Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Ngoài ra, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Hiển thị đồng thời ba slide dạng băng chuyền. Sử dụng các nút Trước và Tiếp theo để chuyển qua ba slide một lúc, hoặc sử dụng các nút trượt ở cuối để chuyển qua ba slide một lúc.
Các hạt silica xốp được điều chế bằng phương pháp sol-gel với một số sửa đổi để thu được các hạt có lỗ xốp rộng. Các hạt này được dẫn xuất hóa với N-phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate (PMI) và styren thông qua phản ứng trùng hợp chuyển mạch-phân mảnh ngược (RAFT) để tạo ra polyamit xen kẽ N-phenylmaleimide. Pha tĩnh là styren (PMP). Các cột thép không gỉ có đường kính nhỏ (100 × 1,8 mm đường kính trong) được đóng gói bằng hỗn hợp huyền phù. Hiệu suất sắc ký của cột PMP được đánh giá để tách hỗn hợp các peptit tổng hợp gồm năm peptit (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, axit amin Leu enkephalin) và sản phẩm thủy phân trypsin của albumin huyết thanh người (HAS). Trong điều kiện rửa giải tối ưu, số lượng đĩa lý thuyết với hỗn hợp peptide đạt 280.000 đĩa/m². So sánh hiệu suất tách của cột được phát triển với cột Ascentis Express RP-Amide thương mại, người ta nhận thấy hiệu quả tách của cột PMP vượt trội hơn so với cột thương mại về hiệu quả tách và độ phân giải.
Ngành công nghiệp dược phẩm sinh học đã trở thành một thị trường toàn cầu đang phát triển mạnh mẽ với sự gia tăng đáng kể thị phần trong những năm gần đây. Với sự bùng nổ của ngành công nghiệp dược phẩm sinh học1,2,3, nhu cầu phân tích peptide và protein ngày càng lớn. Bên cạnh peptide mục tiêu, nhiều tạp chất được hình thành trong quá trình tổng hợp peptide, do đó cần phải tinh chế bằng phương pháp sắc ký để thu được độ tinh khiết mong muốn của peptide. Phân tích và đặc trưng hóa protein trong dịch cơ thể, mô và tế bào là một nhiệm vụ vô cùng khó khăn do số lượng lớn các chất có thể phát hiện được trong một mẫu duy nhất. Mặc dù phép đo khối phổ là một công cụ hiệu quả để xác định trình tự peptide và protein, nhưng nếu các mẫu như vậy được đưa trực tiếp vào máy đo khối phổ, sự tách biệt sẽ không đạt yêu cầu. Vấn đề này có thể được giải quyết bằng cách thực hiện sắc ký lỏng (LC) trước khi phân tích MS, điều này sẽ làm giảm lượng chất phân tích đi vào máy đo khối phổ tại một thời điểm nhất định4,5,6. Ngoài ra, các chất phân tích có thể tập trung trong một vùng hẹp trong quá trình tách pha lỏng, do đó làm tăng nồng độ các chất phân tích này và tăng độ nhạy của phát hiện MS. Sắc ký lỏng (LC) đã có những bước tiến đáng kể trong thập kỷ qua và trở thành một phương pháp được sử dụng rộng rãi để phân tích protein7,8,9,10.
Sắc ký lỏng pha đảo (RP-LC) được sử dụng rộng rãi để tinh chế và tách hỗn hợp peptit bằng cách sử dụng silica biến tính octadecyl (ODS) làm pha tĩnh11,12,13. Tuy nhiên, do cấu trúc phức tạp và bản chất lưỡng tính của chúng,14,15 các pha tĩnh RP không thể cung cấp sự tách biệt thỏa đáng giữa peptit và protein. Do đó, việc phân tích peptit và protein có các mảnh phân cực và không phân cực đòi hỏi các pha tĩnh được thiết kế đặc biệt để tương tác và giữ lại các chất phân tích này16. Sắc ký hỗn hợp, cung cấp các tương tác đa phương thức, có thể là một giải pháp thay thế cho RP-LC để tách peptit, protein và các hỗn hợp phức tạp khác. Một số pha tĩnh hỗn hợp đã được điều chế và các cột chứa đầy các pha tĩnh này đã được sử dụng để tách peptit và protein17,18,19,20,21. Do sự hiện diện của các nhóm phân cực và không phân cực, các pha tĩnh hỗn hợp (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, xen kẽ phân cực/RPLC) thích hợp cho việc tách peptit và protein22,23,24,25,26,27,28. Các pha tĩnh xen kẽ phân cực với các nhóm phân cực liên kết cộng hóa trị thể hiện khả năng tách tốt và tính chọn lọc độc đáo đối với các chất phân tích phân cực và không phân cực vì sự tách phụ thuộc vào tương tác giữa chất phân tích và pha tĩnh. Tương tác đa phương thức 29,30,31,32. Gần đây, Zhang et al. 30 đã thu được các pha tĩnh kết thúc bằng behenyl của polyamin và đã tách thành công hydrocarbon, thuốc chống trầm cảm, flavonoid, nucleoside, estrogen và một số chất phân tích khác. Vật liệu tĩnh nhúng phân cực có cả nhóm phân cực và không phân cực, do đó nó có thể được sử dụng để tách peptit và protein thành các phần kỵ nước và ưa nước. Các cột phân cực nội tuyến (ví dụ: cột C18 với nhóm amide nội tuyến) có sẵn dưới tên thương mại là cột Ascentis Express RP-Amide, nhưng các cột này chỉ được sử dụng để phân tích amin 33.
Trong nghiên cứu hiện tại, một pha tĩnh nhúng phân cực (N-phenylmaleimide, polystyrene nhúng) đã được chuẩn bị và đánh giá để tách peptide và phân cắt HSA bằng trypsin. Chiến lược sau đây đã được sử dụng để chuẩn bị pha tĩnh. Các hạt silica xốp được chuẩn bị theo các quy trình được mô tả trong các ấn phẩm trước đây của chúng tôi, với một số thay đổi trong sơ đồ chuẩn bị 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Tỷ lệ urê, polyetylen glycol (PEG), TMOS và axit axetic trong nước được điều chỉnh để thu được các hạt silica có kích thước lỗ xốp lớn. Thứ hai, một phối tử phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate mới đã được tổng hợp và các hạt silica được dẫn xuất của nó được sử dụng để chuẩn bị các pha tĩnh nhúng phân cực. Pha tĩnh thu được được đóng gói vào một cột thép không gỉ (đường kính trong 100 × 1,8 mm) theo một sơ đồ đóng gói tối ưu. Việc đóng gói cột được hỗ trợ bằng rung cơ học để đảm bảo một lớp đồng nhất bên trong cột. Cột nhồi được đánh giá khả năng tách hỗn hợp các peptide gồm năm peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptide leucine-enkephalin) và các sản phẩm thủy phân trypsin của albumin huyết thanh người (HSA). Quan sát cho thấy hỗn hợp peptide và sản phẩm thủy phân trypsin của HSA được tách biệt với độ phân giải và hiệu quả tốt. Hiệu quả tách của cột PMP được so sánh với cột Ascentis Express RP-Amide. Kết quả cho thấy peptide và protein có độ phân giải tốt và hiệu quả tách cao trên cột PMP, và hiệu quả tách của cột PMP cao hơn so với cột Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyethylene glycol), urê, axit axetic, trimethoxyorthosilicate (TMOS), trimethylchlorosilane (TMCS), trypsin, albumin huyết thanh người (HSA), amoni clorua, urê, hexamethylmethacryloylsidilazane (HMDS), methacryloyl clorua (MC), styren, 4-hydroxy-TEMPO, benzoyl peroxide (BPO), acetonitrile (ACN) dùng cho HPLC, methanol, 2-propanol và acetone. Công ty Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Hoa Kỳ).
Hỗn hợp gồm urê (8 g), polyetylen glycol (8 g) và 8 ml axit axetic 0,01 N được khuấy đều trong 10 phút, sau đó thêm 24 ml TMOS vào dưới điều kiện làm lạnh bằng đá. Hỗn hợp phản ứng được đun nóng ở 40°C trong 6 giờ và sau đó ở 120°C trong 8 giờ trong nồi hấp bằng thép không gỉ. Nước được gạn bỏ và phần cặn được sấy khô ở 70°C trong 12 giờ. Các khối mềm đã sấy khô được nghiền mịn và nung trong lò ở 550°C trong 12 giờ. Ba mẻ được chuẩn bị và phân tích để kiểm tra tính khả reproducible của kích thước hạt, kích thước lỗ xốp và diện tích bề mặt.
Nhóm phân cực và pha tĩnh cho chuỗi polystyrene. Quy trình chuẩn bị được mô tả bên dưới.
N-phenylmaleimide (200 mg) và methyl vinyl isocyanate (100 mg) được hòa tan trong toluene khan, sau đó thêm 0,1 ml 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) vào bình phản ứng để thu được copolyme của phenylmaleimide và methyl vinyl isocyanate (PMCP). Hỗn hợp được đun nóng ở 60°C trong 3 giờ, lọc và sấy khô trong lò ở 40°C trong 3 giờ.
Các hạt silica khô (2 g) được phân tán trong toluen khô (100 ml), khuấy đều và siêu âm trong 10 phút trong bình đáy tròn 500 ml. PMCP (10 mg) được hòa tan trong toluen và thêm nhỏ giọt vào bình phản ứng bằng phễu nhỏ giọt. Hỗn hợp được đun hồi lưu ở 100°C trong 8 giờ, lọc, rửa bằng axeton và sấy khô ở 60°C trong 3 giờ. Sau đó, các hạt silica liên kết với PMCP (100 g) được hòa tan trong toluen (200 ml), và 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) được thêm vào đó với sự có mặt của 100 μl dibutyltin dilaurate làm chất xúc tác. Hỗn hợp được khuấy ở 50°C trong 8 giờ, lọc và sấy khô ở 50°C trong 3 giờ.
Styren (1 ml), benzoyl peroxide BPO (0,5 ml) và các hạt silica gắn với TEMPO-PMCP (1,5 g) được phân tán trong toluen và sục khí nitơ. Quá trình trùng hợp styren được thực hiện ở 100°C trong 12 giờ. Sản phẩm thu được được rửa bằng metanol và sấy khô qua đêm ở 60°C. Sơ đồ tổng quát của phản ứng được thể hiện trong hình 1.
Các mẫu được khử khí ở 393 K trong 1 giờ cho đến khi đạt được áp suất dư nhỏ hơn 10–3 Torr. Lượng N2 hấp phụ ở áp suất tương đối P/P0 = 0,99 được sử dụng để xác định tổng thể tích lỗ xốp. Hình thái của các hạt silica tinh khiết và silica liên kết phối tử được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử quét (Hitachi High Technologies, Tokyo, Nhật Bản). Các mẫu khô (silica tinh khiết và các hạt silica liên kết phối tử) được đặt trên các thanh nhôm bằng băng dính carbon. Vàng được lắng đọng trên mẫu bằng thiết bị lắng đọng phún xạ Q150T, và một lớp Au dày 5 nm được lắng đọng trên mẫu. Điều này cải thiện hiệu quả của quy trình điện áp thấp và cung cấp khả năng phun lạnh mịn. Phân tích nguyên tố được thực hiện bằng máy phân tích thành phần nguyên tố Thermo Electron (Waltham, MA, Hoa Kỳ) Flash EA1112. Máy phân tích kích thước hạt Malvern (Worcestershire, Anh) Mastersizer 2000 được sử dụng để thu được phân bố kích thước hạt. Các hạt silica không phủ và các hạt silica liên kết phối tử (mỗi loại 5 mg) được phân tán trong 5 ml isopropanol, siêu âm trong 10 phút, khuấy trong 5 phút và đặt trên bàn quang học Mastersizer. Phân tích nhiệt trọng lượng được thực hiện với tốc độ 5 °C mỗi phút trong phạm vi nhiệt độ từ 30 đến 800 °C.
Các cột thép không gỉ có đường kính nhỏ, lót sợi thủy tinh với kích thước (ID 100 × 1,8 mm) được đóng gói bằng phương pháp đổ đầy dạng huyền phù theo cùng quy trình như trong tài liệu tham khảo 31. Cột thép không gỉ (lót thủy tinh, ID 100 × 1,8 mm) và một đầu ra chứa tấm lọc 1 µm được nối với máy đóng gói dạng huyền phù (Alltech Deerfield, IL, USA). Chuẩn bị huyền phù pha tĩnh bằng cách hòa tan 150 mg pha tĩnh trong 1,2 ml metanol và đưa vào cột chứa. Metanol được sử dụng làm dung môi huyền phù và dung môi đối chứng. Đóng gói cột bằng cách áp dụng chuỗi áp suất 100 MPA trong 10 phút, 80 MPA trong 15 phút và 60 MPA trong 30 phút. Quá trình đóng gói sử dụng hai máy rung cột sắc ký khí (Alltech, Deerfield, IL, USA) để rung cơ học nhằm đảm bảo đóng gói cột đồng đều. Đóng máy đóng gói dạng huyền phù và xả áp suất từ ​​từ để tránh làm hỏng dây. Cột được tách khỏi vòi phun bùn và một phụ kiện khác được gắn vào đầu vào và kết nối với hệ thống LC để kiểm tra hoạt động của nó.
Hệ thống sắc ký lỏng vi mô (MLC) tùy chỉnh được chế tạo bằng cách sử dụng bơm LC (10AD Shimadzu, Nhật Bản), bộ lấy mẫu với vòng tiêm 50 nL (Valco (Mỹ) C14 W.05), bộ khử khí màng (Shimadzu DGU-14A) và cửa sổ mao dẫn UV-VIS. Thiết bị dò (UV-2075) và cột vi mô tráng men. Sử dụng các ống nối rất nhỏ và ngắn để giảm thiểu ảnh hưởng của sự giãn nở cột bổ sung. Sau khi đổ đầy cột, lắp một mao dẫn (đường kính trong 50 µm, 365) vào đầu ra của khớp nối giảm 1/16″ và lắp một mao dẫn (50 µm) của khớp nối giảm. Việc thu thập dữ liệu và xử lý sắc ký đồ được thực hiện bằng phần mềm Multichro 2000. Ở bước sóng 254 nm, độ hấp thụ UV của các chất phân tích được theo dõi ở mức 0. Dữ liệu sắc ký được phân tích bằng phần mềm OriginPro8 (Northampton, MA).
Trộn 3 mg albumin huyết thanh người dạng bột đông khô, độ tinh khiết ≥ 96% (điện di trên gel agarose) với 1,5 mg trypsin, 1 ml urê 4,0 M và 1 ml amoni bicacbonat 0,2 M. Khuấy dung dịch trong 10 phút và giữ trong bể nước ở 37°C trong 6 giờ, sau đó làm nguội nhanh bằng 1 ml TFA 0,1%. Lọc dung dịch và bảo quản dưới 4°C.
Quá trình tách hỗn hợp peptide và HSA được thủy phân bằng trypsin trên cột PMP được đánh giá riêng biệt. Kiểm tra quá trình thủy phân bằng trypsin của hỗn hợp peptide và HSA được tách bằng cột PMP và so sánh kết quả với cột Ascentis Express RP-Amide. Số đĩa lý thuyết được tính bằng phương trình sau:
Hình ảnh SEM của các hạt silica nguyên chất và các hạt silica liên kết với phối tử được thể hiện trong Hình 2. Hình ảnh SEM của các hạt silica nguyên chất (A, B) cho thấy hình dạng hình cầu, trong đó các hạt bị kéo dài hoặc có đối xứng không đều so với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Bề mặt của các hạt silica liên kết với phối tử (C, D) mịn hơn so với các hạt silica nguyên chất, điều này có thể là do các chuỗi polystyrene bao phủ bề mặt của các hạt silica.
Ảnh hiển vi điện tử quét của các hạt silica nguyên chất (A, B) và các hạt silica liên kết phối tử (C, D).
Hình 2.3(A) thể hiện sự phân bố kích thước hạt của các hạt silica tinh khiết và các hạt silica liên kết phối tử. Các đường cong phân bố kích thước hạt theo thể tích cho thấy kích thước hạt silica tăng lên sau khi biến đổi hóa học (Hình 3A). Dữ liệu phân bố kích thước hạt silica từ nghiên cứu hiện tại và nghiên cứu trước đó được so sánh trong Bảng 1(A). Kích thước hạt theo thể tích d(0,5) của PMP là 3,36 µm, so với giá trị ad(0,5) là 3,05 µm trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi (các hạt silica liên kết polystyrene)34. Do sự thay đổi tỷ lệ PEG, urê, TMOS và axit axetic trong hỗn hợp phản ứng, sự phân bố kích thước hạt của lô này hẹp hơn so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Kích thước hạt của pha PMP lớn hơn một chút so với pha hạt silica liên kết polystyrene mà chúng tôi đã nghiên cứu trước đó. Điều này có nghĩa là quá trình chức năng hóa bề mặt các hạt silica bằng styren chỉ tạo ra một lớp polystyren (0,97 µm) trên bề mặt silica, trong khi ở pha PMP, độ dày lớp là 1,38 µm.
Phân bố kích thước hạt (A) và phân bố kích thước lỗ xốp (B) của các hạt silica nguyên chất và các hạt silica liên kết phối tử.
Kích thước lỗ xốp, thể tích lỗ xốp và diện tích bề mặt của các hạt silica được sử dụng trong nghiên cứu này được thể hiện trong Bảng 1 (B). Hồ sơ PSD của các hạt silica tinh khiết và các hạt silica liên kết phối tử được thể hiện trong Hình 3(B). Kết quả tương đương với nghiên cứu trước đây của chúng tôi34. Kích thước lỗ xốp của các hạt silica tinh khiết và liên kết phối tử lần lượt là 310 Å và 241 Å, cho thấy sau khi biến đổi hóa học, kích thước lỗ xốp giảm 69 Å, như thể hiện trong Bảng 1 (B), và đường cong dịch chuyển được thể hiện trong Hình. Diện tích bề mặt riêng của các hạt silica trong nghiên cứu hiện tại là 116 m2/g, tương đương với nghiên cứu trước đây của chúng tôi (124 m2/g). Như thể hiện trong Bảng 1(B), diện tích bề mặt (m2/g) của các hạt silica sau khi biến đổi hóa học cũng giảm từ 116 m2/g xuống 105 m2/g.
Kết quả phân tích nguyên tố của pha tĩnh được trình bày trong Bảng 2. Hàm lượng carbon của pha tĩnh hiện tại là 6,35%, thấp hơn so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi (các hạt silica liên kết với polystyrene, lần lượt là 7,93%35 và 10,21%)42. Hàm lượng carbon của pha tĩnh hiện tại thấp hơn là do một số phối tử phân cực như phenylmaleimide methyl vinyl isocyanate (PCMP) và 4-hydroxy-TEMPO đã được sử dụng ngoài styrene trong quá trình điều chế SP. Tỷ lệ phần trăm khối lượng nitơ trong pha tĩnh hiện tại là 2,21% so với 0,1735 và 0,85% trong các nghiên cứu trước đây42. Điều này có nghĩa là pha tĩnh hiện tại có tỷ lệ phần trăm khối lượng nitơ cao do phenylmaleimide. Tương tự, sản phẩm (4) và (5) có hàm lượng carbon lần lượt là 2,7% và 2,9%, trong khi sản phẩm cuối cùng (6) có hàm lượng carbon là 6,35%, như thể hiện trong Bảng 2. Phân tích nhiệt trọng lượng (TGA) được sử dụng trên pha tĩnh của PMP để kiểm tra sự mất khối lượng, và đường cong TGA được thể hiện trong Hình 4. Đường cong TGA cho thấy sự mất khối lượng là 8,6%, phù hợp với hàm lượng carbon (6,35%), vì các phối tử không chỉ chứa C mà còn chứa N, O và H.
Chất phối tử phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate được chọn để biến đổi bề mặt các hạt silica vì các nhóm phenylmaleimide và vinylisocyanate phân cực của nó. Các nhóm vinyl isocyanate có thể tiếp tục phản ứng với styren bằng phản ứng trùng hợp gốc tự do sống. Lý do thứ hai là để đưa vào một nhóm có tương tác vừa phải với chất phân tích và không có tương tác tĩnh điện mạnh giữa chất phân tích và pha tĩnh, vì nhóm phenylmaleimide không có điện tích ảo ở pH bình thường. Độ phân cực của pha tĩnh có thể được kiểm soát bằng lượng styren tối ưu và thời gian phản ứng trùng hợp gốc tự do. Bước cuối cùng của phản ứng (trùng hợp gốc tự do) rất quan trọng vì nó làm thay đổi độ phân cực của pha tĩnh. Phân tích nguyên tố được thực hiện để kiểm tra hàm lượng carbon trong các pha tĩnh này. Người ta nhận thấy rằng việc tăng lượng styren và thời gian phản ứng làm tăng hàm lượng carbon của pha tĩnh và ngược lại. Các pha tĩnh được điều chế với các nồng độ styren khác nhau có hàm lượng carbon khác nhau. Tương tự, các pha tĩnh này được đặt trên các cột thép không gỉ và các đặc tính sắc ký của chúng (độ chọn lọc, độ phân giải, giá trị N, v.v.) đã được kiểm tra. Dựa trên các thí nghiệm này, một thành phần tối ưu để điều chế pha tĩnh PMP đã được lựa chọn nhằm đảm bảo độ phân cực được kiểm soát và khả năng giữ lại tốt chất phân tích.
Cột PMP cũng được đánh giá để phân tích năm hỗn hợp peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) bằng cách sử dụng khả năng của pha động 60/40 (v/v) ACN/nước (0,1% TFA) ở tốc độ dòng chảy 80 µl/min. Trong điều kiện rửa giải tối ưu (200.000 đĩa/m), số đĩa lý thuyết (N) trên mỗi cột (100 × 1,8 mm) là 20.000 ± 100. Giá trị N cho ba cột PMP được thể hiện trong Bảng 3 và sắc ký đồ được thể hiện trong Hình 5A. Phân tích nhanh ở tốc độ dòng chảy cao (700 µl/phút) trên cột PMP, năm peptide được rửa giải trong vòng một phút, giá trị N tuyệt vời là 13.500 ± 330 trên mỗi cột (đường kính 100 x 1,8 mm), tương đương với 135.000 đĩa/m (Hình 5B). Ba cột có cùng kích thước (đường kính trong 100 x 1,8 mm) được đổ đầy với ba lô pha tĩnh PMP khác nhau để kiểm tra khả năng tái lập. Các chất phân tích được ghi lại cho mỗi cột bằng cách tách cùng một hỗn hợp thử nghiệm trên mỗi cột bằng cách sử dụng các điều kiện rửa giải tối ưu, số đĩa lý thuyết N và thời gian lưu giữ. Dữ liệu về khả năng tái lập của các cột PMP được thể hiện trong Bảng 4. Khả năng tái lập của cột PMP tương quan tốt với các giá trị %RSD rất thấp như thể hiện trong Bảng 3.
Tách hỗn hợp peptide trên cột PMP (B) và cột Ascentis Express RP-Amide (A), pha động 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), kích thước cột PMP (100 x 1,8 mm đường kính trong), phân tích thứ tự rửa giải của các hợp chất: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) và 5 (enkephalin axit leucic).
Cột PMP (đường kính trong 100 x 1,8 mm) được đánh giá để tách sản phẩm thủy phân trypsin của albumin huyết thanh người bằng HPLC. Sắc ký đồ trong Hình 6 cho thấy các mẫu được tách biệt tốt với độ phân giải rất cao. Dung dịch HSA được phân tích bằng tốc độ dòng 100 μl/min, pha động gồm 70/30 acetonitrile/nước và 0,1% TFA. Sự phân cắt HSA được chia thành 17 đỉnh, như thể hiện trong sắc ký đồ (Hình 6), tương ứng với 17 peptide. Hiệu suất tách của từng đỉnh riêng lẻ từ sản phẩm thủy phân HSA được tính toán và các giá trị được thể hiện trong Bảng 5.
Sản phẩm thủy phân tryptic của HSA được tách trên cột PMP (đường kính trong 100 x 1,8 mm), tốc độ dòng chảy (100 μl/min), pha động 60/40 acetonitrile/nước và 0,1% TFA.
Trong đó L là chiều dài cột, η là độ nhớt của pha động, ΔP là áp suất ngược của cột và u là vận tốc tuyến tính của pha động. Độ thấm của cột PMP là 2,5 × 10–14 m2, tốc độ dòng chảy là 25 µl/min, tỷ lệ pha ACN/nước là 60/40 v/v. Độ thấm của cột PMP (ID 100 × 1,8 mm) tương tự như nghiên cứu trước đây của chúng tôi (tham khảo số 34). Độ thấm của cột chứa các hạt xốp bề mặt là 1,7×10,6 µm, 2,5×10-14 m2 đối với các hạt 5 µm43. Do đó, độ thấm của pha PMP tương tự như độ thấm của các hạt lõi-vỏ có kích thước 5 μm.
trong đó Wx là khối lượng cột chứa đầy cloroform, Wy là khối lượng cột chứa đầy metanol, và ρ là mật độ của dung môi. Mật độ của metanol (ρ = 0,7866) và cloroform (ρ = 1,484). Tổng độ xốp của cột hạt silica-C18 (100 × 1,8 mm ID)34 và cột C18-ure31 mà chúng tôi đã nghiên cứu trước đây lần lượt là 0,63 và 0,55. Điều này có nghĩa là sự hiện diện của các phối tử urê làm giảm tính thấm của pha tĩnh. Mặt khác, tổng độ xốp của cột PMP (đường kính trong 100 × 1,8 mm) là 0,60. Cột PMP ít thấm hơn cột được đóng gói bằng các hạt silica liên kết C18 vì trong các pha tĩnh loại C18, các phối tử C18 được gắn vào các hạt silica theo chuỗi tuyến tính, trong khi ở các pha tĩnh loại polystyrene, một polyme tương đối dày được hình thành xung quanh các hạt. lớp A. Trong một thí nghiệm điển hình, độ xốp của cột được tính như sau:
Hình 7A, B thể hiện đồ thị Van Deemter cho cột PMP (đường kính trong 100 x 1,8 mm) và cột Ascentis Express RP-Amide (đường kính trong 100 x 1,8 mm) dưới cùng điều kiện rửa giải, 60/40 ACN/H2O và 0,1% TFA, tốc độ dòng từ 20 µl/min đến 800 µl/min trên cả hai cột. Giá trị HETP tối thiểu ở tốc độ dòng tối ưu (80 µl/min) lần lượt là 2,6 µm và 3,9 µm đối với cột PMP và cột Ascentis Express RP-Amide. Các giá trị HETP cho thấy hiệu quả tách của cột PMP (100 x 1,8 mm đường kính trong) cao hơn nhiều so với cột Ascentis Express RP-Amide (100 x 1,8 mm đường kính trong) có bán trên thị trường. Đồ thị van Deemter trong Hình 7(A) cho thấy sự giảm giá trị N không cao hơn đáng kể khi lưu lượng tăng so với nghiên cứu trước đây của chúng tôi. Hiệu quả tách cao hơn của cột PMP (đường kính trong 100 × 1,8 mm) so với cột Ascentis Express RP-Amide dựa trên hình dạng và kích thước hạt được cải thiện cũng như quy trình đóng gói cột tinh vi được sử dụng trong công việc hiện tại34.
(A) Đồ thị Van Deemter (HETP so với vận tốc tuyến tính của pha động) thu được trên cột PMP (đường kính trong 100 x 1,8 mm) trong dung môi 60/40 ACN/H2O với 0,1% TFA. (B) Đồ thị Van Deemter (HETP so với vận tốc tuyến tính của pha động) thu được trên cột Ascentis Express RP-Amide (đường kính trong 100 x 1,8 mm) trong dung môi 60/40 ACN/H2O với 0,1% TFA.
Một pha tĩnh phân cực bằng polystyrene xen kẽ đã được điều chế và đánh giá để tách hỗn hợp các peptide tổng hợp và sản phẩm thủy phân trypsin của albumin huyết thanh người (HSA) trong sắc ký lỏng hiệu năng cao. Hiệu suất sắc ký của cột PMP đối với hỗn hợp peptide rất tốt về hiệu quả tách và độ phân giải. Hiệu quả tách được cải thiện của cột PMP là do một số lý do như kích thước hạt silica và kích thước lỗ xốp, tổng hợp pha tĩnh được kiểm soát và vật liệu đóng gói cột phức tạp. Ngoài hiệu quả tách cao, một ưu điểm khác của pha tĩnh này là áp suất ngược cột thấp ở tốc độ dòng chảy cao. Cột PMP có độ tái lập cao và có thể được sử dụng để phân tích hỗn hợp peptide và sản phẩm thủy phân trypsin của các protein khác nhau. Chúng tôi dự định sử dụng cột này để tách các hợp chất hoạt tính sinh học từ các sản phẩm tự nhiên, chiết xuất từ ​​cây thuốc và nấm trong sắc ký lỏng. Trong tương lai, cột PMP cũng sẽ được đánh giá để tách protein và kháng thể đơn dòng.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Nghiên cứu về hệ thống tách peptide bằng sắc ký pha đảo phần I: Phát triển quy trình đặc trưng hóa cột. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Nghiên cứu về hệ thống tách peptide bằng sắc ký pha đảo phần I: Phát triển quy trình đặc trưng hóa cột.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., và Petersson, P. Nghiên cứu các hệ thống tách peptide bằng sắc ký pha ngược, Phần I: Phát triển quy trình đặc trưng hóa cột. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Nghiên cứu về hệ thống tách peptide bằng sắc ký pha đảo phần I: Phát triển quy trình xác định đặc tính cột. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Nghiên cứu về hệ thống tách peptide bằng sắc ký pha đảo phần I: Phát triển quy trình xác định đặc tính cột.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., và Petersson, P. Nghiên cứu các hệ thống tách peptide bằng sắc ký pha ngược, Phần I: Phát triển quy trình đặc trưng hóa cột.J.色谱法。 1603,113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Phương pháp tạo ra các peptide hoạt tính được cải tiến để điều trị các bệnh truyền nhiễm. Công nghệ sinh học. Thành tựu 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Các peptide trị liệu tổng hợp: Khoa học và thị trường. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Các peptide trị liệu tổng hợp: Khoa học và thị trường.Vliege P, Lisowski V, Martinez J và Chreschatyski M. Peptide trị liệu tổng hợp: khoa học và thị trường.Vliege P, Lisowski V, Martinez J và Khreschatsky M. Peptide trị liệu tổng hợp: khoa học và thị trường. Khám phá thuốc. Ngày nay 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Sắc ký lỏng proteomics tiên tiến. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Sắc ký lỏng proteomics tiên tiến.Xem F., Smith RD và Shen Yu. Sắc ký lỏng proteomics nâng cao. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Thành phần protein nâng cao 液相色谱。Xem F., Smith RD và Shen Yu. Sắc ký lỏng proteomics nâng cao.J. Sắc ký. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Phương pháp sắc ký lỏng-khối phổ tiên tiến có khả năng kết hợp chuyển hóa học và protein học trên diện rộng. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ. Vai trò của UHPLC trong phát triển dược phẩm. Chesnut, SM & Salisbury, JJ. Vai trò của UHPLC trong phát triển dược phẩm.Chesnut, SM và Salisbury, JJ. Vai trò của UHPLC trong phát triển dược phẩm.Chesnut, SM và Salisbury, JJ Vai trò của UHPLC trong phát triển thuốc. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM. Các khía cạnh cơ bản và thực tiễn của sắc ký lỏng siêu cao áp để tách nhanh. Wu, N. & Clausen, AM. Các khía cạnh cơ bản và thực tiễn của sắc ký lỏng siêu cao áp để tách nhanh.Wu, N. và Clausen, AM. Các khía cạnh cơ bản và thực tiễn của sắc ký lỏng cao áp để tách nhanh. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM. Các khía cạnh cơ bản và thực tiễn của sắc ký lỏng siêu cao áp để tách nhanh.Wu, N. và Clausen, AM. Các khía cạnh cơ bản và thực tiễn của sắc ký lỏng cao áp để tách nhanh.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cực cao trong phát triển dược phẩm. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cực cao trong phát triển dược phẩm.Ren, SA và Chelischeff, P. Việc sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cực cao trong phát triển dược phẩm. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA và Chelischeff, P. Ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cực cao trong phát triển thuốc.J. Sắc ký. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Một loại hydrogel xốp nguyên khối có nguồn gốc từ nhũ tương dầu trong nước với pha nội cao để thanh lọc hiệu quả enterovirus 71. Tạp chí dự án hóa học 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA. Vai trò của sắc ký lỏng trong nghiên cứu protein. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA. Vai trò của sắc ký lỏng trong nghiên cứu protein.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. và Wilkins, JA. Vai trò của sắc ký lỏng trong nghiên cứu protein. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. và Wilkins, JA. Vai trò của sắc ký lỏng trong nghiên cứu protein.J. Sắc ký. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Các xu hướng mới trong tách sắc ký lỏng pha đảo của các peptide và protein trị liệu: Lý thuyết và ứng dụng. & Guillarme, D. Các xu hướng mới trong tách sắc ký lỏng pha đảo của các peptide và protein trị liệu: Lý thuyết và ứng dụng. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографии с обращенной фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Các xu hướng mới trong việc tách các peptide và protein trị liệu bằng sắc ký lỏng pha ngược: lý thuyết và ứng dụng. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势:理论和应用。 & Guillarme, D.và Guillarmé, D. Các xu hướng mới trong việc tách các peptide và protein trị liệu bằng sắc ký lỏng pha ngược: lý thuyết và ứng dụng.J. Pharm. Khoa học Y sinh. hậu môn. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC. Tách peptit hai chiều bằng hệ thống RP-RP-HPLC với độ pH khác nhau ở chiều tách thứ nhất và thứ hai. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC. Tách peptit hai chiều bằng hệ thống RP-RP-HPLC với độ pH khác nhau ở chiều tách thứ nhất và thứ hai.Gilar M., Olivova P., Dali AE và Gebler JK. Tách peptit hai chiều bằng hệ thống RP-RP-HPLC với độ pH khác nhau ở chiều tách thứ nhất và thứ hai.Gilar M., Olivova P., Dali AE và Gebler JK Tách hai chiều peptit bằng cách sử dụng các giá trị pH khác nhau trong chiều tách thứ nhất và thứ hai bằng hệ thống RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Điều tra đặc tính truyền khối và động học của các cột sắc ký hiệu năng cao được đóng gói bằng các hạt C18 xốp hoàn toàn và xốp bề mặt nhỏ hơn 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Các xu hướng gần đây và những thách thức phân tích trong việc phân lập, xác định và xác nhận các peptit hoạt tính sinh học thực vật. Anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Bức tranh toàn cảnh về protein của giới sinh vật. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Xử lý sau các peptide trị liệu bằng sắc ký lỏng chuẩn bị. Molecules (Basel, Thụy Sĩ) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Sắc ký hỗn hợp và các ứng dụng của nó đối với polyme sinh học. Yang, Y. & Geng, X. Sắc ký hỗn hợp và các ứng dụng của nó đối với polyme sinh học.Yang, Yu. và Geng, X. Sắc ký hỗn hợp và ứng dụng của nó trong nghiên cứu polyme sinh học. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Sắc ký hỗn hợp và ứng dụng của nó trong sinh polyme.Yang, Yu. và Gene, X. Sắc ký hỗn hợp và ứng dụng của nó trong nghiên cứu polyme sinh học.J. Sắc ký. A 1218(49), 8813–8825 (2011).