Terima kasih kerana melayari Nature.com. Anda menggunakan versi pelayar dengan sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau melumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Di samping itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Memaparkan karusel tiga slaid sekaligus. Gunakan butang Sebelumnya dan Seterusnya untuk bergerak melalui tiga slaid pada satu masa atau gunakan butang gelangsar di hujungnya untuk bergerak melalui tiga slaid pada satu masa.
Zarah silika berliang telah disediakan melalui kaedah sol-gel dengan beberapa pengubahsuaian untuk mendapatkan zarah berliang lebar. Zarah-zarah ini telah diderivatisasi dengan N-fenilmaleimida-metilvinil isosianat (PMI) dan stirena melalui pempolimeran pemecahan pemindahan rantai terbalik (RAFT) untuk menghasilkan poliamida interkalasi N-fenilmaleimida. Fasa pegun stirena (PMP). Lajur keluli tahan karat lubang sempit (diameter dalam 100 × 1.8 mm) telah dibungkus dengan pembungkusan buburan. Prestasi kromatografi lajur PMP telah dinilai untuk memisahkan campuran peptida sintetik yang terdiri daripada lima peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leu asid amino enkephalin) dan hidrolisat triptik albumin serum manusia (HAS). Di bawah keadaan elusi optimum, bilangan plat teori dengan campuran peptida mencapai 280,000 plat/m². Membandingkan prestasi pemisahan lajur yang dibangunkan dengan lajur Ascentis Express RP-Amide komersial, diperhatikan bahawa kecekapan pemisahan lajur PMP adalah lebih baik daripada lajur komersial dari segi kecekapan dan resolusi pemisahan.
Industri biofarmaseutikal telah menjadi pasaran global yang berkembang pesat dengan peningkatan ketara dalam bahagian pasaran dalam beberapa tahun kebelakangan ini. Dengan pertumbuhan pesat industri biofarmaseutikal1,2,3, terdapat keperluan yang besar untuk analisis peptida dan protein. Selain peptida sasaran, pelbagai bendasing terbentuk semasa sintesis peptida, jadi penulenan kromatografi diperlukan untuk mendapatkan ketulenan peptida yang diingini. Analisis dan pencirian protein dalam cecair badan, tisu dan sel merupakan tugas yang sangat mencabar kerana bilangan besar spesies yang berpotensi dikesan yang terdapat dalam satu sampel. Walaupun spektrometri jisim merupakan alat yang berkesan untuk penjujukan peptida dan protein, jika sampel tersebut dimasukkan terus ke dalam spektrometer jisim, pemisahan akan menjadi tidak memuaskan. Masalah ini boleh diselesaikan dengan melakukan kromatografi cecair (LC) sebelum analisis MS, yang akan mengurangkan jumlah analit yang memasuki spektrometer jisim pada masa tertentu4,5,6. Di samping itu, analit boleh tertumpu di kawasan sempit semasa pemisahan fasa cecair, sekali gus memekatkan analit ini dan meningkatkan kepekaan pengesanan MS. Kromatografi cecair (LC) telah berkembang dengan ketara sejak dekad yang lalu dan telah menjadi kaedah yang digunakan secara meluas untuk analisis proteomik7,8,9,10.
Kromatografi cecair fasa songsang (RP-LC) digunakan secara meluas untuk menulenkan dan mengasingkan campuran peptida menggunakan silika diubah suai oktadesil (ODS) sebagai fasa pegun11,12,13. Walau bagaimanapun, disebabkan oleh strukturnya yang kompleks dan sifat amfoterik,14,15 fasa pegun RP tidak dapat memberikan pemisahan peptida dan protein yang memuaskan. Oleh itu, analisis peptida dan protein dengan serpihan polar dan bukan polar memerlukan fasa pegun yang direka khas untuk berinteraksi dan mengekalkan analit ini16. Kromatografi campuran, yang menawarkan interaksi multimodal, boleh menjadi alternatif kepada RP-LC untuk mengasingkan peptida, protein dan campuran kompleks lain. Beberapa fasa pegun jenis campuran telah disediakan dan lajur yang diisi dengan fasa pegun ini digunakan untuk mengasingkan peptida dan protein17,18,19,20,21. Disebabkan oleh kehadiran kumpulan polar dan bukan polar, fasa pegun mod campuran (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalasi polar/RPLC) sesuai untuk pemisahan peptida dan protein22,23,24,25,26,27,28. , fasa pegun interkalasi polar dengan kumpulan polar terikat kovalen menunjukkan keupayaan pemisahan yang baik dan selektiviti unik untuk analit polar dan bukan polar kerana pemisahan bergantung pada interaksi antara analit dan fasa pegun Interaksi multimodal 29,30,31,32. Baru-baru ini, Zhang et al. 30 memperoleh fasa pegun poliamina yang ditamatkan behenyl dan berjaya memisahkan hidrokarbon, antidepresan, flavonoid, nukleosida, estrogen dan beberapa analit lain. Bahan pegun terbenam polar mempunyai kumpulan polar dan bukan polar, jadi ia boleh digunakan untuk memisahkan peptida dan protein kepada bahagian hidrofobik dan hidrofilik. Lajur sebaris polar (contohnya, lajur C18 dengan amida sebaris) boleh didapati di bawah nama dagangan lajur Ascentis Express RP-Amide, tetapi lajur ini hanya digunakan untuk analisis amina 33.
Dalam kajian semasa, fasa pegun pembenaman polar (N-fenilmaleimida, polistirena pembenaman) telah disediakan dan dinilai untuk pemisahan peptida dan pembelahan HSA triptik. Strategi berikut telah digunakan untuk menyediakan fasa pegun. Zarah silika berliang telah disediakan mengikut prosedur yang diterangkan dalam penerbitan kami sebelum ini, dengan beberapa perubahan dalam skema penyediaan 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39. Nisbah urea, polietilena glikol (PEG), TMOS dan asid akueus-asetik telah diselaraskan untuk mendapatkan zarah silika dengan saiz liang yang besar. Kedua, ligan fenilmaleimida-metilvinil isosianat baharu telah disintesis dan zarah silika terbitannya telah digunakan untuk menyediakan fasa pegun pembenaman polar. Fasa pegun yang diperoleh telah dibungkus ke dalam lajur keluli tahan karat (diameter dalam 100 × 1.8 mm) mengikut skema pembungkusan yang dioptimumkan. Pembungkusan lajur dibantu oleh getaran mekanikal untuk memastikan lapisan seragam dalam lajur. Kolum yang telah dibungkus telah dinilai untuk pemisahan campuran peptida yang terdiri daripada lima peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, peptida leusina-enkephalin), dan hidrolisat triptik albumin serum manusia (HSA). Telah diperhatikan bahawa campuran peptida dan digest triptik HSA terpisah dengan resolusi dan kecekapan yang baik. Kecekapan pemisahan kolum PMP dibandingkan dengan kolum Ascentis Express RP-Amide. Telah diperhatikan bahawa peptida dan protein mempunyai resolusi yang baik dan kecekapan pemisahan yang tinggi pada kolum PMP, dan kecekapan pemisahan kolum PMP adalah lebih tinggi daripada kolum Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilena glikol), urea, asid asetik, trimetoksisiortosilikat (TMOS), trimetilklorosilana (TMCS), tripsin, albumin serum manusia (HSA), ammonium klorida, urea, heksametilmetakriloyldisilazana (HMDS), metakriloyl klorida (MC), stirena, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksida (BPO), asetonitril (ACN) untuk HPLC, metanol, 2-propanol dan aseton. Syarikat Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, Amerika Syarikat).
Campuran urea (8 g), polietilena glikol (8 g) dan 8 ml asid asetik 0.01 N telah dikacau selama 10 minit, dan 24 ml TMOS telah ditambah ke dalamnya di bawah penyejukan ais. Campuran tindak balas dipanaskan pada suhu 40°C selama 6 jam dan kemudian pada suhu 120°C selama 8 jam dalam autoklaf keluli tahan karat. Air telah dituang dan sisanya dikeringkan pada suhu 70°C selama 12 jam. Blok lembut yang telah dikeringkan telah dikisar dengan halus dan dikalsin dalam ketuhar pada suhu 550°C selama 12 jam. Tiga kelompok telah disediakan dan dicirikan untuk menguji kebolehulangan saiz zarah, saiz liang dan luas permukaan.
Kumpulan kutub dan fasa pegun untuk rantai polistirena. Prosedur penyediaan diterangkan di bawah.
N-fenilmaleimida (200 mg) dan metil vinil isosianat (100 mg) dilarutkan dalam toluena anhidrus, dan kemudian 0.1 ml 2,2′-azoisobutironitrile (AIBN) ditambah ke dalam kelalang tindak balas untuk mendapatkan kopolimer fenilmaleimida dan metil vinil isosianat (PMCP). Campuran dipanaskan pada suhu 60°C selama 3 jam, ditapis dan dikeringkan dalam ketuhar pada suhu 40°C selama 3 jam.
Zarah silika kering (2 g) telah ditaburkan dalam toluena kering (100 ml), dikacau dan disonikasi selama 10 minit dalam kelalang dasar bulat 500 ml. PMCP (10 mg) telah dilarutkan dalam toluena dan ditambah setitik demi setitik ke dalam kelalang tindak balas melalui corong penambahan. Campuran tersebut telah direfluks pada suhu 100°C selama 8 jam, ditapis, dibasuh dengan aseton dan dikeringkan pada suhu 60°C selama 3 jam. Kemudian, zarah silika yang berkaitan dengan PMCP (100 g) telah dilarutkan dalam toluena (200 ml), dan 4-hidroksi-TEMPO (2 ml) telah ditambah ke dalamnya dengan kehadiran 100 μl dibutiltin dilaurat sebagai mangkin. Campuran tersebut telah dikacau pada suhu 50°C selama 8 jam, ditapis dan dikeringkan pada suhu 50°C selama 3 jam.
Stirena (1 ml), benzoil peroksida BPO (0.5 ml) dan zarah silika yang dilekatkan pada TEMPO-PMCP (1.5 g) telah dilarutkan dalam toluena dan disingkirkan dengan nitrogen. Pempolimeran stirena telah dijalankan pada suhu 100°C selama 12 jam. Produk yang terhasil telah dibasuh dengan metanol dan dikeringkan semalaman pada suhu 60°C. Skema umum tindak balas ditunjukkan dalam rajah 1.
Sampel dinyahgas pada 393 K selama 1 jam sehingga tekanan baki kurang daripada 10–3 Torr diperoleh. Jumlah N2 yang terserap pada tekanan relatif P/P0 = 0.99 digunakan untuk menentukan jumlah isipadu liang. Morfologi zarah silika tulen dan terikat ligan diperiksa menggunakan mikroskop elektron imbasan (Hitachi High Technologies, Tokyo, Jepun). Sampel kering (silika tulen dan zarah silika terikat ligan) diletakkan pada rod aluminium menggunakan pita karbon. Emas dimendapkan pada sampel menggunakan peranti percikan Q150T, dan lapisan Au setebal 5 nm dimendapkan pada sampel. Ini meningkatkan kecekapan proses voltan rendah dan memberikan semburan sejuk yang halus. Analisis unsur dilakukan menggunakan penganalisis komposisi unsur Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Penganalisis saiz zarah Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 digunakan untuk mendapatkan taburan saiz zarah. Zarah silika yang tidak bersalut dan zarah silika yang terikat dengan ligan (5 mg setiap satu) telah disebarkan dalam 5 ml isopropanol, disonikasi selama 10 minit, digoncang selama 5 minit, dan diletakkan di atas meja optik Mastersizer. Analisis termogravimetri dijalankan pada kadar 5 °C seminit dalam julat suhu dari 30 hingga 800 °C.
Tiang keluli tahan karat berlubang sempit yang dilapisi gentian kaca dengan dimensi (ID 100 × 1.8 mm) telah dibungkus dengan kaedah pengisian buburan mengikut prosedur yang sama seperti dalam rujukan 31. Tiang keluli tahan karat (berlapis kaca, ID 100 × 1.8 mm) dan saluran keluar yang mengandungi frit 1 µm telah disambungkan ke mesin pembungkusan buburan (Alltech Deerfield, IL, USA). Sediakan ampaian fasa pegun dengan menggantung 150 mg fasa pegun dalam 1.2 ml metanol dan memasukkannya ke dalam tiang takungan. Metanol digunakan sebagai pelarut buburan dan pelarut kawalan. Kemaskan tiang dengan menggunakan jujukan tekanan 100 MP selama 10 minit, 80 MP selama 15 minit, dan 60 MP selama 30 minit. Proses pembungkusan menggunakan dua penggetar tiang kromatografi gas (Alltech, Deerfield, IL, USA) untuk getaran mekanikal bagi memastikan pembungkusan tiang yang seragam. Tutup pembungkus buburan dan lepaskan tekanan secara perlahan-lahan untuk mengelakkan kerosakan pada tali. Lajur telah diputuskan sambungannya daripada muncung buburan dan satu lagi kelengkapan telah dipasang pada saluran masuk dan disambungkan ke sistem LC untuk menguji operasinya.
Satu MLC tersuai telah dibina menggunakan pam LC (10AD Shimadzu, Jepun), pensampel dengan gelung suntikan 50 nL (Valco (USA) C14 W.05), penyahgas membran (Shimadzu DGU-14A), dan tingkap kapilari UV-VIS. Peranti pengesan (UV-2075) dan mikrokolum berenamel. Gunakan tiub penyambung yang sangat sempit dan pendek untuk meminimumkan kesan pengembangan lajur tambahan. Selepas mengisi lajur, pasang kapilari (50 µm id 365) pada saluran keluar simpang pengurangan 1/16″ dan pasang kapilari (50 µm) simpang pengurangan. Pengumpulan data dan pemprosesan kromatogram dilakukan menggunakan perisian Multichro 2000. Pada 254 nm, penyerapan UV bagi analit subjek dipantau pada 0. Data kromatografi dianalisis menggunakan OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin serum manusia, serbuk liofilisasi, ≥ 96% (elektroforesis gel agarosa) 3 mg dicampur dengan tripsin (1.5 mg), 4.0 M urea (1 ml) dan 0.2 M ammonium bikarbonat (1 ml). Larutan dikacau selama 10 minit dan disimpan dalam mandian air pada suhu 37°C selama 6 jam, kemudian didinginkan dengan 1 ml 0.1% TFA. Tapis larutan dan simpan di bawah suhu 4°C.
Pemisahan campuran peptida dan HSA digest triptik pada lajur PMP telah dinilai secara berasingan. Periksa hidrolisis triptik campuran peptida dan HSA yang dipisahkan oleh lajur PMP dan bandingkan keputusannya dengan lajur RP-Amida Ascentis Express. Bilangan plat teori dikira menggunakan persamaan berikut:
Imej SEM zarah silika tulen dan zarah silika yang terikat dengan ligan ditunjukkan dalam Rajah 2. Imej SEM zarah silika tulen (A, B) menunjukkan bentuk sfera di mana zarah-zarah tersebut memanjang atau mempunyai simetri yang tidak sekata berbanding kajian kami sebelum ini. Permukaan zarah silika yang terikat oleh ligan (C, D) adalah lebih licin daripada zarah silika tulen, yang mungkin disebabkan oleh rantai polistirena yang menutupi permukaan zarah silika.
Mikrograf elektron imbasan zarah silika tulen (A, B) dan zarah silika terikat ligan (C, D).
Taburan saiz zarah zarah silika tulen dan zarah silika terikat ligan ditunjukkan dalam Rajah 2.3(A). Lengkung taburan saiz zarah volumetrik menunjukkan bahawa saiz zarah silika meningkat selepas pengubahsuaian kimia (Rajah 3A). Data taburan saiz zarah silika daripada kajian semasa dan kajian sebelumnya dibandingkan dalam Jadual 1(A). Saiz zarah volumetrik d(0.5) PMP ialah 3.36 µm, berbanding nilai ad(0.5) iaitu 3.05 µm dalam kajian kami sebelum ini (zarah silika terikat polistirena)34. Disebabkan oleh perubahan dalam nisbah PEG, urea, TMOS dan asid asetik dalam campuran tindak balas, taburan saiz zarah kelompok ini adalah lebih sempit berbanding kajian kami sebelum ini. Saiz zarah fasa PMP adalah sedikit lebih besar daripada fasa zarah silika terikat polistirena yang kami kaji sebelum ini. Ini bermakna bahawa fungsian permukaan zarah silika dengan stirena hanya memendapkan lapisan polistirena (0.97 µm) pada permukaan silika, manakala dalam fasa PMP ketebalan lapisan ialah 1.38 µm.
Taburan saiz zarah (A) dan taburan saiz liang (B) zarah silika tulen dan zarah silika terikat ligan.
Saiz liang, isipadu liang, dan luas permukaan zarah silika yang digunakan dalam kajian ini ditunjukkan dalam Jadual 1 (B). Profil PSD zarah silika tulen dan zarah silika terikat ligan ditunjukkan dalam Rajah 3(B). Keputusannya setanding dengan kajian kami sebelum ini34. Saiz liang zarah silika tulen dan terikat ligan masing-masing ialah 310 Å dan 241 Å, menunjukkan bahawa selepas pengubahsuaian kimia, saiz liang berkurangan sebanyak 69 Å, seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 1 (B), dan lengkung anjakan ditunjukkan dalam Rajah. Luas permukaan spesifik zarah silika dalam kajian semasa ialah 116 m2/g, yang setanding dengan kajian kami sebelum ini (124 m2/g). Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 1(B), luas permukaan (m2/g) zarah silika selepas pengubahsuaian kimia juga berkurangan daripada 116 m2/g kepada 105 m2/g.
Keputusan analisis unsur fasa pegun dibentangkan dalam Jadual. 2. Kandungan karbon fasa pegun semasa ialah 6.35%, yang mana lebih rendah daripada kajian kami sebelum ini (zarah silika yang dikaitkan dengan polistirena, masing-masing 7.93%35 dan 10.21%) 42. Kandungan karbon fasa pegun semasa di bawah, kerana beberapa ligan polar seperti fenilaleimida metil vinil isosianat (PCMP) dan 4-hidroksi-TEMPO telah digunakan sebagai tambahan kepada stirena dalam penyediaan SP. Peratusan berat nitrogen dalam fasa pegun semasa ialah 2.21% berbanding 0.1735 dan 0.85% dalam kajian terdahulu42. Ini bermakna fasa pegun semasa mempunyai peratusan berat nitrogen yang tinggi disebabkan oleh fenilaleimida. Begitu juga, produk (4) dan (5) masing-masing mempunyai kandungan karbon sebanyak 2.7% dan 2.9%, manakala produk akhir (6) mempunyai kandungan karbon sebanyak 6.35%, seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 2. Analisis termogravimetri (TGA) telah digunakan pada fasa pegun PMP untuk menguji penurunan berat badan, dan lengkung TGA ditunjukkan dalam Rajah 4. Lengkung TGA menunjukkan penurunan berat badan sebanyak 8.6%, yang sepadan dengan kandungan karbon (6.35%), kerana ligan bukan sahaja mengandungi C, tetapi juga N, O dan H.
Ligan fenilaleimida-metilvinil isosianat dipilih untuk mengubah suai permukaan zarah silika kerana kumpulan fenilaleimida dan vinilisosianatnya yang berkutub. Kumpulan vinil isosianat boleh bertindak balas selanjutnya dengan stirena melalui pempolimeran radikal hidup. Sebab kedua adalah untuk memasukkan kumpulan yang mempunyai interaksi sederhana dengan analit dan tiada interaksi elektrostatik yang kuat antara analit dan fasa pegun, memandangkan bahagian fenilaleimida tidak mempunyai cas maya pada pH normal. Kekutuban fasa pegun boleh dikawal oleh jumlah stirena yang optimum dan masa tindak balas pempolimeran radikal bebas. Langkah terakhir tindak balas (pempolimeran radikal bebas) adalah kritikal kerana ia mengubah kekutuban fasa pegun. Analisis unsur telah dijalankan untuk memeriksa kandungan karbon dalam fasa pegun ini. Telah diperhatikan bahawa peningkatan jumlah stirena dan masa tindak balas meningkatkan kandungan karbon fasa pegun dan sebaliknya. SP yang disediakan dengan kepekatan stirena yang berbeza mempunyai beban karbon yang berbeza. Begitu juga, fasa pegun ini diletakkan pada tiang keluli tahan karat dan ciri-ciri kromatografinya (selektiviti, resolusi, nilai N, dll.) telah diperiksa. Berdasarkan eksperimen ini, komposisi yang dioptimumkan untuk penyediaan fasa pegun PMP telah dipilih untuk memberikan kekutuban terkawal dan pengekalan analit yang baik.
Lajur PMP juga dinilai untuk analisis lima campuran peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusina-enkephalin) menggunakan kapasiti fasa bergerak. 60/40 (v/v) ACN/air (0.1% TFA) pada kadar aliran 80 µl/min. Di bawah keadaan elusi optimum (200,000 plat/m), bilangan plat teori (N) setiap lajur (100 × 1.8 mm) ialah 20,000 ± 100. Nilai N untuk tiga lajur PMP ditunjukkan dalam Jadual 3 dan kromatogram ditunjukkan dalam Rajah 5A. Analisis pantas pada kadar aliran tinggi (700 µl/min) pada lajur PMP, lima peptida dielusi dalam masa satu minit, nilai N yang sangat baik iaitu 13,500 ± 330 setiap lajur (diameter 100 x 1.8 mm), bersamaan dengan 135,000 plat/m (Rajah 5B). Tiga lajur bersaiz sama (diameter dalam 100 x 1.8 mm) diisi dengan tiga kelompok fasa pegun PMP yang berbeza untuk menguji kebolehulangan. Analit direkodkan untuk setiap lajur dengan memisahkan campuran ujian yang sama pada setiap lajur menggunakan keadaan elusi optimum, bilangan plat teori N, dan masa pengekalan. Data kebolehulangan untuk lajur PMP ditunjukkan dalam Jadual 4. Kebolehulangan lajur PMP berkorelasi baik dengan nilai %RSD yang sangat rendah seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 3.
Pemisahan campuran peptida pada lajur PMP (B) dan lajur Ascentis Express RP-Amida (A), fasa bergerak 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), dimensi lajur PMP (100 x 1.8 mm id), analisis Tertib elusi sebatian: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) dan 5 (enkephalin asid leusik).
Satu lajur PMP (diameter dalam 100 x 1.8 mm) telah dinilai untuk pemisahan hidrolisat triptik albumin serum manusia melalui HPLC. Kromatogram dalam Rajah 6 menunjukkan bahawa sampel dipisahkan dengan baik dengan resolusi yang sangat baik. Larutan HSA dianalisis menggunakan kadar aliran 100 μl/min, fasa bergerak 70/30 asetonitril/air dan 0.1% TFA. Pembelahan HSA dibahagikan kepada 17 puncak, seperti yang ditunjukkan dalam kromatogram (Rajah 6), sepadan dengan 17 peptida. Kecekapan pemisahan puncak individu daripada hidrolisat HSA dikira dan nilainya ditunjukkan dalam Jadual 5.
Hidrolisis triptik HSA telah diasingkan pada lajur PMP (diameter dalam 100 x 1.8 mm), kadar aliran (100 μl/min), fasa bergerak 60/40 asetonitril/air, dan 0.1% TFA.
di mana L ialah panjang lajur, η ialah kelikatan fasa bergerak, ΔP ialah tekanan balik lajur, dan u ialah halaju linear fasa bergerak. Kebolehtelapan lajur PMP ialah 2.5 × 10–14 m2, kadar aliran ialah 25 µl/min, 60/40 v/v telah digunakan. ACN/air. Kebolehtelapan lajur PMP (ID 100 × 1.8 mm) adalah serupa dengan kajian Ruj.34 kami sebelum ini. Kebolehtelapan lajur yang diisi dengan zarah berliang superfisial ialah 1.7×10 .6 µm, 2.5×10-14 m2 untuk zarah 5 µm43. Oleh itu, kebolehtelapan fasa PMP adalah serupa dengan kebolehtelapan zarah teras-cangkerang dengan saiz 5 μm.
di mana Wx ialah jisim turus yang diisi dengan kloroform, Wy ialah jisim turus yang diisi dengan metanol, dan ρ ialah ketumpatan pelarut. Ketumpatan metanol (ρ = 0.7866) dan kloroform (ρ = 1.484). Jumlah keliangan turus zarah silika-C18 (100 × 1.8 mm ID)34 dan turus C18-urea31 yang dikaji sebelum ini masing-masing ialah 0.63 dan 0.55. Ini bermakna kehadiran ligan urea mengurangkan kebolehtelapan fasa pegun. Sebaliknya, jumlah keliangan turus PMP (diameter dalam 100 × 1.8 mm) ialah 0.60. Turut PMP kurang telap berbanding turus yang diisi dengan zarah silika terikat C18 kerana dalam fasa pegun jenis C18, ligan C18 dilekatkan pada zarah silika dalam rantai linear, manakala dalam fasa pegun jenis polistirena, polimer yang agak tebal terbentuk di sekeliling zarah. lapisan A. Dalam eksperimen biasa, keliangan lajur dikira seperti berikut:
Pada rajah 7A, B menunjukkan plot Van Deemter untuk lajur PMP (id 100 x 1.8 mm) dan lajur Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1.8 mm) di bawah keadaan elusi yang sama, 60/40 ACN/H2O dan 0 .1% TFA 20 µl/min hingga 800 µl/min pada kedua-dua lajur. Nilai HETP minimum pada kadar aliran optimum (80 µl/min) masing-masing ialah 2.6 µm dan 3.9 µm untuk lajur PMP dan lajur Ascentis Express RP-Amide. Nilai HETP menunjukkan bahawa kecekapan pemisahan lajur PMP (100 x 1.8 mm id) adalah jauh lebih tinggi daripada lajur Ascentis Express RP-Amide yang tersedia secara komersial (100 x 1.8 mm id). Graf van Deemter dalam Rajah 7(A) menunjukkan bahawa penurunan nilai N tidak jauh lebih tinggi dengan peningkatan aliran berbanding kajian kami sebelum ini. Kecekapan pemisahan lajur PMP yang lebih tinggi (id 100 × 1.8 mm) berbanding lajur Ascentis Express RP-Amide adalah berdasarkan bentuk dan saiz zarah yang dipertingkatkan dan prosedur pembungkusan lajur yang canggih yang digunakan dalam kerja semasa34.
(A) Plot Van Deemter (HETP vs. halaju linear fasa bergerak) yang diperoleh pada lajur PMP (id 100 x 1.8 mm) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0.1% TFA. (B) Plot Van Deemter (HETP vs. halaju linear fasa bergerak) yang diperoleh pada lajur Ascentis Express RP-Amide (id 100 x 1.8 mm) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0.1% TFA.
Fasa pegun polar polistirena interkalasi telah disediakan dan dinilai untuk pemisahan campuran peptida sintetik dan hidrolisat triptik albumin serum manusia (HSA) dalam kromatografi cecair berprestasi tinggi. Prestasi kromatografi lajur PMP untuk campuran peptida adalah sangat baik dari segi kecekapan dan resolusi pemisahan. Kecekapan pemisahan lajur PMP yang dipertingkatkan adalah disebabkan oleh beberapa sebab seperti saiz zarah silika dan saiz liang, sintesis fasa pegun yang terkawal, dan bahan pembungkusan lajur yang kompleks. Selain kecekapan pemisahan yang tinggi, satu lagi kelebihan fasa pegun ini ialah tekanan balik lajur yang rendah pada kadar aliran yang tinggi. Lajur PMP sangat boleh dihasilkan semula dan boleh digunakan untuk menganalisis campuran peptida dan pencernaan triptik pelbagai protein. Kami berhasrat untuk menggunakan lajur ini untuk pemisahan sebatian bioaktif daripada produk semula jadi, ekstrak tumbuhan ubatan dan cendawan dalam kromatografi cecair. Pada masa hadapan, lajur PMP juga akan dinilai untuk pemisahan protein dan antibodi monoklonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Penyiasatan ke atas sistem pemisahan peptida kromatografi fasa terbalik bahagian I: Pembangunan protokol untuk pencirian lajur. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Penyiasatan ke atas sistem pemisahan peptida kromatografi fasa terbalik bahagian I: Pembangunan protokol untuk pencirian lajur.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., dan Petersson, P. Penyiasatan Sistem Pemisahan Peptida melalui Kromatografi Fasa Songsang, Bahagian I: Membangunkan Protokol untuk Pencirian Lajur. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Penyiasatan ke atas sistem pemisahan peptida kromatografi fasa terbalik bahagian I: Pembangunan protokol untuk ciri-ciri lajur. Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Penyiasatan ke atas sistem pemisahan peptida kromatografi fasa terbalik bahagian I: Pembangunan protokol untuk ciri-ciri lajur.Field, JK, Owerby, MR, Lau, J., Togersen, H., dan Petersson, P. Penyiasatan Sistem Pemisahan Peptida melalui Kromatografi Fasa Songsang, Bahagian I: Membangunkan Protokol untuk Pencirian Lajur.J.色谱法。 1603，113-129。 https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038(2019).
Gomez, B. et al. Kaedah untuk mencipta peptida aktif yang dipertingkatkan untuk rawatan penyakit berjangkit. Bioteknologi. Pencapaian 36(2), 415–429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptida terapeutik sintetik: Sains dan pasaran. Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptida terapeutik sintetik: Sains dan pasaran.Vliege P, Lisowski V, Martinez J dan Chreschatyski M. Peptida terapeutik sintetik: sains dan pasaran.Vliege P, Lisowski V, Martinez J dan Khreschatsky M. Peptida terapeutik sintetik: sains dan pasaran. penemuan ubat. Hari ini 15 (1–2), 40–56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi cecair proteomik lanjutan. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi cecair proteomik lanjutan.Lihat F., Smith RD dan Shen Yu. Kromatografi cecair proteomik lanjutan. Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. 高级蛋白质组液相色谱。 Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Komposisi protein lanjutan 液相色谱。Lihat F., Smith RD dan Shen Yu. Kromatografi cecair proteomik lanjutan.J. Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografi cecair lanjutan-spektrometri jisim mampu menggabungkan metabolomik dan proteomik berasaskan luas. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peranan UHPLC dalam pembangunan farmaseutikal. Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peranan UHPLC dalam pembangunan farmaseutikal.Chesnut, SM dan Salisbury, JJ Peranan UHPLC dalam pembangunan farmaseutikal.Chesnut, SM dan Salisbury, JJ Peranan UHPLC dalam pembangunan ubat. J. Sept Science. 30(8), 1183–1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspek asas dan praktikal kromatografi cecair tekanan ultra tinggi untuk pemisahan pantas. Wu, N. & Clausen, AM Aspek asas dan praktikal kromatografi cecair tekanan ultra tinggi untuk pemisahan pantas.Wu, N. dan Clausen, AM Aspek asas dan praktikal kromatografi cecair tekanan tinggi untuk pemisahan pantas. Wu, N. & Clausen, AM 用于快速分离的超高压液相色谱的基础和实践方面。 Wu, N. & Clausen, AM Aspek asas dan praktikal kromatografi cecair tekanan ultra tinggi untuk pemisahan pantas.Wu, N. dan Clausen, AM Aspek asas dan praktikal kromatografi cecair tekanan tinggi untuk pemisahan pantas.J. Sept. Sains. 30(8), 1167–1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Penggunaan kromatografi cecair berprestasi ultra dalam pembangunan farmaseutikal. Wren, SA & Tchelitcheff, P. Penggunaan kromatografi cecair berprestasi ultra dalam pembangunan farmaseutikal.Ren, SA dan Chelischeff, P. Penggunaan kromatografi cecair prestasi ultra tinggi dalam pembangunan farmaseutikal. Wren, SA & Tchelitcheff, P. 超高效液相色谱在药物开发中的应用。 Wren, SA & Tchelitcheff, P.Ren, SA dan Chelischeff, P. Aplikasi kromatografi cecair berprestasi ultra dalam pembangunan ubat.J. Kromatografi. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrogel makropori monolitik yang diperoleh daripada emulsi minyak-dalam-air dengan fasa dalaman yang tinggi untuk penulenan enterovirus yang cekap 71. Projek kimia. Jurnal 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peranan kromatografi cecair dalam proteomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peranan kromatografi cecair dalam proteomik.Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. dan Wilkins, JA Peranan kromatografi cecair dalam proteomik. Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA 液相色谱在蛋白质组学中的作用。 Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JAShi, Y., Xiang, R., Horvath, C. dan Wilkins, JA Peranan kromatografi cecair dalam proteomik.J. Kromatografi. A 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Vutey, J.-L. & Guillarme, D. Trend baharu dalam pemisahan kromatografi cecair fasa terbalik bagi peptida dan protein terapeutik: Teori dan aplikasi. & Guillarme, D. Trend baharu dalam pemisahan kromatografi cecair fasa terbalik bagi peptida dan protein terapeutik: Teori dan aplikasi. & Guillarme, D. Новые тенденции в разделении терапевтических пептидов и белков с помощью жидкостной хроматографира хроматографира свер теория dan приложения. & Guillarme, D. Trend baharu dalam pemisahan peptida dan protein terapeutik melalui kromatografi cecair fasa terbalik: teori dan aplikasi. & Guillarme, D. 治疗性肽和蛋白质的反相液相色谱分离的新趋势：理论和应用。 & Guillarme, D.dan Guillarmé, D. Trend baharu dalam pemisahan peptida dan protein terapeutik melalui kromatografi cecair fasa terbalik: teori dan aplikasi.J. Pharm. Sains Bioperubatan. anus. 69, 9–27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan sistem RP-RP-HPLC dengan pH berbeza dalam dimensi pemisahan pertama dan kedua. Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan sistem RP-RP-HPLC dengan pH berbeza dalam dimensi pemisahan pertama dan kedua.Gilar M., Olivova P., Dali AE dan Gebler JK Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan sistem RP-RP-HPLC dengan pH berbeza dalam dimensi pemisahan pertama dan kedua.Gilar M., Olivova P., Dali AE dan Gebler JK Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan nilai pH yang berbeza dalam dimensi pemisahan pertama dan kedua menggunakan sistem RP-RP-HPLC. J. Sept Science. 28 (14), 1694–1703 (2005).
Fellitti, S. et al. Penyiasatan pemindahan jisim dan ciri-ciri kinetik lajur kromatografi berprestasi tinggi yang dipenuhi dengan zarah C18 berliang sepenuhnya dan berliang superfisial yang lebih kecil daripada 2 µm. J. Sept Science. 43 (9–10), 1737–1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Trend terkini dan cabaran analitikal dalam pengasingan, pengenalpastian dan pengesahan peptida bioaktif tumbuhan. anus. Makhluk dubur. Kimia. 410(15), 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Muller, JB dkk. Landskap proteomik kerajaan kehidupan. Nature 582 (7813), 592–596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
De Luca, K. et al. Rawatan pasca peptida terapeutik melalui kromatografi cecair preparatif. Molekul (Basel, Switzerland) 26(15), 4688 (2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mod campuran dan aplikasinya kepada biopolimer. Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mod campuran dan aplikasinya kepada biopolimer.Yang, Yu. dan Geng, X. Kromatografi mod campuran dan aplikasinya kepada biopolimer. Yang, Y. & Geng, X. 混合模式色谱及其在生物聚合物中的应用。 Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mod campuran dan aplikasinya dalam biopolimer.Yang, Yu. dan Gene, X. Kromatografi mod campuran dan aplikasinya kepada biopolimer.J. Kromatografi. A 1218(49), 8813–8825 (2011).