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다공성 실리카 입자는 넓은 기공을 갖도록 졸-겔법을 일부 변형하여 제조하였다. 이 입자들을 역전사-분해(RAFT) 중합을 통해 N-페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트(PMI)와 스티렌으로 유도체화하여 N-페닐말레이미드가 삽입된 폴리아미드(PMP)를 생성하였다. 고정상으로는 내경 1.8 mm, 직경 100 mm의 좁은 내경 스테인리스강 컬럼에 슬러리 충전재를 사용하였다. PMP 컬럼의 크로마토그래피 성능은 5가지 합성 펩타이드(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu 아미노산 엔케팔린) 혼합물과 인간 혈청 알부민(HAS)의 트립신 가수분해물을 분리하여 평가하였다. 최적의 용출 조건에서 펩타이드 혼합물을 사용했을 때 이론적인 이론단수는 280,000단/m²에 달했습니다. 개발된 컬럼의 분리 성능을 상용 Ascentis Express RP-Amide 컬럼과 비교한 결과, PMP 컬럼의 분리 효율과 분해능이 상용 컬럼보다 우수한 것으로 나타났습니다.
바이오의약품 산업은 최근 몇 년 동안 시장 점유율이 크게 증가하면서 전 세계적으로 성장하는 시장이 되었습니다. 바이오의약품 산업의 폭발적인 성장1,2,3으로 인해 펩타이드 및 단백질 분석에 대한 수요가 크게 증가했습니다. 펩타이드 합성 과정에서 목표 펩타이드 외에도 다양한 불순물이 생성되므로 원하는 순도의 펩타이드를 얻기 위해서는 크로마토그래피 정제가 필수적입니다. 체액, 조직 및 세포 내 단백질 분석 및 특성 규명은 단일 시료에 존재하는 수많은 잠재적 검출 가능 물질로 인해 매우 어려운 과제입니다. 질량 분석법(MS)은 펩타이드와 단백질의 서열 분석에 효과적인 도구이지만, 이러한 시료를 질량 분석기에 직접 도입할 경우 분리 효율이 저하될 수 있습니다. 이 문제는 질량 분석 전에 액체 크로마토그래피(LC)를 수행함으로써 해결할 수 있으며, 이를 통해 특정 시점에 질량 분석기에 유입되는 분석물질의 양을 줄일 수 있습니다4,5,6. 또한, 액상 분리 과정에서 분석물질이 좁은 영역에 집중될 수 있으므로, 이러한 분석물질의 농도를 높여 질량 분석기의 검출 감도를 향상시킬 수 있습니다. 액체 크로마토그래피(LC)는 지난 10년 동안 크게 발전하여 단백질체 분석에 널리 사용되는 방법이 되었습니다.7,8,9,10
역상 액체 크로마토그래피(RP-LC)는 옥타데실 변형 실리카(ODS)를 고정상으로 사용하여 펩타이드 혼합물의 정제 및 분리에 널리 사용됩니다.11,12,13 그러나 RP 고정상은 복잡한 구조와 양쪽성 특성으로 인해14,15 펩타이드와 단백질을 만족스럽게 분리할 수 없습니다. 따라서 극성 및 비극성 조각을 포함하는 펩타이드와 단백질의 분석에는 이러한 분석물질과 상호작용하고 유지할 수 있도록 특별히 설계된 고정상이 필요합니다.16 다중 모드 상호작용을 제공하는 혼합 크로마토그래피는 펩타이드, 단백질 및 기타 복잡한 혼합물을 분리하는 데 RP-LC의 대안이 될 수 있습니다. 여러 가지 혼합형 고정상이 제조되었고, 이러한 고정상으로 채워진 컬럼을 사용하여 펩타이드와 단백질을 분리했습니다.17,18,19,20,21 극성 및 비극성 그룹의 존재로 인해 혼합 모드 고정상(WAX/RPLC, HILIC/RPLC, 극성 삽입/RPLC)은 펩타이드 및 단백질 분리에 적합합니다.22,23,24,25,26,27,28 공유 결합된 극성 그룹을 갖는 극성 삽입 고정상은 분석물질과 고정상 간의 상호작용(다중 모드 상호작용)에 따라 분리가 이루어지기 때문에 극성 및 비극성 분석물질에 대해 우수한 분리 능력과 독특한 선택성을 나타냅니다.29,30,31,32 최근 Zhang 등30은 폴리아민의 베헤닐 말단 고정상을 합성하여 탄화수소, 항우울제, 플라보노이드, 뉴클레오사이드, 에스트로겐 및 기타 분석물질을 성공적으로 분리했습니다. 극성 삽입 고정 물질은 극성 및 비극성 그룹을 모두 가지고 있으므로 펩타이드와 단백질을 소수성 부분과 친수성 부분으로 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 극성 인라인 컬럼(예: 아미드 인라인이 있는 C18 컬럼)은 Ascentis Express RP-Amide 컬럼이라는 상품명으로 구할 수 있지만 이 컬럼은 아민 33 분석에만 사용되었습니다.
본 연구에서는 극성 임베딩 고정상(N-페닐말레이미드, 임베딩 폴리스티렌)을 제조하고 펩타이드 분리 및 트립신에 의한 HSA 분해에 대한 성능을 평가하였다. 고정상 제조는 다음과 같은 방법을 사용하였다. 다공성 실리카 입자는 이전 연구 논문(31, 34, 35, 36, 37, 38, 39)에 기술된 방법을 일부 수정하여 제조하였다. 요소, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), TMOS 및 아세트산 수용액의 비율을 조절하여 기공 크기가 큰 실리카 입자를 얻었다. 둘째로, 새로운 페닐말레이미드-메틸비닐 이소시아네이트 리간드를 합성하고, 이 리간드로 유도체화된 실리카 입자를 이용하여 극성 임베딩 고정상을 제조하였다. 제조된 고정상을 최적화된 충전 방식에 따라 스테인리스 스틸 컬럼(내경 100 × 1.8 mm)에 충전하였다. 컬럼 충전 시 기계적 진동을 가하여 컬럼 내부에 균일한 층을 형성하였다. 본 연구에서는 5가지 펩타이드(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, 류신-엔케팔린 펩타이드)로 구성된 펩타이드 혼합물과 인간 혈청 알부민(HSA) 트립신 가수분해물의 분리를 위해 충전 컬럼을 평가하였다. 펩타이드 혼합물과 HSA 트립신 가수분해물은 우수한 분해능과 효율로 분리되었다. PMP 컬럼의 분리 효율을 Ascentis Express RP-Amide 컬럼과 비교한 결과, 펩타이드와 단백질 모두 PMP 컬럼에서 우수한 분해능과 높은 분리 효율을 보였으며, PMP 컬럼의 분리 효율이 Ascentis Express RP-Amide 컬럼보다 우수함을 확인하였다.
PEG(폴리에틸렌 글리콜), 요소, 아세트산, 트리메톡시오르토실리케이트(TMOS), 트리메틸클로로실란(TMCS), 트립신, 인간 혈청 알부민(HSA), 염화암모늄, 요소, 헥사메틸메타크릴로일디실라잔(HMDS), 메타크릴로일 클로라이드(MC), 스티렌, 4-하이드록시-TEMPO, 벤조일 퍼옥사이드(BPO), HPLC용 아세토니트릴(ACN), 메탄올, 2-프로판올 및 아세톤. Sigma-Aldrich Company(미국 미주리주 세인트루이스).
요소(8g), 폴리에틸렌 글리콜(8g) 및 0.01N 아세트산 8ml의 혼합물을 10분 동안 교반한 후, 얼음으로 냉각하면서 TMOS 24ml를 첨가하였다. 반응 혼합물을 스테인리스강 오토클레이브에서 40°C에서 6시간, 이어서 120°C에서 8시간 동안 가열하였다. 물을 제거하고 잔류물을 70°C에서 12시간 동안 건조하였다. 건조된 연질 블록을 곱게 분쇄한 후 오븐에서 550°C로 12시간 동안 소성하였다. 입자 크기, 기공 크기 및 표면적의 재현성을 확인하기 위해 세 배치(batch)를 제조하고 특성을 분석하였다.
폴리스티렌 사슬용 극성 그룹 및 고정상. 제조 절차는 아래에 설명되어 있습니다.
N-페닐말레이미드(200mg)와 메틸 비닐 이소시아네이트(100mg)를 무수 톨루엔에 용해시킨 후, 반응 플라스크에 2,2′-아조이소부티로니트릴(AIBN) 0.1ml를 첨가하여 페닐말레이미드와 메틸 비닐 이소시아네이트의 공중합체(PMCP)를 얻었다. 혼합물을 60°C에서 3시간 동안 가열하고, 여과한 후 40°C 오븐에서 3시간 동안 건조시켰다.
건조된 실리카 입자(2g)를 건조 톨루엔(100ml)에 분산시키고, 500ml 둥근바닥 플라스크에서 10분간 교반 및 초음파 처리하였다. PMCP(10mg)를 톨루엔에 용해시킨 후, 첨가 깔때기를 이용하여 반응 플라스크에 한 방울씩 첨가하였다. 혼합물을 100°C에서 8시간 동안 환류시키고, 여과한 후 아세톤으로 세척하고 60°C에서 3시간 동안 건조하였다. 그 후, PMCP가 결합된 실리카 입자(100g)를 톨루엔(200ml)에 용해시키고, 촉매로 디부틸틴 디라우레이트 100μl를 첨가한 상태에서 4-하이드록시-TEMPO(2ml)를 첨가하였다. 혼합물을 50°C에서 8시간 동안 교반하고, 여과한 후 50°C에서 3시간 동안 건조하였다.
스티렌(1 ml), 벤조일퍼옥사이드(BPO, 0.5 ml) 및 TEMPO-PMCP에 부착된 실리카 입자(1.5 g)를 톨루엔에 분산시키고 질소로 퍼징하였다. 스티렌의 중합 반응은 100°C에서 12시간 동안 진행하였다. 생성물을 메탄올로 세척하고 60°C에서 밤새 건조시켰다. 반응의 일반적인 모식도는 그림 1에 나타내었다.
시료는 잔류 압력이 10⁻³ Torr 미만이 될 때까지 393 K에서 1시간 동안 탈기했습니다. 상대 압력 P/P₀ = 0.99에서 흡착된 N₂의 양을 이용하여 총 기공 부피를 측정했습니다. 순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 형태는 주사 전자 현미경(Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰했습니다. 건조된 시료(순수 실리카 및 리간드 결합 실리카 입자)는 탄소 테이프를 사용하여 알루미늄 막대 위에 고정했습니다. Q150T 스퍼터링 장치를 사용하여 시료 위에 5 nm 두께의 금 박막을 증착했습니다. 이는 저전압 공정의 효율을 향상시키고 미세한 콜드 스프레이를 가능하게 합니다. 원소 분석은 Thermo Electron(Waltham, MA, USA) Flash EA1112 원소 조성 분석기를 사용하여 수행했습니다. 입자 크기 분포는 Malvern Mastersizer 2000(Worcestershire, UK) 입자 크기 분석기를 사용하여 측정했습니다. 코팅되지 않은 실리카 입자와 리간드가 결합된 실리카 입자(각 5mg)를 이소프로판올 5ml에 분산시키고, 10분간 초음파 처리한 후 5분간 교반하고, 마스터사이저 광학 벤치에 올려놓았다. 열중량 분석은 30~800°C 온도 범위에서 분당 5°C의 속도로 수행하였다.
내경 100mm, 직경 1.8mm의 유리섬유 라이닝 스테인리스강 컬럼을 참고문헌 31과 동일한 절차에 따라 슬러리 충전법으로 충전하였다. 1µm 프릿이 있는 배출구가 있는 스테인리스강 컬럼(유리 라이닝, 내경 100mm, 직경 1.8mm)을 슬러리 충전기(Alltech, Deerfield, IL, USA)에 연결하였다. 고정상 150mg을 메탄올 1.2ml에 현탁시켜 고정상 현탁액을 제조한 후 저장 컬럼에 주입하였다. 메탄올은 슬러리 용매 및 대조 용매로 사용하였다. 10분 동안 100MPh, 15분 동안 80MPh, 30분 동안 60MPh의 압력을 순차적으로 가하여 컬럼을 충전하였다. 균일한 컬럼 충전을 위해 두 대의 가스 크로마토그래피 컬럼 진동기(Alltech, Deerfield, IL, USA)를 사용하여 기계적 진동을 가하였다. 슬러리 충전기를 닫고 스트링 손상을 방지하기 위해 압력을 천천히 해제하였다. 컬럼을 슬러리 노즐에서 분리하고 다른 연결 부품을 입구에 부착한 후 LC 시스템에 연결하여 작동을 테스트했습니다.
맞춤형 MLC는 LC 펌프(10AD Shimadzu, 일본), 50 nL 주입 루프가 있는 샘플러(Valco(미국) C14 W.05), 멤브레인 탈기 장치(Shimadzu DGU-14A), UV-VIS 모세관 창, 검출기(UV-2075) 및 에나멜 마이크로컬럼을 사용하여 제작되었습니다. 컬럼 팽창 효과를 최소화하기 위해 매우 가늘고 짧은 연결 튜브를 사용했습니다. 컬럼을 채운 후, 1/16″ 감압 접합부 출구에 모세관(내경 50 µm 365)을 설치하고, 감압 접합부에도 모세관(50 µm)을 설치했습니다. 데이터 수집 및 크로마토그램 처리는 Multichro 2000 소프트웨어를 사용하여 수행했습니다. 254 nm에서 분석 대상 물질의 UV 흡광도를 0으로 설정하여 모니터링했습니다. 크로마토그래피 데이터는 OriginPro8(Northampton, MA)을 사용하여 분석했습니다.
동결건조된 인간 혈청 알부민 분말(순도 96% 이상, 아가로스 겔 전기영동) 3mg을 트립신(1.5mg), 4.0M 요소(1ml), 0.2M 탄산암모늄(1ml)과 혼합하였다. 이 용액을 10분간 교반한 후 37°C 수조에서 6시간 동안 반응시켰다. 그 후 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 1ml를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 용액을 여과하고 4°C 이하에서 보관하였다.
펩타이드 혼합물과 트립신 소화물인 HSA의 PMP 컬럼 분리 성능을 별도로 평가하였다. PMP 컬럼으로 분리한 펩타이드와 HSA 혼합물의 트립신 가수분해 결과를 확인하고, Ascentis Express RP-Amide 컬럼을 사용한 결과와 비교하였다. 이론 단수는 다음 공식을 이용하여 계산하였다.
그림 2는 순수 실리카 입자와 리간드가 결합된 실리카 입자의 SEM 이미지를 보여준다. 순수 실리카 입자(A, B)의 SEM 이미지는 구형이지만, 이전 연구 결과와 비교했을 때 입자가 길쭉하거나 불규칙한 대칭을 나타내는 것을 보여준다. 리간드가 결합된 실리카 입자(C, D)의 표면은 순수 실리카 입자보다 매끄러운데, 이는 폴리스티렌 사슬이 실리카 입자 표면을 덮고 있기 때문일 수 있다.
순수 실리카 입자(A, B)와 리간드가 결합된 실리카 입자(C, D)의 주사 전자 현미경 사진.
순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 입자 크기 분포는 그림 2와 3(A)에 나타나 있다. 부피 입자 크기 분포 곡선은 화학적 변형 후 실리카 입자 크기가 증가했음을 보여준다(그림 3A). 본 연구와 이전 연구의 실리카 입자 크기 분포 데이터를 표 1(A)에서 비교하였다. PMP의 부피 입자 크기 d(0.5)는 3.36 µm였으며, 이는 이전 연구(폴리스티렌 결합 실리카 입자)34에서 얻은 ad(0.5) 값 3.05 µm와 비교된다. 반응 혼합물에서 PEG, 요소, TMOS 및 아세트산의 비율이 변화함에 따라, 본 연구의 입자 크기 분포는 이전 연구에 비해 더 좁아졌다. PMP 상의 입자 크기는 이전에 연구했던 폴리스티렌 결합 실리카 입자 상의 입자 크기보다 약간 더 크다. 이는 스티렌을 이용한 실리카 입자의 표면 기능화는 실리카 표면에 폴리스티렌 층(0.97µm)만 증착시킨 반면, PMP 상에서는 층 두께가 1.38µm였음을 의미합니다.
순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 입자 크기 분포(A) 및 기공 크기 분포(B).
본 연구에 사용된 실리카 입자의 기공 크기, 기공 부피 및 표면적은 표 1(B)에 나타내었다. 순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 기공 크기 분포(PSD)는 그림 3(B)에 나타냈다. 결과는 이전 연구34와 유사했다. 순수 실리카 입자와 리간드 결합 실리카 입자의 기공 크기는 각각 310 Å와 241 Å였으며, 화학적 개질 후 기공 크기가 69 Å 감소했음을 표 1(B)에서 확인할 수 있다. 변화 곡선은 그림 3(B)에 나타냈다. 본 연구에서 실리카 입자의 비표면적은 116 m²/g으로, 이전 연구(124 m²/g)와 유사하다. 표 1(B)에서 볼 수 있듯이, 화학적 개질 후 실리카 입자의 표면적(m²/g) 또한 116 m²/g에서 105 m²/g으로 감소했다.
고정상의 원소 분석 결과는 표 2에 제시되어 있다. 현재 고정상의 탄소 함량은 6.35%로, 이전 연구(폴리스티렌과 결합된 실리카 입자, 각각 7.93%35 및 10.21%)42보다 낮다. 현재 고정상의 탄소 함량이 낮은 이유는 SP 제조 시 스티렌 외에 페닐말레이미드 메틸 비닐 이소시아네이트(PCMP) 및 4-하이드록시-TEMPO와 같은 극성 리간드를 사용했기 때문이다. 현재 고정상의 질소 함량은 2.21%로, 이전 연구42의 0.1735% 및 0.85%에 비해 높다. 이는 페닐말레이미드 첨가로 인해 현재 고정상에 질소 함량이 높다는 것을 의미한다. 마찬가지로 제품 (4)와 (5)는 각각 2.7%와 2.9%의 탄소 함량을 가지는 반면, 최종 제품 (6)은 표 2에서 볼 수 있듯이 6.35%의 탄소 함량을 가집니다. PMP의 고정상에 대한 열중량 분석(TGA)을 사용하여 중량 감소를 테스트했으며, TGA 곡선은 그림 4에 나타나 있습니다. TGA 곡선은 8.6%의 중량 감소를 보여주는데, 이는 리간드가 C뿐만 아니라 N, O 및 H도 포함하고 있기 때문에 탄소 함량(6.35%)과 잘 일치합니다.
리간드인 페닐말레이미드-메틸비닐이소시아네이트는 극성인 페닐말레이미드 및 비닐이소시아네이트 그룹을 가지고 있기 때문에 실리카 입자의 표면 개질에 사용하기 위해 선택되었습니다. 비닐이소시아네이트 그룹은 리빙 라디칼 중합을 통해 스티렌과 추가적으로 반응할 수 있습니다. 두 번째 이유는 페닐말레이미드 부분이 정상 pH에서 가상 전하를 띠지 않으므로 분석물질과 적당한 상호작용을 가지면서 분석물질과 고정상 사이에 강한 정전기적 상호작용이 없는 그룹을 도입하기 위함입니다. 고정상의 극성은 최적의 스티렌 양과 자유 라디칼 중합 반응 시간을 조절함으로써 제어할 수 있습니다. 반응의 마지막 단계(자유 라디칼 중합)는 고정상의 극성을 변화시키기 때문에 매우 중요합니다. 이러한 고정상의 탄소 함량을 확인하기 위해 원소 분석을 수행했습니다. 스티렌 양과 반응 시간이 증가함에 따라 고정상의 탄소 함량이 증가하고, 반대로 감소함에 따라 탄소 함량이 감소하는 것을 관찰했습니다. 스티렌 농도가 다른 조건에서 제조된 고정상은 서로 다른 탄소 함량을 나타냈습니다. 마찬가지로, 이러한 고정상을 스테인리스 스틸 컬럼에 적용하여 크로마토그래피 특성(선택성, 분해능, N 값 등)을 확인하였다. 이러한 실험을 바탕으로, 분석물질의 극성을 제어하고 우수한 유지율을 제공하는 PMP 고정상 제조를 위한 최적 조성을 선정하였다.
PMP 컬럼은 이동상 60/40(v/v) 아세토니트릴/물(0.1% 트리플루오로아세트산)을 사용하여 5가지 펩타이드 혼합물(Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, 류신-엔케팔린) 분석에 대해서도 평가되었으며, 유속은 80 µl/min였습니다. 최적 용출 조건(200,000 플레이트/m)에서 컬럼(100 × 1.8 mm)당 이론단수(N)는 20,000 ± 100입니다. 세 가지 PMP 컬럼에 대한 N 값은 표 3에, 크로마토그램은 그림 5A에 나타냈습니다. PMP 컬럼에서 높은 유속(700 µl/min)으로 빠른 분석을 수행한 결과, 1분 이내에 5개의 펩타이드가 용출되었으며, 컬럼당 13,500 ± 330의 우수한 이론단수(N) 값을 나타냈는데, 이는 135,000 플레이트/m에 해당합니다(그림 5B). 동일한 크기(내경 100 x 1.8 mm)의 컬럼 3개에 각각 다른 배치로 제조된 PMP 고정상을 채워 재현성을 테스트했습니다. 각 컬럼에서 동일한 시험 혼합물을 최적의 용출 조건, 이론단수(N) 및 유지 시간을 사용하여 분리함으로써 각 컬럼의 분석 대상 물질을 기록했습니다. PMP 컬럼의 재현성 데이터는 표 4에 나타냈습니다. 표 3에서 볼 수 있듯이 PMP 컬럼의 재현성은 매우 낮은 %RSD 값과 높은 상관관계를 보였습니다.
PMP 컬럼(B)과 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(A)에서 펩타이드 혼합물의 분리, 이동상 60/40 아세토니트릴/물(TFA 0.1%), PMP 컬럼 크기(100 x 1.8 mm 내경), 분석 결과 화합물의 용출 순서: 1(Gly-Tyr), 2(Gly-Leu-Tyr), 3(Gly-Gly-Tyr-Arg), 4(Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) 및 5(류신산 엔케팔린).
HPLC를 이용하여 인간 혈청 알부민(HSA)의 트립신 가수분해물의 분리를 위해 PMP 컬럼(내경 100 x 1.8 mm)을 평가하였다. 그림 6의 크로마토그램에서 볼 수 있듯이, 시료들은 매우 우수한 분해능으로 잘 분리되었다. HSA 용액은 유속 100 μl/min, 이동상 70/30 아세토니트릴/물, 그리고 0.1% TFA를 사용하여 분석하였다. HSA의 분해 산물은 크로마토그램(그림 6)에서와 같이 17개의 피크로 나타났으며, 이는 17개의 펩타이드에 해당한다. HSA 가수분해물의 각 피크에 대한 분리 효율을 계산하였으며, 그 값은 표 5에 제시되어 있다.
HSA 트립신 가수분해물은 PMP 컬럼(내경 100 x 1.8 mm), 유속 100 μl/min, 이동상 60/40 아세토니트릴/물, 0.1% TFA 조건에서 분리하였다.
여기서 L은 컬럼 길이, η는 이동상의 점도, ΔP는 컬럼의 배압, u는 이동상의 선속도이다. PMP 컬럼의 투과도는 2.5 × 10⁻¹⁴ m²였고, 유속은 25 µl/min이었으며, 아세토니트릴/물 혼합액은 60/40 v/v로 사용하였다. PMP 컬럼(내경 100 × 1.8 mm)의 투과도는 이전 연구(참고문헌 34)와 유사하였다. 표면 다공성 입자로 채워진 컬럼의 투과도는 1.7 × 10⁻⁶ µm이고, 5 µm 입자의 경우 2.5 × 10⁻¹⁴ m²이다.⁴³ 따라서 PMP 상의 투과도는 5 µm 크기의 코어-쉘 입자의 투과도와 유사하다.
여기서 Wx는 클로로포름으로 채워진 컬럼의 질량, Wy는 메탄올로 채워진 컬럼의 질량, ρ는 용매의 밀도입니다. 메탄올(ρ = 0.7866)과 클로로포름(ρ = 1.484)의 밀도는 다음과 같습니다. 실리카-C18 입자 컬럼(100 × 1.8 mm 내경)34과 이전에 연구했던 C18-요소31 컬럼의 총 기공률은 각각 0.63과 0.55였습니다. 이는 요소 리간드의 존재가 고정상의 투과성을 감소시킨다는 것을 의미합니다. 한편, PMP 컬럼(내경 100 × 1.8 mm)의 총 기공률은 0.60입니다. PMP 컬럼은 C18 결합 실리카 입자로 채워진 컬럼보다 투과성이 낮습니다. 이는 C18형 고정상에서는 C18 리간드가 실리카 입자에 선형 사슬 형태로 결합되어 있는 반면, 폴리스티렌형 고정상에서는 입자 주변에 비교적 두꺼운 중합체 층이 형성되기 때문입니다. 일반적인 실험에서 컬럼의 다공성은 다음과 같이 계산됩니다.
그림 7A와 7B는 동일한 용출 조건(60/40 아세토니트릴/물, 0.1% 트리플루오로아세트산, 유속 20 µl/min ~ 800 µl/min)에서 PMP 컬럼(내경 100 x 1.8 mm)과 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(내경 100 x 1.8 mm)에 대한 반 데엠터 플롯을 보여준다. 최적 유속(80 µl/min)에서의 최소 HETP 값은 PMP 컬럼의 경우 2.6 µm, Ascentis Express RP-Amide 컬럼의 경우 3.9 µm였다. HETP 값은 PMP 컬럼(내경 100 x 1.8 mm)의 분리 효율이 시판되는 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(내경 100 x 1.8 mm)보다 훨씬 높음을 보여준다. 그림 7(A)의 van Deemter 그래프는 유량이 증가함에 따라 N 값의 감소가 이전 연구에 비해 크게 높지 않음을 보여줍니다. Ascentis Express RP-Amide 컬럼에 비해 PMP 컬럼(내경 100 × 1.8 mm)의 분리 효율이 더 높은 것은 개선된 입자 모양과 크기, 그리고 본 연구에서 사용된 정교한 컬럼 패킹 절차에 기반합니다.34
(A) 0.1% TFA를 첨가한 60/40 아세토니트릴/물 용액에서 PMP 컬럼(내경 100 x 1.8 mm)을 사용하여 얻은 반 데엠터 플롯(HETP 대 이동상 선형 속도). (B) 0.1% TFA를 첨가한 60/40 아세토니트릴/물 용액에서 Ascentis Express RP-Amide 컬럼(내경 100 x 1.8 mm)을 사용하여 얻은 반 데엠터 플롯(HETP 대 이동상 선형 속도).
폴리스티렌(PMP)을 극성 고정상으로 사용하여 합성 펩타이드 혼합물과 인간 혈청 알부민(HSA) 트립신 가수분해물의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분리 성능을 평가했습니다. PMP 컬럼은 펩타이드 혼합물 분리에 있어 분리 효율과 분해능 면에서 우수한 성능을 보였습니다. PMP 컬럼의 향상된 분리 효율은 실리카 입자 크기 및 기공 크기, 고정상의 제어된 합성, 그리고 복합적인 컬럼 충전재 등 여러 요인에 기인합니다. 높은 분리 효율 외에도, 이 고정상의 또 다른 장점은 높은 유속에서도 낮은 컬럼 배압을 유지한다는 것입니다. PMP 컬럼은 재현성이 매우 높으며, 다양한 단백질의 트립신 소화물 및 펩타이드 혼합물 분석에 사용할 수 있습니다. 본 연구에서는 이 컬럼을 액체 크로마토그래피를 이용하여 천연물, 약용 식물 추출물, 버섯 추출물에서 생리활성 화합물을 분리하는 데 활용할 계획입니다. 향후에는 단백질 및 단클론 항체 분리에도 PMP 컬럼의 성능을 평가할 예정입니다.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. 역상 크로마토그래피 펩타이드 분리 시스템에 대한 연구 1부: 컬럼 특성화를 위한 프로토콜 개발. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. 역상 크로마토그래피 펩타이드 분리 시스템에 대한 연구 1부: 컬럼 특성화를 위한 프로토콜 개발.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., 및 Petersson, P. 역상 크로마토그래피를 이용한 펩타이드 분리 시스템 연구, 1부: 컬럼 특성화를 위한 프로토콜 개발. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. 역상 크로마토그래피 펩타이드 분리 시스템 연구 1부: 컬럼 특성 프로토콜 개발. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. 역상 크로마토그래피 펩타이드 분리 시스템 연구 1부: 컬럼 특성 프로토콜 개발.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., 및 Petersson, P. 역상 크로마토그래피를 이용한 펩타이드 분리 시스템 연구, 1부: 컬럼 특성화를 위한 프로토콜 개발.J.color谱법。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019)。
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