Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Та хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй хөтчийн хувилбарыг ашиглаж байна. Хамгийн сайн туршлагын тулд бид танд шинэчлэгдсэн хөтчийг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр Тохиромжтой байдлын горимыг идэвхгүй болгох). Үүнээс гадна, тасралтгүй дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг хэв маяг болон JavaScriptгүйгээр харуулдаг.
Гурван слайдын тойруулгыг нэг дор харуулна. Өмнөх болон Дараагийн товчлууруудыг ашиглан нэг дор гурван слайдаар шилжих эсвэл төгсгөлд байгаа гулсах товчлууруудыг ашиглан нэг дор гурван слайдаар шилжих боломжтой.
Сүвэрхэг цахиурын хэсгүүдийг өргөн нүх сүвтэй хэсгүүдийг гаргаж авахын тулд зарим өөрчлөлтийг оруулан золь-гелийн аргаар бэлтгэсэн. Эдгээр хэсгүүдийг урвуу гинжин дамжуулалт-фрагментация (RAFT) полимержилтээр N-фенилмалеимид интеркализат полиамид гарган авахын тулд N-фенилмалеимид интеркализат полиамид гарган авахын тулд N-фенилмалеимид-метилвинил изоцианат (PMI) болон стиролоор деривативжуулсан. Стирол (PMP) хөдөлгөөнгүй фаз. Нарийн цооногтой зэвэрдэггүй ган багануудыг (100 × 1.8 мм дотоод диаметртэй) зутан савлагаатай савласан. PMP баганын хроматографийн гүйцэтгэлийг таван пептид (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu амин хүчлийн энкефалин) болон хүний ​​сийвэнгийн альбумины триптик гидролизат (HAS)-аас бүрдсэн синтетик пептидийн холимгийг ялгахын тулд үнэлсэн. Хамгийн оновчтой элюцийн нөхцөлд пептидийн холимогтой хавтангийн онолын тоо 280,000 хавтан/кв.м хүрсэн. Боловсруулсан баганын ялгах гүйцэтгэлийг арилжааны Ascentis Express RP-Amide баганатай харьцуулж үзэхэд PMP баганын ялгах үр ашиг нь ялгах үр ашиг болон нягтралын хувьд арилжааны баганаас илүү байсан нь ажиглагдсан.
Сүүлийн жилүүдэд биофармацевтикийн салбар зах зээлийн эзлэх хувь мэдэгдэхүйц нэмэгдэж, дэлхийн зах зээл өргөжиж байна. Биофармацевтикийн салбарын огцом өсөлтийн улмаас1,2,3 пептид болон уургийн шинжилгээ хийх хэрэгцээ маш их байна. Зорилтот пептидээс гадна пептидийн нийлэгжилтийн явцад янз бүрийн хольц үүсдэг тул пептидийн хүссэн цэвэр байдлыг авахын тулд хроматографийн цэвэршүүлэлт шаардлагатай байдаг. Нэг дээжинд илрэх боломжтой олон тооны зүйл байдаг тул биеийн шингэн, эд, эс дэх уургийн шинжилгээ, шинж чанарыг тодорхойлох нь маш хэцүү ажил юм. Массын спектрометр нь пептид болон уургийн дарааллыг тогтоох үр дүнтэй хэрэгсэл боловч ийм дээжийг массын спектрометрт шууд оруулбал ялгах нь хангалтгүй байх болно. Энэ асуудлыг MS шинжилгээний өмнө шингэн хроматографи (LC) хийснээр шийдэж болох бөгөөд энэ нь тодорхой хугацаанд массын спектрометрт орж буй аналитийн хэмжээг бууруулна4,5,6. Үүнээс гадна, аналитууд шингэн фазын ялгах үед нарийн бүсэд төвлөрч, улмаар эдгээр аналитуудыг төвлөрүүлж, MS илрүүлэх мэдрэмжийг нэмэгдүүлдэг. Шингэн хроматографи (ШХ) нь сүүлийн арван жилд мэдэгдэхүйц хөгжсөн бөгөөд протеомик шинжилгээнд өргөн хэрэглэгддэг арга болсон7,8,9,10.
Урвуу фазын шингэн хроматографи (RP-LC) нь октадецилээр өөрчлөгдсөн цахиурын давхар исэл (ODS)-ийг хөдөлгөөнгүй фаз болгон ашиглан пептидийн хольцыг цэвэршүүлэх, ялгахад өргөн хэрэглэгддэг11,12,13. Гэсэн хэдий ч тэдгээрийн нарийн төвөгтэй бүтэц, амфотерик шинж чанараас шалтгаалан14,15 RP хөдөлгөөнгүй фазууд нь пептид ба уургийг хангалттай салгаж чадахгүй. Тиймээс туйлширсан ба туйлширсан бус хэлтэрхийтэй пептид ба уургийн шинжилгээнд эдгээр аналитикуудыг харилцан үйлчлэлцэж, хадгалахын тулд тусгайлан боловсруулсан хөдөлгөөнгүй фазууд шаардлагатай16. Олон төрлийн харилцан үйлчлэлийг санал болгодог холимог хроматографи нь пептид, уураг болон бусад нарийн төвөгтэй хольцыг ялгахад RP-LC-ийн өөр хувилбар байж болно. Хэд хэдэн холимог төрлийн хөдөлгөөнгүй фазуудыг бэлтгэж, эдгээр хөдөлгөөнгүй фазаар дүүргэсэн багануудыг пептид ба уургийг ялгахад ашигласан17,18,19,20,21. Туйл болон туйл бус бүлгүүд байдаг тул холимог горимын суурин фазууд (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, туйл хоорондын интеркаляци/RPLC) нь пептид ба уургийг ялгахад тохиромжтой22,23,24,25,26,27,28. , ковалент холбоо бүхий туйл хоорондын бүлэгтэй туйл хоорондын интеркаляцитай суурин фазууд нь туйл болон туйл бус аналитуудын хувьд сайн ялгах чадвар, өвөрмөц сонгомол чанарыг харуулдаг, учир нь ялгаруулалт нь аналит ба суурин фазын харилцан үйлчлэлээс хамаардаг. Олон горимын харилцан үйлчлэл 29,30,31,32. Саяхан Жан нар 30 полиаминуудын бехенил төгсгөлтэй суурин фазуудыг гаргаж авч, нүүрсустөрөгч, антидепрессант, флавоноид, нуклеозид, эстроген болон бусад зарим аналитуудыг амжилттай ялгасан. Туйлд суулгагдсан суурин материал нь туйл болон туйл бус бүлгүүдтэй тул пептид ба уургийг гидрофобик ба гидрофилийн хэсгүүдэд ялгахад ашиглаж болно. Туйлын шугаман багана (жишээ нь, амидын шугаман баганатай C18 багана) нь Ascentis Express RP-Amide багана гэсэн худалдааны нэрээр худалдаалагдаж байгаа боловч эдгээр баганыг зөвхөн амин 33-ын шинжилгээнд ашиглаж ирсэн.
Одоогийн судалгаанд туйлын суулгацын хөдөлгөөнгүй фаз (N-фенилмалеимид, суулгацын полистирол)-ыг бэлтгэж, пептидийн ялгарал болон триптик HSA задралд үнэлсэн. Хөдөлгөөнгүй фазыг бэлтгэхэд дараах стратегийг ашигласан. Сүвэрхэг цахиурын хэсгүүдийг өмнөх нийтлэлүүдэд дурдсан журмын дагуу бэлтгэсэн бөгөөд бэлтгэлийн схем 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39-д зарим өөрчлөлт оруулсан. Мочевин, полиэтилен гликол (PEG), TMOS болон усан цууны хүчлийн харьцааг тохируулж, том нүх сүвтэй цахиурын хэсгүүдийг гаргаж авсан. Хоёрдугаарт, шинэ фенилмалеимид-метилвинил изоцианатын лиганд нийлэгжүүлж, түүний деривативжуулсан цахиурын хэсгүүдийг туйлын суулгацын хөдөлгөөнгүй фазуудыг бэлтгэхэд ашигласан. Олж авсан хөдөлгөөнгүй фазыг оновчтой савлах схемийн дагуу зэвэрдэггүй ган багана (дотоод диаметр 100 × 1.8 мм)-д савласан. Баганын савлагааг механик чичиргээгээр багана дотор жигд давхаргыг хангахад тусалдаг. Савласан баганыг таван пептид (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин пептид) болон хүний ​​сийвэнгийн альбумины (HSA) триптик гидролизатуудаас бүрдсэн пептидийн холимогийг ялгахад үнэлсэн. Пептидийн холимог болон HSA триптик задрал нь сайн нягтралтай, үр ашигтайгаар ялгардаг болохыг ажигласан. PMP баганын ялгах үр ашгийг Ascentis Express RP-Amide баганынхтай харьцуулсан. Пептид ба уургууд нь PMP багана дээр сайн нягтралтай, өндөр ялгах үр ашигтай байдаг бөгөөд PMP баганын ялгах үр ашиг нь Ascentis Express RP-Amide баганыхаас өндөр байдаг болохыг ажигласан.
PEG (полиэтилен гликол), мочевин, цууны хүчил, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трипсин, хүний ​​сийвэнгийн альбумин (HSA), аммонийн хлорид, мочевин, гексаметилметакрилойлдисилазан (HMDS), метакрилойл хлорид (MC), стирол, 4-гидрокси-TEMPO, бензоил хэт исэл (BPO), HPLC-д зориулсан ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол ба ацетон. Sigma-Aldrich компани (Сент-Луис, Миссури, АНУ).
Мочевин (8 гр), полиэтилен гликол (8 гр) болон 8 мл 0.01 Н цууны хүчлийн холимгийг 10 минутын турш хутгаж, мөсөөр хөргөх дор 24 мл TMOS нэмсэн. Урвалын хольцыг зэвэрдэггүй ган автоклавт 40°C-д 6 цаг, дараа нь 120°C-д 8 цаг халаана. Усыг шүүж, үлдэгдлийг 70°C-д 12 цагийн турш хатаана. Хатаасан зөөлөн блокуудыг жигд нунтаглаж, 550°C-д зууханд 12 цагийн турш шатаана. Бөөмийн хэмжээ, нүх сүвний хэмжээ, гадаргуугийн талбайн давтагдах чадварыг шалгахын тулд гурван багц бэлтгэж, шинжилсэн.
Полистирол гинжин хэлхээний туйлын бүлэг ба хөдөлгөөнгүй фаз. Бэлтгэх журмыг доор тайлбарлав.
N-фенилмалеимид (200 мг) болон метил винил изоцианат (100 мг)-ийг усгүй толуолд уусгаж, дараа нь фенилмалеимид болон метил винил изоцианат (PMCP)-ийн сополимерийг гарган авахын тулд урвалын колбонд 0.1 мл 2,2′-азоиизобутиронитрил (AIBN) нэмсэн. ) Холимгийг 60°C-д 3 цагийн турш халааж, шүүж, 40°C-д зууханд 3 цагийн турш хатаасан.
Хатаасан цахиурын хэсгүүдийг (2 г) хуурай толуолд (100 мл) тарааж, хутгаж, 500 мл-ийн дугуй ёроолтой колбонд 10 минутын турш хэт авиагаар шүүсэн. PMCP (10 мг)-ийг толуолд уусгаж, нэмэлт юүлүүрээр дамжуулан урвалын колбонд дуслаар нэмсэн. Холимгийг 100°C-д 8 цагийн турш буцаан шүүж, шүүж, ацетоноор угааж, 60°C-д 3 цагийн турш хатаасан. Дараа нь PMCP (100 г)-тай холбоотой цахиурын хэсгүүдийг толуолд (200 мл) уусгаж, катализатор болгон 100 мкл дибутилтин дилауратыг байрлуулж 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) нэмсэн. Холимгийг 50°C-д 8 цагийн турш хутгаж, шүүж, 50°C-д 3 цагийн турш хатаасан.
Стирол (1 мл), бензоил хэт исэл BPO (0.5 мл) болон TEMPO-PMCP (1.5 г)-д холбогдсон цахиурын хэсгүүдийг толуолд тарааж, азотоор цэвэрлэсэн. Стиролын полимержилтийг 100°C-д 12 цагийн турш явуулсан. Үүссэн бүтээгдэхүүнийг метанолоор угааж, 60°C-д хонуулж хатаасан. Урвалын ерөнхий схемийг Зураг 1-т үзүүлэв.
Дээжийг 10-3 Торр-оос бага үлдэгдэл даралт гартал 393 К-д 1 цагийн турш хийгүйжүүлсэн. Нийт нүх сүвний эзэлхүүнийг тодорхойлохын тулд P/P0 = 0.99 харьцангуй даралттай үед шингээгдсэн N2-ийн хэмжээг ашигласан. Цэвэр ба лиганд холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн морфологийг сканнердах электрон микроскоп (Hitachi High Technologies, Токио, Япон) ашиглан судалсан. Хуурай дээжийг (цэвэр цахиур ба лиганд холбогдсон цахиурын хэсгүүд) нүүрстөрөгчийн тууз ашиглан хөнгөн цагаан саваа дээр байрлуулсан. Q150T шүршигч төхөөрөмж ашиглан дээжинд алтыг хуримтлуулж, дээжинд 5 нм зузаантай Au давхаргыг хуримтлуулсан. Энэ нь бага хүчдэлийн процессын үр ашгийг сайжруулж, хүйтэн шүрших нарийн боломжийг олгодог. Элементийн шинжилгээг Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 элементийн найрлагын анализатор ашиглан хийсэн. Бөөмийн хэмжээний тархалтыг авахын тулд Malvern бөөмийн хэмжээний анализатор (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 ашигласан. Бүрээгүй цахиурын хэсгүүд болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийг (тус бүр 5 мг) 5 мл изопропанолд уусгаж, 10 минутын турш хэт авиагаар шүүж, 5 минутын турш хутгаж, Мастерсайзер оптик вандан дээр байрлуулсан. Термогравиметрийн шинжилгээг 30-800 °C температурын хязгаарт минутанд 5 °C хурдтайгаар явуулдаг.
Хэмжээтэй (ID 100 × 1.8 мм) шилэн ширхэгтэй доторлогоотой нарийн нүхтэй зэвэрдэггүй ган багануудыг 31-р лавлагаатай ижил аргаар зутан дүүргэх аргаар савласан. Зэвэрдэггүй ган багана (шилэн доторлогоотой, ID 100 × 1.8 мм) болон 1 µм фрит агуулсан гаралтыг зутан савлах машинд (Alltech Deerfield, IL, USA) холбосон. Хөдөлгөөнгүй фазын суспензийг 150 мг хөдөлгөөнгүй фазыг 1.2 мл метанолд суспензлээд, нөөцлүүрийн баганад хийж бэлтгэнэ. Метанолыг зутан уусгагч болон хяналтын уусгагч болгон ашигласан. Баганыг 10 минутын турш 100 MP, 15 минутын турш 80 MP, 30 минутын турш 60 MP даралтын дарааллаар савлана. Савлах процесст механик чичиргээнд зориулж хоёр хийн хроматографийн баганын чичиргээг (Alltech, Deerfield, IL, USA) ашигласан бөгөөд ингэснээр баганыг жигд савлах боломжтой болно. Утас гэмтэхээс сэргийлж зутан савлагчийг хааж, даралтыг аажмаар суллана. Баганыг шивхний цоргоноос салгаж, оролтын нүхэнд өөр нэг холбох хэрэгслийг холбож, LC системд холбож, ажиллагааг нь шалгасан.
Захиалгат MLC-г LC насос (10AD Shimadzu, Япон), 50 нл шахах гогцоотой дээж авагч (Valco (USA) C14 W.05), мембраны хийгүйжүүлэгч (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS хялгасан судасны цонх ашиглан бүтээсэн. Илрүүлэгч төхөөрөмж (UV-2075) болон паалантай бичил багана. Нэмэлт баганын тэлэлтийн нөлөөллийг багасгахын тулд маш нарийн, богино холбох хоолой ашиглана уу. Баганыг дүүргэсний дараа 1/16″ бууруулагч уулзварын гаралтын хэсэгт хялгасан судас (50 µm id 365) суурилуулж, бууруулагч уулзварын хялгасан судас (50 µm) суурилуулна. Өгөгдөл цуглуулах болон хроматограмм боловсруулалтыг Multichro 2000 програм хангамж ашиглан гүйцэтгэдэг. 254 нм-д судалгаанд хамрагдсан аналитуудын хэт ягаан туяаны шингээлтийг 0 хэмд хянасан. Хроматографийн өгөгдлийг OriginPro8 (Нортгемптон, MA) ашиглан шинжилсэн.
Хүний сийвэнгийн альбумин, лиофилжүүлсэн нунтаг, ≥ 96% (агарозын гель электрофорез) 3 мг-ийг трипсин (1.5 мг), 4.0 М мочевин (1 мл) болон 0.2 М аммонийн бикарбонат (1 мл)-тэй хольж хутгана. Уусмалыг 10 минут хутгаж, 37°C-д 6 цагийн турш усан ваннд байлгаад, дараа нь 1 мл 0.1% TFA-аар унтраана. Уусмалыг шүүж, 4°C-аас доош температурт хадгална.
PMP баганад пептид ба триптик дайжест HSA-ийн холимогийг ялгах ажлыг тусад нь үнэлсэн. PMP баганаар тусгаарлагдсан пептид ба HSA-ийн холимогийн триптик гидролизийг шалгаж, үр дүнг Ascentis Express RP-Amide баганатай харьцуулна уу. Онолын хавтангийн тоог дараах тэгшитгэлийг ашиглан тооцоолно:
Цэвэр цахиурын хэсгүүд болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн SEM зургийг Зураг 2-т үзүүлэв. Цэвэр цахиурын хэсгүүдийн SEM зургууд (A, B) нь өмнөх судалгаануудтай харьцуулахад бөөмс нь сунасан эсвэл жигд бус тэгш хэмтэй бөмбөрцөг хэлбэртэй байгааг харуулж байна. Лиганд (C, D)-ээр холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн гадаргуу нь цэвэр цахиурын хэсгүүдийнхээс илүү гөлгөр бөгөөд энэ нь цахиурын хэсгүүдийн гадаргууг бүрхсэн полистирол гинжтэй холбоотой байж болох юм.
Цэвэр цахиурын хэсгүүд (A, B) болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн (C, D) сканнердах электрон микрографууд.
Цэвэр цахиурын бөөмс ба лигандтай холбогдсон цахиурын бөөмсийн хэмжээний тархалтыг Зураг 2. 3(A)-д үзүүлэв. Эзлэхүүний бөөмсийн хэмжээний тархалтын муруй нь химийн өөрчлөлтийн дараа цахиурын бөөмсийн хэмжээ нэмэгдсэнийг харуулав (Зураг 3A). Одоогийн судалгаа болон өмнөх судалгааны цахиурын бөөмсийн хэмжээний тархалтын өгөгдлийг Хүснэгт 1(A)-д харьцуулсан болно. PMP-ийн эзлэхүүний бөөмсийн хэмжээ d(0.5) нь 3.36 µm байсан бөгөөд бидний өмнөх судалгаанд (полистирол холбогдсон цахиурын бөөмс)34 ad(0.5) утга 3.05 µm байсан. Урвалын холимог дахь PEG, мочевин, TMOS болон цууны хүчлийн харьцаа өөрчлөгдсөний улмаас энэ багцын бөөмсийн хэмжээний тархалт өмнөх судалгаатай харьцуулахад илүү нарийссан. PMP фазын бөөмсийн хэмжээ нь бидний өмнө нь судалж байсан полистирол холбогдсон цахиурын бөөмсийн фазынхаас арай том байна. Энэ нь цахиурын хэсгүүдийг стиролоор гадаргуугийн функциональжуулахад цахиурын гадаргуу дээр зөвхөн полистирол давхарга (0.97 µм) хуримтлагдсан бол PMP үе шатанд давхаргын зузаан 1.38 µм байсан гэсэн үг юм.
Цэвэр цахиурын хэсгүүд болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн ширхэгийн хэмжээний тархалт (A) ба нүх сүвний хэмжээний тархалт (B).
Энэхүү судалгаанд ашигласан цахиурын хэсгүүдийн нүх сүвний хэмжээ, нүх сүвний эзэлхүүн, гадаргуугийн талбайг Хүснэгт 1 (B)-д үзүүлэв. Цэвэр цахиурын хэсгүүд болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн PSD профайлыг Зураг 3(B)-д үзүүлэв. Үр дүнг бидний өмнөх судалгаатай харьцуулж болно34. Цэвэр болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн нүх сүвний хэмжээ тус тус 310 Å ба 241 Å байсан нь химийн өөрчлөлт хийсний дараа нүх сүвний хэмжээ Хүснэгт 1 (B)-д үзүүлсэн шиг 69 Å-ээр буурсан бөгөөд шилжилтийн муруйг Зурагт үзүүлэв. Одоогийн судалгаанд цахиурын хэсгүүдийн гадаргуугийн талбай нь 116 м2/г бөгөөд энэ нь бидний өмнөх судалгаатай (124 м2/г) харьцуулж болно. Хүснэгт 1(B)-д үзүүлсэнчлэн химийн өөрчлөлт хийсний дараа цахиурын хэсгүүдийн гадаргуугийн талбай (м2/г) мөн 116 м2/г-аас 105 м2/г болж буурсан байна.
Хөдөлгөөнгүй фазын элементийн шинжилгээний үр дүнг Хүснэгт 2-т үзүүлэв. Одоогийн хөдөлгөөнгүй фазын нүүрстөрөгчийн агууламж 6.35% байгаа нь бидний өмнөх судалгаанаас (полистиролтой холбоотой цахиурын хэсгүүд тус тус 7.93%35 ба 10.21%) бага байна. 42. SP бэлтгэхэд стиролоос гадна фенилмалеимид метил винил изоцианат (PCMP) болон 4-гидрокси-TEMPO зэрэг зарим туйлын лигандуудыг ашигласан тул одоогийн хөдөлгөөнгүй фазын нүүрстөрөгчийн агууламж доор байна. Одоогийн хөдөлгөөнгүй фазын азотын жингийн хувь нь өмнөх судалгаануудад 0.1735 ба 0.85% байсантай харьцуулахад 2.21% байна42. Энэ нь одоогийн хөдөлгөөнгүй фаз нь фенилмалеимидээс болж азотын жингийн өндөр хувьтай гэсэн үг юм. Үүнтэй адилаар, (4) ба (5) бүтээгдэхүүнүүд нь тус тус 2.7% ба 2.9% нүүрстөрөгчийн агууламжтай байдаг бол эцсийн бүтээгдэхүүн (6) нь 6.35% нүүрстөрөгчийн агууламжтай байна. PMP-ийн хөдөлгөөнгүй үе шатанд жин хасах туршилтыг хийхийн тулд термогравиметрийн шинжилгээ (TGA) ашигласан бөгөөд TGA муруйг Зураг 4-т үзүүлэв. TGA муруй нь жин хасах 8.6% байгааг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь нүүрстөрөгчийн агууламжтай (6.35%) сайн тохирч байна, учир нь лигандууд нь зөвхөн C2 төдийгүй N, O, H2 агуулдаг.
Лиганд фенилмалеимид-метилвинил изоцианатыг цахиурын хэсгүүдийн гадаргууг өөрчлөх зорилгоор сонгосон, учир нь түүний туйлын фенилмалеимид ба винилизоцианатын бүлгүүд байдаг. Винил изоцианатын бүлгүүд нь амьд радикал полимержилтээр стиролтой урвалд орж болно. Хоёр дахь шалтгаан нь аналиттай дунд зэргийн харилцан үйлчлэлцдэг, аналит ба хөдөлгөөнгүй фазын хооронд хүчтэй электростатик харилцан үйлчлэлцдэггүй бүлгийг оруулах явдал юм, учир нь фенилмалеимид хэсэг нь хэвийн рН-д виртуал цэнэггүй байдаг. Хөдөлгөөнгүй фазын туйлшралыг стиролын оновчтой хэмжээ болон чөлөөт радикал полимержилтийн урвалын хугацаагаар хянаж болно. Урвалын эцсийн алхам (чөлөөт радикал полимержилт) нь хөдөлгөөнгүй фазын туйлшралыг өөрчилдөг тул чухал юм. Эдгээр хөдөлгөөнгүй фазууд дахь нүүрстөрөгчийн агууламжийг шалгахын тулд элементийн шинжилгээ хийсэн. Стиролын хэмжээ болон урвалын хугацааг нэмэгдүүлэх нь хөдөлгөөнгүй фазын нүүрстөрөгчийн агууламжийг нэмэгдүүлдэг бөгөөд эсрэгээрээ байдаг нь ажиглагдсан. Стиролын өөр өөр концентрацитай бэлтгэсэн SPs нь өөр өөр нүүрстөрөгчийн ачаалалтай байдаг. Үүнтэй адилаар эдгээр хөдөлгөөнгүй фазуудыг зэвэрдэггүй ган баганан дээр байрлуулж, тэдгээрийн хроматографийн шинж чанаруудыг (сонголт, нягтрал, N утга гэх мэт) шалгасан. Эдгээр туршилтуудад үндэслэн хяналттай туйлшрал болон аналитийг сайн хадгалах боломжийг олгохын тулд PMP хөдөлгөөнгүй фазыг бэлтгэх оновчтой найрлагыг сонгосон.
Мөн PMP баганыг хөдөлгөөнт фазын багтаамжийг ашиглан пептидийн таван холимог (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин-энкефалин)-ийн шинжилгээнд үнэлсэн. 60/40 (v/v) ACN/ус (0.1% TFA) нь 80 мкл/мин урсгалын хурдтай байна. Хамгийн оновчтой элюцийн нөхцөлд (200,000 хавтан/м2) багана тус бүрийн онолын хавтангийн тоо (N) (100 × 1.8 мм) 20,000 ± 100 байна. Гурван PMP баганын N утгыг Хүснэгт 3-т, хроматограммыг Зураг 5А-д үзүүлэв. PMP баганад өндөр урсгалын хурдтай (700 мкл/мин) хурдан шинжилгээ хийсэн бөгөөд нэг минутын дотор таван пептид ялгарсан, багана бүрт 13,500 ± 330 N утга (100 x 1.8 мм диаметртэй) маш сайн байсан бөгөөд энэ нь 135,000 хавтан/м2-той тэнцүү юм (Зураг 5B). Дахин боловсруулалтыг шалгахын тулд ижил хэмжээтэй гурван баганыг (дотоод диаметр 100 x 1.8 мм) PMP суурин фазын гурван өөр багцаар дүүргэсэн. Аналитуудыг багана бүрт ижил туршилтын хольцыг оновчтой ялгах нөхцөл, онолын хавтангийн тоо N, хадгалах хугацааг ашиглан ялгаж тэмдэглэсэн. PMP баганын дахин боловсруулалтын өгөгдлийг Хүснэгт 4-т үзүүлэв. Хүснэгт 3-т үзүүлсэн шиг PMP баганын дахин боловсруулалт нь маш бага %RSD утгатай сайн хамааралтай байв.
PMP багана (B) болон Ascentis Express RP-Amide багана (A) дээрх пептидийн хольцыг ялгах, хөдөлгөөнт фаз 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP баганын хэмжээс (100 x 1.8 мм id), шинжилгээ. Нэгдлүүдийн ялгаруулах дараалал: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) ба 5 (лейкийн хүчил энкефалин).
Хүний сийвэнгийн альбумины триптик гидролизатын HPLC-ээр ялгах PMP баганыг (дотоод диаметр 100 x 1.8 мм) үнэлсэн. Зураг 6-д үзүүлсэн хроматограмм нь дээжийг маш сайн нягтралтайгаар сайн ялгасан болохыг харуулж байна. HSA уусмалыг 100 мкл/мин урсгалын хурд, 70/30 ацетонитрил/усны хөдөлгөөнт фаз болон 0.1% TFA ашиглан шинжилсэн. HSA-ийн задралыг хроматограммд (Зураг 6) үзүүлсэн шиг 17 пептидтэй тохирч буй 17 оргилд хуваасан. HSA гидролизатаас бие даасан оргилуудын ялгах үр ашгийг тооцоолж, утгыг Хүснэгт 5-д үзүүлэв.
HSA триптик гидролизатуудыг PMP багана (дотоод диаметр 100 x 1.8 мм), урсгалын хурд (100 мкл/мин), хөдөлгөөнт фазын 60/40 ацетонитрил/ус, 0.1% TFA дээр ялгасан.
энд L нь баганын урт, η нь хөдөлгөөнт фазын зуурамтгай чанар, ΔP нь баганын арын даралт, u нь хөдөлгөөнт фазын шугаман хурд юм. PMP баганын нэвчилт нь 2.5 × 10–14 м2, урсгалын хурд нь 25 мкл/мин, 60/40 v/v ашигласан. ACN/ус. PMP баганын нэвчилт (ID 100 × 1.8 мм) нь бидний өмнөх 34-р лавлагааны судалгаатай төстэй байсан. Өнгөц сүвэрхэг хэсгүүдээр дүүргэсэн баганын нэвчилт нь 1.7 × 10 .6 мкм, 5 мкм хэсгүүдийн хувьд 2.5 × 10-14 м2 байна43. Тиймээс PMP фазын нэвчилт нь 5 мкм хэмжээтэй цөм бүрхүүлийн хэсгүүдийн нэвчилттэй төстэй юм.
энд Wx нь хлороформоор дүүргэсэн баганын масс, Wy нь метанолоор дүүргэсэн баганын масс, ρ нь уусгагчийн нягтрал юм. Метанолын нягтрал (ρ = 0.7866) ба хлороформын нягтрал (ρ = 1.484). Цахиур-C18 бөөмийн багана (100 × 1.8 мм ID)34 болон бидний өмнө нь судалсан C18-мочевин31 баганын нийт сүвэрхэг чанар нь тус тус 0.63 ба 0.55 байв. Энэ нь мочевин лиганд байгаа нь хөдөлгөөнгүй фазын нэвчилтийг бууруулдаг гэсэн үг юм. Нөгөөтэйгүүр, PMP баганын нийт сүвэрхэг чанар (дотоод диаметр 100 × 1.8 мм) нь 0.60 байна. PMP багана нь C18 холбогдсон цахиурын бөөмсөөр дүүргэсэн баганаас бага нэвчилттэй байдаг, учир нь C18 төрлийн хөдөлгөөнгүй фазуудад C18 лигандууд нь цахиурын бөөмстэй шугаман гинжин хэлхээнд холбогддог бол полистирол төрлийн хөдөлгөөнгүй фазуудад бөөмсийн эргэн тойронд харьцангуй зузаан полимер үүсдэг. А давхарга. Ердийн туршилтад баганын сүвэрхэг чанарыг дараах байдлаар тооцоолно.
Зураг 7А, В дээр PMP багана (id 100 x 1.8 мм) болон Ascentis Express RP-Amide багана (id 100 x 1.8 мм)-ийн хувьд ижил элюцийн нөхцөлд, хоёр багана дээр 60/40 ACN/H2O болон 0.1% TFA 20 µl/min-ээс 800 µl/min хүртэлх Ван Деемтерийн графикийг харуулав. Хамгийн оновчтой урсгалын хурд (80 µl/мин) дахь HETP-ийн хамгийн бага утга нь PMP багана болон Ascentis Express RP-Amide баганын хувьд тус тус 2.6 µm ба 3.9 µm байв. HETP-ийн утга нь PMP баганын (100 x 1.8 мм id) тусгаарлах үр ашиг нь худалдаанд байгаа Ascentis Express RP-Amide багана (100 x 1.8 мм id)-ээс хамаагүй өндөр болохыг харуулж байна. Зураг 7(A)-д үзүүлсэн ван Деемтерийн графикаас харахад N утгын бууралт нь бидний өмнөх судалгаатай харьцуулахад урсгал нэмэгдэхийн хэрээр мэдэгдэхүйц өндөр биш байна. Ascentis Express RP-Amide баганатай харьцуулахад PMP баганын өндөр ялгах үр ашиг (id 100 × 1.8 мм) нь сайжруулсан бөөмийн хэлбэр, хэмжээ болон одоогийн ажилд ашигласан нарийн төвөгтэй багана савлах процедурт үндэслэсэн болно34.
(A) 0.1% TFA бүхий 60/40 ACN/H2O дахь PMP багана (id 100 x 1.8 мм) дээр олж авсан Ван Димтерийн график (HETP ба хөдөлгөөнт фазын шугаман хурд). (B) 0.1% TFA бүхий 60/40 ACN/H2O дахь Ascentis Express RP-Amide багана (id 100 x 1.8 мм) дээр олж авсан Ван Димтерийн график (HETP ба хөдөлгөөнт фазын шугаман хурд).
Өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографид хүний ​​сийвэнгийн альбумин (HSA)-ийн нийлэг пептид ба триптик гидролизатын холимгийг ялгахад зориулж завсрын полистиролын туйлын стационар фазыг бэлтгэж, үнэлсэн. Пептидийн холимогт зориулсан PMP баганын хроматографийн гүйцэтгэл нь ялгах үр ашиг, нягтралын хувьд маш сайн. PMP баганын ялгах үр ашиг сайжирсан нь цахиурын бөөмийн хэмжээ ба нүх сүвний хэмжээ, хөдөлгөөнгүй фазын хяналттай синтез, баганын савлах материалын нарийн төвөгтэй байдал зэрэг хэд хэдэн шалтгаантай холбоотой юм. Өндөр ялгах үр ашгаас гадна энэхүү стационар фазын бас нэг давуу тал нь өндөр урсгалын хурдтай үед бага баганын арын даралт бага байдаг. PMP багана нь өндөр хуулбарлах боломжтой бөгөөд пептидийн холимог болон янз бүрийн уургийн триптик задралыг шинжлэхэд ашиглаж болно. Бид энэ баганыг байгалийн гаралтай бүтээгдэхүүн, эмийн ургамлын ханд, мөөгнөөс шингэн хроматографид био идэвхт нэгдлүүдийг ялгахад ашиглахаар төлөвлөж байна. Ирээдүйд PMP баганыг уураг болон моноклональ эсрэгбиеийг ялгахад үнэлэх болно.
Филд, Ж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х. & Петерссон, П. Урвуу фазын хроматографийн пептид ялгах системийн судалгаа I хэсэг: Баганын шинж чанарыг тодорхойлох протокол боловсруулах. Филд, Ж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х. & Петерссон, П. Урвуу фазын хроматографийн пептид ялгах системийн судалгаа I хэсэг: Баганын шинж чанарыг тодорхойлох протокол боловсруулах.Филд, Ж.К., Оверби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х., болон Петерссон, П. Урвуу фазын хроматографийн аргаар пептид ялгах системийг судлах нь, I хэсэг: Баганын шинж чанарын протокол боловсруулах. Филд, Ж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х. & Петерссон, П. Урвуу фазын хроматографийн пептид ялгах системийн судалгаа I хэсэг: Баганын шинж чанарын протокол боловсруулах. Филд, Ж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х. & Петерссон, П. Урвуу фазын хроматографийн пептид ялгах системийн судалгаа I хэсэг: Баганын шинж чанарын протокол боловсруулах.Филд, Ж.К., Оверби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х., болон Петерссон, П. Урвуу фазын хроматографийн аргаар пептид ялгах системийг судлах нь, I хэсэг: Баганын шинж чанарын протокол боловсруулах.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Гомез, Б. нар. Халдварт өвчнийг эмчлэхэд зориулсан сайжруулсан идэвхтэй пептид үүсгэх аргууд. Биотехнологи. Амжилтууд 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинез, Ж. & Хрестчатиский, М. Синтетик эмчилгээний пептидүүд: Шинжлэх ухаан ба зах зээл. Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинез, Ж. & Хрестчатиский, М. Синтетик эмчилгээний пептидүүд: Шинжлэх ухаан ба зах зээл.Влиеге П, Лисовски В, Мартинез Ж болон Чрещатиски М. Синтетик эмчилгээний пептидүүд: шинжлэх ухаан ба зах зээл.Влиеге П, Лисовски В, Мартинез Ж болон Хрешацкий М. Синтетик эмчилгээний пептидүүд: шинжлэх ухаан ба зах зээл. Эмийн нээлт. Өнөөдөр 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Сие, Ф., Смит, РД & Шен, Ю. Дэвшилтэт протеомик шингэний хроматографи. Сие, Ф., Смит, РД & Шен, Ю. Дэвшилтэт протеомик шингэний хроматографи.Ф., Смит РД болон Шен Ю-г үзнэ үү. Дэвшилтэт протеомын шингэний хроматографи. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Нарийвчилсан уургийн найрлага 液相色谱。Ф., Смит РД болон Шен Ю-г үзнэ үү. Дэвшилтэт протеомын шингэний хроматографи.Хроматографи. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Дэвшилтэт шингэн хроматографи-массын спектрометр нь өргөн хүрээтэй метаболомик ба протеомикийг хослуулах чадвартай. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, СМ & Салисбери, ЖЖ Эмийн хөгжилд UHPLC-ийн үүрэг. Чеснат, СМ & Салисбери, ЖЖ Эмийн хөгжилд UHPLC-ийн үүрэг.Чеснат, СМ болон Салисбери, ЖЖ. Эмийн хөгжилд UHPLC-ийн үүрэг.Чеснат, СМ болон Салисбери, ЖЖ. Эмийн хөгжилд UHPLC-ийн үүрэг. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Ву, Н. & Клаусен, AM Хурдан ялгах зориулалттай хэт өндөр даралтын шингэн хроматографийн үндсэн ба практик талууд. Ву, Н. & Клаусен, AM Хурдан ялгах зориулалттай хэт өндөр даралтын шингэн хроматографийн үндсэн ба практик талууд.Ву, Н. болон Клаусен, AM Хурдан ялгах өндөр даралтын шингэний хроматографийн үндсэн ба практик талууд. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Ву, Н. & Клаусен, AM Хурдан ялгах зориулалттай хэт өндөр даралтын шингэн хроматографийн үндсэн ба практик талууд.Ву, Н. болон Клаусен, AM Хурдан ялгах өндөр даралтын шингэний хроматографийн үндсэн ба практик талууд.J. Есдүгээр сар. Шинжлэх ухаан. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. & Челитчефф, П. Эмийн хөгжилд хэт өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографийн хэрэглээ. Рен, С.А. & Челитчефф, П. Эмийн хөгжилд хэт өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографийн хэрэглээ.Рен, SA болон Челишефф, П. Эмийн хөгжилд хэт өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографийн хэрэглээ. Wren, SA & Tchelicheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Рен, SA & Челитчефф, П.Рен, SA болон Челишефф, П. Эмийн хөгжилд хэт өндөр гүйцэтгэлтэй шингэн хроматографийн хэрэглээ.Хроматографийн сэтгүүл. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. нар. Энтеровирус 71-ийг үр дүнтэй цэвэршүүлэх өндөр дотоод фазтай, усан дахь тосны эмульсээс гаргаж авсан цул макро нүх сүвтэй гидрогель. Химийн. төсөл. Сэтгүүл 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. & Вилкинс, ЖА Протеомик дахь шингэний хроматографийн үүрэг. Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. & Вилкинс, ЖА Протеомик дахь шингэний хроматографийн үүрэг.Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. болон Вилкинс, Ж.А. Протеомик дахь шингэний хроматографийн үүрэг. Ши, Ю., Шиан, Р., Хорват, С. & Вилкинс, ЖА 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Ши, Ю., Шиан, Р., Хорват, С, Вилкинс, Ж.АШи, Ю., Сян, Р., Хорват, К. болон Вилкинс, Ж.А. Протеомик дахь шингэний хроматографийн үүрэг.Хроматографийн сэтгүүл. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вутей, Ж.-Л. & Гуилларме, Д. Эмчилгээний пептид ба уургийг урвуу фазын шингэн хроматографийн аргаар ялгах шинэ чиг хандлага: Онол ба хэрэглээ. & Гуилларме, Д. Эмчилгээний пептид ба уургийг урвуу фазын шингэн хроматографийн аргаар ялгах шинэ чиг хандлага: Онол ба хэрэглээ. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория и приложения. & Гуилларме, Д. Урвуу фазын шингэн хроматографийн аргаар эмчилгээний пептид ба уургийг ялгах шинэ чиг хандлага: онол ба хэрэглээ. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Гуилларме, Д.болон Гуилларме, Д. Урвуу фазын шингэн хроматографийн аргаар эмчилгээний пептид ба уургийг ялгах шинэ чиг хандлага: онол ба хэрэглээ.Эмийн сангийн сэтгүүл. Биоанагаахын шинжлэх ухаан. анус. 69, 9–27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дэйли, А.Э. & Геблер, Ж.К. Эхний болон хоёр дахь тусгаарлах хэмжээсүүдээр өөр өөр рН-тэй RP-RP-HPLC системийг ашиглан пептидийг хоёр хэмжээст ялгах. Гилар, М., Оливова, П., Дэйли, А.Э. & Геблер, Ж.К. Эхний болон хоёр дахь тусгаарлах хэмжээсүүдээр өөр өөр рН-тэй RP-RP-HPLC системийг ашиглан пептидийг хоёр хэмжээст ялгах.Гилар М., Оливова П., Дали А.Е., Геблер Ж.К. Эхний болон хоёр дахь тусгаарлах хэмжээсүүдэд өөр өөр рН-тэй RP-RP-HPLC системийг ашиглан пептидийг хоёр хэмжээст ялгах.Гилар М., Оливова П., Дали А.Е., Геблер Ж.К. RP-RP-HPLC системийг ашиглан эхний болон хоёр дахь ялгах хэмжээсүүдэд өөр өөр рН утгыг ашиглан пептидийг хоёр хэмжээст ялгах. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Феллитти, С. нар. 2 µм-ээс бага хэмжээтэй бүрэн сүвэрхэг болон өнгөц сүвэрхэг C18 хэсгүүдээр дүүргэсэн өндөр хүчин чадалтай хроматографийн баганын массын дамжуулалт ба кинетик шинж чанаруудын судалгаа. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Пиовесана, С. нар. Ургамлын биологийн идэвхт пептидийг ялгах, тодорхойлох, баталгаажуулах чиглэлээрх сүүлийн үеийн чиг хандлага ба аналитик бэрхшээлүүд. анус. Амьтан анал. Химийн. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, ЖБ нар. Амьдралын хаант улсын протеомын ландшафт. Байгаль 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
Де Лука, К. нар. Эмчилгээний пептидийг бэлдмэлийн шингэн хроматографиар боловсруулсны дараах эмчилгээ. Молекулууд (Базель, Швейцарь) 26(15), 4688 (2021).
Ян, Ю. & Гэн, Х. Холимог горимын хроматографи ба түүний биополимерт хэрэглэх нь. Ян, Ю. & Гэн, Х. Холимог горимын хроматографи ба түүний биополимерт хэрэглэх нь.Ян, Ю. болон Гэн, Х. Холимог горимын хроматографи ба түүний биополимерт хэрэглэх нь. Ян, Ю, Гэн, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Ян, Ю. & Ген, Х. Холимог горимын хроматографи ба түүний биополимерт хэрэглэх нь.Ян, Ю. болон Ген, Х. Холимог горимын хроматографи ба түүний биополимерт хэрэглэх нь.Хроматографийн сэтгүүл. A 1218(49), 8813–8825 (2011).