Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Gumagamit ka ng bersyon ng browser na may limitadong suporta sa CSS. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Bilang karagdagan, upang matiyak ang patuloy na suporta, ipinapakita namin ang site nang walang mga estilo at JavaScript.
Nagpapakita ng isang carousel ng tatlong slide nang sabay-sabay. Gamitin ang mga button na Nakaraan at Susunod upang lumipat sa tatlong slide nang sabay-sabay, o gamitin ang mga button na slider sa dulo upang lumipat sa tatlong slide nang sabay-sabay.
Ang mga porous silica particle ay inihanda gamit ang sol-gel method na may ilang mga pagbabago upang makakuha ng mga wide-pore particle. Ang mga particle na ito ay dine-derivatize gamit ang N-phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate (PMI) at styrene sa pamamagitan ng reverse chain transfer-fragmentation (RAFT) polymerization upang makagawa ng N-phenylmaleimide intercalated polyamides. Ang Styrene (PMP) stationary phase. Ang mga narrow bore stainless steel column (100 × 1.8 mm inner diameter) ay nilagyan ng slurry packing. Ang chromatographic performance ng PMP column ay sinuri upang paghiwalayin ang isang pinaghalong synthetic peptides na binubuo ng limang peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu amino acid enkephalin) at tryptic hydrolyzate ng human serum albumin (HAS). Sa ilalim ng pinakamainam na kondisyon ng elution, ang theoretical number ng mga plate na may pinaghalong peptides ay umabot sa 280,000 plates/sq.m. Sa paghahambing ng pagganap sa paghihiwalay ng nabuong haligi sa komersyal na haligi ng Ascentis Express RP-Amide, naobserbahan na ang kahusayan sa paghihiwalay ng haligi ng PMP ay mas mahusay kaysa sa komersyal na haligi sa mga tuntunin ng kahusayan sa paghihiwalay at resolusyon.
Ang industriya ng biopharmaceutical ay naging isang lumalawak na pandaigdigang merkado na may malaking pagtaas sa bahagi ng merkado nitong mga nakaraang taon. Dahil sa mabilis na paglago ng industriya ng biopharmaceutical1,2,3, mayroong malaking pangangailangan para sa pagsusuri ng peptide at protina. Bukod sa target na peptide, iba't ibang dumi ang nabubuo sa panahon ng synthesis ng peptide, kaya kinakailangan ang chromatographic purification upang makuha ang ninanais na kadalisayan ng peptide. Ang pagsusuri at paglalarawan ng mga protina sa mga likido sa katawan, mga tisyu, at mga selula ay isang lubhang mahirap na gawain dahil sa malaking bilang ng mga potensyal na matukoy na species na naroroon sa isang sample. Bagama't ang mass spectrometry ay isang epektibong kasangkapan para sa pag-sequence ng mga peptide at protina, kung ang mga naturang sample ay direktang ipinasok sa mass spectrometer, ang paghihiwalay ay magiging hindi kasiya-siya. Ang problemang ito ay maaaring malutas sa pamamagitan ng pagsasagawa ng liquid chromatography (LC) bago ang pagsusuri ng MS, na magbabawas sa dami ng mga analyte na pumapasok sa mass spectrometer sa isang takdang oras4,5,6. Bilang karagdagan, ang mga analyte ay maaaring mag-concentrate sa isang makitid na rehiyon habang naghihiwalay ng liquid phase, sa gayon ay nag-concentrate ng mga analyte na ito at nagpapataas ng sensitivity ng MS detection. Ang liquid chromatography (LC) ay lubos na umunlad sa nakalipas na dekada at naging malawakang ginagamit na pamamaraan para sa proteomic analysis7,8,9,10.
Ang reverse-phase liquid chromatography (RP-LC) ay malawakang ginagamit upang linisin at paghiwalayin ang mga halo ng mga peptide gamit ang octadecyl-modified silica (ODS) bilang stationary phase11,12,13. Gayunpaman, dahil sa kanilang kumplikadong istraktura at amphoteric na katangian,14,15 ang mga RP stationary phase ay hindi makapagbibigay ng kasiya-siyang paghihiwalay ng mga peptide at protina. Samakatuwid, ang pagsusuri ng mga peptide at protina na may mga polar at non-polar na fragment ay nangangailangan ng mga espesyal na idinisenyong stationary phase upang makipag-ugnayan at mapanatili ang mga analyte na ito16. Ang mixed chromatography, na nag-aalok ng multimodal interactions, ay maaaring maging alternatibo sa RP-LC para sa paghihiwalay ng mga peptide, protina, at iba pang kumplikadong halo. Maraming mixed-type stationary phase ang inihanda at ang mga column na puno ng mga stationary phase na ito ay ginamit upang paghiwalayin ang mga peptide at protina17,18,19,20,21. Dahil sa presensya ng mga polar at non-polar group, ang mga mixed mode stationary phase (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar intercalation/RPLC) ay angkop para sa paghihiwalay ng mga peptide at protina22,23,24,25,26,27,28. , ang mga polar intercalated stationary phase na may covalently bonded polar group ay nagpapakita ng mahusay na kakayahan sa paghihiwalay at natatanging selectivity para sa polar at non-polar analytes dahil ang paghihiwalay ay nakasalalay sa interaksyon sa pagitan ng analyte at ng stationary phase. Multimodal interactions 29,30,31,32. Kamakailan lamang, nakuha nina Zhang et al. 30 ang behenyl-terminated stationary phases ng mga polyamine at matagumpay na napaghiwalay ang mga hydrocarbon, antidepressants, flavonoids, nucleosides, estrogens, at ilang iba pang analytes. Ang polar embedded stationary material ay may parehong polar at non-polar groups, kaya maaari itong gamitin upang paghiwalayin ang mga peptide at protina sa mga hydrophobic at hydrophilic na bahagi. Ang mga polar inline column (hal., mga C18 column na may amide inline) ay makukuha sa ilalim ng trade name na Ascentis Express RP-Amide column, ngunit ang mga column na ito ay ginamit lamang para sa pagsusuri ng amine 33.
Sa kasalukuyang pag-aaral, isang polar embedding stationary phase (N-phenylmaleimide, embedding polystyrene) ang inihanda at sinuri para sa peptide separation at tryptic HSA cleavage. Ang sumusunod na estratehiya ay ginamit upang ihanda ang stationary phase. Ang mga porous silica particle ay inihanda ayon sa mga pamamaraang inilarawan sa aming mga nakaraang publikasyon, na may ilang mga pagbabago sa mga scheme ng paghahanda 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Ang mga ratio ng urea, polyethylene glycol (PEG), TMOS at aqueous-acetic acid ay inayos upang makakuha ng mga silica particle na may malalaking pore size. Pangalawa, isang bagong phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate ligand ang na-synthesize at ang mga derivatized silica particle nito ay ginamit upang ihanda ang mga polar embedded stationary phase. Ang nakuha na stationary phase ay inimpake sa isang stainless steel column (inner diameter 100 × 1.8 mm) ayon sa isang optimized packing scheme. Ang pag-iimpake ng column ay tinutulungan ng mechanical vibration upang matiyak ang isang pare-parehong layer sa loob ng column. Ang naka-pack na kolum ay sinuri para sa paghihiwalay ng isang pinaghalong peptide na binubuo ng limang peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin peptide), at tryptic hydrolysates ng human serum albumin (HSA). Naobserbahan na ang pinaghalong peptide at ang HSA tryptic digest ay naghiwalay nang may mahusay na resolusyon at kahusayan. Ang kahusayan sa paghihiwalay ng kolum ng PMP ay inihambing sa kolum ng Ascentis Express RP-Amide. Naobserbahan na ang mga peptide at protina ay may mahusay na resolusyon at mataas na kahusayan sa paghihiwalay sa kolum ng PMP, at ang kahusayan sa paghihiwalay ng kolum ng PMP ay mas mataas kaysa sa kolum ng Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyethylene glycol), urea, acetic acid, trimethoxyorthosilicate (TMOS), trimethylchlorosilane (TMCS), trypsin, human serum albumin (HSA), ammonium chloride, urea, hexamethylmethacryloyldisilazane (HMDS), methacryloyl chloride (MC), styrene, 4-hydroxy-TEMPO, benzoyl peroxide (BPO), acetonitrile (ACN) para sa HPLC, methanol, 2-propanol at acetone. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
Isang pinaghalong urea (8 g), polyethylene glycol (8 g) at 8 ml ng 0.01 N. acetic acid ang hinalo sa loob ng 10 minuto, at 24 ml ng TMOS ang idinagdag dito sa ilalim ng yelo. Ang pinaghalong reaksyon ay pinainit sa 40°C sa loob ng 6 na oras at pagkatapos ay sa 120°C sa loob ng 8 oras sa isang stainless steel autoclave. Ang tubig ay ibinuhos at ang natira ay pinatuyo sa 70°C sa loob ng 12 oras. Ang mga pinatuyong malambot na bloke ay giniling nang maayos at kinalsina sa oven sa 550°C sa loob ng 12 oras. Tatlong batch ang inihanda at kinilala upang subukan ang reproducibility ng mga laki ng particle, laki ng butas, at lawak ng ibabaw.
Polar group at stationary phase para sa mga polystyrene chain. Ang pamamaraan ng paghahanda ay inilalarawan sa ibaba.
Ang N-phenylmaleimide (200 mg) at methyl vinyl isocyanate (100 mg) ay tinunaw sa anhydrous toluene, at pagkatapos ay idinagdag ang 0.1 ml ng 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) sa reaction flask upang makakuha ng copolymer ng phenylmaleimide at methyl vinyl isocyanate (PMCP). Ang timpla ay pinainit sa 60°C sa loob ng 3 oras, sinala, at pinatuyo sa oven sa 40°C sa loob ng 3 oras.
Ang mga pinatuyong partikulo ng silica (2 g) ay ikinalat sa tuyong toluene (100 ml), hinalo, at nilagyan ng sonication sa loob ng 10 minuto sa isang 500 ml na round bottom flask. Ang PMCP (10 mg) ay tinunaw sa toluene at idinagdag nang patak-patak sa reaction flask sa pamamagitan ng isang addition funnel. Ang timpla ay pina-reflux sa 100°C sa loob ng 8 oras, sinala, hinugasan ng acetone, at pinatuyo sa 60°C sa loob ng 3 oras. Pagkatapos, ang mga partikulo ng silica na nauugnay sa PMCP (100 g) ay tinunaw sa toluene (200 ml), at ang 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) ay idinagdag dito sa presensya ng 100 μl ng dibutyltin dilaurate bilang catalyst. Ang timpla ay hinalo sa 50°C sa loob ng 8 oras, sinala, at pinatuyo sa 50°C sa loob ng 3 oras.
Ang styrene (1 ml), benzoyl peroxide BPO (0.5 ml) at mga particle ng silica na nakakabit sa TEMPO-PMCP (1.5 g) ay ikinalat sa toluene at nilinis gamit ang nitrogen. Ang polimerisasyon ng styrene ay isinagawa sa 100°C sa loob ng 12 oras. Ang nagresultang produkto ay hinugasan gamit ang methanol at pinatuyo magdamag sa 60°C. Ang pangkalahatang pamamaraan ng reaksyon ay ipinapakita sa fig. 1.
Ang mga sample ay tinanggalan ng gas sa 393 K sa loob ng 1 oras hanggang sa makuha ang natitirang presyon na mas mababa sa 10–3 Torr. Ang dami ng N2 na na-adsorb sa relatibong presyon na P/P0 = 0.99 ay ginamit upang matukoy ang kabuuang volume ng pore. Ang morpolohiya ng puro at ligand-bound silica particles ay sinuri gamit ang isang scanning electron microscope (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Ang mga tuyong sample (purong silica at ligand-bound silica particles) ay inilagay sa mga aluminum rod gamit ang carbon tape. Ang ginto ay idineposito sa sample gamit ang isang Q150T sputtering device, at isang 5 nm na kapal na Au layer ang idineposito sa sample. Pinapabuti nito ang kahusayan ng low voltage process at nagbibigay ng pinong malamig na pag-spray. Ang elemental analysis ay isinagawa gamit ang isang Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elemental composition analyzer. Isang Malvern particle size analyzer (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 ang ginamit upang makuha ang particle size distribution. Ang mga hindi pinahiran na partikulo ng silica at mga partikulo ng silica na nakagapos sa ligand (5 mg bawat isa) ay ipinakalat sa 5 ml ng isopropanol, sina-sonicate sa loob ng 10 minuto, hinalo sa loob ng 5 minuto, at inilagay sa isang Mastersizer optical bench. Ang thermogravimetric analysis ay isinasagawa sa bilis na 5 °C kada minuto sa hanay ng temperatura mula 30 hanggang 800 °C.
Ang mga hanay na hindi kinakalawang na asero na may linyang glass fiber at may sukat na (ID 100 × 1.8 mm) ay inimpake gamit ang slurry filling method kasunod ng parehong pamamaraan gaya ng nasa sanggunian 31. Ang hanay na hindi kinakalawang na asero (may linyang glass, ID 100 × 1 .8 mm) at isang labasan na naglalaman ng 1 µm frit ay ikinonekta sa isang slurry packaging machine (Alltech Deerfield, IL, USA). Maghanda ng suspensyon ng stationary phase sa pamamagitan ng paglalagay ng 150 mg ng stationary phase sa 1.2 ml ng methanol at pagpapasok nito sa isang reservoir column. Ginamit ang methanol bilang slurry solvent at control solvent. I-pack ang hanay sa pamamagitan ng paglalapat ng pressure sequence na 100 MP sa loob ng 10 minuto, 80 MP sa loob ng 15 minuto, at 60 MP sa loob ng 30 minuto. Ang proseso ng pag-iimpake ay gumamit ng dalawang gas chromatography column vibrator (Alltech, Deerfield, IL, USA) para sa mechanical vibration upang matiyak ang pare-parehong pag-iimpake ng hanay. Isara ang slurry packer at dahan-dahang bitawan ang presyon upang maiwasan ang pinsala sa string. Ang haligi ay idiniskonekta mula sa slurry nozzle at isa pang fitting ang ikinabit sa inlet at ikinonekta sa LC system upang subukan ang operasyon nito.
Isang pasadyang MLC ang ginawa gamit ang isang LC pump (10AD Shimadzu, Japan), isang sampler na may 50 nL injection loop (Valco (USA) C14 W.05), isang membrane degasser (Shimadzu DGU-14A), at isang UV-VIS capillary window. Detector device (UV-2075) at enamelled microcolumn. Gumamit ng napakakitid at maiikling connecting tubes upang mabawasan ang epekto ng karagdagang column expansion. Pagkatapos mapuno ang column, maglagay ng capillary (50 µm id 365) sa outlet ng 1/16″ reducing junction at maglagay ng capillary (50 µm) ng reducing junction. Ang pagkolekta ng datos at pagproseso ng chromatogram ay isinagawa gamit ang Multichro 2000 software. Sa 254 nm, ang UV absorbance ng mga subject analytes ay mino-monitor sa 0. Ang chromatographic data ay sinuri gamit ang OriginPro8 (Northampton, MA).
Human serum albumin, lyophilized powder, ≥ 96% (agarose gel electrophoresis) 3 mg na hinaluan ng trypsin (1.5 mg), 4.0 M urea (1 ml) at 0.2 M ammonium bicarbonate (1 ml). Ang solusyon ay hinalo sa loob ng 10 minuto at pinanatili sa isang paliguan ng tubig sa 37°C sa loob ng 6 na oras, pagkatapos ay pinalamig gamit ang 1 ml ng 0.1% TFA. Salain ang solusyon at iimbak sa temperaturang mababa sa 4°C.
Ang paghihiwalay ng pinaghalong peptides at tryptic digest HSA sa isang PMP column ay sinuri nang hiwalay. Suriin ang tryptic hydrolysis ng pinaghalong peptides at HSA na pinaghihiwalay ng isang PMP column at ihambing ang mga resulta sa isang Ascentis Express RP-Amide column. Ang bilang ng mga theoretical plate ay kinakalkula gamit ang sumusunod na equation:
Ang mga imahe ng SEM ng mga purong partikulo ng silica at mga partikulo ng silica na nakagapos ng ligand ay ipinapakita sa Figure 2. Ang mga imahe ng SEM ng mga purong partikulo ng silica (A, B) ay nagpapakita ng isang spherical na hugis kung saan ang mga partikulo ay pahaba o may irregular na simetriya kumpara sa aming mga nakaraang pag-aaral. Ang ibabaw ng mga partikulo ng silica na nakagapos ng ligand (C, D) ay mas makinis kaysa sa mga purong partikulo ng silica, na maaaring dahil sa mga kadena ng polystyrene na bumabalot sa ibabaw ng mga partikulo ng silica.
Mga scanning electron micrograph ng mga purong silica particle (A, B) at mga ligand bound silica particle (C, D).
Ang distribusyon ng laki ng particle ng mga purong silica particle at ligand-bound silica particle ay ipinapakita sa Fig. 2. 3(A). Ang mga volumetric particle size distribution curve ay nagpakita na ang laki ng silica particle ay tumaas pagkatapos ng chemical modification (Fig. 3A). Ang datos ng distribusyon ng laki ng silica particle mula sa kasalukuyang pag-aaral at sa nakaraang pag-aaral ay inihambing sa Table 1(A). Ang volumetric particle size d(0.5) ng PMP ay 3.36 µm, kumpara sa ad(0.5) value na 3.05 µm sa aming nakaraang pag-aaral (polystyrene bonded silica particles)34. Dahil sa pagbabago sa ratio ng PEG, urea, TMOS at acetic acid sa reaction mixture, ang distribusyon ng laki ng particle ng batch na ito ay mas makitid kumpara sa aming nakaraang pag-aaral. Ang laki ng particle ng PMP phase ay bahagyang mas malaki kaysa sa polystyrene bound silica particle phase na aming pinag-aralan kanina. Nangangahulugan ito na ang functionalization ng ibabaw ng mga particle ng silica na may styrene ay nagdeposito lamang ng isang polystyrene layer (0.97 µm) sa ibabaw ng silica, habang sa PMP phase ang kapal ng layer ay 1.38 µm.
Distribusyon ng laki ng partikulo (A) at distribusyon ng laki ng butas (B) ng mga purong partikulo ng silica at mga partikulo ng silica na nakagapos sa ligand.
Ang laki ng butas, dami ng butas, at lawak ng ibabaw ng mga particle ng silica na ginamit sa pag-aaral na ito ay ipinapakita sa Talahanayan 1 (B). Ang mga PSD profile ng purong mga particle ng silica at mga particle ng silica na nakagapos sa ligand ay ipinapakita sa Mga Larawan 3(B). Ang mga resulta ay maihahambing sa aming nakaraang pag-aaral34. Ang laki ng butas ng mga particle ng silica na nakagapos sa puro at ligand ay 310 Å at 241 Å, ayon sa pagkakabanggit, na nagpapahiwatig na pagkatapos ng pagbabagong kemikal, ang laki ng butas ay bumaba ng 69 Å, tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 1 (B), at ang shift curve ay ipinapakita sa Fig. Ang tiyak na lawak ng ibabaw ng mga particle ng silica sa kasalukuyang pag-aaral ay 116 m2/g, na maihahambing sa aming nakaraang pag-aaral (124 m2/g). Tulad ng ipinapakita sa Talahanayan 1(B), ang lawak ng ibabaw (m2/g) ng mga particle ng silica pagkatapos ng pagbabagong kemikal ay bumaba rin mula 116 m2/g hanggang 105 m2/g.
Ang mga resulta ng elemental na pagsusuri ng stationary phase ay ipinapakita sa Talahanayan 2. Ang nilalaman ng carbon ng kasalukuyang stationary phase ay 6.35%, na mas mababa kaysa sa aming nakaraang pag-aaral (mga particle ng silica na nauugnay sa polystyrene, 7.93%35 at 10.21%, ayon sa pagkakabanggit) 42. Ang nilalaman ng carbon ng kasalukuyang stationary phase sa ibaba, dahil ang ilang polar ligands tulad ng phenylmaleimide methyl vinyl isocyanate (PCMP) at 4-hydroxy-TEMPO ay ginamit bilang karagdagan sa styrene sa paghahanda ng SP. Ang porsyento ng bigat ng nitrogen sa kasalukuyang stationary phase ay 2.21% kumpara sa 0.1735 at 0.85% sa mga nakaraang pag-aaral 42. Nangangahulugan ito na ang kasalukuyang stationary phase ay may mataas na porsyento ng bigat ng nitrogen dahil sa phenylmaleimide. Gayundin, ang mga produkto (4) at (5) ay may nilalamang carbon na 2.7% at 2.9%, ayon sa pagkakabanggit, habang ang pangwakas na produkto (6) ay may nilalamang carbon na 6.35%, gaya ng ipinapakita sa Table 2. Ginamit ang Thermogravimetric analysis (TGA) sa stationary phase ng PMP upang subukan ang pagbaba ng timbang, at ang TGA curve ay ipinapakita sa Figure 4. Ang TGA curve ay nagpapakita ng pagbaba ng timbang na 8.6%, na naaayon sa nilalamang carbon (6.35%), dahil ang mga ligand ay naglalaman hindi lamang ng C, kundi pati na rin ng N, O at H.
Ang ligand na phenylmaleimide-methylvinyl isocyanate ay pinili upang baguhin ang ibabaw ng mga particle ng silica dahil sa mga polar na phenylmaleimide at vinylisocyanate groups nito. Ang mga vinyl isocyanate group ay maaaring higit pang mag-react sa styrene sa pamamagitan ng living radical polymerization. Ang pangalawang dahilan ay upang magsingit ng isang grupo na may katamtamang interaksyon sa analyte at walang malakas na electrostatic interactions sa pagitan ng analyte at ng stationary phase, dahil ang phenylmaleimide moiety ay walang virtual charge sa normal na pH. Ang polarity ng stationary phase ay maaaring kontrolin ng pinakamainam na dami ng styrene at ng reaction time ng free radical polymerization. Ang huling hakbang ng reaksyon (free radical polymerization) ay kritikal dahil binabago nito ang polarity ng stationary phase. Isinagawa ang elemental analysis upang suriin ang carbon content sa mga stationary phase na ito. Naobserbahan na ang pagtaas ng dami ng styrene at reaction time ay nagpapataas ng carbon content ng stationary phase at vice versa. Ang mga SP na inihanda na may iba't ibang konsentrasyon ng styrene ay may iba't ibang carbon load. Gayundin, ang mga nakatigil na yugtong ito ay inilagay sa mga haliging hindi kinakalawang na asero at ang kanilang mga katangiang chromatographic (selectivity, resolution, N value, atbp.) ay sinuri. Batay sa mga eksperimentong ito, isang na-optimize na komposisyon para sa paghahanda ng PMP stationary phase ang pinili upang magbigay ng kontroladong polarity at mahusay na pagpapanatili ng analyte.
Sinuri rin ang PMP column para sa pagsusuri ng limang pinaghalong peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkephalin) gamit ang kapasidad ng mobile phase na 60/40 (v/v) ACN/tubig (0.1% TFA) sa flow rate na 80 µl/min. Sa ilalim ng optimal elution conditions (200,000 plates/m), ang bilang ng theoretical plates (N) bawat column (100 × 1.8 mm) ay 20,000 ± 100. Ang mga N values ​​para sa tatlong PMP column ay ipinapakita sa Table 3 at ang mga chromatogram ay ipinapakita sa Figure 5A. Mabilis na pagsusuri sa mataas na rate ng daloy (700 µl/min) sa isang haligi ng PMP, limang peptide ang na-elute sa loob ng isang minuto, mahusay na halaga ng N na 13,500 ± 330 bawat haligi (100 x 1.8 mm ang diyametro), katumbas ng 135,000 plates/m (Fig. 5B). Tatlong haligi na magkapareho ang laki (panloob na diyametro 100 x 1.8 mm) ang pinuno ng tatlong magkakaibang batch ng PMP stationary phase upang subukan ang reproducibility. Ang mga analyte ay naitala para sa bawat haligi sa pamamagitan ng paghihiwalay ng parehong test mixture sa bawat haligi gamit ang pinakamainam na mga kondisyon ng elution, bilang ng mga theoretical plates N, at oras ng pagpapanatili. Ang datos ng reproducibility para sa mga haligi ng PMP ay ipinapakita sa Talahanayan 4. Ang reproducibility ng haligi ng PMP ay may mahusay na kaugnayan sa napakababang halaga ng %RSD gaya ng ipinapakita sa Talahanayan 3.
Paghihiwalay ng mga pinaghalong peptide sa isang haligi ng PMP (B) at isang haligi ng Ascentis Express RP-Amide (A), mobile phase 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), mga sukat ng haligi ng PMP (100 x 1.8 mm id), pagsusuri Pagkakasunod-sunod ng elusyon ng mga compound: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) at 5 (leucic acid enkephalin).
Isang PMP column (panloob na diyametro na 100 x 1.8 mm) ang sinuri para sa paghihiwalay ng tryptic hydrolyzate ng human serum albumin gamit ang HPLC. Ipinapakita ng chromatogram sa Figure 6 na ang mga sample ay mahusay na nakahiwalay na may napakagandang resolusyon. Sinuri ang mga solusyon ng HSA gamit ang flow rate na 100 μl/min, isang mobile phase na 70/30 acetonitrile/tubig at 0.1% TFA. Ang cleavage ng HSA ay hinati sa 17 peaks, tulad ng ipinapakita sa chromatogram (Fig. 6), na katumbas ng 17 peptides. Ang kahusayan sa paghihiwalay ng mga indibidwal na peak mula sa HSA hydrolyzate ay kinalkula at ang mga halaga ay ipinapakita sa Table 5.
Ang mga HSA tryptic hydrolysate ay pinaghiwalay sa isang PMP column (panloob na diyametro 100 x 1.8 mm), flow rate (100 μl/min), mobile phase 60/40 acetonitrile/tubig, at 0.1% TFA.
kung saan ang L ay ang haba ng haligi, ang η ay ang lagkit ng mobile phase, ang ΔP ay ang back pressure ng haligi, at ang u ay ang linear velocity ng mobile phase. Ang permeability ng haligi ng PMP ay 2.5 × 10–14 m2, ang flow rate ay 25 µl/min, 60/40 v/v ang ginamit. ACN/tubig. Ang permeability ng haligi ng PMP (ID 100 × 1.8 mm) ay katulad ng sa aming nakaraang pag-aaral sa Ref.34. Ang permeability ng isang haligi na puno ng mga mababaw na porous na particle ay 1.7×10 .6 µm, 2.5×10-14 m2 para sa 5 µm na particle43. Samakatuwid, ang permeability ng PMP phase ay katulad ng permeability ng mga core-shell particle na may sukat na 5 μm.
kung saan ang Wx ay ang masa ng kolum na puno ng chloroform, ang Wy ay ang masa ng kolum na puno ng methanol, at ang ρ ay ang densidad ng solvent. Densidad ng methanol (ρ = 0.7866) at chloroform (ρ = 1.484). Ang kabuuang porosity ng kolum ng particle na silica-C18 (100 × 1.8 mm ID)34 at ang ating naunang pinag-aralang kolum na C18-urea31 ay 0.63 at 0.55, ayon sa pagkakabanggit. Nangangahulugan ito na ang presensya ng mga urea ligand ay binabawasan ang permeability ng stationary phase. Sa kabilang banda, ang kabuuang porosity ng kolum na PMP (panloob na diyametro 100 × 1.8 mm) ay 0.60. Ang mga kolum ng PMP ay hindi gaanong permeable kaysa sa mga kolum na puno ng mga particle na silica na nakagapos ng C18 dahil sa mga stationary phase na uri ng C18, ang mga C18 ligand ay nakakabit sa mga particle na silica sa mga linear chain, habang sa mga stationary phase na uri ng polystyrene, isang medyo makapal na polymer ang nabubuo sa paligid ng mga particle. patong A. Sa isang tipikal na eksperimento, ang porosity ng haligi ay kinakalkula gaya ng sumusunod:
Sa fig. 7A, B, makikita ang mga Van Deemter plot para sa isang PMP column (id 100 x 1.8 mm) at isang Ascentis Express RP-Amide column (id 100 x 1.8 mm) sa ilalim ng parehong mga kondisyon ng elution, 60/40 ACN/H2O at 0 .1% TFA 20 µl/min hanggang 800 µl/min sa parehong column. Ang pinakamababang halaga ng HETP sa pinakamainam na flow rate (80 µl/min) ay 2.6 µm at 3.9 µm para sa PMP column at Ascentis Express RP-Amide column, ayon sa pagkakabanggit. Ipinapakita ng mga halaga ng HETP na ang separation efficiency ng PMP column (100 x 1.8 mm id) ay mas mataas kaysa sa komersyal na makukuhang Ascentis Express RP-Amide column (100 x 1.8 mm id). Ipinapakita ng van Deemter graph sa Fig. 7(A) na ang pagbaba sa halaga ng N ay hindi gaanong mas mataas kasabay ng pagtaas ng daloy kumpara sa aming nakaraang pag-aaral. Ang mas mataas na kahusayan sa paghihiwalay ng haligi ng PMP (id 100 × 1.8 mm) kumpara sa haligi ng Ascentis Express RP-Amide ay batay sa pinahusay na hugis at laki ng particle at sa sopistikadong pamamaraan ng pag-iimpake ng haligi na ginamit sa kasalukuyang gawain34.
(A) Van Deemter plot (HETP vs. mobile phase linear velocity) na nakuha sa isang PMP column (id 100 x 1.8 mm) sa 60/40 ACN/H2O na may 0.1% TFA. (B) Van Deemter plot (HETP vs. mobile phase linear velocity) na nakuha sa isang Ascentis Express RP-Amide column (id 100 x 1.8 mm) sa 60/40 ACN/H2O na may 0.1% TFA.
Isang polar stationary phase ng intercalated polystyrene ang inihanda at sinuri para sa paghihiwalay ng pinaghalong synthetic peptides at tryptic hydrolyzate ng human serum albumin (HSA) sa high performance liquid chromatography. Ang chromatographic performance ng mga PMP column para sa mga peptide mixture ay mahusay sa mga tuntunin ng kahusayan sa paghihiwalay at resolusyon. Ang pinahusay na kahusayan sa paghihiwalay ng mga PMP column ay dahil sa ilang mga kadahilanan tulad ng laki ng silica particle at laki ng pore, kontroladong synthesis ng mga stationary phase, at mga kumplikadong materyales sa pag-iimpake ng column. Bilang karagdagan sa mataas na kahusayan sa paghihiwalay, ang isa pang bentahe ng stationary phase na ito ay ang mababang column back pressure sa mataas na flow rate. Ang mga PMP column ay lubos na maaaring kopyahin at maaaring gamitin upang suriin ang mga pinaghalong peptides at tryptic digestion ng iba't ibang protina. Layunin naming gamitin ang column na ito para sa paghihiwalay ng mga bioactive compound mula sa mga natural na produkto, mga katas ng mga halamang gamot at mga kabute sa liquid chromatography. Sa hinaharap, susuriin din ang mga PMP column para sa paghihiwalay ng mga protina at monoclonal antibodies.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Imbestigasyon sa mga sistema ng paghihiwalay ng peptide gamit ang reversed phase chromatography, bahagi I: Pagbuo ng isang protocol para sa paglalarawan ng hanay. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Imbestigasyon sa mga sistema ng paghihiwalay ng peptide gamit ang reversed phase chromatography, bahagi I: Pagbuo ng isang protocol para sa paglalarawan ng hanay.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., at Petersson, P. Imbestigasyon ng mga Sistema ng Paghihiwalay ng Peptide sa pamamagitan ng Reverse-Phase Chromatography, Bahagi I: Pagbuo ng isang Protocol para sa Pag-characterize ng Kolum. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Imbestigasyon sa mga sistema ng paghihiwalay ng peptide gamit ang reversed phase chromatography, bahagi I: Pagbuo ng isang protocol para sa mga katangian ng column. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Imbestigasyon sa mga sistema ng paghihiwalay ng peptide gamit ang reversed phase chromatography, bahagi I: Pagbuo ng isang protocol para sa mga katangian ng column.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., at Petersson, P. Imbestigasyon ng mga Sistema ng Paghihiwalay ng Peptide sa pamamagitan ng Reverse-Phase Chromatography, Bahagi I: Pagbuo ng isang Protocol para sa Pag-characterize ng Kolum.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. et al. Mga Paraan para sa Paglikha ng Pinahusay na Aktibong Peptide para sa Paggamot ng mga Nakakahawang Sakit. Bioteknolohiya. Mga Nakamit 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Mga sintetikong therapeutic peptide: Agham at merkado. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Mga sintetikong therapeutic peptide: Agham at merkado.Vliege P, Lisowski V, Martinez J at Chreschatyski M. Mga sintetikong therapeutic peptide: agham at merkado.Vliege P, Lisowski V, Martinez J at Khreschatsky M. Mga sintetikong therapeutic peptide: agham at merkado. pagtuklas ng gamot. Ngayon 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD at Shen, Y. Mas mataas na proteomic liquid chromatography. Xie, F., Smith, RD at Shen, Y. Mas mataas na proteomic liquid chromatography.Tingnan ang F., Smith RD at Shen Yu. Mas mataas na proteomic liquid chromatography. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced na komposisyon ng protina 液相色谱。Tingnan ang F., Smith RD at Shen Yu. Mas mataas na proteomic liquid chromatography.J. Kromatograpiya. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Ang advanced liquid chromatography-mass spectrometry ay kayang pagsamahin ang malawakang metabolomics at proteomics. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM at Salisbury, JJ Ang papel ng UHPLC sa pagpapaunlad ng parmasyutiko. Chesnut, SM at Salisbury, JJ Ang papel ng UHPLC sa pagpapaunlad ng parmasyutiko.Chesnut, SM at Salisbury, JJ Ang papel ng UHPLC sa pagpapaunlad ng parmasyutiko.Chesnut, SM at Salisbury, JJ Ang papel ng UHPLC sa pagbuo ng gamot. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Mga Pangunahing at Praktikal na Aspeto ng Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography para sa Mabilis na Paghihiwalay. Wu, N. & Clausen, AM Mga Pangunahing at Praktikal na Aspeto ng Ultrahigh Pressure Liquid Chromatography para sa Mabilis na Paghihiwalay.Wu, N. at Clausen, AM Mga Pangunahin at Praktikal na Aspeto ng High Pressure Liquid Chromatography para sa Mabilis na Paghihiwalay. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Mga Pangunahin at Praktikal na Aspeto ng Ultra-High Pressure Liquid Chromatography para sa Mabilis na Paghihiwalay.Wu, N. at Clausen, AM Mga Pangunahin at Praktikal na Aspeto ng High Pressure Liquid Chromatography para sa Mabilis na Paghihiwalay.J. Sept. Agham. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Paggamit ng ultra-performance liquid chromatography sa pagpapaunlad ng parmasyutiko. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Paggamit ng ultra-performance liquid chromatography sa pagpapaunlad ng parmasyutiko.Ren, SA at Chelischeff, P. Ang paggamit ng ultra high performance liquid chromatography sa pagpapaunlad ng parmasyutiko. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA at Tchelitcheff, P.Ren, SA at Chelischeff, P. Aplikasyon ng ultra-performance liquid chromatography sa pagbuo ng gamot.J. Kromatograpiya. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Isang monolithic macroporous hydrogel na nagmula sa isang oil-in-water emulsion na may mataas na internal phase para sa mahusay na purification ng enterovirus 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ang papel ng likidong chromatography sa proteomics. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ang papel ng likidong chromatography sa proteomics.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. at Wilkins, JA Ang papel ng liquid chromatography sa proteomics. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. at Wilkins, JA Ang papel ng liquid chromatography sa proteomics.J. Kromatograpiya. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Mga bagong uso sa reversed-phase liquid chromatographic separations ng mga therapeutic peptide at protina: Teorya at mga aplikasyon. & Guillarme, D. Mga bagong uso sa reversed-phase liquid chromatographic separations ng mga therapeutic peptide at protina: Teorya at mga aplikasyon. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографира хроматографира хроматографира теория и приложения. & Guillarme, D. Mga bagong uso sa paghihiwalay ng mga therapeutic peptide at protina sa pamamagitan ng reverse phase liquid chromatography: teorya at mga aplikasyon. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 at Guillarme, D.at Guillarmé, D. Mga bagong uso sa paghihiwalay ng mga therapeutic peptide at protina sa pamamagitan ng reverse phase liquid chromatography: teorya at mga aplikasyon.J. Pharm. Agham Biomedikal. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dalawang-dimensyonal na paghihiwalay ng mga peptide gamit ang sistemang RP-RP-HPLC na may iba't ibang pH sa una at pangalawang dimensyon ng paghihiwalay. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dalawang-dimensyonal na paghihiwalay ng mga peptide gamit ang sistemang RP-RP-HPLC na may iba't ibang pH sa una at pangalawang dimensyon ng paghihiwalay.Gilar M., Olivova P., Dali AE at Gebler JK Dalawang-dimensyonal na paghihiwalay ng mga peptide gamit ang sistemang RP-RP-HPLC na may iba't ibang pH sa una at pangalawang dimensyon ng paghihiwalay.Gilar M., Olivova P., Dali AE at Gebler JK Dalawang-dimensyonal na paghihiwalay ng mga peptide gamit ang iba't ibang halaga ng pH sa una at pangalawang dimensyon ng paghihiwalay gamit ang sistemang RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Imbestigasyon ng mass transfer at kinetic characteristics ng mga high-performance chromatography column na puno ng ganap na porous at mababaw na porous na mga particle ng C18 na mas maliit sa 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Mga kamakailang uso at mga hamon sa pagsusuri sa paghihiwalay, pagtukoy, at pagpapatunay ng mga bioactive peptide ng halaman. anus. Nilalang anal. Kemikal. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomikong tanawin ng kaharian ng buhay. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Pagkatapos ng paggamot ng mga therapeutic peptide sa pamamagitan ng preparative liquid chromatography. Molecules (Basel, Switzerland) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatography at ang mga aplikasyon nito sa mga biopolymer. Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatography at ang mga aplikasyon nito sa mga biopolymer.Yang, Yu. at Geng, X. Mixed mode chromatography at ang aplikasyon nito sa mga biopolymer. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Mixed mode chromatography at ang aplikasyon nito sa mga biopolymer.Yang, Yu. at Gene, X. Mixed mode chromatography at ang aplikasyon nito sa mga biopolymer.J. Kromatograpiya. A 1218(49), 8813–8825 (2011).