхэгийн хэмжээтэй тархалтыг Зураг 2. 3(A)-д үзүүлэв. Химийн өөрчлөлтийн дараа цахиурын тоосонцрын хэмжээ ихэссэнийг эзэлхүүний ширхэгийн хэмжээ хуваарилалтын муруй харуулсан (Зураг 3А). Одоогийн судалгаа болон өмнөх судалгааны цахиурын тоосонцрын тархалтын өгөгдлийг Хүснэгт 1(А)-д харьцуулсан болно. PMP-ийн эзлэхүүний ширхэгийн хэмжээ d(0.5) 3.36 μм байсан бол бидний өмнөх судалгаагаар 3.05 μм (полистиролтой цахиурын тоосонцор)34 байсан ad(0.5)-тай харьцуулахад. Урвалын хольц дахь PEG, мочевин, TMOS болон цууны хүчлийн харьцаа өөрчлөгдсөний улмаас энэ багцын ширхэгийн хэмжээ бидний өмнөх судалгаатай харьцуулахад нарийссан. PMP фазын ширхэгийн хэмжээ нь бидний өмнө нь судалж байсан полистирол холбогдсон цахиурт бөөмийн фазын хэмжээнээс арай том байна. Энэ нь стирол бүхий цахиурын хэсгүүдийн гадаргуугийн функциональ байдал нь цахиурын гадаргуу дээр зөвхөн полистирол давхаргыг (0.97 μм) хуримтлуулсан бол PMP үе шатанд давхаргын зузаан нь 1.38 μм байсан гэсэн үг юм.
Цэвэр цахиурын тоосонцор ба лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн ширхэгийн хэмжээ (A) ба нүх сүвний хэмжээ (B).
Энэ судалгаанд ашигласан цахиурын тоосонцоруудын нүх сүвний хэмжээ, нүхний хэмжээ, гадаргуугийн талбайг 1-р хүснэгтэд (B) үзүүлэв. Цэвэр цахиурын тоосонцор болон лигандтай цахиурын хэсгүүдийн PSD профайлыг Зураг дээр үзүүлэв. 3(B). Үр дүн нь бидний өмнөх судалгаатай харьцуулах боломжтой байсан34. Цэвэр болон лигандтай цахиурын хэсгүүдийн нүх сүвний хэмжээ 310 Å ба 241 Å байсан нь химийн өөрчлөлтийн дараа нүх сүвний хэмжээ 69 Å-ээр багассаныг Хүснэгт 1 (B)-д үзүүлсэн ба шилжилтийн муруйг Зураг дээр үзүүлэв. Одоогийн судалгааны цахиурын ширхэгийн гадаргуугийн талбай нь 6/1 г байна. бидний өмнөх судалгаатай харьцуулах боломжтой (124 м2/г). Хүснэгт 1(B)-д үзүүлснээр химийн өөрчлөлтийн дараах цахиурын хэсгүүдийн гадаргуугийн талбай (м2/г) мөн 116 м2/г-аас 105 м2/г хүртэл буурсан байна.
Хөдөлгөөнгүй фазын элементийн шинжилгээний үр дүнг Хүснэгтэнд үзүүлэв. 2. Одоогийн суурин фазын нүүрстөрөгчийн агууламж 6.35% байгаа нь бидний өмнөх судалгаанаас бага байна (полистиролтой холбоотой цахиурын тоосонцор 7.93%35 ба 10.21% тус тус) 42. Зарим туйлтай лигандууд болох фенилмалеимид (МПП) ба метилмалеимид (MP) тул доор байгаа одоогийн суурин фазын нүүрстөрөгчийн агууламж. SP бэлтгэхэд стиролоос гадна 4-гидрокси-ТЕМПО ашигласан. Одоогийн суурин фаз дахь азотын жингийн хувь нь өмнөх судалгаануудын 0.1735, 0.85%-тай харьцуулахад 2.21% байна42. Энэ нь одоогийн суурин фаз нь фенилмалеймидын улмаас азотын жингийн өндөр хувийг эзэлдэг гэсэн үг юм. Үүний нэгэн адил (4) ба (5) бүтээгдэхүүнд нүүрстөрөгчийн агууламж 2.7% ба 2.9% байгаа бол эцсийн бүтээгдэхүүн (6) нь 6.35% нүүрстөрөгчийн агууламжтай байгааг Хүснэгт 2-т үзүүлэв. Жин хасах эсэхийг шалгахын тулд PMP-ийн суурин үе шатанд термогравиметрийн шинжилгээг (TGA) ашигласан ба TGA муруй нь жингийн алдагдлыг Зураг 4-т харуулж байна. 8.6% нь нүүрстөрөгчийн агууламжтай (6.35%) сайн тохирч байна, учир нь лигандууд нь зөвхөн C төдийгүй N, O, H агуулдаг.
Лиганд фенилмалеймид-метилвинил изоцианат нь туйлын фенилмалеймид ба винилизоцианатын бүлгүүдтэй тул цахиурын тоосонцорыг өөрчлөхийн тулд сонгосон. Винил изоцианатын бүлгүүд нь амьд радикал полимержих замаар стиролтой урвалд орж болно. Хоёрдахь шалтгаан нь фенилмалеймидын хэсэг нь хэвийн рН-д виртуал цэнэггүй тул задлан шинжилдэг бодистой дунд зэргийн харилцан үйлчлэлтэй, аналит ба суурин фазын хооронд хүчтэй электростатик харилцан үйлчлэлгүй бүлгийг оруулах явдал юм. Хөдөлгөөнгүй фазын туйлшралыг стиролын оновчтой хэмжээ болон чөлөөт радикал полимержих урвалын хугацаа зэргээр хянаж болно. Урвалын эцсийн шат (чөлөөт радикал полимержилт) нь хөдөлгөөнгүй фазын туйлшралыг өөрчилдөг тул маш чухал юм. Эдгээр суурин үе дэх нүүрстөрөгчийн агууламжийг шалгахын тулд элементийн шинжилгээ хийсэн. Стиролын хэмжээ болон урвалын хугацааг нэмэгдүүлэх нь хөдөлгөөнгүй фазын нүүрстөрөгчийн агууламжийг нэмэгдүүлж, эсрэгээр нь ажиглагдсан. Янз бүрийн концентрацитай стиролаар бэлтгэсэн SP нь өөр өөр нүүрстөрөгчийн ачаалалтай байдаг. Үүний нэгэн адил эдгээр суурин фазуудыг зэвэрдэггүй ган баганууд дээр байрлуулж, тэдгээрийн хроматографийн шинж чанарыг (сонголт, нягтрал, N утга гэх мэт) шалгасан. Эдгээр туршилтууд дээр үндэслэн PMP-ийн суурин фазыг бэлтгэхэд зориулсан оновчтой найрлагыг сонгон авч, хяналттай туйлшрал, аналитийн сайн хадгалалтыг хангасан.
Мөн PMP баганыг хөдөлгөөнт фазын хүчин чадлыг ашиглан пептидийн таван холимог (Гли-Тир, Гли-Лью-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, лейцин-энкефалин) шинжилгээнд үнэлэв. 60/40 (v/v) ACN/ус (0.1% TFA) 80 мкл/мин урсгалын хурдтай. Цэвэршүүлэх оновчтой нөхцөлд (200,000 хавтан/м) нэг баганын онолын хавтангийн тоо (N) (100 × 1.8 мм) 20,000 ± 100 байна. Гурван PMP баганын N утгыг 3-р хүснэгтэд, хроматограммыг Зураг 5А-д үзүүлэв. PMP баганад өндөр урсгалын хурдаар (700 мкл/мин) хурдан шинжилгээ хийх, нэг минутын дотор ялгарсан таван пептид, багана тутамд 13500 ± 330 (100 х 1.8 мм диаметртэй) N-ийн маш сайн утга, 135,000 хавтан/м (Зураг 5Б). Ижил хэмжээтэй гурван баганыг (дотоод диаметр нь 100 х 1.8 мм) давтагдах чадварыг шалгахын тулд PMP суурин фазын гурван өөр багцаар дүүргэсэн. Шинжлэх бодисыг багана тус бүр дээр хамгийн оновчтой уусмалын нөхцөл, онолын хавтангийн N тоо, хадгалах хугацааг ашиглан багана бүр дээр ижил туршилтын хольцыг салгах замаар бүртгэв. PMP баганын давтагдах чадварыг Хүснэгт 4-т үзүүлэв. PMP баганын давтагдах чадвар нь Хүснэгт 3-т үзүүлсэн шиг маш бага %RSD утгатай сайн хамааралтай байна.
PMP багана (B) ба Ascentis Express RP-Amide багана (A) дээрх пептидийн хольцыг салгах, хөдөлгөөнт фаз 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP баганын хэмжээс (100 x 1.8 мм id), шинжилгээ Нэгдлүүдийн ялгаруулалтын дараалал: 1 (Гли-Тир), 2Тир, 2-Г (Гли-Гли-Тир-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) ба 5 (лейкийн хүчил энкефалин).
PMP баганыг (дотоод диаметр нь 100 х 1.8 мм) HPLC-ээр хүний ​​ийлдэс альбумины триптик гидролизатыг ялгахад үнэлэв. Зураг 6-д үзүүлсэн хроматограмм нь дээжийг маш сайн нягтаршилтайгаар сайн салгаж байгааг харуулж байна. HSA-ийн уусмалыг 100 мкл/мин урсгалын хурд, 70/30 ацетонитрил/усны хөдөлгөөнт фаз, 0.1% TFA ашиглан шинжлэв. HSA-ийн хуваагдлыг хроматограммд (Зураг 6) харуулсанчлан 17 пептид харгалзах 17 оргилд хуваасан. HSA гидролизатаас бие даасан оргилуудыг салгах үр ашгийг тооцоолж, утгыг 5-р хүснэгтэд үзүүлэв.
HSA триптик гидролизатыг PMP багана (дотоод диаметр нь 100 x 1.8 мм), урсгалын хурд (100 мкл/мин), хөдөлгөөнт фаз 60/40 ацетонитрил/ус, 0.1% TFA дээр тусгаарласан.
Энд L нь баганын урт, η нь хөдөлгөөнт фазын зуурамтгай чанар, ΔP нь баганын арын даралт, u нь хөдөлгөөнт фазын шугаман хурд юм. PMP баганын нэвчилт нь 2.5 × 10-14 м2, урсгалын хурд 25 мкл/мин, 60/40 в/в ашигласан. ACN/ус. PMP баганын нэвчилт (ID 100 × 1.8 мм) нь бидний өмнөх Ref.34 судалгаатай төстэй байсан. Өнгөц сүвэрхэг хэсгүүдээр дүүрсэн баганын нэвчилт нь 1.7×10.6 мкм, 5 мкм хэмжээтэй хэсгүүдийн хувьд 2.5×10-14 м243 байна. Тиймээс PMP фазын нэвчилт нь 5 μм хэмжээтэй үндсэн бүрхүүлийн хэсгүүдийн нэвчилттэй төстэй байдаг.
Энд Wx нь хлороформоор дүүрсэн баганын масс, Wy нь метанолоор дүүрсэн баганын масс, ρ нь уусгагчийн нягт юм. Метанол (ρ = 0.7866) ба хлороформ (ρ = 1.484) -ийн нягтрал. Цахиур-C18 ширхэгийн баганын (100 × 1.8 мм ID)34 болон бидний өмнө нь судалсан C18-urea31 баганын нийт сүвэрхэг чанар 0.63 ба 0.55 тус тус байв. Энэ нь мочевин лиганд байгаа нь суурин фазын нэвчилтийг бууруулдаг гэсэн үг юм. Нөгөө талаас, PMP баганын нийт сүвэрхэг чанар (дотоод диаметр нь 100 × 1.8 мм) 0.60 байна. PMP багана нь C18 төрлийн цахиурын тоосонцороор савлагдсан баганаас бага нэвчилттэй байдаг, учир нь C18 төрлийн хөдөлгөөнгүй фазуудад C18 лигандууд нь шугаман гинжин хэлхээнд цахиурын тоосонцортой холбогддог бол полистирол төрлийн суурин фазуудад хэсгүүдийн эргэн тойронд харьцангуй зузаан полимер үүсдэг. давхарга A. Ердийн туршилтаар баганын сүвэрхэг чанарыг дараах байдлаар тооцдог.
Зураг дээр. 7A, B-д PMP баганын (id 100 x 1.8 мм) болон Ascentis Express RP-Amide баганын (id 100 x 1.8 мм) Van Deemter-ийн графикийг ижил тунгаах нөхцөлд, 60/40 ACN/H2O ба 0.1% TFA 20 мкл/мин-аас 80 мкл/мин хүртэл хоёуланд нь үзүүлэв. Хамгийн оновчтой урсгалын хурдтай (80 мкл/мин) HETP-ийн хамгийн бага утга нь PMP багана болон Ascentis Express RP-Amide баганын хувьд 2.6 мкм ба 3.9 мкм байв. HETP утгууд нь PMP баганын (100 x 1.8 мм id) тусгаарлах үр ашиг нь худалдаанд гарсан Ascentis Express RP-Amide баганаас (100 x 1.8 мм id) хамаагүй өндөр байгааг харуулж байна. Зураг 7(A)-д үзүүлсэн ван Димтерийн графикаас харахад бидний өмнөх судалгаатай харьцуулахад урсгал нэмэгдэхийн хэрээр N утгын бууралт төдийлөн өндөр биш байна. Ascentis Express RP-Amide баганатай харьцуулахад PMP баганын (id 100 × 1.8 мм) салгах өндөр үр ашиг нь сайжруулсан ширхэгийн хэлбэр, хэмжээ, одоогийн ажилд хэрэглэгдэж буй багана савлах нарийн аргад суурилдаг34.
(A) 0.1% TFA-тай 60/40 ACN/H2O-д PMP багана (id 100 x 1.8 мм) дээр авсан Ван Димтерийн график (HETP ба хөдөлгөөнт фазын шугаман хурд). (B) 0.1% TFA-тай 60/40 ACN/H2O-д Ascentis Express RP-Amide багана (id 100 x 1.8 мм) дээр авсан Ван Димтерийн график (HETP ба хөдөлгөөнт фазын шугаман хурд).
Өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографийн аргаар хүний ​​ийлдэс альбумин (HSA) -ын синтетик пептид ба триптик гидролизатын холимогийг ялгах зорилгоор интеркалацилагдсан полистиролын туйлын суурин фазыг бэлтгэж, үнэлэв. Пептидийн хольцын PMP баганын хроматографийн гүйцэтгэл нь салгах үр ашиг, нягтралын хувьд маш сайн байдаг. PMP баганын салгах үр ашиг нь цахиурын ширхэгийн хэмжээ, нүхний хэмжээ, суурин фазын хяналттай синтез, баганын нарийн төвөгтэй баглаа боодлын материал зэрэг хэд хэдэн шалтгаантай холбоотой юм. Өндөр салгах үр ашгаас гадна энэ суурин фазын өөр нэг давуу тал нь өндөр урсгалын хурдтай баганын арын даралт бага байдаг. PMP баганууд нь маш их давтагдах чадвартай бөгөөд пептидийн холимог болон янз бүрийн уургийн триптийн задралд дүн шинжилгээ хийхэд ашиглаж болно. Шингэн хроматографийн аргаар байгалийн гаралтай бүтээгдэхүүн, эмийн ургамлын ханд, мөөгнөөс биоидэвхтэй нэгдлүүдийг ялгахад энэхүү баганыг ашиглахыг зорьж байна. Ирээдүйд PMP баганыг уураг болон моноклональ эсрэгбиемүүдийг ялгах зорилгоор үнэлнэ.
Талбай, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Урвуу фазын хроматографийн пептидийн салгах системийг судлах I хэсэг: Баганын шинж чанарыг тодорхойлох протокол боловсруулах. Талбай, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Урвуу фазын хроматографийн пептидийг салгах системийг судлах I хэсэг: Баганын шинж чанарыг тодорхойлох протокол боловсруулах.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Peptide тусгаарлах системийг урвуу фазын хроматографийн аргаар судлах, I хэсэг: Баганын шинж чанарыг тодорхойлох протокол боловсруулах. Талбай, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Урвуу фазын хроматографийн пептидийг салгах системийг судлах I хэсэг: Баганын шинж чанарын протокол боловсруулах. Талбай, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Урвуу фазын хроматографийн пептидийг салгах системийг судлах I хэсэг: Баганын шинж чанарын протокол боловсруулах.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Peptide тусгаарлах системийг урвуу фазын хроматографийн аргаар судлах, I хэсэг: Баганын шинж чанарыг тодорхойлох протокол боловсруулах.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Халдварт өвчний эмчилгээнд идэвхтэй пептидүүдийг бий болгох арга. Биотехнологи. Амжилт 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Синтетик эмчилгээний пептидүүд: Шинжлэх ухаан ба зах зээл. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Синтетик эмчилгээний пептидүүд: Шинжлэх ухаан ба зах зээл.Vliege P, Lisowski V, Martinez J болон Chreschatyski M. Синтетик эмчилгээний пептидүүд: шинжлэх ухаан ба зах зээл.Vliege P, Lisowski V, Martinez J болон Khreschatsky M. Синтетик эмчилгээний пептидүүд: шинжлэх ухаан ба зах зээл. эмийн нээлт. Өнөөдөр 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Нарийвчилсан протеомик шингэн хроматографи. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Нарийвчилсан протеомик шингэн хроматографи.Ф., Смит РД, Шэн Юү нарыг үзнэ үү. Нарийвчилсан протеомик шингэний хроматографи. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Нарийвчилсан уургийн найрлага 液相色谱。Ф., Смит РД, Шэн Юү нарыг үзнэ үү. Нарийвчилсан протеомик шингэний хроматографи.J. Хроматографи. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. нар. Нарийвчилсан шингэн хроматографи-масс спектрометр нь өргөн суурьтай метаболомик ба протеомикийг хослуулах чадвартай. анус. Чим. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Эмийн хөгжилд UHPLC-ийн үүрэг. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Эмийн хөгжилд UHPLC-ийн үүрэг.Chesnut, SM болон Salisbury, JJ Эмийн хөгжилд UHPLC-ийн үүрэг.Chesnut, SM болон Salisbury, JJ Эмийн хөгжилд UHPLC-ийн үүрэг. J. Sept Шинжлэх ухаан. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Хурдан салгахад зориулсан хэт өндөр даралтын шингэн хроматографийн үндсэн ба практик талууд. Wu, N. & Clausen, AM Хурдан салгахад зориулсан хэт өндөр даралтын шингэн хроматографийн үндсэн ба практик талууд.Wu, N. and Clausen, AM. Хурдан салгах өндөр даралтын шингэний хроматографийн үндсэн ба практик талууд. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Хурдан салгахад зориулсан хэт өндөр даралтын шингэн хроматографийн үндсэн ба практик талууд.Wu, N. and Clausen, AM. Хурдан салгах өндөр даралтын шингэний хроматографийн үндсэн ба практик талууд.J. 9-р сарын шинжлэх ухаан. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelicheff, P. Эмийн хөгжилд хэт өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматографийн хэрэглээ. Wren, SA & Tchelicheff, P. Эмийн хөгжилд хэт өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматографийн хэрэглээ.Рен, SA болон Chelischeff, P. Эмийн хөгжилд хэт өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматографийн хэрэглээ. Wren, SA & Tchelicheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelicheff, P.Рен, SA ба Челишефф, П. Эмийн боловсруулалтад хэт үр дүнтэй шингэн хроматографийн хэрэглээ.J. Хроматографи. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, H. нар. Энтеровирусыг үр дүнтэй цэвэршүүлэх дотоод үе шат өндөртэй усан дахь тос эмульсээс гаргаж авсан цул макро сүвэрхэг гидрогель 71. Химийн. төсөл. Сэтгүүл 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Шингэн хроматографийн протеомикийн үүрэг. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Шингэн хроматографийн протеомикийн үүрэг.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. and Wilkins, JA Proteomics дахь шингэн хроматографийн үүрэг. Ши, Ю., Шиан, Р., Хорват, С. & Вилкинс, ЖА 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Ши, Ю., Шиан, Р., Хорват, С, Вилкинс, Ж.АShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. and Wilkins, JA Proteomics дахь шингэн хроматографийн үүрэг.J. Хроматографи. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вутей, Ж.-Л. & Guillarme, D. Эмчилгээний пептид ба уургийн урвуу фазын шингэн хроматографийн ялгах шинэ чиг хандлага: Онол ба хэрэглээ. & Guillarme, D. Эмчилгээний пептид ба уургийн урвуу фазын шингэн хроматографийн ялгах шинэ чиг хандлага: Онол ба хэрэглээ. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Урвуу фазын шингэн хроматографийн аргаар эмчилгээний пептид ба уураг ялгах шинэ чиг хандлага: онол ба хэрэглээ. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, Д.ба Guillarmé, D. Урвуу фазын шингэний хроматографийн аргаар эмчилгээний пептид ба уураг ялгах шинэ чиг хандлага: онол ба хэрэглээ.Ж.Фарм. Биоанагаахын шинжлэх ухаан. анус. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC RP-RP-HPLC системийг ашиглан пептидийн хоёр хэмжээст тусгаарлалт нь эхний болон хоёр дахь ялгах хэмжигдэхүүнээр өөр өөр рН-тэй. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC RP-RP-HPLC системийг ашиглан пептидийн хоёр хэмжээст тусгаарлалт нь эхний болон хоёр дахь ялгах хэмжигдэхүүнээр өөр өөр рН-тэй.Gilar M., Olivova P., Dali AE болон Gebler JK. Эхний болон хоёр дахь салгах хэмжигдэхүүнд өөр өөр рН-тэй RP-RP-HPLC системийг ашиглан пептидийн хоёр хэмжээст тусгаарлалт.Гилар М., Оливова П., Дали АЕ, Геблер ЖК нар RP-RP-HPLC системийг ашиглан эхний болон хоёр дахь салгах хэмжигдэхүүнд өөр өөр рН-ийн утгыг ашиглан пептидүүдийг хоёр хэмжээст тусгаарлах. J. Sept Шинжлэх ухаан. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. 2 мкм-ээс бага хэмжээтэй бүрэн сүвэрхэг ба өнгөц сүвэрхэг C18 тоосонцороор савлагдсан өндөр хүчин чадалтай хроматографийн баганын масс дамжуулалт ба кинетик шинж чанарыг судлах. J. Sept Шинжлэх ухаан. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Ургамлын био идэвхит пептидийг тусгаарлах, тодорхойлох, баталгаажуулах сүүлийн үеийн чиг хандлага ба аналитик сорилтууд. анус. Анал амьтан. Химийн. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Амьдралын хаант улсын протеомик ландшафт. Байгаль 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
Де Лука, К. нар. Бэлдмэл шингэний хроматографийн аргаар эмчилгээний пептидийн дараах эмчилгээ. Молекулууд (Базель, Швейцарь) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Холимог горимын хроматографи ба биополимеруудад хэрэглэх. Yang, Y. & Geng, X. Холимог горимын хроматографи ба биополимеруудад хэрэглэх.Ян, Ю. болон Geng, X. Холимог горимын хроматографи ба биополимерт хэрэглэх. Ян, Ю, Гэн, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Холимог горимын хроматографи ба биополимер дахь хэрэглээ.Ян, Ю. ба Ген, X. Холимог горимын хроматографи ба биополимерт хэрэглэх.J. Хроматографи. A 1218(49), 8813–8825 (2011).