نشكرك على زيارة موقع Nature.com. أنت تستخدم متصفحًا يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). بالإضافة إلى ذلك، ولضمان استمرار الدعم، نعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
يعرض شريطًا دائريًا من ثلاث شرائح في وقت واحد. استخدم زري "السابق" و"التالي" للتنقل بين الشرائح الثلاث في كل مرة، أو استخدم أزرار التمرير في النهاية للتنقل بين الشرائح الثلاث في كل مرة.
تم تحضير جزيئات السيليكا المسامية باستخدام طريقة سول-جل مع بعض التعديلات للحصول على جزيئات ذات مسام واسعة. ثم تم اشتقاق هذه الجزيئات باستخدام N-فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات (PMI) والستايرين عبر بلمرة نقل السلسلة العكسية-التجزئة (RAFT) لإنتاج بولي أميدات متداخلة مع N-فينيل ماليميد. استُخدم الستايرين (PMP) كطور ثابت. تم تعبئة أعمدة الفولاذ المقاوم للصدأ ذات التجويف الضيق (100 × 1.8 مم قطر داخلي) بمادة حشو معلقة. تم تقييم الأداء الكروماتوغرافي لعمود PMP لفصل خليط من الببتيدات الاصطناعية يتكون من خمسة ببتيدات (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، Leu amino acid enkephalin) ومحلول التحلل التربسيني لألبومين مصل الدم البشري (HAS). في ظل ظروف الإذابة المثلى، بلغ العدد النظري للصفائح التي تحتوي على خليط من الببتيدات 280,000 صفيحة/متر مربع. وبمقارنة أداء الفصل للعمود المُطوَّر مع عمود Ascentis Express RP-Amide التجاري، لوحظ أن كفاءة فصل عمود PMP كانت متفوقة على العمود التجاري من حيث كفاءة الفصل والدقة.
أصبحت صناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية سوقًا عالميًا متناميًا، مع زيادة ملحوظة في حصتها السوقية خلال السنوات الأخيرة. ومع هذا النمو الهائل، تبرز الحاجة الماسة لتحليل الببتيدات والبروتينات. فبالإضافة إلى الببتيد المستهدف، تتشكل شوائب متنوعة أثناء عملية تصنيعه، مما يستلزم تنقية كروماتوغرافية للحصول على النقاء المطلوب. ويُعد تحليل وتوصيف البروتينات في سوائل الجسم والأنسجة والخلايا مهمة بالغة الصعوبة نظرًا لكثرة الأنواع التي يمكن الكشف عنها في العينة الواحدة. ورغم أن مطياف الكتلة أداة فعالة لتسلسل الببتيدات والبروتينات، إلا أن إدخال هذه العينات مباشرةً إلى مطياف الكتلة يُؤدي إلى فصل غير مُرضٍ. ويمكن حل هذه المشكلة بإجراء كروماتوغرافيا سائلة (LC) قبل تحليل مطياف الكتلة، مما يُقلل كمية المواد المراد تحليلها الداخلة إلى مطياف الكتلة في وقت محدد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمواد المراد تحليلها أن تتركز في منطقة ضيقة أثناء فصل الطور السائل، مما يؤدي إلى تركيزها وزيادة حساسية الكشف باستخدام مطياف الكتلة. وقد شهدت تقنية الاستشراب السائل (LC) تطورًا ملحوظًا خلال العقد الماضي، وأصبحت طريقة شائعة الاستخدام في تحليل البروتينات.
تُستخدم كروماتوغرافيا السائل ذي الطور العكسي (RP-LC) على نطاق واسع لتنقية وفصل مخاليط الببتيدات باستخدام السيليكا المعدلة بالأوكتاديسيل (ODS) كطور ثابت^11،12،13. ومع ذلك، ونظرًا لبنيتها المعقدة وطبيعتها المذبذبة^14،15، لا تستطيع الأطوار الثابتة في كروماتوغرافيا السائل ذي الطور العكسي توفير فصل مُرضٍ للببتيدات والبروتينات. لذلك، يتطلب تحليل الببتيدات والبروتينات التي تحتوي على أجزاء قطبية وغير قطبية أطوارًا ثابتة مصممة خصيصًا للتفاعل مع هذه المواد واحتجازها¹⁶. يمكن أن تكون كروماتوغرافيا الخلط، التي توفر تفاعلات متعددة الأنماط، بديلاً لكروماتوغرافيا السائل ذي الطور العكسي لفصل الببتيدات والبروتينات وغيرها من المخاليط المعقدة. وقد تم تحضير العديد من الأطوار الثابتة المختلطة، واستُخدمت أعمدة مملوءة بهذه الأطوار الثابتة لفصل الببتيدات والبروتينات^{17،18،19،20،21}. بسبب وجود مجموعات قطبية وغير قطبية، تُعدّ الأطوار الثابتة ذات الوضع المختلط (WAX/RPLC، HILIC/RPLC، التداخل القطبي/RPLC) مناسبة لفصل الببتيدات والبروتينات^{22،23،24،25،26،27،28}. تُظهر الأطوار الثابتة المتداخلة قطبيًا، ذات المجموعات القطبية المرتبطة تساهميًا، قدرات فصل جيدة وانتقائية فريدة للمواد التحليلية القطبية وغير القطبية، لأن الفصل يعتمد على التفاعل بين المادة التحليلية والطور الثابت (التفاعلات متعددة الأنماط)^{29،30،31،32}. مؤخرًا، حصل تشانغ وآخرون³⁰ على أطوار ثابتة من البوليامينات ذات نهايات بيهينيل، ونجحوا في فصل الهيدروكربونات، ومضادات الاكتئاب، والفلافونويدات، والنيوكليوسيدات، والإستروجينات، وبعض المواد التحليلية الأخرى. تحتوي المادة الثابتة المضمنة قطبيًا على مجموعات قطبية وغير قطبية، لذا يمكن استخدامها لفصل الببتيدات والبروتينات إلى أجزاء كارهة للماء ومحبة للماء. تتوفر الأعمدة القطبية المضمنة (مثل أعمدة C18 مع الأميد المضمن) تحت الاسم التجاري Ascentis Express RP-Amide columns، ولكن هذه الأعمدة لم تستخدم إلا لتحليل الأمين 33.
في هذه الدراسة، تم تحضير طور ثابت قطبي مُضمّن (N-فينيل ماليميد، مُضمّن بالبوليسترين) وتقييمه لفصل الببتيدات وفصل بروتين مصل الألبومين البشري (HSA) بواسطة إنزيم التربسين. استُخدمت الاستراتيجية التالية لتحضير الطور الثابت: تم تحضير جزيئات السيليكا المسامية وفقًا للإجراءات الموضحة في منشوراتنا السابقة، مع بعض التعديلات على مخططات التحضير 31، 34، 35، 36، 37، 38، 39. تم تعديل نسب اليوريا، والبولي إيثيلين جليكول (PEG)، وTMOS، وحمض الأسيتيك المائي للحصول على جزيئات سيليكا ذات أحجام مسام كبيرة. ثانيًا، تم تصنيع رابطة جديدة من فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات، واستُخدمت جزيئات السيليكا المُشتقة منها لتحضير أطوار ثابتة قطبية مُضمّنة. تم تعبئة الطور الثابت المُحضر في عمود من الفولاذ المقاوم للصدأ (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) وفقًا لمخطط تعبئة مُحسّن. يُساعد الاهتزاز الميكانيكي في تعبئة العمود لضمان طبقة متجانسة داخله. تم تقييم العمود المعبأ لفصل خليط من خمسة ببتيدات (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، ببتيد الليوسين-إنكيفالين) مع مُستخلصات التريبسين لألبومين مصل الدم البشري (HSA). لوحظ أن خليط الببتيدات ومستخلص التريبسين لألبومين مصل الدم البشري انفصلا بدقة وكفاءة عاليتين. قورنت كفاءة فصل عمود PMP بكفاءة عمود Ascentis Express RP-Amide. تبين أن الببتيدات والبروتينات تتمتع بدقة وكفاءة فصل عاليتين على عمود PMP، وأن كفاءة فصل عمود PMP أعلى من كفاءة عمود Ascentis Express RP-Amide.
بولي إيثيلين جلايكول (PEG)، يوريا، حمض الخليك، ثلاثي ميثوكسي أورثوسيليكات (TMOS)، ثلاثي ميثيل كلورو سيلان (TMCS)، تريبسين، ألبومين مصل الإنسان (HSA)، كلوريد الأمونيوم، يوريا، سداسي ميثيل ميثاكريلويل ثنائي سيلازان (HMDS)، كلوريد ميثاكريلويل (MC)، ستايرين، 4-هيدروكسي-TEMPO، بيروكسيد البنزويل (BPO)، أسيتونيتريل (ACN) لتحليل HPLC، ميثانول، 2-بروبانول، وأسيتون. شركة سيجما-ألدريتش (سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية).
تم تقليب مزيج من اليوريا (8 غ)، والبولي إيثيلين جليكول (8 غ)، و8 مل من حمض الأسيتيك بتركيز 0.01 مولار لمدة 10 دقائق، ثم أضيف إليه 24 مل من رباعي ميثوكسي سيلان (TMOS) مع التبريد بالثلج. سُخّن مزيج التفاعل عند 40 درجة مئوية لمدة 6 ساعات، ثم عند 120 درجة مئوية لمدة 8 ساعات في جهاز تعقيم من الفولاذ المقاوم للصدأ. تم فصل الماء، وجُفّف المتبقي عند 70 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. طُحنت الكتل اللينة المجففة جيدًا، ثم كُلّست في فرن عند 550 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. جُهّزت ثلاث دفعات، وخضعت للتحليل لاختبار قابلية تكرار أحجام الجسيمات، وحجم المسام، ومساحة السطح.
مجموعة قطبية وطور ثابت لسلاسل البوليسترين. يرد وصف إجراء التحضير أدناه.
تم إذابة 200 ملغ من N-فينيل ماليميد و100 ملغ من ميثيل فينيل إيزوسيانات في التولوين اللامائي، ثم أُضيف 0.1 مل من 2،2′-أزوإيزوبوتيرونيتريل (AIBN) إلى دورق التفاعل للحصول على بوليمر مشترك من فينيل ماليميد وميثيل فينيل إيزوسيانات (PMCP). سُخّن المزيج عند 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، ثم رُشّح وجُفّف في فرن عند 40 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
تم تشتيت جزيئات السيليكا المجففة (2 غرام) في التولوين الجاف (100 مل)، ثم تم تحريكها وتعريضها للموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق في قارورة ذات قاع مستدير سعتها 500 مل. تم إذابة PMCP (10 ملغ) في التولوين، ثم أضيفت قطرة قطرة إلى قارورة التفاعل باستخدام قمع إضافة. تم تسخين المزيج تحت الارتداد عند 100 درجة مئوية لمدة 8 ساعات، ثم تم ترشيحه وغسله بالأسيتون وتجفيفه عند 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. بعد ذلك، تم إذابة جزيئات السيليكا المرتبطة بـ PMCP (100 غرام) في التولوين (200 مل)، وأضيف إليها 4-هيدروكسي-TEMPO (2 مل) بوجود 100 ميكرولتر من ثنائي لورات ثنائي بيوتيل القصدير كمحفز. تم تحريك المزيج عند 50 درجة مئوية لمدة 8 ساعات، ثم تم ترشيحه وتجفيفه عند 50 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
تم تشتيت الستايرين (1 مل)، وبيروكسيد البنزويل (0.5 مل)، وجزيئات السيليكا المرتبطة بـ TEMPO-PMCP (1.5 غ) في التولوين، ثم تم تمرير غاز النيتروجين في المزيج. أُجريت عملية بلمرة الستايرين عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. غُسل الناتج بالميثانول وجُفف طوال الليل عند درجة حرارة 60 درجة مئوية. يوضح الشكل 1 المخطط العام للتفاعل.
أُزيلت الغازات من العينات عند درجة حرارة 393 كلفن لمدة ساعة واحدة حتى انخفض الضغط المتبقي إلى أقل من 10⁻³ تور. استُخدمت كمية النيتروجين الممتص عند الضغط النسبي P/P₀ = 0.99 لتحديد الحجم الكلي للمسام. دُرست مورفولوجيا جزيئات السيليكا النقية والمرتبطة بالليجاند باستخدام مجهر إلكتروني ماسح (هيتاشي هاي تكنولوجيز، طوكيو، اليابان). وُضعت العينات الجافة (جزيئات السيليكا النقية والمرتبطة بالليجاند) على قضبان ألومنيوم باستخدام شريط كربوني. رُسب الذهب على العينة باستخدام جهاز رش Q150T، حيث رُسبت طبقة من الذهب بسمك 5 نانومتر. يُحسّن هذا من كفاءة عملية الجهد المنخفض ويُوفر رشًا باردًا دقيقًا. أُجري التحليل العنصري باستخدام محلل التركيب العنصري Flash EA1112 من شركة Thermo Electron (والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية). استُخدم جهاز تحليل حجم الجسيمات Mastersizer 2000 من شركة Malvern (وورسيسترشاير، المملكة المتحدة) للحصول على توزيع حجم الجسيمات. تم تشتيت جسيمات السيليكا غير المطلية وجسيمات السيليكا المرتبطة بالليجاند (5 ملغ لكل منهما) في 5 مل من الإيزوبروبانول، ثم عُولجت بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق، ورُجّت لمدة 5 دقائق، ووُضعت على طاولة بصرية لجهاز Mastersizer. أُجري التحليل الحراري الوزني بمعدل 5 درجات مئوية في الدقيقة في نطاق درجة حرارة من 30 إلى 800 درجة مئوية.
تم تعبئة أعمدة من الفولاذ المقاوم للصدأ ذات تجويف ضيق مبطنة بألياف زجاجية (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) باستخدام طريقة التعبئة بالمعلق، باتباع نفس الإجراء المذكور في المرجع 31. تم توصيل عمود الفولاذ المقاوم للصدأ (المبطن بالزجاج، قطر داخلي 100 × 1.8 مم) ومخرج يحتوي على مرشح مسامي 1 ميكرومتر بجهاز تعبئة المعلق (Alltech، ديرفيلد، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية). تم تحضير معلق الطور الثابت بتعليق 150 ملغ من الطور الثابت في 1.2 مل من الميثانول وتغذيته إلى عمود الخزان. استُخدم الميثانول كمذيب للمعلق ومذيب تحكم. تم تعبئة العمود بتطبيق سلسلة ضغط مقدارها 100 ميجا باسكال لمدة 10 دقائق، ثم 80 ميجا باسكال لمدة 15 دقيقة، ثم 60 ميجا باسكال لمدة 30 دقيقة. استخدمت عملية التعبئة جهازي اهتزاز لأعمدة كروماتوغرافيا الغاز (Alltech، ديرفيلد، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية) للاهتزاز الميكانيكي لضمان تعبئة متجانسة للعمود. أغلق حشوة الملاط وحرر الضغط ببطء لتجنب تلف السلسلة. تم فصل العمود عن فوهة الملاط، وتم تركيب وصلة أخرى على المدخل وتوصيلها بنظام كروماتوغرافيا السائل لاختبار تشغيله.
تم تصميم عمود كروماتوغرافي متعدد الطبقات (MLC) مخصص باستخدام مضخة كروماتوغرافيا سائلة (10AD Shimadzu، اليابان)، وجهاز أخذ عينات بحلقة حقن سعتها 50 نانولتر (Valco (الولايات المتحدة الأمريكية) C14 W.05)، وجهاز إزالة غازات غشائي (Shimadzu DGU-14A)، ونافذة شعرية للأشعة فوق البنفسجية والمرئية. استُخدمت أنابيب توصيل قصيرة وضيقة جدًا لتقليل تأثير التمدد الإضافي للعمود. بعد ملء العمود، تم تركيب أنبوب شعري (قطره الداخلي 50 ميكرومتر) عند مخرج وصلة الاختزال (1/16 بوصة)، ثم تم تركيب أنبوب شعري آخر (قطره 50 ميكرومتر) عند وصلة الاختزال نفسها. تم جمع البيانات ومعالجة الكروماتوغرام باستخدام برنامج Multichro 2000. عند 254 نانومتر، تم رصد امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للمواد التحليلية عند 0. تم تحليل البيانات الكروماتوغرافية باستخدام OriginPro8 (نورثامبتون، ماساتشوستس).
يُخلط 3 ملغ من ألبومين مصل الدم البشري، مسحوق مجفف بالتجميد، ≥ 96% (حسب نتائج الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز)، مع 1.5 ملغ من التربسين، و1 مل من اليوريا بتركيز 4.0 مولار، و1 مل من بيكربونات الأمونيوم بتركيز 0.2 مولار. يُحرّك المحلول لمدة 10 دقائق، ثم يُحفظ في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات، ثم يُوقف التفاعل بإضافة 1 مل من حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك بتركيز 0.1%. يُرشّح المحلول ويُحفظ في درجة حرارة أقل من 4 درجات مئوية.
تم تقييم فصل خليط من الببتيدات وهضم التربسين لبروتين مصل الألبومين البشري (HSA) على عمود PMP بشكل منفصل. تحقق من التحلل التربسيني لخليط الببتيدات وبروتين مصل الألبومين البشري (HSA) المفصول بواسطة عمود PMP وقارن النتائج مع عمود Ascentis Express RP-Amide. يتم حساب عدد الصفائح النظرية باستخدام المعادلة التالية:
تُظهر الصورة 2 صورًا مجهرية إلكترونية ماسحة (SEM) لجزيئات السيليكا النقية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالليجاند. تُظهر صور جزيئات السيليكا النقية (أ، ب) شكلًا كرويًا، حيث تكون الجزيئات مستطيلة أو ذات تناظر غير منتظم مقارنةً بدراساتنا السابقة. أما سطح جزيئات السيليكا المرتبطة بالليجاند (ج، د) فهو أكثر نعومة من سطح جزيئات السيليكا النقية، وقد يُعزى ذلك إلى سلاسل البوليسترين التي تُغطي سطح جزيئات السيليكا.
صور مجهرية إلكترونية ماسحة لجزيئات السيليكا النقية (A، B) وجزيئات السيليكا المرتبطة بالليجاند (C، D).
يوضح الشكل 2.3 (أ) توزيع حجم جسيمات السيليكا النقية وجسيمات السيليكا المرتبطة بالليجاند. وأظهرت منحنيات توزيع حجم الجسيمات الحجمية زيادة في حجم جسيمات السيليكا بعد التعديل الكيميائي (الشكل 3 أ). ويُقارن الجدول 1 (أ) بيانات توزيع حجم جسيمات السيليكا من هذه الدراسة مع الدراسة السابقة. بلغ حجم الجسيمات الحجمي d(0.5) لـ PMP 3.36 ميكرومتر، مقارنةً بقيمة ad(0.5) البالغة 3.05 ميكرومتر في دراستنا السابقة (جسيمات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين)³⁴. ونظرًا لتغير نسبة PEG واليوريا وTMOS وحمض الأسيتيك في خليط التفاعل، كان توزيع حجم الجسيمات في هذه الدفعة أضيق مقارنةً بدراستنا السابقة. ويُعد حجم جسيمات طور PMP أكبر قليلًا من حجم جسيمات طور جسيمات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين التي درسناها سابقًا. وهذا يعني أن عملية التوظيف السطحي لجزيئات السيليكا باستخدام الستايرين أدت إلى ترسب طبقة من البوليسترين (0.97 ميكرومتر) فقط على سطح السيليكا، بينما في طور PMP كان سمك الطبقة 1.38 ميكرومتر.
توزيع حجم الجسيمات (أ) وتوزيع حجم المسام (ب) لجسيمات السيليكا النقية وجسيمات السيليكا المرتبطة بالليجاند.
يوضح الجدول 1 (ب) حجم المسام، وحجم المسام، ومساحة سطح جزيئات السيليكا المستخدمة في هذه الدراسة. كما يوضح الشكل 3 (ب) توزيع حجم المسام لجزيئات السيليكا النقية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالليجاند. وكانت النتائج مماثلة لدراستنا السابقة³⁴. بلغ حجم مسام جزيئات السيليكا النقية 310 أنغستروم، بينما بلغ حجم مسام جزيئات السيليكا المرتبطة بالليجاند 241 أنغستروم، مما يشير إلى انخفاض حجم المسام بمقدار 69 أنغستروم بعد التعديل الكيميائي، كما هو موضح في الجدول 1 (ب)، ويظهر منحنى التغير في الشكل. تبلغ مساحة السطح النوعية لجزيئات السيليكا في هذه الدراسة 116 م²/غ، وهي قيمة مماثلة لدراستنا السابقة (124 م²/غ). وكما هو موضح في الجدول 1 (ب)، انخفضت مساحة سطح جزيئات السيليكا (م²/غ) بعد التعديل الكيميائي من 116 م²/غ إلى 105 م²/غ.
تُعرض نتائج التحليل العنصري للطور الثابت في الجدول 2. يبلغ محتوى الكربون في الطور الثابت الحالي 6.35%، وهو أقل من النسبة في دراستنا السابقة (جسيمات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين، 7.93% و10.21% على التوالي).⁴² ويعود انخفاض محتوى الكربون في الطور الثابت الحالي إلى استخدام بعض الروابط القطبية، مثل فينيل ماليميد ميثيل فينيل إيزوسيانات (PCMP) و4-هيدروكسي-TEMPO، بالإضافة إلى الستايرين في تحضير الطور الثابت. تبلغ النسبة المئوية الوزنية للنيتروجين في الطور الثابت الحالي 2.21%، مقارنةً بـ 0.17% و0.85% في الدراسات السابقة.⁴² وهذا يعني أن الطور الثابت الحالي يحتوي على نسبة عالية من النيتروجين بسبب وجود فينيل ماليميد. وبالمثل، يحتوي المنتجان (4) و(5) على نسبة كربون تبلغ 2.7% و2.9% على التوالي، بينما يحتوي المنتج النهائي (6) على نسبة كربون تبلغ 6.35%، كما هو موضح في الجدول 2. استُخدم التحليل الحراري الوزني (TGA) على الطور الثابت لـ PMP لاختبار فقدان الوزن، ويظهر منحنى TGA في الشكل 4. يُظهر منحنى TGA فقدانًا في الوزن بنسبة 8.6%، وهو ما يتوافق جيدًا مع نسبة الكربون (6.35%)، نظرًا لأن الروابط لا تحتوي على الكربون فقط، بل تحتوي أيضًا على النيتروجين والأكسجين والهيدروجين.
تم اختيار الليجاند فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات لتعديل سطح جزيئات السيليكا نظرًا لمجموعتي فينيل ماليميد وفينيل إيزوسيانات القطبيتين. تتفاعل مجموعات فينيل إيزوسيانات مع الستايرين عبر بلمرة الجذور الحرة الحية. والسبب الثاني هو إدخال مجموعة ذات تفاعلات معتدلة مع المادة المراد تحليلها، ودون تفاعلات كهروستاتيكية قوية بين المادة المراد تحليلها والطور الثابت، نظرًا لأن جزء فينيل ماليميد لا يحمل شحنة افتراضية عند درجة الحموضة الطبيعية. يمكن التحكم في قطبية الطور الثابت من خلال الكمية المثلى من الستايرين وزمن تفاعل بلمرة الجذور الحرة. تُعد الخطوة الأخيرة من التفاعل (بلمرة الجذور الحرة) حاسمة لأنها تُغير قطبية الطور الثابت. أُجري تحليل عنصري للتحقق من محتوى الكربون في هذه الأطوار الثابتة. لوحظ أن زيادة كمية الستايرين وزمن التفاعل تزيد من محتوى الكربون في الطور الثابت، والعكس صحيح. تختلف حمولة الكربون في الأطوار الثابتة المُحضّرة بتراكيز مختلفة من الستايرين. وبالمثل، وُضعت هذه الأطوار الثابتة على أعمدة من الفولاذ المقاوم للصدأ، وفُحصت خصائصها الكروماتوغرافية (الانتقائية، والفصل، وقيمة N، إلخ). وبناءً على هذه التجارب، تم اختيار تركيبة مُثلى لتحضير الطور الثابت PMP لتوفير قطبية مُتحكّم بها واحتفاظ جيد بالمادة المُحلّلة.
تم تقييم عمود PMP أيضًا لتحليل خمسة مخاليط من الببتيدات (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، leucine-enkephalin) باستخدام سعة الطور المتحرك. 60/40 (حجم/حجم) أسيتونيتريل/ماء (0.1% حمض ثلاثي فلورو أسيتيك) بمعدل تدفق 80 ميكرولتر/دقيقة. في ظل ظروف الإذابة المثلى (200,000 صفيحة/م)، يبلغ عدد الصفائح النظرية (N) لكل عمود (100 × 1.8 مم) 20,000 ± 100. تُعرض قيم N لأعمدة PMP الثلاثة في الجدول 3، وتُعرض مخططات الكروماتوغرافيا في الشكل 5A. تم إجراء تحليل سريع بمعدل تدفق عالٍ (700 ميكرولتر/دقيقة) على عمود PMP، حيث تم فصل خمسة ببتيدات خلال دقيقة واحدة، مع قيمة N ممتازة تبلغ 13500 ± 330 لكل عمود (قطر 100 × 1.8 مم)، أي ما يعادل 135000 صفيحة/م (الشكل 5ب). تم ملء ثلاثة أعمدة من نفس الحجم (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) بثلاث دفعات مختلفة من الطور الثابت PMP لاختبار قابلية التكرار. تم تسجيل المواد المُحللة لكل عمود بفصل نفس خليط الاختبار على كل عمود باستخدام ظروف الفصل المثلى، وعدد الصفائح النظرية N، ووقت الاحتفاظ. تُظهر بيانات قابلية التكرار لأعمدة PMP في الجدول 4. وقد ارتبطت قابلية تكرار عمود PMP ارتباطًا وثيقًا بقيم %RSD منخفضة جدًا كما هو موضح في الجدول 3.
فصل مخاليط الببتيد على عمود PMP (B) وعمود Ascentis Express RP-Amide (A)، الطور المتحرك 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1٪)، أبعاد عمود PMP (100 × 1.8 مم id)، ترتيب استخلاص المركبات: 1 (Gly-Tyr)، 2 (Gly-Leu-Tyr)، 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg)، 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) و 5 (حمض الليوسيك إنكيفالين).
تم تقييم عمود PMP (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) لفصل ناتج التحلل التريبسيني لألبومين مصل الدم البشري باستخدام تقنية HPLC. يُظهر مخطط الكروماتوغرافيا في الشكل 6 فصلًا جيدًا للعينات بدقة عالية. تم تحليل محاليل HSA باستخدام معدل تدفق 100 ميكرولتر/دقيقة، وطور متحرك مكون من 70/30 أسيتونيتريل/ماء و0.1% حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA). تم تقسيم ناتج تحلل HSA إلى 17 قمة، كما هو موضح في مخطط الكروماتوغرافيا (الشكل 6)، والتي تُقابل 17 ببتيدًا. تم حساب كفاءة فصل كل قمة من ناتج تحلل HSA، والنتائج موضحة في الجدول 5.
تم فصل الهيدروليزات التربسينية لـ HSA على عمود PMP (القطر الداخلي 100 × 1.8 مم)، ومعدل التدفق (100 ميكرولتر/دقيقة)، والطور المتحرك 60/40 أسيتونيتريل/ماء، و0.1% TFA.
حيث L هو طول العمود، وη لزوجة الطور المتحرك، وΔP ضغط الارتداد في العمود، وu السرعة الخطية للطور المتحرك. بلغت نفاذية عمود PMP 2.5 × 10⁻¹⁴ م²، ومعدل التدفق 25 ميكرولتر/دقيقة، واستُخدم مزيج من الأسيتونيتريل والماء بنسبة 60/40 حجم/حجم. كانت نفاذية عمود PMP (قطره الداخلي 100 × 1.8 مم) مماثلة لتلك المذكورة في دراستنا السابقة (المرجع 34). تبلغ نفاذية عمود مملوء بجزيئات مسامية سطحية 1.7 × 10⁶ ميكرومتر، و2.5 × 10⁻¹⁴ م² لجزيئات قطرها 5 ميكرومتر (المرجع 43). لذلك، فإن نفاذية طور PMP مماثلة لنفاذية جزيئات الغلاف واللب ذات حجم 5 ميكرومتر.
حيث Wx هي كتلة العمود المملوء بالكلوروفورم، وWy هي كتلة العمود المملوء بالميثانول، وρ هي كثافة المذيب. كثافة الميثانول (ρ = 0.7866) وكثافة الكلوروفورم (ρ = 1.484). بلغت المسامية الكلية لعمود جسيمات السيليكا-C18 (قطر داخلي 100 × 1.8 مم)³⁴ وعمود اليوريا-C18 الذي درسناه سابقًا³¹ 0.63 و0.55 على التوالي. هذا يعني أن وجود روابط اليوريا يقلل من نفاذية الطور الثابت. من ناحية أخرى، تبلغ المسامية الكلية لعمود PMP (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) 0.60. تتميز أعمدة PMP بنفاذية أقل من الأعمدة المعبأة بجزيئات السيليكا المرتبطة بـ C18، وذلك لأن روابط C18 في الأطوار الثابتة من نوع C18 ترتبط بجزيئات السيليكا في سلاسل خطية، بينما في الأطوار الثابتة من نوع البوليسترين، تتشكل طبقة بوليمرية سميكة نسبيًا حول الجزيئات. في تجربة نموذجية، تُحسب مسامية العمود كما يلي:
يوضح الشكلان 7أ و7ب مخططات فان ديمتر لعمود PMP (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) وعمود Ascentis Express RP-Amide (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) تحت نفس ظروف الإذابة، وهي 60/40 أسيتونيتريل/ماء و0.1% حمض ثلاثي فلورو أسيتيك، بمعدل تدفق يتراوح من 20 ميكرولتر/دقيقة إلى 800 ميكرولتر/دقيقة على كلا العمودين. بلغت أدنى قيم HETP عند معدل التدفق الأمثل (80 ميكرولتر/دقيقة) 2.6 ميكرومتر و3.9 ميكرومتر لعمود PMP وعمود Ascentis Express RP-Amide على التوالي. تشير قيم HETP إلى أن كفاءة فصل عمود PMP (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) أعلى بكثير من كفاءة عمود Ascentis Express RP-Amide المتوفر تجاريًا (قطر داخلي 100 × 1.8 مم). يُظهر الرسم البياني لفان ديمتر في الشكل 7 (أ) أن انخفاض قيمة N ليس أعلى بشكل ملحوظ مع زيادة التدفق مقارنةً بدراستنا السابقة. وتستند كفاءة الفصل الأعلى لعمود PMP (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) مقارنةً بعمود Ascentis Express RP-Amide إلى تحسين شكل وحجم الجسيمات وإجراءات تعبئة العمود المتطورة المستخدمة في هذا العمل.³⁴
(أ) مخطط فان ديمتر (HETP مقابل السرعة الخطية للطور المتحرك) تم الحصول عليه على عمود PMP (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) في خليط من الأسيتونيتريل/الماء بنسبة 60/40 مع 0.1% من حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك. (ب) مخطط فان ديمتر (HETP مقابل السرعة الخطية للطور المتحرك) تم الحصول عليه على عمود Ascentis Express RP-Amide (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) في خليط من الأسيتونيتريل/الماء بنسبة 60/40 مع 0.1% من حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك.
تم تحضير طور ثابت قطبي من البوليسترين المتداخل وتقييمه لفصل خليط من الببتيدات الاصطناعية والناتج المائي للتحلل التربسيني لألبومين مصل الدم البشري (HSA) باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء. يتميز أداء أعمدة PMP الكروماتوغرافي لخلائط الببتيدات بكفاءة فصل ودقة عاليتين. ويعود تحسن كفاءة الفصل في أعمدة PMP إلى عدة أسباب، منها حجم جزيئات السيليكا وحجم المسام، والتحكم في تصنيع الأطوار الثابتة، واستخدام مواد تعبئة معقدة للأعمدة. إضافةً إلى كفاءة الفصل العالية، يتميز هذا الطور الثابت بانخفاض ضغط العمود الخلفي عند معدلات التدفق العالية. تتميز أعمدة PMP بقابلية عالية للتكرار، ويمكن استخدامها لتحليل خلائط الببتيدات والهضم التربسيني لمختلف البروتينات. نعتزم استخدام هذا العمود لفصل المركبات النشطة بيولوجيًا من المنتجات الطبيعية، ومستخلصات النباتات الطبية والفطر باستخدام كروماتوغرافيا السائل. وفي المستقبل، سيتم تقييم أعمدة PMP أيضًا لفصل البروتينات والأجسام المضادة وحيدة النسيلة.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investing into reversed phase chromatography peptide chapter systems part I: Development of the protocol for column characterization. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investing into reversed phase chromatography peptide chapter systems part I: Development of the protocol for column characterization.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Investigation of Peptide Separation Systems by Reverse-Pase Chromatography, Part I: Developing a Protocol for the column characterization. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investing into reversed phase chromatography peptide chapter systems part I: Development of the protocol for column properties. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Investing into reversed phase chromatography peptide chapter systems part I: Development of the protocol for column properties.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., and Petersson, P. Investigation of Peptide Separation Systems by Reverse-Pase Chromatography, Part I: Developing a Protocol for the column characterization.J.色谱法Â 1603،113-129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
غوميز، ب. وآخرون. طرق لإنتاج ببتيدات فعالة محسّنة لعلاج الأمراض المعدية. التكنولوجيا الحيوية. الإنجازات 36(2)، 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. الببتيدات العلاجية الاصطناعية: العلم والسوق. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. الببتيدات العلاجية الاصطناعية: العلم والسوق.Vliege P, Lisowski V, Martinez J and Chreschatyski M. الببتيدات العلاجية الاصطناعية: العلم والسوق.فليج ب، ليسوفسكي ف، مارتينيز ج، وخريشاتسكي م. الببتيدات العلاجية الاصطناعية: العلم والسوق. اكتشاف الأدوية. اليوم 15 (1-2)، 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced proteomic liquid chromatography. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced proteomic liquid chromatography.انظر F.، سميث آر دي وشين يو. كروماتوغرافيا البروتين السائل المتقدمة. شيه، إف، سميث، آر دي وشين، واي. Xie، F.، Smith، RD & Shen، Y. تكوين البروتين المتقدم 液相色谱.انظر F.، سميث آر دي وشين يو. كروماتوغرافيا البروتين السائل المتقدمة.J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
ليو، و. وآخرون. تقنية كروماتوغرافيا السائل المتقدمة المقترنة بقياس الطيف الكتلي قادرة على الجمع بين علم الأيض وعلم البروتينات واسع النطاق. مجلة أنوس. شيم. أكتا 1069، 89-97 (2019).
تشيستنت، إس إم وسالزبوري، جيه جيه دور تقنية UHPLC في تطوير الأدوية. تشيستنت، إس إم وسالزبوري، جيه جيه دور تقنية UHPLC في تطوير الأدوية.تشيستنت، إس إم وسالزبوري، جيه جيه دور تقنية UHPLC في تطوير الأدوية.تشيستنت، إس إم وسالزبوري، جيه جيه. دور UHPLC في تطوير الأدوية. مجلة علوم الفصل. 30(8)، 1183-1190 (2007).
وو، ن. وكلاوسن، أ.م. الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوغرافيا السائلة ذات الضغط العالي للغاية من أجل عمليات الفصل السريعة. وو، ن. وكلاوسن، أ.م. الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوغرافيا السائلة ذات الضغط العالي للغاية من أجل عمليات الفصل السريعة.وو، ن. وكلاوسن، أ.م. الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط للفصل السريع. Wu، N. & Clausen، AM. وو، ن. وكلاوسن، أ.م. الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوغرافيا السائلة ذات الضغط العالي للغاية للفصل السريع.وو، ن. وكلاوسن، أ.م. الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوغرافيا السائلة عالية الضغط للفصل السريع.مجلة علوم الفصل. 30(8)، 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. استخدام كروماتوغرافيا السائل فائق الأداء في تطوير الأدوية. Wren, SA & Tchelitcheff, P. استخدام كروماتوغرافيا السائل فائق الأداء في تطوير الأدوية.رين، إس إيه وشيليشيف، بي. استخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء في تطوير الأدوية. رين، إس إيه وتشيليتشيف، بي. رين، إس إيه وتشيليتشيف، بي.رين، إس إيه وشيليشيف، بي. تطبيق كروماتوغرافيا السائل فائق الأداء في تطوير الأدوية.مجلة الكروماتوغرافيا. 1119(1-2)، 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. هيدروجيل متجانس ذو مسام كبيرة مشتق من مستحلب زيت في الماء مع طور داخلي عالي لتنقية فعالة لفيروس معوي 71. مجلة المشروع الكيميائي 401، 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA دور الكروماتوغرافيا السائلة في علم البروتينات. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA دور الكروماتوغرافيا السائلة في علم البروتينات.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. and Wilkins, JA دور الكروماتوغرافيا السائلة في علم البروتينات. شي، واي.، شيانغ، آر.، هورفاث، سي. ويلكنز، JA. شي، واي.، شيانغ، آر.، هورفاث، سي. & ويلكنز، JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. and Wilkins, JA دور الكروماتوغرافيا السائلة في علم البروتينات.J. Chromatography. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
فيكيت، إس.، فوتي، جيه.-إل. & Guillarme, D. الاتجاهات الجديدة في الفصل الكروماتوغرافي السائل ذي الطور العكسي للببتيدات والبروتينات العلاجية: النظرية والتطبيقات. & Guillarme, D. الاتجاهات الجديدة في الفصل الكروماتوغرافي السائل ذي الطور العكسي للببتيدات والبروتينات العلاجية: النظرية والتطبيقات. & Guillarme، D. اتجاهات جديدة في الببتيدات العلاجية المتنوعة والأفضل من خلال كروماتوغرافيا حيوية ذات طبيعة واضحة: النظرية والتطبيق. & Guillarme, D. الاتجاهات الجديدة في فصل الببتيدات العلاجية والبروتينات بواسطة كروماتوغرافيا السائل العكسي: النظرية والتطبيقات. & Guillame، D. & Guillarme, D.و Guillarmé، D. الاتجاهات الجديدة في فصل الببتيدات والبروتينات العلاجية بواسطة كروماتوغرافيا السائل العكسي: النظرية والتطبيقات.J. Pharm. Biomedical Science. anus. 69, 9–27 (2012).
جيلار، م.، أوليفوفا، ب.، دالي، أ.إ. وجيبلر، ج.س. الفصل ثنائي الأبعاد للببتيدات باستخدام نظام RP-RP-HPLC مع درجة حموضة مختلفة في البعدين الأول والثاني للفصل. جيلار، م.، أوليفوفا، ب.، دالي، أ.إ. وجيبلر، ج.س. الفصل ثنائي الأبعاد للببتيدات باستخدام نظام RP-RP-HPLC مع درجة حموضة مختلفة في البعدين الأول والثاني للفصل.جيلار م.، أوليفوفا ب.، دالي أ.إ. وجيبلر ج.ك. الفصل ثنائي الأبعاد للببتيدات باستخدام نظام RP-RP-HPLC مع درجة حموضة مختلفة في البعدين الأول والثاني للفصل.جيلار م.، أوليفوفا ب.، دالي أ.إ.، وجيبلر ج.ك. الفصل ثنائي الأبعاد للببتيدات باستخدام قيم أس هيدروجيني مختلفة في بُعدي الفصل الأول والثاني باستخدام نظام RP-RP-HPLC. مجلة علوم الفصل. 28 (14)، 1694-1703 (2005).
فيليتي، إس. وآخرون. دراسة انتقال الكتلة والخصائص الحركية لأعمدة كروماتوغرافيا عالية الأداء معبأة بجزيئات C18 مسامية بالكامل وجزيئات مسامية سطحية أصغر من 2 ميكرومتر. مجلة علوم الفصل. 43 (9-10)، 1737-1745 (2020).
بيوفيسانا، س. وآخرون. الاتجاهات الحديثة والتحديات التحليلية في عزل وتحديد والتحقق من صحة الببتيدات النشطة بيولوجيًا في النباتات. مجلة الكيمياء التحليلية للحيوانات. 410(15)، 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
مولر، جيه بي وآخرون. المشهد البروتيني لمملكة الحياة. مجلة نيتشر 582 (7813)، 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. المعالجة اللاحقة للببتيدات العلاجية بواسطة كروماتوغرافيا السائل التحضيرية. Molecules (Basel, Switzerland) 26(15), 4688 (2021).
يانغ، واي. وجينغ، إكس. كروماتوغرافيا الوضع المختلط وتطبيقاتها على البوليمرات الحيوية. يانغ، واي. وجينغ، إكس. كروماتوغرافيا الوضع المختلط وتطبيقاتها على البوليمرات الحيوية.يانغ، يو. وجينغ، إكس. كروماتوغرافيا الوضع المختلط وتطبيقها على البوليمرات الحيوية. Yang، Y. & Geng، X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用. يانغ، واي. وجينغ، إكس. كروماتوغرافيا الوضع المختلط وتطبيقها في البوليمرات الحيوية.يانغ، يو. وجين، إكس. كروماتوغرافيا الوضع المختلط وتطبيقها على البوليمرات الحيوية.J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).