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Des particules de silice poreuses ont été préparées par la méthode sol-gel, légèrement modifiée pour obtenir des particules à pores larges. Ces particules ont ensuite été fonctionnalisées avec du N-phénylmaléimide-méthylvinylisocyanate (PMI) et du styrène par polymérisation RAFT (polymérisation par transfert de chaîne inverse et fragmentation) afin de produire des polyamides intercalés de N-phénylmaléimide. La phase stationnaire utilisée était le styrène (PMP). Des colonnes en acier inoxydable à faible diamètre interne (100 × 1,8 mm) ont été remplies d'une suspension. Les performances chromatographiques de la colonne PMP ont été évaluées pour la séparation d'un mélange de peptides synthétiques (cinq peptides : Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg et l'enképhaline, un acide aminé) et d'un hydrolysat trypsique d'albumine sérique humaine (HAS). Dans des conditions d'élution optimales, le nombre théorique de plateaux théoriques avec un mélange de peptides a atteint 280 000 plateaux/m². En comparant les performances de séparation de la colonne développée avec celles de la colonne commerciale Ascentis Express RP-Amide, il a été observé que l'efficacité de séparation de la colonne PMP était supérieure à celle de la colonne commerciale en termes d'efficacité et de résolution.
L'industrie biopharmaceutique est devenue un marché mondial en pleine expansion, avec une augmentation significative de sa part de marché ces dernières années. Cette croissance exponentielle^1,2,3 engendre un besoin important en analyse de peptides et de protéines. Outre le peptide cible, diverses impuretés se forment lors de la synthèse peptidique ; une purification chromatographique est donc nécessaire pour obtenir le peptide de pureté souhaitée. L'analyse et la caractérisation des protéines dans les fluides corporels, les tissus et les cellules constituent une tâche extrêmement complexe en raison du grand nombre d'espèces potentiellement détectables présentes dans un seul échantillon. Bien que la spectrométrie de masse soit un outil efficace pour le séquençage des peptides et des protéines, l'introduction directe de ces échantillons dans le spectromètre de masse ne permet pas une séparation satisfaisante. Ce problème peut être résolu par la réalisation d'une chromatographie liquide (CL) avant l'analyse par spectrométrie de masse (SM), ce qui réduit la quantité d'analytes entrant simultanément dans le spectromètre de masse^4,5,6. De plus, la séparation en phase liquide permet la concentration des analytes dans une zone restreinte, augmentant ainsi la sensibilité de la détection par SM. La chromatographie liquide (CL) a considérablement progressé au cours de la dernière décennie et est devenue une méthode largement utilisée pour l'analyse protéomique7,8,9,10.
La chromatographie liquide en phase inverse (CLPI) est largement utilisée pour purifier et séparer les mélanges de peptides, en utilisant la silice modifiée par l'octadécyle (ODS) comme phase stationnaire^11,12,13. Cependant, en raison de leur structure complexe et de leur nature amphotère^14,15, les phases stationnaires CLPI ne permettent pas une séparation satisfaisante des peptides et des protéines. Par conséquent, l'analyse des peptides et des protéines comportant des fragments polaires et non polaires nécessite des phases stationnaires spécialement conçues pour interagir avec ces analytes et les retenir¹⁶. La chromatographie mixte, qui offre des interactions multimodales, peut constituer une alternative à la CLPI pour la séparation des peptides, des protéines et d'autres mélanges complexes. Plusieurs phases stationnaires mixtes ont été préparées et des colonnes remplies de ces phases stationnaires ont été utilisées pour séparer les peptides et les protéines^{17,18,19,20,21}. Du fait de la présence de groupements polaires et non polaires, les phases stationnaires à modes mixtes (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalation polaire/RPLC) conviennent à la séparation des peptides et des protéines^{22,23,24,25,26,27,28}. Les phases stationnaires intercalées polaires, comportant des groupements polaires liés de manière covalente, présentent d'excellentes capacités de séparation et une sélectivité unique pour les analytes polaires et non polaires, la séparation dépendant de l'interaction entre l'analyte et la phase stationnaire (interactions multimodales^29,30,31,32). Récemment, Zhang et al.³⁰ ont obtenu des phases stationnaires à terminaison béhényle de polyamines et ont réussi à séparer des hydrocarbures, des antidépresseurs, des flavonoïdes, des nucléosides, des œstrogènes et d'autres analytes. Le matériau stationnaire à incorporation polaire possède à la fois des groupements polaires et non polaires, ce qui permet de séparer les peptides et les protéines en leurs parties hydrophobes et hydrophiles. Les colonnes polaires en ligne (par exemple, les colonnes C18 avec amide en ligne) sont disponibles sous le nom commercial de colonnes Ascentis Express RP-Amide, mais ces colonnes n'ont été utilisées que pour l'analyse de l'amine 33.
Dans cette étude, une phase stationnaire d'enrobage polaire (N-phénylmaléimide, polystyrène d'enrobage) a été préparée et évaluée pour la séparation de peptides et le clivage trypsique de l'HSA. La stratégie suivante a été utilisée pour préparer cette phase stationnaire. Des particules de silice poreuses ont été préparées selon les procédures décrites dans nos publications précédentes, avec quelques modifications des schémas de préparation^{31, 34, 35, 36, 37, 38, 39}. Les proportions d'urée, de polyéthylène glycol (PEG), de TMOS et d'acide acétique aqueux ont été ajustées afin d'obtenir des particules de silice à pores larges. Ensuite, un nouveau ligand phénylmaléimide-isocyanate de méthylvinyle a été synthétisé et ses particules de silice dérivatisées ont servi à préparer les phases stationnaires d'enrobage polaires. La phase stationnaire obtenue a été conditionnée dans une colonne en acier inoxydable (diamètre intérieur 100 × 1,8 mm) selon un schéma de remplissage optimisé. Le remplissage de la colonne est facilité par des vibrations mécaniques afin d'assurer une couche uniforme. La colonne garnie a été évaluée pour la séparation d'un mélange de cinq peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg et leucine-enképhaline) et d'hydrolysats trypsiques d'albumine sérique humaine (HSA). La séparation du mélange peptidique et du digestat trypsique d'HSA a été observée avec une bonne résolution et une bonne efficacité. L'efficacité de séparation de la colonne PMP a été comparée à celle de la colonne Ascentis Express RP-Amide. Les peptides et les protéines ont présenté une bonne résolution et une efficacité de séparation élevée sur la colonne PMP, supérieure à celle de la colonne Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyéthylène glycol), urée, acide acétique, triméthoxyorthosilicate (TMOS), triméthylchlorosilane (TMCS), trypsine, albumine sérique humaine (HSA), chlorure d'ammonium, urée, hexaméthylméthacryloyldisilazane (HMDS), chlorure de méthacryloyle (MC), styrène, 4-hydroxy-TEMPO, peroxyde de benzoyle (BPO), acétonitrile (ACN) pour HPLC, méthanol, 2-propanol et acétone. Sigma-Aldrich Company (Saint-Louis, Missouri, États-Unis).
Un mélange d'urée (8 g), de polyéthylène glycol (8 g) et de 8 ml d'acide acétique 0,01 N a été agité pendant 10 minutes, puis 24 ml de TMOS ont été ajoutés sous refroidissement par la glace. Le mélange réactionnel a été chauffé à 40 °C pendant 6 heures, puis à 120 °C pendant 8 heures dans un autoclave en acier inoxydable. L'eau a été décantée et le résidu a été séché à 70 °C pendant 12 heures. Les blocs mous séchés ont été broyés finement et calcinés dans un four à 550 °C pendant 12 heures. Trois lots ont été préparés et caractérisés afin de tester la reproductibilité de la taille des particules, de la porosité et de la surface spécifique.
Groupe polaire et phase stationnaire pour les chaînes de polystyrène. Le mode de préparation est décrit ci-dessous.
On a dissous 200 mg de N-phénylmaléimide et 100 mg d'isocyanate de méthyle et de vinyle dans du toluène anhydre, puis 0,1 ml de 2,2′-azobisisobutyronitrile (AIBN) a été ajouté au ballon réactionnel pour obtenir un copolymère de phénylmaléimide et d'isocyanate de méthyle et de vinyle (PMCP). Le mélange a été chauffé à 60 °C pendant 3 heures, filtré et séché à l'étuve à 40 °C pendant 3 heures.
Deux grammes de particules de silice séchées ont été dispersés dans 100 ml de toluène anhydre, agités et soumis à une sonication pendant 10 minutes dans un ballon à fond rond de 500 ml. Dix milligrammes de PMCP ont été dissous dans du toluène et ajoutés goutte à goutte au ballon réactionnel à l'aide d'une ampoule à addition. Le mélange a été porté à reflux à 100 °C pendant 8 heures, filtré, lavé à l'acétone et séché à 60 °C pendant 3 heures. Ensuite, 100 g de particules de silice associées au PMCP ont été dissous dans 200 ml de toluène, et 2 ml de 4-hydroxy-TEMPO ont été ajoutés en présence de 100 µl de dilaurate de dibutylétain comme catalyseur. Le mélange a été agité à 50 °C pendant 8 heures, filtré et séché à 50 °C pendant 3 heures.
Le styrène (1 ml), le peroxyde de benzoyle (BPO, 0,5 ml) et des particules de silice fixées sur du TEMPO-PMCP (1,5 g) ont été dispersés dans du toluène et purgés à l'azote. La polymérisation du styrène a été réalisée à 100 °C pendant 12 heures. Le produit obtenu a été lavé au méthanol et séché à 60 °C pendant une nuit. Le schéma général de la réaction est présenté figure 1.
Les échantillons ont été dégazés à 393 K pendant 1 h jusqu'à obtention d'une pression résiduelle inférieure à 10⁻³ Torr. La quantité de N₂ adsorbée à une pression relative P/P₀ = 0,99 a permis de déterminer le volume poreux total. La morphologie des particules de silice pure et de silice liée à un ligand a été examinée par microscopie électronique à balayage (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japon). Les échantillons secs (silice pure et particules de silice liées à un ligand) ont été fixés sur des tiges d'aluminium à l'aide d'un ruban adhésif en carbone. Une couche d'or de 5 nm d'épaisseur a été déposée sur l'échantillon par pulvérisation cathodique (Q150T). Ce procédé améliore l'efficacité de la pulvérisation à basse tension et permet une projection à froid de haute précision. L'analyse élémentaire a été réalisée à l'aide d'un analyseur de composition élémentaire Flash EA1112 (Thermo Electron, Waltham, MA, États-Unis). La distribution granulométrique a été obtenue à l'aide d'un granulomètre Mastersizer 2000 (Malvern, Worcestershire, Royaume-Uni). Des particules de silice non enrobées et des particules de silice liées à un ligand (5 mg chacune) ont été dispersées dans 5 ml d'isopropanol, soniquées pendant 10 minutes, agitées pendant 5 minutes, puis placées sur le banc optique d'un Mastersizer. L'analyse thermogravimétrique a été réalisée à une vitesse de 5 °C par minute dans la gamme de températures de 30 à 800 °C.
Des colonnes en acier inoxydable à faible diamètre intérieur (100 × 1,8 mm), revêtues de fibres de verre, ont été remplies par la méthode de remplissage par suspension, selon la procédure décrite dans la référence 31. Une colonne en acier inoxydable (revêtue de fibres de verre, diamètre intérieur 100 × 1,8 mm) munie d'une sortie équipée d'une fritte de 1 µm a été connectée à une machine de remplissage par suspension (Alltech, Deerfield, IL, États-Unis). Une suspension de phase stationnaire a été préparée en dissolvant 150 mg de phase stationnaire dans 1,2 ml de méthanol et en l'introduisant dans la colonne réservoir. Le méthanol a été utilisé comme solvant de suspension et comme solvant témoin. Le remplissage de la colonne a été effectué par application d'une séquence de pressions : 100 MPa pendant 10 min, 80 MPa pendant 15 min et 60 MPa pendant 30 min. Deux vibrateurs pour colonnes de chromatographie en phase gazeuse (Alltech, Deerfield, IL, États-Unis) ont été utilisés pour assurer un remplissage uniforme de la colonne. Fermez le packer de boue et relâchez la pression lentement pour éviter d'endommager la colonne. La colonne a été déconnectée de la buse de boue et un autre raccord a été installé à l'entrée et connecté au système LC pour tester son fonctionnement.
Une colonne MLC personnalisée a été construite à l'aide d'une pompe LC (10AD Shimadzu, Japon), d'un échantillonneur avec une boucle d'injection de 50 nL (Valco (États-Unis) C14 W.05), d'un dégazeur à membrane (Shimadzu DGU-14A) et d'une fenêtre capillaire UV-VIS. Un détecteur UV (UV-2075) et une microcolonne émaillée ont été utilisés. Des tubes de connexion très étroits et courts ont été employés afin de minimiser l'effet de la dilatation de la colonne. Après le remplissage de la colonne, un capillaire (50 µm de diamètre interne 365) a été installé à la sortie de la jonction réductrice 1/16″ et un autre capillaire (50 µm) a été installé au niveau de cette jonction. L'acquisition des données et le traitement des chromatogrammes ont été réalisés à l'aide du logiciel Multichro 2000. L'absorbance UV des analytes a été mesurée à 254 nm. Les données chromatographiques ont été analysées avec le logiciel OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumine sérique humaine (poudre lyophilisée, pureté ≥ 96 %, électrophorèse sur gel d'agarose) : 3 mg mélangés à 1,5 mg de trypsine, 1 ml d'urée 4,0 M et 1 ml de bicarbonate d'ammonium 0,2 M. La solution est agitée pendant 10 min, puis incubée au bain-marie à 37 °C pendant 6 h. La réaction est ensuite stoppée par addition de 1 ml d'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1 %. La solution est filtrée et conservée à une température inférieure à 4 °C.
La séparation d'un mélange de peptides et d'un hydrolysat trypsique d'HSA sur une colonne PMP a été évaluée séparément. L'hydrolyse trypsique d'un mélange de peptides et d'HSA séparés par une colonne PMP a été vérifiée et les résultats comparés à ceux obtenus avec une colonne Ascentis Express RP-Amide. Le nombre de plateaux théoriques est calculé à l'aide de l'équation suivante :
La figure 2 présente des images MEB de particules de silice pure et de particules de silice liées à un ligand. Les images MEB des particules de silice pure (A, B) révèlent une forme sphérique, les particules étant allongées ou présentant une symétrie irrégulière par rapport à nos études précédentes. La surface des particules de silice liées au ligand (C, D) est plus lisse que celle des particules de silice pure, ce qui pourrait être dû aux chaînes de polystyrène qui la recouvrent.
Micrographies électroniques à balayage de particules de silice pure (A, B) et de particules de silice liées à un ligand (C, D).
La distribution granulométrique des particules de silice pure et des particules de silice liées à un ligand est présentée sur la figure 2.3(A). Les courbes de distribution granulométrique volumique montrent une augmentation de la taille des particules de silice après modification chimique (figure 3A). Les données de distribution granulométrique de la présente étude et d'une étude précédente sont comparées dans le tableau 1(A). Le diamètre volumique des particules d(0,5) du PMP était de 3,36 µm, contre 3,05 µm pour ad(0,5) dans notre étude précédente (particules de silice liées au polystyrène)³⁴. En raison de la modification des proportions de PEG, d'urée, de TMOS et d'acide acétique dans le milieu réactionnel, la distribution granulométrique de ce lot était plus étroite que dans notre étude précédente. La taille des particules de la phase PMP est légèrement supérieure à celle de la phase de silice liée au polystyrène étudiée précédemment. Cela signifie que la fonctionnalisation de surface des particules de silice avec du styrène n'a déposé qu'une couche de polystyrène (0,97 µm) sur la surface de la silice, alors que dans la phase PMP, l'épaisseur de la couche était de 1,38 µm.
Distribution de la taille des particules (A) et distribution de la taille des pores (B) des particules de silice pure et des particules de silice liées à un ligand.
La taille des pores, le volume poreux et la surface spécifique des particules de silice utilisées dans cette étude sont présentés dans le tableau 1 (B). Les profils de distribution de la taille des pores (PSD) des particules de silice pures et des particules de silice liées à un ligand sont présentés dans les figures 3 (B). Les résultats sont comparables à ceux de notre étude précédente³⁴. Les tailles des pores des particules de silice pures et liées à un ligand étaient respectivement de 310 Å et 241 Å, ce qui indique qu'après modification chimique, la taille des pores a diminué de 69 Å, comme le montre le tableau 1 (B), et la courbe de décalage est présentée dans la figure 3 (B). La surface spécifique des particules de silice dans la présente étude est de 116 m²/g, ce qui est comparable à notre étude précédente (124 m²/g). Comme le montre le tableau 1 (B), la surface spécifique (m²/g) des particules de silice après modification chimique a également diminué, passant de 116 m²/g à 105 m²/g.
Les résultats de l'analyse élémentaire de la phase stationnaire sont présentés dans le tableau 2. La teneur en carbone de cette phase est de 6,35 %, inférieure à celle obtenue dans nos études précédentes (particules de silice associées au polystyrène, respectivement 7,93 %³⁵ et 10,21 %)⁴². Cette différence s'explique par l'utilisation, en plus du styrène, de ligands polaires tels que le phénylmaléimide, l'isocyanate de méthyle et de vinyle (PCMP) et le 4-hydroxy-TEMPO lors de sa préparation. Le pourcentage massique d'azote dans cette phase stationnaire est de 2,21 %, contre 0,17³⁵ et 0,85 % dans les études précédentes⁴². Ceci indique une teneur en azote élevée, due à la présence de phénylmaléimide. De même, les produits (4) et (5) ont une teneur en carbone de 2,7 % et 2,9 %, respectivement, tandis que le produit final (6) a une teneur en carbone de 6,35 %, comme indiqué dans le tableau 2. L'analyse thermogravimétrique (ATG) a été utilisée sur la phase stationnaire du PMP pour tester la perte de masse, et la courbe ATG est présentée sur la figure 4. La courbe ATG montre une perte de masse de 8,6 %, ce qui est en bon accord avec la teneur en carbone (6,35 %), puisque les ligands contiennent non seulement du C, mais aussi du N, du O et du H.
Le ligand phénylmaléimide-isocyanate de méthylvinyle a été choisi pour modifier la surface des particules de silice en raison de ses groupements polaires phénylmaléimide et vinylisocyanate. Ces groupements peuvent réagir avec le styrène par polymérisation radicalaire vivante. Ce choix permet également d'insérer un groupement présentant des interactions modérées avec l'analyte et aucune interaction électrostatique forte entre l'analyte et la phase stationnaire, le groupement phénylmaléimide étant électriquement neutre à pH normal. La polarité de la phase stationnaire peut être contrôlée par la quantité optimale de styrène et la durée de la polymérisation radicalaire. L'étape finale de la réaction (polymérisation radicalaire) est cruciale car elle modifie la polarité de la phase stationnaire. Une analyse élémentaire a été réalisée pour déterminer la teneur en carbone de ces phases stationnaires. Il a été observé que l'augmentation de la quantité de styrène et de la durée de la réaction accroît la teneur en carbone de la phase stationnaire, et inversement. Les phases stationnaires préparées avec différentes concentrations de styrène présentent des teneurs en carbone différentes. De même, ces phases stationnaires ont été déposées sur des colonnes en acier inoxydable et leurs caractéristiques chromatographiques (sélectivité, résolution, valeur N, etc.) ont été vérifiées. À partir de ces expériences, une composition optimisée pour la préparation de la phase stationnaire PMP a été sélectionnée afin d'assurer une polarité contrôlée et une bonne rétention de l'analyte.
La colonne PMP a également été évaluée pour l'analyse de cinq mélanges de peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enképhaline) en utilisant la capacité de la phase mobile : 60/40 (v/v) ACN/eau (0,1 % TFA) à un débit de 80 µl/min. Dans des conditions d'élution optimales (200 000 plateaux théoriques/m), le nombre de plateaux théoriques (N) par colonne (100 × 1,8 mm) est de 20 000 ± 100. Les valeurs de N pour les trois colonnes PMP sont présentées dans le tableau 3 et les chromatogrammes sont illustrés dans la figure 5A. Une analyse rapide à haut débit (700 µl/min) sur une colonne PMP a permis l'élution de cinq peptides en moins d'une minute, avec une excellente valeur N de 13 500 ± 330 par colonne (100 x 1,8 mm de diamètre), équivalente à 135 000 plateaux théoriques/m (Fig. 5B). Trois colonnes de même dimension (diamètre interne 100 x 1,8 mm) ont été remplies avec trois lots différents de phase stationnaire PMP afin d'évaluer la reproductibilité. Les analytes ont été analysés pour chaque colonne en séparant le même mélange test sur chacune d'elles, dans des conditions d'élution optimales (nombre de plateaux théoriques N et temps de rétention). Les données de reproductibilité des colonnes PMP sont présentées dans le Tableau 4. La reproductibilité de la colonne PMP est excellente, avec des valeurs de %RSD très faibles (Tableau 3).
Séparation de mélanges de peptides sur une colonne PMP (B) et une colonne Ascentis Express RP-Amide (A), phase mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensions de la colonne PMP (100 x 1,8 mm id), ordre d'élution des composés : 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) et 5 (enképhaline d'acide leucique).
Une colonne PMP (diamètre interne 100 x 1,8 mm) a été évaluée pour la séparation de l'hydrolysat trypsique d'albumine sérique humaine par HPLC. Le chromatogramme de la figure 6 montre une excellente séparation des échantillons avec une très bonne résolution. Les solutions d'HSA ont été analysées avec un débit de 100 μl/min, une phase mobile composée de 70/30 d'acétonitrile/eau et de 0,1 % de TFA. Le clivage de l'HSA a permis d'identifier 17 pics, comme illustré sur le chromatogramme (figure 6), correspondant à 17 peptides. Les efficacités de séparation de chaque pic de l'hydrolysat d'HSA ont été calculées et les valeurs sont présentées dans le tableau 5.
Les hydrolysats trypsiques d'HSA ont été séparés sur une colonne PMP (diamètre intérieur 100 x 1,8 mm), débit (100 μl/min), phase mobile 60/40 acétonitrile/eau et 0,1 % TFA.
où L représente la longueur de la colonne, η la viscosité de la phase mobile, ΔP la contre-pression de la colonne et u la vitesse linéaire de la phase mobile. La perméabilité de la colonne PMP était de 2,5 × 10⁻¹⁴ m², le débit de 25 µl/min et un mélange acétonitrile/eau (60/40 v/v) a été utilisé. La perméabilité de la colonne PMP (diamètre intérieur 100 × 1,8 mm) était similaire à celle de notre étude précédente (réf. 34). La perméabilité d'une colonne remplie de particules superficiellement poreuses est de 1,7 × 10⁻⁶ µm et de 2,5 × 10⁻¹⁴ m² pour des particules de 5 µm (réf. 43). Par conséquent, la perméabilité de la phase PMP est comparable à celle des particules cœur-coquille de 5 µm.
où Wx représente la masse de la colonne remplie de chloroforme, Wy la masse de la colonne remplie de méthanol et ρ la masse volumique du solvant. Les masses volumiques du méthanol (ρ = 0,7866) et du chloroforme (ρ = 1,484) sont respectivement de 0,63 et 0,55. La porosité totale de la colonne à particules de silice-C18 (100 × 1,8 mm DI)³⁴ et de notre colonne C18-urée précédemment étudiée³¹ est donc de 0,63. Ceci indique que la présence de ligands urée réduit la perméabilité de la phase stationnaire. Par ailleurs, la porosité totale de la colonne PMP (diamètre intérieur 100 × 1,8 mm) est de 0,60. Les colonnes PMP sont moins perméables que les colonnes garnies de particules de silice liées au C18, car dans les phases stationnaires de type C18, les ligands C18 sont fixés aux particules de silice sous forme de chaînes linéaires, tandis que dans les phases stationnaires de type polystyrène, un polymère relativement épais se forme autour des particules (couche A). Dans une expérience typique, la porosité de la colonne est calculée comme suit :
Les figures 7A et 7B présentent les courbes de Van Deemter obtenues avec une colonne PMP (diamètre interne 100 x 1,8 mm) et une colonne Ascentis Express RP-Amide (diamètre interne 100 x 1,8 mm) dans les mêmes conditions d'élution (60/40 ACN/H₂O et 0,1 % TFA, débit de 20 à 800 µl/min pour les deux colonnes). Les valeurs minimales de HETP au débit optimal (80 µl/min) étaient de 2,6 µm pour la colonne PMP et de 3,9 µm pour la colonne Ascentis Express RP-Amide. Ces valeurs de HETP indiquent que l'efficacité de séparation de la colonne PMP (diamètre interne 100 x 1,8 mm) est nettement supérieure à celle de la colonne Ascentis Express RP-Amide (diamètre interne 100 x 1,8 mm) disponible dans le commerce. Le graphique de van Deemter (Fig. 7A) montre que la diminution de la valeur de N avec l'augmentation du débit n'est pas significativement plus importante que dans notre étude précédente. L'efficacité de séparation supérieure de la colonne PMP (diamètre interne 100 × 1,8 mm) par rapport à la colonne Ascentis Express RP-Amide est due à l'amélioration de la forme et de la taille des particules ainsi qu'à la méthode de remplissage sophistiquée utilisée dans cette étude³⁴.
(A) Courbe de Van Deemter (HETP en fonction de la vitesse linéaire de la phase mobile) obtenue sur une colonne PMP (diamètre interne 100 x 1,8 mm) dans un mélange 60/40 ACN/H₂O contenant 0,1 % de TFA. (B) Courbe de Van Deemter (HETP en fonction de la vitesse linéaire de la phase mobile) obtenue sur une colonne Ascentis Express RP-Amide (diamètre interne 100 x 1,8 mm) dans un mélange 60/40 ACN/H₂O contenant 0,1 % de TFA.
Une phase stationnaire polaire de polystyrène intercalé a été préparée et évaluée pour la séparation d'un mélange de peptides synthétiques et d'hydrolysat trypsique d'albumine sérique humaine (HSA) par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Les performances chromatographiques des colonnes PMP pour les mélanges peptidiques sont excellentes en termes d'efficacité de séparation et de résolution. Cette efficacité accrue est due à plusieurs facteurs, tels que la taille des particules de silice et la porosité, la synthèse contrôlée des phases stationnaires et la complexité des matériaux de remplissage de la colonne. Outre cette haute efficacité de séparation, cette phase stationnaire présente également l'avantage d'une faible contre-pression à haut débit. Les colonnes PMP sont très reproductibles et peuvent être utilisées pour l'analyse de mélanges de peptides et de produits de digestion trypsique de diverses protéines. Nous envisageons d'utiliser cette colonne pour la séparation de composés bioactifs issus de produits naturels, d'extraits de plantes médicinales et de champignons par chromatographie liquide. À l'avenir, les colonnes PMP seront également évaluées pour la séparation de protéines et d'anticorps monoclonaux.
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