Takk for at du besøker Nature.com. Du bruker en nettleserversjon med begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I tillegg, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Viser en karusell med tre lysbilder samtidig. Bruk Forrige- og Neste-knappene for å gå gjennom tre lysbilder om gangen, eller bruk glidebryterknappene på slutten for å gå gjennom tre lysbilder om gangen.
Porøse silikapartikler ble fremstilt ved sol-gel-metoden med noen modifikasjoner for å oppnå partikler med brede porer. Disse partiklene ble derivatisert med N-fenylmaleimid-metylvinylisocyanat (PMI) og styren via reverskjedeoverføringsfragmentering (RAFT)-polymerisasjon for å produsere N-fenylmaleimid-interkalerte polyamider. Styren (PMP) stasjonær fase. Smalborede kolonner i rustfritt stål (100 × 1,8 mm indre diameter) ble pakket med en oppslemmingspakking. Den kromatografiske ytelsen til PMP-kolonnen ble evaluert for å separere en blanding av syntetiske peptider bestående av fem peptider (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu-aminosyre-enkefalin) og tryptisk hydrolysat av humant serumalbumin (HAS). Under optimale elueringsforhold nådde det teoretiske antallet plater med en blanding av peptider 280 000 plater/kvm. Ved sammenligning av separasjonsytelsen til den utviklede kolonnen med den kommersielle Ascentis Express RP-Amide-kolonnen ble det observert at separasjonseffektiviteten til PMP-kolonnen var bedre enn den kommersielle kolonnen når det gjelder separasjonseffektivitet og oppløsning.
Den biofarmasøytiske industrien har blitt et voksende globalt marked med en betydelig økning i markedsandel de siste årene. Med den eksplosive veksten i den biofarmasøytiske industrien1,2,3 er det et stort behov for peptid- og proteinanalyse. I tillegg til målpeptidet dannes det forskjellige urenheter under peptidsyntesen, så kromatografisk rensing er nødvendig for å oppnå ønsket renhet av peptidet. Analyse og karakterisering av proteiner i kroppsvæsker, vev og celler er en ekstremt utfordrende oppgave på grunn av det store antallet potensielt detekterbare arter som er tilstede i en enkelt prøve. Selv om massespektrometri er et effektivt verktøy for sekvensering av peptider og proteiner, vil separasjonen være utilfredsstillende hvis slike prøver introduseres direkte i massespektrometeret. Dette problemet kan løses ved å utføre væskekromatografi (LC) før MS-analyse, noe som vil redusere mengden analytter som kommer inn i massespektrometeret på et gitt tidspunkt4,5,6. I tillegg kan analytter konsentreres i et smalt område under væskefaseseparasjon, og dermed konsentrere disse analyttene og øke følsomheten til MS-deteksjon. Væskekromatografi (LC) har hatt betydelige fremskritt det siste tiåret og har blitt en mye brukt metode for proteomisk analyse 7,8,9,10.
Omvendt fasevæskekromatografi (RP-LC) er mye brukt for å rense og separere blandinger av peptider ved bruk av oktadecylmodifisert silika (ODS) som stasjonær fase11,12,13. På grunn av deres komplekse struktur og amfotere natur14,15 kan imidlertid ikke RP stasjonære faser gi en tilfredsstillende separasjon av peptider og proteiner. Derfor krever analyse av peptider og proteiner med polare og ikke-polare fragmenter spesialdesignede stasjonære faser for å samhandle og beholde disse analyttene16. Blandet kromatografi, som tilbyr multimodale interaksjoner, kan være et alternativ til RP-LC for å separere peptider, proteiner og andre komplekse blandinger. Flere stasjonære faser av blandet type ble fremstilt, og kolonner fylt med disse stasjonære fasene ble brukt til å separere peptider og proteiner17,18,19,20,21. På grunn av tilstedeværelsen av polare og ikke-polare grupper er blandede stasjonære faser (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar interkalering/RPLC) egnet for separasjon av peptider og proteiner22,23,24,25,26,27,28. , Polare interkalerte stasjonære faser med kovalent bundne polare grupper viser gode separasjonsegenskaper og unik selektivitet for polare og ikke-polare analytter fordi separasjonen avhenger av interaksjonen mellom analytten og den stasjonære fasen. Multimodale interaksjoner29,30,31,32. Nylig oppnådde Zhang et al.30 behenyl-terminerte stasjonære faser av polyaminer og separerte hydrokarboner, antidepressiva, flavonoider, nukleosider, østrogener og noen andre analytter. Det polare, innebygde stasjonære materialet har både polare og ikke-polare grupper, slik at det kan brukes til å separere peptider og proteiner i hydrofobe og hydrofile deler. Polare inline-kolonner (f.eks. C18-kolonner med amid inline) er tilgjengelige under handelsnavnet Ascentis Express RP-Amide-kolonner, men disse kolonnene har kun blitt brukt til analyse av amin 33.
I den nåværende studien ble en polar innebygd stasjonær fase (N-fenylmaleimid, innebygd polystyren) fremstilt og evaluert for peptidseparasjon og tryptisk HSA-spaltning. Følgende strategi ble brukt for å fremstille den stasjonære fasen. Porøse silikapartikler ble fremstilt i henhold til prosedyrene beskrevet i våre tidligere publikasjoner, med noen endringer i fremstillingsskjemaene 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Forholdene mellom urea, polyetylenglykol (PEG), TMOS og vandig eddiksyre ble justert for å oppnå silikapartikler med store porestørrelser. For det andre ble en ny fenylmaleimid-metylvinylisocyanatligand syntetisert, og dens derivatiserte silikapartikler ble brukt til å fremstille polare innebygde stasjonære faser. Den oppnådde stasjonære fasen ble pakket i en kolonne av rustfritt stål (indre diameter 100 × 1,8 mm) i henhold til et optimalisert pakkeskjema. Pakkingen av kolonnen hjelpes av mekanisk vibrasjon for å sikre et jevnt lag i kolonnen. Den pakkede kolonnen ble evaluert for separasjon av en blanding av peptider bestående av fem peptider (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalinpeptid) og tryptiske hydrolysater av humant serumalbumin (HSA). Det ble observert at peptidblandingen og HSA-tryptisk digest separerte med god oppløsning og effektivitet. Separasjonseffektiviteten til PMP-kolonnen ble sammenlignet med Ascentis Express RP-Amide-kolonnen. Det ble observert at peptider og proteiner har god oppløsning og høy separasjonseffektivitet på PMP-kolonnen, og separasjonseffektiviteten til PMP-kolonnen er høyere enn for Ascentis Express RP-Amide-kolonnen.
PEG (polyetylenglykol), urea, eddiksyre, trimetoksyortosilikat (TMOS), trimetylklorsilan (TMCS), trypsin, humant serumalbumin (HSA), ammoniumklorid, urea, heksametylmetakryloyldisilazan (HMDS), metakryloylklorid (MC), styren, 4-hydroksy-TEMPO, benzoylperoksid (BPO), acetonitril (ACN) for HPLC, metanol, 2-propanol og aceton. Sigma-Aldrich Company (St. Louis, Missouri, USA).
En blanding av urea (8 g), polyetylenglykol (8 g) og 8 ml 0,01 N eddiksyre ble omrørt i 10 minutter, og 24 ml TMOS ble tilsatt under iskjøling. Reaksjonsblandingen ble varmet opp ved 40 °C i 6 timer og deretter ved 120 °C i 8 timer i en autoklav av rustfritt stål. Vannet ble dekantert, og resten ble tørket ved 70 °C i 12 timer. De tørkede myke blokkene ble malt glatt og kalsinert i en ovn ved 550 °C i 12 timer. Tre batcher ble fremstilt og karakterisert for å teste reproduserbarheten av partikkelstørrelser, porestørrelse og overflateareal.
Polargruppe og stasjonær fase for polystyrenkjeder. Fremstillingsprosedyren er beskrevet nedenfor.
N-fenylmaleimid (200 mg) og metylvinylisocyanat (100 mg) ble løst opp i vannfri toluen, og deretter ble 0,1 ml 2,2'-azoisobutyronitril (AIBN) tilsatt reaksjonskolben for å oppnå en kopolymer av fenylmaleimid og metylvinylisocyanat (PMCP). Blandingen ble varmet opp ved 60 °C i 3 timer, filtrert og tørket i en ovn ved 40 °C i 3 timer.
Tørkede silikapartikler (2 g) ble dispergert i tørr toluen (100 ml), omrørt og sonikert i 10 minutter i en 500 ml rundbunnet kolbe. PMCP (10 mg) ble løst opp i toluen og tilsatt dråpevis til reaksjonskolben via en tilsetningstrakt. Blandingen ble kokt under tilbakeløp ved 100 °C i 8 timer, filtrert, vasket med aceton og tørket ved 60 °C i 3 timer. Deretter ble silikapartiklene assosiert med PMCP (100 g) løst opp i toluen (200 ml), og 4-hydroksy-TEMPO (2 ml) ble tilsatt i nærvær av 100 μl dibutyltinn-dilaurat som katalysator. Blandingen ble omrørt ved 50 °C i 8 timer, filtrert og tørket ved 50 °C i 3 timer.
Styren (1 ml), benzoylperoksid BPO (0,5 ml) og silikapartikler festet til TEMPO-PMCP (1,5 g) ble dispergert i toluen og renset med nitrogen. Polymerisasjonen av styren ble utført ved 100 °C i 12 timer. Det resulterende produktet ble vasket med metanol og tørket over natten ved 60 °C. Det generelle reaksjonsskjemaet er vist i figur én.
Prøvene ble avgasset ved 393 K i 1 time inntil et resttrykk på mindre enn 10–3 Torr ble oppnådd. Mengden N2 adsorbert ved relativt trykk P/P0 = 0,99 ble brukt til å bestemme det totale porevolumet. Morfologien til rene og ligandbundne silikapartikler ble undersøkt ved hjelp av et skanningselektronmikroskop (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Tørre prøver (ren silika og ligandbundne silikapartikler) ble plassert på aluminiumsstenger ved hjelp av karbontape. Gull ble avsatt på prøven ved hjelp av en Q150T-sputteringsenhet, og et 5 nm tykt Au-lag ble avsatt på prøven. Dette forbedrer effektiviteten til lavspenningsprosessen og gir fin kaldsprøyting. Elementanalyse ble utført ved hjelp av en Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elementsammensetningsanalysator. En Malvern-partikkelstørrelsesanalysator (Worcestershire, Storbritannia) Mastersizer 2000 ble brukt til å bestemme partikkelstørrelsesfordelingen. Ubelagte silikapartikler og ligandbundne silikapartikler (5 mg hver) ble dispergert i 5 ml isopropanol, sonikert i 10 minutter, omrørt i 5 minutter og plassert på en Mastersizer optisk benk. Termogravimetrisk analyse utføres med en hastighet på 5 °C per minutt i temperaturområdet fra 30 til 800 °C.
Glassfiberforede kolonner av rustfritt stål med smale boringer og dimensjoner (ID 100 × 1,8 mm) ble pakket med slamfyllingsmetode etter samme prosedyre som i referanse 31. Kolonne av rustfritt stål (glassforet, ID 100 × 1,8 mm) og et utløp som inneholdt en 1 µm fritte ble koblet til en slampakkemaskin (Alltech Deerfield, IL, USA). Lag en suspensjon av den stasjonære fasen ved å suspendere 150 mg av den stasjonære fasen i 1,2 ml metanol og mate den inn i en reservoarkolonne. Metanol ble brukt som slamløsningsmiddel og kontrollløsningsmiddel. Pakk kolonnen ved å påføre en trykksekvens på 100 MP i 10 min, 80 MP i 15 min og 60 MP i 30 min. Pakkingsprosessen brukte to gasskromatografikolonnevibratorer (Alltech, Deerfield, IL, USA) for mekanisk vibrasjon for å sikre jevn kolonnepakking. Lukk slampakkeren og slipp trykket sakte for å forhindre skade på strengen. Kolonnen ble frakoblet slamdysen, og en annen kopling ble festet til innløpet og koblet til LC-systemet for å teste driften.
En spesialtilpasset MLC ble konstruert ved hjelp av en LC-pumpe (10AD Shimadzu, Japan), en prøvetaker med en 50 nL injeksjonssløyfe (Valco (USA) C14 W.05), en membranavgasser (Shimadzu DGU-14A) og et UV-VIS-kapillærvindu. Detektorenhet (UV-2075) og emaljert mikrokolonne. Bruk svært smale og korte forbindelsesrør for å minimere effekten av ytterligere kolonneekspansjon. Etter at kolonnen er fylt, installer et kapillærrør (50 µm id 365) ved utløpet av 1/16″ reduserende overgang og installer et kapillærrør (50 µm) i reduserende overgang. Datainnsamling og kromatogrambehandling utføres ved hjelp av Multichro 2000-programvaren. Ved 254 nm ble UV-absorbansen til forsøksanalyttene overvåket ved 0. Kromatografiske data ble analysert ved hjelp av OriginPro8 (Northampton, MA).
Humant serumalbumin, frysetørket pulver, ≥ 96 % (agarosegelelektroforese) 3 mg blandet med trypsin (1,5 mg), 4,0 M urea (1 ml) og 0,2 M ammoniumbikarbonat (1 ml). Løsningen ble omrørt i 10 minutter og holdt i et vannbad ved 37 °C i 6 timer, deretter bråkjølt med 1 ml 0,1 % TFA. Filtrer løsningen og oppbevar under 4 °C.
Separasjon av en blanding av peptider og tryptisk fordøyd HSA på en PMP-kolonne ble evaluert separat. Sjekk den tryptiske hydrolysen av en blanding av peptider og HSA separert av en PMP-kolonne og sammenlign resultatene med en Ascentis Express RP-Amide-kolonne. Antall teoretiske plater beregnes ved hjelp av følgende ligning:
SEM-bilder av rene silikapartikler og ligandbundne silikapartikler er vist i figur 2. SEM-bilder av rene silikapartikler (A, B) viser en sfærisk form der partiklene er forlengede eller har uregelmessig symmetri sammenlignet med våre tidligere studier. Overflaten til silikapartiklene bundet av liganden (C, D) er glattere enn rene silikapartikler, noe som kan skyldes polystyrenkjedene som dekker overflaten av silikapartiklene.
Skanningselektronmikroskopibilder av rene silikapartikler (A, B) og ligandbundne silikapartikler (C, D).
Partikkelstørrelsesfordelingen av rene silikapartikler og ligandbundne silikapartikler er vist i figur 2.3(A). Volumetriske partikkelstørrelsesfordelingskurver viste at silikapartikkelstørrelsen økte etter kjemisk modifisering (figur 3A). Dataene for silikapartikkelstørrelsesfordeling fra den nåværende studien og den forrige studien er sammenlignet i tabell 1(A). Den volumetriske partikkelstørrelsen d(0,5) for PMP var 3,36 µm, sammenlignet med ad(0,5)-verdien på 3,05 µm i vår tidligere studie (polystyrenbundne silikapartikler)34. På grunn av endringen i forholdet mellom PEG, urea, TMOS og eddiksyre i reaksjonsblandingen, var partikkelstørrelsesfordelingen for denne batchen smalere sammenlignet med vår tidligere studie. Partikkelstørrelsen til PMP-fasen er litt større enn for den polystyrenbundne silikapartikkelfasen som vi studerte tidligere. Dette betyr at overflatefunksjonaliseringen av silikapartikler med styren kun avsatte et polystyrenlag (0,97 µm) på silikoverflaten, mens lagtykkelsen i PMP-fasen var 1,38 µm.
Partikkelstørrelsesfordeling (A) og porestørrelsesfordeling (B) av rene silikapartikler og ligandbundne silikapartikler.
Porestørrelsen, porevolumet og overflatearealet til silikapartiklene som ble brukt i denne studien er vist i tabell 1 (B). PSD-profilene til rene silikapartikler og ligandbundne silikapartikler er vist i figur 3 (B). Resultatene var sammenlignbare med vår tidligere studie34. Porestørrelsene til rene og ligandbundne silikapartikler var henholdsvis 310 Å og 241 Å, noe som indikerer at porestørrelsen ble redusert med 69 Å etter kjemisk modifisering, som vist i tabell 1 (B), og forskyvningskurven er vist i figur 3. Det spesifikke overflatearealet til silikapartiklene i den aktuelle studien er 116 m2/g, som er sammenlignbart med vår tidligere studie (124 m2/g). Som vist i tabell 1 (B), ble overflatearealet (m2/g) til silikapartiklene etter kjemisk modifisering også redusert fra 116 m2/g til 105 m2/g.
Resultatene av elementanalysen av den stasjonære fasen er presentert i tabell 2. Karboninnholdet i den nåværende stasjonære fasen er 6,35 %, som er lavere enn i vår tidligere studie (silikapartikler assosiert med polystyren, henholdsvis 7,93 %35 og 10,21 %)42. Karboninnholdet i den nåværende stasjonære fasen er nedenfor, siden noen polare ligander som fenylmaleimidmetylvinylisocyanat (PCMP) og 4-hydroksy-TEMPO har blitt brukt i tillegg til styren i fremstillingen av SP. Vektprosenten av nitrogen i den nåværende stasjonære fasen er 2,21 % sammenlignet med 0,1735 og 0,85 % i tidligere studier42. Dette betyr at den nåværende stasjonære fasen har en høy vektprosent av nitrogen på grunn av fenylmaleimidet. På samme måte har produktene (4) og (5) et karboninnhold på henholdsvis 2,7 % og 2,9 %, mens sluttproduktet (6) har et karboninnhold på 6,35 %, som vist i tabell 2. Termogravimetrisk analyse (TGA) ble brukt på den stasjonære fasen av PMP for å teste vekttap, og TGA-kurven er vist i figur 4. TGA-kurven viser et vekttap på 8,6 %, noe som stemmer godt overens med karboninnholdet (6,35 %), siden ligandene ikke bare inneholder C1, men også N2, O2 og H2.
Liganden fenylmaleimid-metylvinylisocyanat ble valgt for å modifisere overflaten av silikapartiklene på grunn av dens polare fenylmaleimid- og vinylisocyanatgrupper. Vinylisocyanatgrupper kan reagere videre med styren ved levende radikalpolymerisasjon. Den andre grunnen er å sette inn en gruppe som har moderate interaksjoner med analytten og ingen sterke elektrostatiske interaksjoner mellom analytten og den stasjonære fasen, siden fenylmaleimiddelen ikke har noen virtuell ladning ved normal pH. Polariteten til den stasjonære fasen kan kontrolleres av den optimale mengden styren og reaksjonstiden for friradikalpolymerisasjonen. Det siste trinnet i reaksjonen (friradikalpolymerisasjon) er kritisk da det endrer polariteten til den stasjonære fasen. Elementanalyse ble utført for å kontrollere karboninnholdet i disse stasjonære fasene. Det har blitt observert at økning av mengden styren og reaksjonstiden øker karboninnholdet i den stasjonære fasen og omvendt. SP-er fremstilt med forskjellige konsentrasjoner av styren har forskjellige karbonmengder. På samme måte ble disse stasjonære fasene plassert på kolonner av rustfritt stål, og deres kromatografiske egenskaper (selektivitet, oppløsning, N-verdi osv.) ble kontrollert. Basert på disse eksperimentene ble en optimalisert sammensetning for fremstilling av den stasjonære PMP-fasen valgt for å gi kontrollert polaritet og god retensjon av analytten.
PMP-kolonnen ble også evaluert for analyse av fem blandinger av peptider (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin) ved bruk av kapasiteten til den mobile fasen. 60/40 (v/v) ACN/vann (0,1 % TFA) med en strømningshastighet på 80 µl/min. Under optimale elueringsforhold (200 000 plater/m²) er antallet teoretiske plater (N) per kolonne (100 × 1,8 mm) 20 000 ± 100. N-verdiene for de tre PMP-kolonnene er vist i tabell 3, og kromatogrammene er vist i figur 5A. Rask analyse ved høy strømningshastighet (700 µl/min) på en PMP-kolonne, fem peptider eluert innen ett minutt, utmerket N-verdi på 13 500 ± 330 per kolonne (100 x 1,8 mm diameter), tilsvarende 135 000 plater/m² (fig. 5B). Tre kolonner av samme størrelse (indre diameter 100 x 1,8 mm) ble fylt med tre forskjellige batcher av PMP stasjonær fase for å teste reproduserbarheten. Analytter ble registrert for hver kolonne ved å separere den samme testblandingen på hver kolonne ved bruk av optimale elueringsbetingelser, antall teoretiske plater N og retensjonstid. Reproduserbarhetsdataene for PMP-kolonnene er vist i tabell 4. Reproduserbarheten til PMP-kolonnen korrelerte godt med svært lave %RSD-verdier som vist i tabell 3.
Separasjon av peptidblandinger på en PMP-kolonne (B) og en Ascentis Express RP-Amide-kolonne (A), mobil fase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), PMP-kolonnedimensjoner (100 x 1,8 mm id), analyse. Elueringsrekkefølge for forbindelser: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) og 5 (leucinsyre-enkefalin).
En PMP-kolonne (indre diameter 100 x 1,8 mm) ble evaluert for separasjon av tryptisk hydrolysat av humant serumalbumin ved hjelp av HPLC. Kromatogrammet i figur 6 viser at prøvene er godt separert med svært god oppløsning. HSA-løsninger ble analysert ved bruk av en strømningshastighet på 100 μl/min, en mobil fase på 70/30 acetonitril/vann og 0,1 % TFA. Spaltingen av HSA ble delt inn i 17 topper, som vist i kromatogrammet (figur 6), tilsvarende 17 peptider. Separasjonseffektiviteten til individuelle topper fra HSA-hydrolysatet ble beregnet, og verdiene er vist i tabell 5.
HSA-tryptiske hydrolysater ble separert på en PMP-kolonne (indre diameter 100 x 1,8 mm), strømningshastighet (100 μl/min), mobil fase 60/40 acetonitril/vann og 0,1 % TFA.
hvor L er kolonnelengden, η er viskositeten til den mobile fasen, ΔP er kolonnens mottrykk, og u er den lineære hastigheten til den mobile fasen. Permeabiliteten til PMP-kolonnen var 2,5 × 10–14 m2, strømningshastigheten var 25 µl/min, 60/40 v/v ble brukt. ACN/vann. Permeabiliteten til PMP-kolonnen (ID 100 × 1,8 mm) var lik den i vår tidligere Ref. 34-studie. Permeabiliteten til en kolonne fylt med overfladisk porøse partikler er 1,7 × 10,6 µm, 2,5 × 10⁻⁴ m2 for 5 µm partikler43. Derfor er permeabiliteten til PMP-fasen lik permeabiliteten til kjerne-skall-partikler med en størrelse på 5 μm.
hvor Wx er massen til kolonnen fylt med kloroform, Wy er massen til kolonnen fylt med metanol, og ρ er tettheten til løsningsmidlet. Tettheten av metanol (ρ = 0,7866) og kloroform (ρ = 1,484). Den totale porøsiteten til silika-C18-partikkelkolonnen (100 × 1,8 mm ID)34 og vår tidligere studerte C18-urea31-kolonne var henholdsvis 0,63 og 0,55. Dette betyr at tilstedeværelsen av urealigander reduserer permeabiliteten til den stasjonære fasen. På den annen side er den totale porøsiteten til PMP-kolonnen (indre diameter 100 × 1,8 mm) 0,60. PMP-kolonner er mindre permeable enn kolonner pakket med C18-bundne silikapartikler fordi C18-ligandene i stasjonære faser av C18-typen er festet til silikapartiklerne i lineære kjeder, mens det i stasjonære faser av polystyrentypen dannes en relativt tykk polymer rundt partiklene. lag A. I et typisk eksperiment beregnes kolonneporøsiteten som følger:
Figur 7A og B viser Van Deemter-plott for en PMP-kolonne (innvendig diameter 100 x 1,8 mm) og en Ascentis Express RP-Amide-kolonne (innvendig diameter 100 x 1,8 mm) under de samme elueringsbetingelsene, 60/40 ACN/H2O og 0,1 % TFA 20 µl/min til 800 µl/min på begge kolonnene. Minimum HETP-verdiene ved optimal strømningshastighet (80 µl/min) var henholdsvis 2,6 µm og 3,9 µm for PMP-kolonnen og Ascentis Express RP-Amide-kolonnen. HETP-verdiene viser at separasjonseffektiviteten til PMP-kolonnen (100 x 1,8 mm innvendig diameter) er mye høyere enn for den kommersielt tilgjengelige Ascentis Express RP-Amide-kolonnen (100 x 1,8 mm innvendig diameter). Van Deemter-grafen i figur 7(A) viser at reduksjonen i N-verdi ikke er signifikant høyere med økende strømning sammenlignet med vår tidligere studie. Den høyere separasjonseffektiviteten til PMP-kolonnen (innvendig diameter 100 × 1,8 mm) sammenlignet med Ascentis Express RP-Amide-kolonnen er basert på den forbedrede partikkelformen og -størrelsen og den sofistikerte kolonnepakkingsprosedyren som brukes i nåværende arbeid34.
(A) Van Deemter-plott (HETP vs. lineær hastighet for mobil fase) oppnådd på en PMP-kolonne (innvendig diameter 100 x 1,8 mm) i 60/40 ACN/H2O med 0,1 % TFA. (B) Van Deemter-plott (HETP versus lineær hastighet for mobil fase) oppnådd på en Ascentis Express RP-Amide-kolonne (innvendig diameter 100 x 1,8 mm) i 60/40 ACN/H2O med 0,1 % TFA.
En polar stasjonær fase av interkalert polystyren ble fremstilt og evaluert for separasjon av en blanding av syntetiske peptider og tryptisk hydrolysat av humant serumalbumin (HSA) i høytrykksvæskekromatografi. Den kromatografiske ytelsen til PMP-kolonner for peptidblandinger er utmerket når det gjelder separasjonseffektivitet og oppløsning. Den forbedrede separasjonseffektiviteten til PMP-kolonner skyldes flere årsaker, som silikapartikkelstørrelse og porestørrelse, kontrollert syntese av stasjonære faser og komplekse kolonnepakningsmaterialer. I tillegg til den høye separasjonseffektiviteten er en annen fordel med denne stasjonære fasen det lave kolonnemottrykket ved høye strømningshastigheter. PMP-kolonner er svært reproduserbare og kan brukes til å analysere blandinger av peptider og tryptisk fordøyelse av forskjellige proteiner. Vi har til hensikt å bruke denne kolonnen til separasjon av bioaktive forbindelser fra naturprodukter, ekstrakter av medisinplanter og sopp i væskekromatografi. I fremtiden vil PMP-kolonner også bli evaluert for separasjon av proteiner og monoklonale antistoffer.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersøkelse av peptidseparasjonssystemer med revers fasekromatografi del I: Utvikling av en protokoll for kolonnekarakterisering. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersøkelse av peptidseparasjonssystemer med reversfasekromatografi del I: Utvikling av en protokoll for kolonnekarakterisering.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., og Petersson, P. Undersøkelse av peptidseparasjonssystemer ved omvendt fasekromatografi, del I: Utvikling av en protokoll for kolonnekarakterisering. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersøkelse av peptidseparasjonssystemer med revers fasekromatografi del I: Utvikling av en protokoll for kolonnekarakteristikker. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersøkelse av peptidseparasjonssystemer med revers fasekromatografi del I: Utvikling av en protokoll for kolonnekarakteristikker.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., og Petersson, P. Undersøkelse av peptidseparasjonssystemer ved omvendt fasekromatografi, del I: Utvikling av en protokoll for kolonnekarakterisering.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
Gomez, B. et al. Metoder for å lage forbedrede aktive peptider for behandling av infeksjonssykdommer. Bioteknologi. Achievements 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. og Khrestchatisky, M. Syntetiske terapeutiske peptider: Vitenskap og marked. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. og Khrestchatisky, M. Syntetiske terapeutiske peptider: Vitenskap og marked.Vliege P, Lisowski V, Martinez J og Chreschatyski M. Syntetiske terapeutiske peptider: vitenskap og marked.Vliege P, Lisowski V, Martinez J og Khreschatsky M. Syntetiske terapeutiske peptider: vitenskap og marked. legemiddelutvikling. Today 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD og Shen, Y. Avansert proteomisk væskekromatografi. Xie, F., Smith, RD og Shen, Y. Avansert proteomisk væskekromatografi.Se F., Smith RD og Shen Yu. Avansert proteomisk væskekromatografi. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Avansert proteinsammensetning 液相色谱。Se F., Smith RD og Shen Yu. Avansert proteomisk væskekromatografi.J. Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Avansert væskekromatografi-massespektrometri er i stand til å kombinere bredt basert metabolomikk og proteomikk. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM og Salisbury, JJ. UHPLCs rolle i farmasøytisk utvikling. Chesnut, SM og Salisbury, JJ. UHPLCs rolle i farmasøytisk utvikling.Chesnut, SM og Salisbury, JJ UHPLCs rolle i farmasøytisk utvikling.Chesnut, SM og Salisbury, JJ. UHPLCs rolle i legemiddelutvikling. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Grunnleggende og praktiske aspekter ved ultrahøytrykksvæskekromatografi for raske separasjoner. Wu, N. & Clausen, AM Grunnleggende og praktiske aspekter ved ultrahøytrykksvæskekromatografi for raske separasjoner.Wu, N. og Clausen, AM. Grunnleggende og praktiske aspekter ved høytrykksvæskekromatografi for rask separasjon. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Grunnleggende og praktiske aspekter ved ultrahøytrykksvæskekromatografi for rask separasjon.Wu, N. og Clausen, AM. Grunnleggende og praktiske aspekter ved høytrykksvæskekromatografi for rask separasjon.J. Sept. Science. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA og Tchelitcheff, P. Bruk av ultralydsvæskekromatografi i farmasøytisk utvikling. Wren, SA og Tchelitcheff, P. Bruk av ultralydsvæskekromatografi i farmasøytisk utvikling.Ren, SA og Chelischeff, P. Bruk av ultrahøytrykksvæskekromatografi i farmasøytisk utvikling. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA og Tchelitcheff, P.Ren, SA og Chelischeff, P. Anvendelse av ultralydsvæskekromatografi i legemiddelutvikling.J. Kromatografi. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. En monolittisk makroporøs hydrogel utvunnet fra en olje-i-vann-emulsjon med en høy intern fase for effektiv rensing av enterovirus 71. Chemical. project. Journal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. og Wilkins, JA. Væskekromatografiens rolle i proteomikk. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. og Wilkins, JA. Væskekromatografiens rolle i proteomikk.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. og Wilkins, JA. Væskekromatografiens rolle i proteomikk. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. og Wilkins, JA. Væskekromatografiens rolle i proteomikk.J. Kromatografi. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Nye trender innen reversfasevæskekromatografiske separasjoner av terapeutiske peptider og proteiner: Teori og anvendelser. & Guillarme, D. Nye trender innen reversfasevæskekromatografiske separasjoner av terapeutiske peptider og proteiner: Teori og anvendelser. & Guillarme, D. фазой: теория и приложения. & Guillarme, D. Nye trender innen separasjon av terapeutiske peptider og proteiner ved omvendt fase væskekromatografi: teori og anvendelser. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.og Guillarmé, D. Nye trender innen separasjon av terapeutiske peptider og proteiner ved omvendt fase væskekromatografi: teori og anvendelser.J. Pharm. Biomedisinsk vitenskap. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE og Gebler, JC Todimensjonal separasjon av peptider ved bruk av RP-RP-HPLC-system med forskjellig pH i første og andre separasjonsdimensjon. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE og Gebler, JC Todimensjonal separasjon av peptider ved bruk av RP-RP-HPLC-system med forskjellig pH i første og andre separasjonsdimensjon.Gilar M., Olivova P., Dali AE og Gebler JK Todimensjonal separasjon av peptider ved bruk av RP-RP-HPLC-systemet med forskjellig pH i den første og andre separasjonsdimensjonen.Gilar M., Olivova P., Dali AE og Gebler JK Todimensjonal separasjon av peptider ved bruk av forskjellige pH-verdier i den første og andre separasjonsdimensjonen ved bruk av RP-RP-HPLC-systemet. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Undersøkelse av masseoverføring og kinetiske egenskaper ved høytrykkskromatografikolonner pakket med fullstendig porøse og overfladisk porøse C18-partikler mindre enn 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Nyere trender og analytiske utfordringer innen isolering, identifisering og validering av plantebaserte bioaktive peptider. anus. Creature anal. Chemical. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB et al. Proteomisk landskap i livets rike. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Etterbehandling av terapeutiske peptider ved preparativ væskekromatografi. Molecules (Basel, Sveits) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. og Geng, X. Blandet moduskromatografi og dens anvendelser på biopolymerer. Yang, Y. og Geng, X. Blandet moduskromatografi og dens anvendelser på biopolymerer.Yang, Yu. og Geng, X. Blandet moduskromatografi og dens anvendelse på biopolymerer. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. og Geng, X. Blandet moduskromatografi og dens anvendelse i biopolymerer.Yang, Yu. og Gene, X. Blandet moduskromatografi og dens anvendelse på biopolymerer.J. Kromatografi. A 1218(49), 8813–8825 (2011).